Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein experimentelles Verfahren, um den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen quantitativ und umfassend zu untersuchen. Dieser Workflow, basierend auf einer Kombination von isotopischen Tracer Experimente und ein Analyseverfahren ermöglicht das Schicksal der konsumierten Nährstoffe und die metabolische Herkunft der Moleküle können durch Mikroorganismen bestimmt werden.
Abstract
Studien auf dem Gebiet der Mikrobiologie verlassen sich auf die Umsetzung einer Vielzahl von Methoden. Insbesondere trägt die Entwicklung geeigneter Methoden wesentlich zur bietet umfangreiche Kenntnisse des Stoffwechsels von Mikroorganismen in chemisch definierten Medien mit einzigartigen Stickstoff und Kohlenstoffquellen wachsen. Im Gegensatz dazu bleibt die Verwaltung durch den Stoffwechsel von mehreren Nährstoffquellen, trotz ihrer breite Präsenz in natürlichen oder industriellen Bereichen nahezu unerforscht. Diese Situation ist vor allem der Mangel an geeigneten Methoden, der Ermittlungen zu behindern.
Wir berichten über eine experimentelle Strategie, quantitativ und umfassend zu erforschen wie Stoffwechsel funktioniert, wenn eine Nährstoff als eine Mischung aus verschiedenen Moleküle, d. h., eine komplexe Ressource bereitgestellt wird. Hier beschreiben wir die Anwendung für die Beurteilung der Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff durch die Hefe metabolischen Netzwerkes. Der Workflow kombiniert bei stabiler Isotope Tracers Experimente mit ausgewählten 13C- oder 15N-markierten Substraten. Es besteht zunächst parallel und reproduzierbare Fermentationen in demselben Medium, beinhaltet eine Mischung aus N-haltige Moleküle; ausgewählten Stickstoffquelle ist jedoch jedes Mal beschriftet. Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) erfolgt die Kennzeichnung Muster gezielt Verbindungen zu bewerten und den Verbrauch und die Wiederherstellung von Substraten in anderen Metaboliten zu quantifizieren. Eine integrierte Analyse des kompletten Datensatzes gibt einen Überblick über das Schicksal der verbrauchten Substrate innerhalb der Zellen. Dieser Ansatz erfordert eine genaueste Protokoll für die Sammlung von Proben – erleichtert durch ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen – und die Erreichung der zahlreichen zeitaufwendige Analysen. Trotz dieser Einschränkungen erlaubt es, Verständnis, zum ersten Mal die Partitionierung von mehreren Quellen von Stickstoff in der Hefe metabolischen Netzwerkes. Wir aufgeklärt die Umverteilung von Stickstoff aus reichlicher Quellen gegenüber anderen N-Verbindungen und die metabolische Ursprünge des flüchtigen Molekülen und proteinogene Aminosäuren bestimmt.
Introduction
Verständnis wie mikrobiellen Stoffwechsel funktioniert, ist ein zentrales Thema für die Gestaltung von effizienten Strategien zur Gärungsprozesse zu verbessern und die Produktion von fermentativen Verbindungen zu modulieren. Fortschritte in der Genomik und funktionelle Genomik in den letzten zwei Jahrzehnten weitgehend zur Erweiterung der Kenntnisse über die Topologie des metabolischen Netze in vielen Mikroorganismen beigetragen. Zugang zu diesen Informationen führten zu die Entwicklung von Konzepten, die für einen umfassenden Überblick über die Zellfunktionen1abzielen. Diese Methoden setzen häufig auf eine modellbasierte Interpretation von messbaren Parametern. Diese experimentellen Daten beinhalten einerseits Metabolit Aufnahme und Produktion Preise und auf der anderen Seite quantitative intrazellulärer Informationen, der von Isotop Tracer vorliegt Experimente. Diese Daten liefern wichtige Informationen für den Abzug von der in-Vivo -Aktivität der verschiedenen Bahnen in einem definierten metabolischen Netzwerkes2,3,4. Derzeit verfügbaren analytische Techniken ermöglichen nur die präzise Erkennung von Mustern von Molekülen beschriften, wenn ein Single-Element-Isotop mit und eventuell bei der Beschriftung mit zwei Isotopen Elementen zusammen. Darüber hinaus unter den meisten Wachstumsbedingungen besteht die Kohlenstoffquelle nur aus ein oder zwei Verbindungen. Infolgedessen wurden Ansätze beruhen auf 13C-isotopischen Tracer aus Kohlenstoff Substraten weit verbreitet und erfolgreich eingesetzt, um entwickeln ein umfassendes Verständnis der Kohlenstoff metabolischen Netzwerkes Operationen5,6,7 ,8.
