Summary
Este protocolo descreve um procedimento experimental para quantitativamente e exaustivamente investigar o metabolismo de várias fontes de nutrientes. Este fluxo de trabalho, com base em uma combinação de experiências de traçador isotópico e um procedimento analítico, permite que o destino dos nutrientes consumidos e a origem metabólica de moléculas synthetized por microorganismos a ser determinada.
Abstract
Estudos no campo da microbiologia dependem da implementação de uma vasta gama de metodologias. Em particular, o desenvolvimento de métodos adequados substancialmente contribui para fornecer amplo conhecimento do metabolismo dos microrganismos crescendo em meios quimicamente definidos contendo nitrogênio exclusivo e fontes de carbono. Em contraste, a gestão através do metabolismo de várias fontes de nutrientes, apesar de sua ampla presença em ambientes naturais ou industriais, permanece praticamente inexplorada. Esta situação é principalmente devido à falta de metodologias adequadas, o que dificulta as investigações.
Nós relatamos uma estratégia experimental quantitativamente e exaustivamente explorar como metabolismo funciona quando um nutriente é fornecido como uma mistura de moléculas diferentes, ou seja, um recurso complexo. Aqui, descrevemos a sua aplicação para avaliar o particionamento de várias fontes de nitrogênio através da rede metabólica de levedura. O fluxo de trabalho combina informações obtidas durante as experiências de traçador de isótopo estável usando selecionado 13C - ou 15N-rotulado substratos. Primeiro consiste em fermentações paralelas e pode ser reproduzidas no mesmo meio, que inclui uma mistura de moléculas contendo N; no entanto, uma fonte de nitrogênio selecionado é rotulada de cada vez. Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) é implementada para avaliar os padrões de rotulagem dos compostos alvo e para quantificar o consumo e a recuperação de substratos em outros metabólitos. Uma análise integrada do conjunto completo de dados fornece uma visão geral sobre o destino dos substratos consumidos dentro das células. Essa abordagem requer um protocolo exato para a coleta de amostras – facilitada por um sistema de monitoramento on-line de fermentações robô-assistida – e a realização de inúmeras análises demoradas. Apesar dessas limitações, permitiu compreender, pela primeira vez, o particionamento de várias fontes de nitrogênio em toda a rede metabólica de levedura. Nós elucidado a redistribuição do nitrogênio de fontes mais abundantes em direção a outros compostos de N e determinada a origem metabólica de moléculas voláteis e aminos-ácido proteinogenic.
Introduction
Entendimento como funciona o metabolismo microbiano é uma questão fundamental para a concepção de estratégias eficientes para melhorar os processos de fermentação e modulam a produção de compostos fermentativa. Avanços na genômica e genômica funcional nestas últimas duas décadas, em grande medida contribuídas para alargar o conhecimento da topologia de redes metabólicas em muitos microorganismos. Acesso a esta informação levou ao desenvolvimento de abordagens que aponta para uma visão abrangente da função celular1. Essas metodologias muitas vezes dependem de uma interpretação baseada em modelo de parâmetros mensuráveis. Estes dados experimentais incluem, por um lado, taxas de absorção e produção do metabólito e, por outro lado, experiências quantitativa informação intracelular que é obtida do traçador de isótopo. Estes dados fornecem informações essenciais para a dedução da atividade na vivo de percursos diferentes em uma rede metabólica definidas2,3,4. Atualmente, as técnicas analíticas disponíveis apenas permitem a detecção precisa de rotulagem padrões de moléculas quando usando um elemento único isótopo e, possivelmente, quando co etiquetando com dois elementos isotópicos. Além disso, na maioria das condições de crescimento, a fonte de carbono consiste apenas de um ou dois compostos. Por conseguinte, abordagens baseadas em 13C-isotópica traçadores de substratos de carbono foram amplamente e com êxito aplicadas para desenvolver uma compreensão completa do carbono rede metabólica operações5,6,7 ,8.
Em contraste, em muitos ambientes naturais e industriais, o recurso de azoto disponível que suporta o crescimento microbiano, muitas vezes é composto de uma vasta gama de moléculas. Por exemplo, durante a fermentação do vinho ou cerveja, o nitrogênio é fornecido como uma mistura de 18 aminoácidos e amônia em concentrações variáveis de9. Essa matriz de compostos de N que são acessíveis para o anabolismo faz estas condições complexas de mídia extremamente diferentes daqueles comumente usados para estudos fisiológicos, como o último é obtido usando uma fonte única de nitrogênio, normalmente de amónio.
Em geral, internalizada nitrogênio compostos podem ser diretamente incorporados em proteínas ou catabolizados. A estrutura da rede do metabolismo de nitrogênio em muitos microorganismos, incluindo o fermento Saccharomyces cerevisiae, é muito complexa, em conformidade com a diversidade de substratos. Esquematicamente, este sistema é baseado na combinação do núcleo central do metabolismo de nitrogênio que catalisa a interconversão de glutamina, glutamato e α-cetoglutarato10,,11, com transaminases e deaminases. Através desta rede, grupos amina de amónio ou outros aminoácidos são reunidos e α-ceto ácidos liberados. Estes intermediários são também synthetized a central carbono metabolismo (CCM)12,13. Este grande número de reações ramificadas e intermediários, envolvidos em ambos o catabolismo de fontes exógenas de nitrogênio e o anabolismo dos aminos-ácido proteinogenic, cumpre os requisitos anabólicos das células. A atividade através destes diferentes rotas interconectadas resulta também na excreção de metabólitos. Em particular, α-ceto ácidos podem ser redirecionados através da via de Ehrlich para produzir alcoóis superiores e seus acetato éster derivados14, que são contribuintes essenciais para os perfis sensoriais dos produtos. Posteriormente, como funciona o metabolismo de nitrogênio desempenha um papel fundamental na produção de biomassa e a formação de moléculas voláteis (aroma).
As reações, enzimas e genes envolvidos no metabolismo de nitrogênio são extensivamente descritos na literatura. No entanto, a questão da distribuição de várias fontes de nitrogênio em toda uma rede metabólica não ainda foi resolvida. Existem duas razões principais que explicam esta falta de informação. Em primeiro lugar, tendo em conta a complexidade importante da rede do metabolismo de nitrogênio, uma grande quantidade de dados quantitativos é necessária para um completo entendimento da sua operação, que não estava disponível até agora. Segundo, muitos experimentais restrições e limitações dos métodos analíticos impediram a implementação de abordagens que foram usados anteriormente para a elucidação da função do CCM.
Para superar esses problemas, nós escolhemos desenvolver uma abordagem de nível de sistema que se baseia a reconciliação de dados de uma série de experimentos de traçador isotópico. O fluxo de trabalho inclui:
-Um conjunto de fermentações realizados sob as mesmas condições ambientais, enquanto uma fonte de nutrientes selecionada diferente (substrato) é rotulada de cada vez.
-Uma combinação de procedimentos analíticos (HPLC, GC-MS) para uma determinação precisa, em diferentes fases da fermentação, a concentração residual de rotulada de substrato e a concentração e o enriquecimento isotópico de compostos derivados de o catabolismo da molécula rotulado, incluindo a biomassa derivada.
-Um cálculo do balanço de massa e isotópico para cada consumido molécula etiquetada e uma posterior análise integrada do conjunto de dados para obter uma visão global da gestão de múltiplas fontes de nutrientes por microorganismos através da determinação de taxas de fluxo .
Para aplicar esta metodologia, deve ser dada atenção ao comportamento reprodutível dos microorganismos/tensão entre culturas. Além disso, devem ser colhidas amostras de diferentes culturas durante o andamento de fermentação bem definidos mesmo. No trabalho experimental relatado neste manuscrito, um sistema de robô-assistida é usado para monitoramento on-line de fermentações para contabilizar essas restrições.
Além disso, é essencial escolher um conjunto de substratos rotulados (composto, natureza e posição da rotulagem) que é apropriado para abordar o problema científico do estudo. Aqui, arginina, glutamina e 15N-rotulado amónio foram selecionados como as três fontes de nitrogênio principais encontradas no suco de uva. Isso permitiu avaliar o padrão de redistribuição do nitrogênio de compostos consumidos para o aminos-ácido proteinogenic. Nós também objetivou investigar o destino do backbone de aminoácidos consumidos e sua contribuição para a produção de moléculas voláteis de carbono. Para cumprir este objectivo, uniformemente 13C-rotulado leucina, valina, treonina e isoleucina foram incluídos no estudo como aminoácidos, que são derivados de grandes intermediários da via de Ehrlich.
No geral, nós exploramos quantitativamente como fermento gerencia um recurso complexo nitrogênio pela redistribuição de fontes exógenas de nitrogênio para cumprir suas exigências anabolizantes durante a fermentação enquanto Adicionalmente, removendo o excesso de precursores de carbono como moléculas voláteis. O procedimento experimental relatado neste artigo pode ser aplicado para investigar outras múltiplas fontes de nutrientes usados por qualquer outro microorganismo. Parece ser uma abordagem adequada para a análise do impacto do fundo genético ou condições ambientais sobre o comportamento metabólico de microorganismos.
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Protocol
1. fermentação e amostragem
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Preparação de mídia e fermentadores
Nota: Todas as fermentações são efectuadas em paralelo, usando a mesma tensão e na mesma quimicamente definidas sintético médio (SM, composição fornecida na tabela 1), que inclui uma mistura de amônia e aminoácidos como fontes de nitrogênio15. Para cada fermentação, um composto único nitrogênio é fornecido exclusivamente em um uniforme etiquetados 13C ou formulário 15N (100%), enquanto os outros permanecem sem rótulo. Para cada fonte de nitrogênio rotulado que é usado no conjunto de experimentos (aqui: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), dois fermentadores são preparados. Para cada condição, fermentação duplicada é realizada usando apenas sem rótulo moléculas (fermentações de controle 7).- Para cada fonte de N a ser estudado, preparar 500 mL de SM médio que contém todas as fontes de nitrogênio listadas na tabela 1, com excepção do composto a ser usado em 100% rotulado formulário.
Nota: A molécula etiquetada é adicionada nas próximas etapas. - Pasteurizar a cada meio em um frasco de 1 L (10 min, 100 ° C) que contém uma barra de agita magnética. Pesar a quantidade adequada de molécula etiquetada para atingir a concentração final que é relatada na tabela 1 e dissolvê-lo no meio.
- Esterilize o meio usando um sistema de filtragem de vácuo descartável (membrana de acetato de celulose, 0,22 µm). Usando uma proveta estéril, divida o meio entre dois fermentadores pré-esterilizados (250 mL) que contêm uma barra de agita magnética e estão equipados com fechaduras de fermentação para evitar a entrada de oxigênio, mas permitir a liberação de CO2.
- Aqueça os frascos de fermentação a 28 ° C, colocando-os na sala de incubação para 1 noite (temperatura de 28 ° C).
- Para cada fonte de N a ser estudado, preparar 500 mL de SM médio que contém todas as fontes de nitrogênio listadas na tabela 1, com excepção do composto a ser usado em 100% rotulado formulário.
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Inoculação e monitoramento de fermentações
- Cresce a cepa de S. cerevisiae em tubos estéreis, contendo 10 mL de meio YPD a 28 ° C, com agitação (150 rpm) por 12 h. Em seguida, Pipetar 1 mL de YPD preculture e transferi-lo para 10 mL de meio de SM (em tubos estéreis de 15 mL). Incube a cultura para 12 horas a 28 ° C, com agitação (150 rpm).
- Sob fluxo laminar, recolher uma alíquota de preculture e quantificar a população de células usando um contador de partículas eletrônico que é equipado com uma abertura de 100 µm. Centrifugue o preculture (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) e suspender o sedimento em um volume adequado de água estéril para obter uma concentração final de 2,5 x 108 células/mL. Inocule cada fermentador com 1 mL de suspensão de célula.
Nota: O sistema robótico usado para monitorar o progresso da fermentação é descrito na Figura 1. - Prepare a plataforma de fermentação instalando os fermentadores em guias de apoio que são colocados sobre as placas de agita 21-posição corretamente e definir a taxa de agita a 270 rpm. Para iniciar o monitoramento on-line de cada fermentação, iniciar o aplicativo de controle do robô, em seguida, clique no botão "Iniciar teste" e selecione o volume de fermentação a efectuar (300 mL).
- A interface exibida permite a indicação do número e a posição de fermentadores na plataforma. Para garantir que isso ocorrer, clique com o botão direito sobre a localização do slot e escolher "enable" para ativar o monitoramento de fermentador localizado nessa posição.
- Inicialize o software de cálculo, permanentemente em execução no sistema, antes de iniciar a aquisição de peso. Clique no botão "Initialiser" e validar com "okey". Clique sobre o botão"Iniciar" do aplicativo para iniciar as aquisições de peso-controle do robô.
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Procedimento de amostragem
Nota: Para cada fermentador, amostras quando a CO2 produção (valor mostrado o computador que está executando o software de cálculo on-line) atinge o set-point necessário: 5, 10, 40 e 90 g/L neste estudo.-
Procedimento para culturas com compostos rotulados de amostragem.
- Centrifugar duas amostras de 6 mL (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Salvar e armazenar os sobrenadantes congelados em duas alíquotas a-80 ° C. Lave as pelotas duas vezes com 5 mL de água destilada e loja a-80 ° C para a medição dos avanços isotópicas.