Im Gegensatz dazu in vielen natürlichen und industriellen Umgebungen, die verfügbarer Stickstoff-Ressource, die mikrobielles Wachstum unterstützt oft eine Vielzahl von Molekülen besteht aus. Zum Beispiel wird während der Gärung von Wein oder Bier, Stickstoff als eine Mischung aus 18 Aminosäuren und Ammonium bei variablen Konzentrationen9bereitgestellt. Dieses Array von N-Verbindungen, die zugänglich für Anabolismus sind macht diese komplexe Medien Bedingungen erheblich unterscheiden sich von denen üblicherweise für physiologische Untersuchungen, wie Letzteres erreicht werden mit einer einzigartigen Quelle von Stickstoff, in der Regel Ammonium.
Alles in allem verinnerlicht Stickstoff Verbindungen können direkt integriert in Proteine oder catabolized. Die Netzwerkstruktur des Stickstoff-Stoffwechsels in vielen Mikroorganismen, einschließlich der Hefe Saccharomyces Cerevisiae, ist sehr komplex, im Einklang mit der Vielfalt von Substraten. Schematisch, basiert dieses System auf die Kombination von den zentralen Kern des Stickstoff-Stoffwechsels fußenden von Glutamin, Glutamat und α-Ketoglutarate10,11, Transaminasen und Deaminases katalysiert. Durch dieses Netzwerk Amin Gruppen aus Ammonium oder anderen Aminosäuren werden gesammelt und α-Keto-Säuren freigesetzt. Diese Zwischenprodukte sind auch dazu durch zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel (CCM)12,13. Diese große Anzahl von verzweigten Reaktionen und Zwischenprodukte, beteiligt, der Abbau von exogenen Stickstoff Quellen und Anabolismus proteinogene Aminosäuren, erfüllt die anabole Anforderungen der Zellen. Die Aktivität durch diese miteinander verbundenen Routen führt auch die Ausscheidung von Stoffwechselprodukten. Insbesondere können α-Keto-Säuren umgeleitet werden, durch die Ehrlich Weg, höhere Alkohole und ihre Acetat Ester Derivate14, die wesentliche Mitwirkende zu den sensorischen Profile von Produkten sind zu produzieren. Anschließend spielt Funktionsweise Stickstoff-Stoffwechsel eine Schlüsselrolle bei der Erzeugung von Biomasse und die Bildung von flüchtigen Molekülen (Aroma).
Die Reaktionen, Enzyme und Genen, die im Stickstoff-Stoffwechsel sind in der Literatur ausführlich beschrieben. Jedoch ist die Frage der Verteilung von mehreren Quellen von Stickstoff in einem metabolischen Netzwerk noch nicht angesprochen worden. Es gibt zwei Hauptgründe, die erklären, dieser Mangel an Informationen. Zunächst wichtig angesichts der Stickstoff-Stoffwechsel-Netzwerk, eine große Menge von quantitativen Daten ist erforderlich für ein umfassendes Verständnis ihrer Tätigkeit, die nicht verfügbar war bis jetzt. Zweitens viele experimentelle Einschränkungen und Grenzen der analytischen Methoden verhindert die Umsetzung von Ansätzen, die zuvor für die Aufklärung der CCM-Funktion verwendet wurden.
Um diese Probleme zu überwinden, haben wir einen System-Ebenen-Ansatz zu entwickeln, der auf die Vereinbarkeit von Daten aus einer Reihe von isotopischen Tracer Experimenten basiert. Der Workflow enthält:
-Eine Reihe von Fermentationen durchgeführt, unter gleichen Umweltbedingungen, während eine andere ausgewählte Nährstoffe-Quelle (Substrat) jeweils gekennzeichnet ist.
-Eine Kombination von analytischen Verfahren (HPLC, GC-MS) für eine genaue Bestimmung, in verschiedenen Stadien der Gärung Restkonzentration von beschrifteten Substrat und die Konzentration und die Isotopen Anreicherung von Verbindungen, die von abgeleitet werden der Katabolismus der beschrifteten Molekül, einschließlich abgeleitete Biomasse.
-Eine Berechnung der Masse und Isotopen Waage für jede verbrauchte beschrifteten Molekül und eine weitere integrierte Analyse des Datasets, einen globalen Überblick über die Verwaltung von mehreren Nährstoffquellen durch Mikroorganismen durch die Bestimmung der Flux-Verhältnisse zu erhalten .