- Procedimento para culturas sem compostos rotulados de amostragem
- Colha 10 mL de cultura, que será utilizada para determinação do peso seco. Granule as células de duas amostras de 10ml por centrifugação (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Lave as pelotas duas vezes com 10 mL de água destilada e armazená-los a-80 ° C para a determinação do teor de proteínas e aminoácidos.
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Procedimento para culturas com compostos rotulados de amostragem.
2. quantificação de fontes de nitrogênio consumido
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Determinação enzimática das concentrações de amônia residual
Nota: A determinação da concentração de amônia em sobrenadantes é realizada usando um kit de enzimáticos comercial; todos os reagentes são fornecidos pelo fabricante.- Preparar uma solução padrão de amônia (61,4 mg/L), dissolvendo a 25 mg de precisamente pesada (NH4)2então4 num balão volumétrico de 100 mL.
- Para cumprir as instruções do fabricante, realize uma diluição de 1:2 das amostras que foram tiradas antes da fermentação e a 5 g/L de CO2 lançado. Ajuste o pH das amostras de aproximadamente 8 adicionando 1m KOH. Tome nota do volume adicionado e levar em conta o fator de diluição.
- Em cubetas de Espectrofotômetro de 4 mL, mistura, 100 µ l de amostra (diluída se necessário), água destilada ou solução de amoníaco padrão com 2 mL de Reagente 1 (0,75 mM ADP e 30 U/mL glutamato desidrogenase no buffer de pH 7,8) e 500 µ l de Reagente 2 (NADH 1,3 mM). Incubar durante 15 minutos à temperatura ambiente e ler a absorbância do NADH a 340 nm (A1).
- Adicionar 500 µ l de Reagente 3 (60mm α-cetoglutarato em tampão de pH 8), incubar a amostra por 20 min em temperatura ambiente e ler a absorbância do NADH a 340 nm (A2).
- Calcule a concentração de amônia usando:
Camônia (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)amostra- (0.839 x A1-A2)água destilada] - Verifique a concentração correta é obtida com a solução-padrão.
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Determinação cromatográfica das concentrações residuais de aminoácido
Nota: A determinação das concentrações de aminoácidos em sobrenadantes é conseguida usando um sistema de análise de aminoácidos dedicado baseado em cromatografia de troca iônica com post de derivatização de coluna de N-compostos com ninidrina, que permite sua Detecção colorimétrica.- Prepare uma solução de referência, adicionando-se 200 µ l de uma mistura comercial de aminoácidos neutros e ácidos, 200 µ l de uma mistura comercial de aminoácidos básicos e 200 µ l de glutamina de 2,5 mM a 400 µ l de tampão de citrato de lítio 200 mM, pH 2.2. Esta solução de referência quimicamente definidas é tratada como uma amostra.
- Adicione 200 µ l de solução de ácido sulfosalicílico 25% (p/v) que contém 2,5 mM norleucina (padrão interno) a 800 µ l de amostra para remover moléculas com alto peso molecular. Incube durante 1 h a 4 ° C, o centrifugador (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) e o filtro através de uma membrana de nitrocelulose de tamanho de poros de 0,22 µm (seringas).
- No software do programador, clique no botão "Executar" para iniciar a cromatografia líquida de análises (LC) com o analisador equipado com uma coluna permutadora de catiões (forma de lítio). Eluir os aminoácidos com buffers de lítio sucessivas para criar um gradiente de pH e um gradiente na concentração de Counter-íons em combinação com um gradiente de temperatura (tabela 2).
- Quantificar os compostos de azoto após derivatização ninidrina por um detector espectrofotométrico a 570 nm (roxo coloração: reação entre um grupo de ninidrina e amina de aminoácidos) e 440 nm (amarelo coloração: reação entre o grupo de ninidrina e imina prolina).
- Realize uma calibração interna de ponto único, usando a solução de referência e norleucina como padrão interno para calcular as concentrações de aminoácidos nas amostras usando o software do fabricante.
3. quantificação dos aminos-ácido Proteinogenic
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Medição do peso seco celular
- Filtro 10 mL da cultura através de um filtro de nitrocelulose (poros tamanho 0,45 µm) que é pré-pesados em um copo de alumínio, utilizando um dispositivo de vácuo. Lave duas vezes com 50 mL de água destilada.
- Coloque o filtro no copo de alumínio e secar em forno de calor a 105 ° C por 48 h (até que não há mais mudança de peso é observada) antes de contra-peritagem o filtro no copo. Calcule a diferença de peso.
- Calcule a média de pelo menos 3 medições independentes para determinar com precisão o peso de pilha seca de cultura de levedura.
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Quantificação do teor de proteínas de células
Nota: A quantificação da fração de proteínas das células é realizada pelo menos em triplicado utilizar pastilhas de célula sem rótulo que foram obtidas conforme descrito na seção 1.3.2.- Extrair proteínas pela adição de 1 mL de solução de DMSO (50% v/v) de pelotas congeladas e incubar a 105 ° C por 1h em forno de calor seco.
- Quantificar o teor de proteínas em extratos de DMSO usando o ensaio colorimétrico bioquímico que se baseia a redução de proteínas de Cu ++ em íons de Cu+ que são ainda mais precipitadas pelo ácido bicinchoninic em um complexo azul (ensaio BCA).
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Determinação das contribuições relativas de aminoácidos em proteínas
Nota: O perfil de aminoácidos proteinogenic é determinado pelo menos em triplicado de pelotas célula sem rótulo (1.3.2.).- Prepare um extracto oxidado, suspendendo o centrifugado em 200 µ l de ácido perfórmico (90% de ácido fórmico, 10% de peróxido de hidrogênio). Incubar por 4 h a 4 ° C e parar a reação pela adição de sulfato de sódio de 33,6 mg.
Nota: A etapa de oxidação é necessária para converter a cisteína e a metionina em metionina sulfona e cisteico ácido, o que será ainda mais quantificar por cromatografia de troca iônica. No entanto, alguns aminoácidos (tirosina, fenilalanina, histidina e arginina) são desnaturados durante o tratamento da oxidação. Por conseguinte, preparam-se dois hidrolisados (com e sem oxidação). - Adicionar 800 µ l de HCl 6N célula pelotas ou oxidado extrato e incubar a amostra em um tubo de vidro hermeticamente fechados para 16 h a 110 ° C em um forno de calor seco. Adicionar 200 µ l de 2,5 mM norleucina e remover HCl com uma corrente de azoto. Lave (resuspending o extrato seco e em seguida, removendo o líquido com um fluxo de nitrogênio), duas vezes com 800 µ l de água destilada e, em seguida, com 800 µ l de etanol. Ocupa-se em 800 µ l de tampão de acetato de lítio 200 mM, pH 2.2.
Nota: Deve ser dada atenção para o tempo de incubação para a hidrólise como alguns aminoácidos não são estáveis em condições ácidas. A fração de triptofano em proteína é estimada a partir de dados encontrados no literatura16, como este aminoácido é inteiramente desnaturado durante a hidrólise de HCl. - Prepare um hidrolisado-padrão para a calibração interna de ponto único. Adicione 160 µ l de uma solução comercial de aminoácidos hidrolisados a 840 µ l de tampão de acetato do lítio 200 mM, pH 2.2, que contém 625 sulfona de metionina µM, 625 de ácido cisteico µM e 625 norleucina µM.
- Determine a concentração relativa de aminoácidos em proteínas usando o método cromatográfico, descrito na seção 2.2.
- Prepare um extracto oxidado, suspendendo o centrifugado em 200 µ l de ácido perfórmico (90% de ácido fórmico, 10% de peróxido de hidrogênio). Incubar por 4 h a 4 ° C e parar a reação pela adição de sulfato de sódio de 33,6 mg.
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Cálculos
- Calcule a percentagem de peso de cada aminoácido em proteínas, dividindo a quantidade medida de cada aminoácido (mg/L) pela quantidade total de ácido aminado que foi medido no extracto de proteína (soma em mg/L).
- Multiplica esse percentual pela concentração de proteínas em cultura (mg/L), ou seja, o produto entre o teor de proteína da biomassa e o peso seco, para avaliar a concentração de cada aminoácido proteinogenic na cultura (mg/L).
4. medida de enriquecimento isotópico de aminos-ácido Proteinogenic
Nota: Para a medição de enriquecimento isotópico de aminos-ácido proteinogenic, use as célula rotulada de Pelotas. Três agentes diferentes são usados para a etapa de derivatização para quantificar o enriquecimento isotópico de aminoácidos. As intensidades de íons de cluster são medidas para estimar os padrões de rotulagem dos aminoácidos. O sinal de cada íon de cluster corresponde a abundância de isotopomers a massa (m0 = sem rotulagem, m+ 1 = 1 átomo rotulado,...) de um fragmento de ácido aminado. Um exemplo de um cromatograma é obtida após o procedimento DMADMF é fornecido na Figura 2.
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Hidrólise de biomassa
- Hidrolise as pelotas de célula (correspondendo a 1-2 mg de biomassa seca) adicionando 1,2 mL de 6 M de HCl e incubar a amostra para 16 h a 105 ° C em tubos de vidro hermeticamente fechado em um forno de calor seco.
- Adicione 1,2 mL de água destilada e centrifugação a 3.000 x g por 5 min remover restos celulares. Distribua o sobrenadante em frações de 6 400 µ l em tubos de vidro aberto. Seque as frações em um forno de calor a 105 ° C até atingir a consistência de xarope (4-5h).
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Derivatização de Ethylchloroformate (ECF)
- Dissolver o hidrolisado secado em 200 µ l de 20mm HCl; em seguida, adicione o µ l 133 de piridina: etanol (1:4). Adicione 50 µ l de ECF para derivatize os aminoácidos e esperar até que todos os CO2 foi lançado. Transfira a mistura para centrifugar os tubos que contêm 500 µ l do diclorometano para extrair os pyrazole compostos.
- Vórtice os tubos durante 10 s e centrifugar por 4 min a 10.000 g x; recolha a fase orgânica inferior, com uma pipeta Pasteur e transferência para os frascos de GC que contêm inserções de vidro cônico, de modo que as amostras podem ser injetadas diretamente dentro do instrumento de GC/MS.
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(N, N)-derivatização de acetal (DMFDMA) de dimetil dimetilformamida.
- Dissolva o hidrolisado secado em 50 µ l de metanol e 200 µ l de acetonitrilo. Adicione 300 µ l de DMFDMA. O tubo de vórtice e transferência as amostras para mostruário de GC frascos que contêm inserções de vidro cônico.
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N, derivatização de trifluoroacetamide (BSTFA) O-Bis (trimetilsilil)
- Suspenda o hidrolisado em 200 µ l de acetonitrilo. Acrescente 200 µ l de BSTFA, fechar hermeticamente o tubo de vidro e incube por 4 h a 135 ° C antes de transferir o extrato diretamente para frascos de GC.
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Análise por CG-em
- Analise amostras com um cromatógrafo de gás que está equipado com um injector de mostruário e é acoplado a um espectrômetro de massa.
- Utilize software específicos para o instrumento de controle e analisar os cromatogramas. No menu "Sequence", clique na "tabela de Log de exemplo" para criar a lista de exemplo e clique no botão "Executar" para iniciar as injeções.
Nota: O cromatógrafo a gás é equipado com uma coluna capilar de sílica 30 m x 0,25 mm apolar com uma espessura de película 0,15 μm. Temperatura do espectrômetro de massa quadrupolo a 150 ° C e mantenha a linha de transferência a 250 ° C para todas as análises. Três programas analíticos, cada um específico para cada agente de derivatização, são usados. - Derivados ECF: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 230 ° C e que da origem a 250 ° C. Programe o mostruário para injetar 1 µ l de amostras com uma relação de divisão de 3:1. Executar as análises, aumentando gradualmente a temperatura do forno da seguinte forma: 130 ° C por 3 min; gradiente de 15 ° C/min a 260 ° C; manter a temperatura a 260 ° C por 20 min.
- Derivados DMFDMA: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo constante de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 230 ° C e que da origem a 250 ° C. Programe o mostruário para injetar 1 µ l de amostras com uma relação de divisão de 3:1. Executar as análises, aumentando gradualmente a temperatura do forno da seguinte forma: 60 ° C, durante 1 min; gradiente de 20 ° C/min até 130 ° C; segundo gradiente de 4 ° C/min a 260 ° C; manter a temperatura a 260 ° C por 10 min.
- Derivados BSTFA: Uso de hélio como fase móvel com um fluxo constante de 1,2 mL/min. Regule a temperatura da entrada a 275 ° C e que da origem a 300 ° C. Executar as análises (injeção: 1 µ l), gradualmente aumentando a temperatura do forno da seguinte forma: 110 ° C por 1 min; primeiro gradiente de 2 ° C/min a 154 ° C; segundo gradiente de 5 ° C/min até 300 ° C; manter a temperatura de 300 ° c por 10 min.
- Procedimento deteção: Para cada modo de derivatização, injetar uma amostra (1 µ l) em modo de varredura com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV e tomar nota do tempo de retenção de cada aminoácido.
- Usar esses valores para definir as janelas de tempo ao longo do cromatograma e de íons de diferentes selecionados, que são característicos de cada aminoácido e listados na tabela 3; esses valores devem ser incluídos para cada aminoácido. Incluir esta informação no programa SIM deteção e executar as análises no modo SIM com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV.
- Utilize software específicos para o instrumento de controle e analisar os cromatogramas. No menu "Sequence", clique na "tabela de Log de exemplo" para criar a lista de exemplo e clique no botão "Executar" para iniciar as injeções.