Um diese Methode anzuwenden, muss das reproduzierbare Verhalten des Stamm/Mikroorganismus zwischen den Kulturen Aufmerksamkeit geschenkt werden. Darüber hinaus müssen Proben aus verschiedenen Kulturen während der gleichen wohldefinierte Gärung Fortschritt entnommen werden. In der experimentellen Arbeit berichtet in dieser Handschrift dient ein Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung von Fermentationen, um diese Einschränkungen zu berücksichtigen.
Darüber hinaus ist es wichtig, eine Reihe von beschrifteten Substrate (Verbindung, Natur und Position der Beschriftung) zu wählen, die an die wissenschaftliche Fragestellung der Studie geeignet ist. Hier wurden 15N beschriftet Ammonium, Glutamin und Arginin als die drei wichtigsten Stickstoff Quellen gefunden in Traubensaft ausgewählt. Dies ermöglichte es bewerten das Muster der Stickstoff Umverteilung von verbrauchten Verbindungen zu den proteinogene Aminosäuren. Wir wollten auch das Schicksal des Kohlenstoff-Backbones der verbrauchten Aminosäuren und deren Beitrag zur Produktion von flüchtigen Moleküle zu untersuchen. Um zu erreichen dieses Ziel, einheitlich 13C beschriftet Leucin, Isoleucin, Threonin und Valin in der Studie als Aminosäuren gehörten, die wichtige Zwischenprodukte des Ehrlich-Signalwegs abgeleitet sind.
Alles in allem, erkundeten wir quantitativ wie Hefe eine komplexe Stickstoff-Ressource verwaltet, durch eine exogene Stickstoff Quellen zur Erfüllung seiner anabolen Anforderungen während der Gärung beim zusätzlich entfernen das überschüssige Kohlenstoff Grundstoffe als Umverteilung flüchtige Moleküle. Die Versuchsdurchführung berichtet in diesem Papier kann angewendet werden, um andere mehrere Nährstoffquellen verwendet von anderen Mikroorganismus zu untersuchen. Es scheint ein geeigneter Ansatz für die Analyse der Auswirkungen der genetischen Hintergrund oder Umweltbedingungen auf die metabolischen Verhalten der Mikroorganismen zu sein.
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Protocol
1. Gärung und Probenahme
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Erstellung von Medien und Fermenter
Hinweis: Alle die Fermentationen sind parallel mit dem gleichen Stamm und durchgeführt in der gleichen chemisch definiert synthetisches Medium (SM, Zusammensetzung, die in Tabelle 1zur Verfügung gestellt), die enthält einer Mischungaus aus Ammonium und Aminosäuren als Stickstoff15Quellen. Für jede Gärung erfolgt eine einzelne Stickstoff-Verbindung ausschließlich in einem einheitlich beschrifteten 13C oder 15N Form (100 %), während die anderen unbeschriftet bleiben. Für jede beschriftete Stickstoffquelle, die in der Reihe von Experimenten verwendet wird (hier: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), zwei Fermenter werden vorbereitet. Für jede Kondition ist doppelte Gärung mit nur unbeschriftete Moleküle (7 Steuerung Fermentationen) durchgeführt.- Für jede N-Quelle studiert werden, bereiten 500 mL SM beschriftet Medium, das alle Stickstoff-Quellen mit Ausnahme der Verbindung in 100 % verwendet werden in Tabelle 1aufgeführten enthält Form.
Hinweis: Das beschriftete Molekül wird in den nächsten Schritten hinzugefügt. - Pasteurisieren jedes Medium in eine 1 L Flasche (10 min., 100 ° C), enthält einen magnetischen Rührstab. Wiegen Sie die entsprechende Menge an beschrifteten Molekül, die letztendliche Konzentration zu erreichen, die in Tabelle 1 gemeldet wird und in dem Medium auflösen.
- Sterilisieren Sie das Medium mit einem Einweg-Vakuumfiltration System (Cellulose-Acetat-Membran, 0,22 µm). Mit einer sterilen Messzylinder, teilen Sie das Medium zwischen zwei vorsterilisierten Fermenter (250 mL), die enthalten einen magnetischen Rührstab und sind ausgestattet mit Gärung sperren zu vermeiden den Eintrag von Sauerstoff aber können die Freisetzung von CO2.
- Erhitzen Sie die Gärung Kolben 28 ° c indem man sie in der Inkubation Zimmer für 1 Nacht (Temperatur bei 28 ° C).