- Coletar os resultados das análises; ou seja, para cada aminoácido, grave um cluster de intensidades que correspondem a seus diferentes isotopomers em massa. Processar os dados usando o dedicatedsoftware17 para corrigir para a rotulagem natural e calcular o enriquecimento isotópico dos aminoácidos proteinogenic (definido como a fração rotulada de um aminoácido com relação a sua quantidade total da proteína amostras).
Nota: O enriquecimento isotópico de uma molécula (ou seja), expressos em percentagem, é calculada dividindo a soma das intensidades corrigidas da massa isotopomers com rotulagem (m1, m2,.... mn) pela soma do corrigido intensidades de todas as isotopomers em massa (m0, m1, m2,... m,n):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + m,n)
- Analise amostras com um cromatógrafo de gás que está equipado com um injector de mostruário e é acoplado a um espectrômetro de massa.
5. quantificação e enriquecimento isotópico de compostos voláteis
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Extração de compostos voláteis rotuladas
- Adicionar 10 µ l de deuterado padrões internos para 5 mL do sobrenadante (concentração final de compostos deuterados: 100 µ g/L) em um tubo de vidro de 15 mL. Adicionar 1 mL de diclorometano, firmemente fechar os tubos e agitá-los em uma plataforma de balanço de 20 min. centrifugar por 5 min a 3.000 x g e recolher a fase orgânica inferior em um tubo de vidro de 15 mL. Repeti a extracção de diclorometano.
- Seque o extrato orgânico mais de 500 mg de sulfato de sódio anidro e recolher a fase líquida, com uma pipeta Pasteur. Concentrar o extrato por um fator de quatro sob fluxo de nitrogênio e transferir para um frasco de mostruário de GC.
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GC-MS quantificação de compostos voláteis
- Equipar o cromatógrafo a gás com uma coluna capilar de sílica fundida de 30 m x 0,25 mm com 0,25 μm de espessura de filme e aplicar um fluxo constante de hélio de 1,0 mL/min. Segure o injetor e a linha de transferência a 250 ° C.
- Injectar 2 µ l da amostra com uma relação de divisão de 10:1 e separar as moléculas voláteis extraídas usando o seguinte perfil de temperatura do forno: manter a temperatura por 3 min a 40 ° C, aumentar até 4 ° C/min até 220 ° C e mantenha o forno a 220 ° C por 20 min.
- Detectar os compostos usando um espectrômetro de massa com sua temperatura de origem definido a 230 ° C e sua temperatura de espectrômetro de massa quadrupolo fixado em 150 ° C. Grave os espectros de massa no modo de monitoração de íon selecionado (SIM) com ionização de elétron positivo impacto em 70 eV e utilizando os clusters de íons específicos para os compostos voláteis que são relatados na tabela 4.
- Use uma calibração externa de 7 pontos para quantificar as concentrações de moléculas voláteis das somas das intensidades do cluster do íon correspondente. Prepare Soluções conservadas em estoque de cada composto (10 g/L) em 100% de etanol. Então, prepare-se soluções-padrão para cada classe de moléculas voláteis (ésteres, acetatos, ácidos e álcoois), misturando as soluções. Finalmente, dilua a quantidades diferentes das soluções-padrão em uma solução hidroalcoólica de 12% contendo 5 g/L ácido tartárico com o pH ajustado para 3.3 para preparo de soluções de calibração.
- Em paralelo, corrigir para a rotulagem natural das intensidades de cada cluster de íon e calcular o enriquecimento isotópico de compostos voláteis, que é definido como a fração rotulada das moléculas e é expresso como uma porcentagem usando o software dedicado 17.
6. cálculos para uma análise integrada do conjunto de dados
-
Recolha dos dados brutos
- Usando as planilhas mostradas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, Insira os valores de dados brutos que correspondem à concentração dos aminoácidos extracelulares, peso seco de célula, teor de proteínas das células, a concentração de moléculas voláteis e isotópica enriquecimento dos aminos-ácido proteinogenic e moléculas voláteis.
Nota: Os dados mostrados nas tabelas são expressas em mM. Todos os resultados também são expressos em mg/L, multiplicando-se os valores em mM pelo peso molecular de cada molécula ou em mg N/L multiplicando a concentração milimolar de um amino-ácido proteinogenic a massa atômica do nitrogênio (14 u) e pelo número de ato de nitrogênio MS que são fornecidos pelo catabolismo desta molécula. - Calcule a percentagem em massa de cada aminoácido em proteínas dividindo sua quantidade em mg/L no hidrolisado pela quantidade total de aminoácidos (sua soma em mg/L).
- Calcule significa, desvios-padrão e erros-padrão da média a partir dos dados obtidos nos experimentos independentes.
- Calcular a concentração de proteinogenic (mg/L) para cada aminoácido multiplicando-se o percentual deste aminoácido em proteínas (mg aa/g de proteínas), a fração de proteína na biomassa (g proteínas/g DW) e o resíduo seco (produção de biomassa), na médio (g DW/L).
- Usando as planilhas mostradas nas tabelas 5, 6, 7 e 8, Insira os valores de dados brutos que correspondem à concentração dos aminoácidos extracelulares, peso seco de célula, teor de proteínas das células, a concentração de moléculas voláteis e isotópica enriquecimento dos aminos-ácido proteinogenic e moléculas voláteis.
-
15 Experimentos de traçador isotópico N
- Usando as planilhas que são apresentadas na tabela 9, calcular as frações sem rótulo e rotuladas de nitrogênio que estão presentes em aminoácidos proteinogenic (expressos em mg N/L) de suas concentrações totais (expressas em mg de N/L) e suas isotópicos avanços. Para cada aminoácido, rotulada fração corresponde ao produto entre a sua concentração total e seu enriquecimento isotópico, e a parte sem rótulo é a diferença entre o total e os montantes rotulados.
- Em seguida, determinar a fração de nitrogênio total em proteínas contido em aminoácidos proteinogenic quantificados neste estudo soma o montante total da Ala Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, dele, Glu e Arg (em mg N/L) e o total, dividindo um Monte do nitrogênio contido nas proteínas por este montante.
- Calcular o nitrogênio fornecido por arginina, glutamina ou amónia que foi recuperada nos ácidos proteinogenic quantificados neste estudo, somando-se a fração rotulada (em mg N/L) de aminos-ácido proteinogenic que foram quantificados no estudo (Ala Gly, Val, Asp, PHE, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, dele, Glu e Arg) durante experimentos na presença de 15N-rotulado de arginina, glutamina, ou de amónio e dividindo esta fração de nitrogênio rotulados pela quantidade total de azoto no proteinogenic quantificado amino ácidos.
- Avalie a contribuição dos 3 aminoácidos mais abundantes para o pool intracelular de nitrogênio utilizado para a biossíntese de novo combinando dados do 13C e experimentos de traçador de isótopo de 15N (planilha na tabela 7).
- Do montante total (expressado em milímetros) de proteinogenic Val, Leu, Ile ou Thr, deduzir a parte derivada da incorporação direta de compostos consumidos (13C experimentos) e a parte que foi synthetized de novo usando nitrogênio do 3 principais fontes a fim de avaliar a fração que foi synthetized de novo usando nitrogênio de outros aminoácidos.
- Em seguida, calcular a razão entre a quantidade de aminoácido de novo synthetized usando nitrogênio fornecido por Gln, Arg e NH4+ (soma expressada em mM) a quantidade total de proteinogenic aminoácidos (em mM) para quantificar a contribuição de arginina, glutamina e amónio para o pool de nitrogênio intracelular.
-
13 C experimentos de traçador isotópico
- Calcular as frações etiquetadas e sem rótulo dos aminoácidos proteinogenic das concentrações expressados em mM e avanços isotópicos dos aminos-ácido proteinogenic que foram obtido durante experimentos na presença de 13C-rotulado Leu, Val, Ile ou Thr. (ver 6.2.1, quadro 10).
- Calcular as frações sem rótulo e rotuladas de compostos voláteis de concentrações expressados em mM e avanços isotópicos de compostos voláteis que foram obtidos durante experimentos na presença de 13C-rotulado Leu, Val, Ile ou Thr ( Tabela 10).
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Representative Results
A Figura 3 apresenta um diagrama de fluxo de trabalho que foi implementado para investigar a gestão pelo fermento de várias fontes de nitrogênio que são encontrados durante a fermentação do vinho.
Para diferentes pontos de amostragem, as características de parâmetros – crescimento biológico, padrões de consumo de nitrogênio e o perfil de aminoácidos, proteinogenic demonstrará uma grande reprodutibilidade entre fermentações (Figura 4). Essa consistência valida a relevância da abordagem baseada na combinação de dados que foram gerados durante um conjunto de 14 fermentações independentes.
A Figura 5 mostra uma visão abrangente da redistribuição do nitrogênio de fontes que estão disponíveis no suco de uva para todos os aminoácidos proteinogenic. Esta análise é suportada principalmente pelos resultados que foram obtidos a partir de experiências realizadas na presença de compostos N-rotulado de 15. Combinado com a determinação dos saldos em massa e isotópicas, a medição do enriquecimento isotópico dos aminos-ácido proteinogenic forneceu a primeira quantificação da contribuição de nitrogênio-originado de arginina, glutamina, amónio e outros fontes para os grupos amina de cada um destes compostos. A redistribuição importante de nitrogênio que é sublinhada aqui reflete o papel substancial da síntese de novo de aminoácidos em sustentar o crescimento de levedura.
Além disso, este estudo, comparando os montantes dos compostos rotulados em proteínas com seu consumo, permite que a fração de moléculas de N-contendo consumidas diretamente incorporados nas proteínas quando entram as células para ser avaliado. Proteinogenic aminoácidos são diferenciados de acordo com seu nível de incorporação directa na biomassa; alguns deles são exclusivamente (Asp, Glu) ou mais do que 80% de novo synthetized, enquanto apenas pequenas quantidades de outros compostos são gerados pela síntese de novo . Curiosamente, este último grupo inclui lisina e histidina, que são os aminoácidos único em que todas as fontes consumidas diretamente são incorporadas.
Figura 5B apresenta também, para alguns aminoácidos, uma comparação entre a quantidade consumida aminoácido que é recuperado diretamente para a biomassa, calculada a partir de dados obtidos em experimentos de 15N-rotulagem e medido experimentalmente em 13 C-rotulagem de experimentos. As pequenas diferenças entre estes valores mostram a confiabilidade e a robustez da abordagem que foi implementada neste estudo.
A Figura 6 mostra um exemplo de quantitativos de particionamento (rácios) de fluxos através de vias metabólicas que foi obtido através da implementação do fluxo de trabalho relatado neste trabalho. Este mapa foi elaborado, combinando informações de experiências de traçador isotópico utilizando substratos de 15N - e 13C-etiquetadas e descreve o particionamento dos consumido aminoácidos alifáticos na rede metabólica envolvida na valina e biossíntese de leucina no fermento (para cálculos, consulte a tabela 1 e tabela 2). Medindo-se a produção e o enriquecimento isotópico de aminos-ácido proteinogenic e compostos voláteis, avaliamos a quantidade destes compostos que foram synthetized de pilares carbono consumido U-C13- valina e U-C13- leucina, que corresponde a fração rotulada dos compostos. Posteriormente, fomos capazes de determinar a contribuição da CCM para sua formação (a fração sem rótulo dos compostos). Saldos em massa de carbono configurar usando o fluxo de trabalho e o procedimento de cálculo proposto aqui mostram que mais de 96% do consumido valina e leucina são recuperados em seus produtos de conversão, ou seja, proteinogenic leucina e valina e volátil superior álcoois. Este achado confirma a adequação da abordagem relatada para estudos quantitativos do metabolismo. A análise integrada e abrangente do conjunto de dados oferece novos insights no destino dos aminoácidos consumidos. Surpreendentemente, uma fração substancial de valina e leucina são catabolizado apesar de um considerável desequilíbrio entre a disponibilidade destes compostos no meio e seu conteúdo em biomassa. No entanto, a fração de N-compostos exógenos diretamente incorporada as proteínas depende da natureza do aminoácido. Outro ponto-chave diz respeito a origem metabólica dos aminos-ácido proteinogenic e moléculas voláteis. A análise do padrão de criação de etiquetas de C 13de proteinogenic leucina e valina revela que o esqueleto de carbono destes ácidos aminados vem principalmente de precursores, que foram synthetized através do CCM. Em consonância com esta observação, a baixa incorporação de rotulagem em isobutanol e isoamílico álcool demonstra o envolvimento muito limitado do catabolismo de valina e leucina que foram consumidos pelo fermento na formação destes álcoois superiores.
Figura 1. Robótico sistema automatizado para monitoramento da elevado-produção fermentações. (A) plataforma robótica. Fermentadores (a) são colocados em guias de suporte magnético agitação placas (b). Uma cortina de luz de segurança (c) protege os usuários. Um braço robótico (d) move os fermentadores sucessivamente da sua localização em um dos 6 mexendo pratos de uma balança de precisão (e) no lado esquerdo da mesa de trabalho, para medir o peso a cada 4 horas. A plataforma robótica está localizada em uma sala com temperatura controlada. (B) representação esquemática da arquitetura de software. Uma interface gráfica permite que os usuários definir as configurações de experimentais. Esta informação é transmitida para o aplicativo de controle que controla o braço robótico e registra o peso diferente em arquivos diferentes data.xlm cru (1 arquivo/fermentação). O software para cálculo de coleta os arquivos xlm e calcula, para cada ponto de tempo, a quantidade de CO2 que é lançado (expressado em g/L), que é proporcional à quantidade de açúcares que tenham sido consumidas em seu tempo e a taxa de fermentação, que corresponde à taxa de produção de CO2 , em g de CO2/L/h (proporcional à taxa de consumo de açúcar). Dados são armazenados em um banco de dados relacional e visualizadas usando uma interface gráfica dedicada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise por CG-em dos aminos-ácido proteinogenic: exemplo de alanina. (A) cromatograma obtido após derivatização de aminos-ácido proteinogenic usando DMFDMA. (B) espectros de alanina pyrazole de massa. Dois picos principais que correspondem aos fragmentos com m0/z = 99 e m0/z = 158. (C) reação de derivatização de alanina com DMFDMA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Fluxo de trabalho para a análise quantitativa do metabolismo de nitrogênio múltiplas fontes pelo fermento. Este processo inclui fermentações (i) um conjunto de 28 (7 fontes de nitrogênio e fermentações com ou sem compostos de azoto em duplicado); (ii) uma parte analítica que envolve vários procedimentos de extração e derivatização de moléculas e análises HPLC ou GM-MS e (iii) processamento de dados brutos e uma análise integrada de conjuntos de dados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Reprodutibilidade dos parâmetros biológicos de um conjunto de fermentações independentes. (A-B) Os valores médios e desvios-padrão do peso seco e o teor de proteínas que foram obtidos a partir da 14 fermentações independentes executadas utilizando compostos sem rótulo. (C-D) Os valores médios e desvios-padrão de proteinogenic e consumidos aminoácidos que foram medidos durante 14 fermentações independentes executadas utilizando compostos sem rótulo. Produção de CO2 : 5 (verde), 10 (azul), 40 (rosa) e 90 (roxo) g/L. , por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Redistribuição do nitrogênio de três fontes principais de nitrogênio para aminoácidos proteinogenic durante a fermentação. (A) origem metabólica dos aminos-ácido proteinogenic: direto de incorporação da contraparte consumido (azul) e síntese de novo usando nitrogênio fornecido pelo consumido arginina (laranja), glutamina (verde), amônio (rosa) ou outros (de aminoácidos roxo). Expresso como uma percentagem do montante total de cada amino-ácido proteinogenic. (B) comparação entre a quantidade de aminoácidos consumidos (azul) e a parte do aminoácido consumida que é diretamente recuperado em proteínas, calculado a partir dos dados obtidos em experimentos de traçador 15N (roxos) ou experimentalmente medidos durante a fermentação com 13C-rotulado moléculas (rosa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Análise quantitativa de valina e leucina metabolismo. Particionamento de (verde) consumida leucina e valina (azul) através da rede metabólica quando 40 g/L de CO2 são produzidos. As barras são proporcionais a quantidade de cada composto e são expressas em µM, incluindo a fração que foi synthetized do metabolismo de carbono central (laranja). Valores na fonte normal: quantidade em µM; valores na fonte em itálico: percentagem de consumidos valina (azul) ou leucina (verde) que foi catabolizada através da via. Os cálculos são fornecidos na tabela 1 e tabela 2. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Compostos | Quantidade por litro |
| Glicose C6H12O6 | 240 g |
| Ácido málico C4H6O5 | 6 g |
| Ácido cítrico C6H8O7 | 6 g |
| Fosfato de potássio KH2PO4 | 0,75 g |
| Sulfato de potássio K2SO4 | 0,5 g |
| Sulfato de magnésio MgSO4, 7 H2O | 0,25 g |
| Cloreto de cálcio CaCl2, 2 H2O | 0,155 g |
| Cloreto de sódio NaCl | 0,2 g |
| Mio-inositol | 20 mg |
| Pantotenato de cálcio | 1,5 mg |
| Cloridrato de tiamina | 0,223 mg |
| Ácido nicotínico | 2 mg |
| Piridoxina | 0,25 mg |
| Biotina | 0,003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| O ZnSO4·7H2 | 4 mg |
| O CuSO4·5H2 | 1 mg |
| O CoCl2·6H2 | 0,4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterol | 3,75 mg |
| Ácido oleico | 1,25 Μ l |
| Tween 80 | 125 Μ l |
| Tirosina | 8,6 mg |
| Triptofano | 84,4 mg |
| Isoleucina | 15,4 mg |
| Aspartato de | 20,9 mg |
| Glutamato | mg 56,7 |
| Arginina | mg 176,2 |
| Leucina | 22,8 mg |
| Treonina | 35,7 mg |
| Glicina | 8,6 mg |
| Glutamina | mg 237,8 |
| Alanina | 68,4 mg |
| Valina | 20,9 mg |
| Metionina | 14,8 mg |
| Fenilalanina | 17,9 mg |
| Serina | 37,0 mg |
| Histidina | 15,4 mg |
| Lisina | 8,0 mg |
| Cisteína | 6,2 mg |
| Prolina | 288,3 mg |
| Amoníaco cloreto NH4Cl | 220 mg |
| O pH do meio foi ajustado para 3.3 com NaOH 10 M. | |
Tabela 1. Composição do meio sintético utilizado neste estudo. Este meio quimicamente definido imita a composição do suco de uva.
| Tampão de eluição | Temperatura | |
| De 0 a 6 min | Citrato de lítio, 200 mM, pH 2.8 | 32 ° C |
| De 6 a 38 min | Citrato de lítio, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| De 38 a 57 min | Citrato de lítio, 500 mM, pH 3.15 | 64,5 ° C |
| De 57-83 min | Citrato de lítio, 900 mM, pH 3.5 | 75 ° C |
| De 83 a 120 min | Citrato de lítio, 1650 mM, pH 3,55 | 75 ° C |
| De 120 a 130 min | Hidróxido de lítio, 300 mM |
Tabela 2. Condições utilizadas para a separação de aminoácidos por cromatografia de troca iônica. Buffers de eluição com aumento das concentrações de sal são usados sucessivamente em combinação com um gradiente de temperatura para permitir a separação dos aminoácidos.
| Os aminoácidos | Derivatizing reagente | RT (min) | Clusters de íon (m/z) |
| Alanina | ECFum | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glicina | ECFum | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFum | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 144, 145, 146 | |
| Valina | ECFum | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucina | ECFum | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucina | ECFum | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Treonina | ECFum | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFum | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serina | ECFum | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFum | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolina | ECFum | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartato de | ECFum | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamato | ECFum | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanina | ECFum | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lisina | ECFum | 11,95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidina | ECFum | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginina | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| um ECF, cloroformiato de etila; b DMFDMA (N, N)-acetal de dibutilo dimetilformamida; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tabela 3. Parâmetros analíticos utilizados para a determinação dos avanços isotópicas de aminoácidos usando o íon selecionado monitoramento modo (SIM). Esta tabela resume os agentes químicos utilizados para derivatização, tempo de retenção do pyrazole compostos e o aglomerado de íons obtidos em MS (modo de impacto de elétrons) para cada aminoácido.
| Os aminoácidos | Derivatizing reagente | RT (min) | Clusters de íon (m/z) |
| Alanina | ECFum | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glicina | ECFum | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFum | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 144, 145, 146 | |
| Valina | ECFum | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucina | ECFum | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucina | ECFum | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFum | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFum | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serina | ECFum | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFum | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolina | ECFum | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartato de | ECFum | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamato | ECFum | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanina | ECFum | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lisina | ECFum | 11,95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidina | ECFum | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginina | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Tabela 4. Parâmetros analíticos utilizados para a determinação dos avanços isotópicas e quantificação de compostos voláteis utilizando o íon selecionado monitoramento modo (SIM). Esta tabela resume o tempo de retenção e o aglomerado de íons obtidos em MS (modo de impacto de elétrons) para cada composto volátil.
Tabela 5. Processamento de dados brutos obtidos a partir da quantificação dos resíduos de aminoácidos Dataset contém dados de medições da iniciais e residuais de aminoácidos. Esses valores são usados para calcular a quantidade de aminoácidos consumidos (por subtração). Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 6. Processamento de dados brutos obtidos a partir da quantificação dos aminos-ácido proteinogenic. Esse conjunto de dados contém dados sobre a composição em aminoácidos de hidrolisados de biomassa (A) e a fração de proteínas na biomassa (B). Esses valores são usados para avaliar a percentagem em massa de cada aminoácido em proteínas (C). Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 7. Aminos-ácido Proteinogenic. Esta planilha é usada para calcular a concentração da proteinogenic aminoácidos de dados resumidos na tabela 5 e tabela 6(em mM). Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Quadro 8. Processamento de dados brutos obtidos a partir da quantificação dos alcoóis superiores. Conjunto de dados inclui dados de medições das concentrações de compostos voláteis (A) e converte os dados expressados em unidades de mg/L para µM (B). Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Tabela 9. Processamento de dados brutos obtidos de determinação de avanços isotópicas dos aminos-ácido proteinogenic usando 15N-rotulado de substratos.
Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
Quadro 10. Processamento de dados brutos obtidos de determinação de avanços isotópicas dos aminos-ácido proteinogenic e compostos voláteis usando 13C-rotulado de substratos.
Médias e desvios-padrão são calculados para cálculos ainda mais. Clique aqui para baixar esta tabela.
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Discussion
Quantificar o particionamento de compostos através de redes metabólicas usando experimentos traçador isotópico é uma abordagem promissora para a compreensão do funcionamento do metabolismo microbiano. Esta metodologia, quando aplicada com êxito com um ou dois substratos rotulados, atualmente não pode ser implementada para estudar o metabolismo de várias fontes usando vários isótopos elementais rotulados (ou seja, mais de dois substratos). Com efeito, as técnicas analíticas disponíveis permitem a determinação precisa dos padrões de rotulagem dos aminos-ácido proteinogenic e moléculas exclusivamente quando usando isótopos de um elemento único e possivelmente quando co etiquetando com dois elementos. Por conseguinte, para resolver essas limitações e avaliar a gestão de múltiplas fontes de nutrientes por microorganismos, optou-se por repetir um conjunto de culturas sob as mesmas condições ambientais ao rotular um substrato selecionado com 13C ou 15 Isótopos N. Então, ainda mais combinação da informação específica que é fornecida por cada 13C ou experiência de traçador de 15N oferece uma vista de estendido quantitativa do metabolismo de várias fontes.
A realização da abordagem relatada baseia-se na implementação de uma série podem ser reproduzida de culturas em condições padrão e a recolha de amostras de uma população de células em um estado fisiológico definido que é a mesma para todas as culturas (célula crescimento, consumo de substrato, etc.). Estas condições devem ser satisfeitas para que os dados obtidos de experimentos independentes podem ser misturados e analisados em conjunto. Satisfazer essas restrições requer precisos e frequente monitoramento da atividade microbiana que foi realizada, no trabalho experimental relatou aqui, usando um sistema de robô-assistida para monitoramento on-line de atividade de fermentação de leveduras. No entanto, os métodos mais convencionais para cultivo de microorganismos e monitoramento, tais como a determinação do crescimento celular, através da medição da densidade óptica, podem ser usados para normalizar o processo de amostragem.
Outro pré-requisito para a realização desta metodologia é ter uma visão clara das vias metabólicas envolvidas na rede para ser investigado. Este conhecimento é essencial para escolher o conjunto de substratos rotulados que são as mais apropriadas para lidar com o assunto a ser estudado. Os compostos rotulados, bem como a natureza e a posição da rotulagem (13C, 15N ou outros) dentro das moléculas devem ser selecionados adequadamente a fim de) recuperar todas as etiquetas fornecidas pelos substratos nos compostos derivados de suas catabolismo e são ainda mais analisaram no procedimento e ii) obter dados redundantes que demonstram a precisão da metodologia e a validade das conclusões. O procedimento descrito aqui também inclui um número importante de análises que pode ser demorada e dispendiosa em recursos humanos e financeiros. Além disso, algumas restrições analíticas podem limitar o uso desta metodologia. Primeiro, os usuários devem assegurar que todos os métodos analíticos que são necessários para a quantificação dos compostos produzidos durante o metabolismo microbiano e para a determinação do seu enriquecimento isotópico estão disponíveis. Em segundo lugar, esta abordagem só se aplica para avaliar o metabolismo de substratos para que todos a conversão de compostos são produzidos em quantidades suficientes para ser quantificado com precisão.
Neste trabalho, nós aplicamos este fluxo de trabalho para explorar a gestão de várias fontes de nitrogênio de levedura durante a fermentação do vinho. Este relatório ofereceu novos insights sobre o metabolismo de levedura, incluindo o substancial catabolismo de aminoácidos mais consumidos, combinada com sua baixa incorporação directa em proteínas e o importante contributo do CCM para fornecer precursores que é mais utilizado para tanto a síntese de novo dos aminos-ácido proteinogenic e a formação de moléculas voláteis.
De maneira geral, a abordagem descrita aqui pode ser usada para quantificar o particionamento de vários substratos através da rede metabólica de qualquer microorganismo. Permitirá que os investigadores para elucidar o destino de todos os compostos consumidos depois entram as células e abordar a identificação da origem metabólica dos precursores e produtos. Esta informação pode ser útil para comparar a atividade metabólica das variedades que têm diferentes origens genéticas ou crescem em condições diferentes e, consequentemente, para a concepção de estratégias racionais para melhorar os processos de fermentação.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin e Jean-Marie Sabalyrolles, contribuir para a concepção do sistema de fermentação assistida por robótica e Martine Pradal, Nicolas Bouvier e Pascale Brial pelo apoio técnico. Financiamento para este projeto foi fornecido pelo Ministère de Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
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