- Für jede N-Quelle studiert werden, bereiten 500 mL SM beschriftet Medium, das alle Stickstoff-Quellen mit Ausnahme der Verbindung in 100 % verwendet werden in Tabelle 1aufgeführten enthält Form.
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Impfung und Überwachung von Fermentationen
- Wachsen Sie S. Cerevisiae -Stamm in sterilen Röhrchen mit 10 mL YPD Medium bei 28 ° C mit schütteln (150 u/min) für 12 h. Dann 1 mL der YPD Pipettieren preculture und überträgt es auf 10 mL SM Medium (15 mL steriles Röhrchen). Inkubieren Sie die Kultur für 12 h bei 28 ° C mit schütteln (150 u/min).
- Unter Laminar-Flow sammeln eine Vorkultur aliquoten und Quantifizierung der Zellpopulation, die mit einem elektronischen Partikelzähler, das mit einer 100 µm Blende ausgestattet ist. Zentrifugieren Sie der Vorkultur (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) und hängen Sie das Pellet in einem entsprechenden Volumen von sterilem Wasser, eine Endkonzentration von 2,5 x 108 Zellen/mL zu erhalten. Impfen Sie jedem Fermenter mit 1 mL Zellsuspension.
Hinweis: Das Robot-System verwendet, um den Fortschritt der Gärung überwachen ist in Abbildung 1beschrieben. - Bereiten Sie die Gärung-Plattform durch die Installation der Fermenter in den Support-Führern, die richtig auf die 21-Position rühren Platten gelegt und die mitreißende Rate bei 270 u/min eingestellt. Zum Starten der Online-Überwachung von jeder Gärung, starten Sie die Robotersteuerung Anwendung dann klicken Sie auf "Start-Assay" und wählen Sie das Volume Gärung (300 mL) durchgeführt werden.
- Die angezeigten-Schnittstelle erlaubt die Angabe der Anzahl und die Position der Fermenter auf der Plattform. Um sicherzustellen, dass dies der Fall ist, einen Rechtsklick auf die Slot-Position und wählen Sie "aktivieren" Aktivieren der Überwachung des Fermenters befindet sich an dieser Stelle.
- Initialisieren Sie die Berechnungssoftware, dauerhaft auf dem System ausgeführt, bevor Sie beginnen mit dem Gewicht. Klicken Sie auf die Schaltfläche "Initialiser" und bestätigen Sie mit "Ok". Klicken Sie auf die Schaltfläche"Start" der Robotersteuerung Anwendung Gewicht Akquisitionen zu starten.
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Stichprobenverfahren
Hinweis: Für jede Fermenter werden Proben genommen wenn die CO2 -Produktion (auf dem Computer mit der Berechnungssoftware online angezeigte Wert) den gewünschten Sollwert erreicht: 5, 10, 40 und 90 g/L in dieser Studie.-
Stichprobenverfahren für Kulturen mit beschrifteten Verbindungen.
- Zentrifugieren Sie zwei 6 mL Proben (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Speichern Sie und die gefrorenen Überstände in zwei Aliquote bei-80 ° C. Waschen Sie die Pellets zweimal mit 5 mL destilliertem Wasser und Store bei-80 ° C für die Messung von Isotopen Bereicherungen.
- Stichprobenverfahren für Kulturen ohne markierten Verbindungen
- Ernte 10 mL der Kultur, die für trockene Gewichtsermittlung verwendet wird. Pellet-die Zellen von zwei 10 mL Proben durch Zentrifugieren (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Die Pellets zweimal mit 10 mL destilliertem Wasser zu waschen und bei-80 ° C für die Bestimmung von Protein und Aminosäuren-Inhalte zu speichern.
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Stichprobenverfahren für Kulturen mit beschrifteten Verbindungen.
2. Quantifizierung der verbrauchte Stickstoff Quellen
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Enzymatische Bestimmung des restlichen Ammoniak-Konzentrationen
Hinweis: Die Bestimmung des Ammoniak-Konzentration im Überstände erfolgt mit einem kommerziellen Enzymbasis Kit; alle Reagenzien sind vom Hersteller zur Verfügung gestellt.- Bereiten Sie eine standard-Ammoniak-Lösung (61,4 mg/L) durch Auflösen von 25 mg genau gewogen (NH4)2SO4 in einem 100 mL volumetrischen Kolben.
- Um den Anweisungen des Herstellers zu erfüllen, führen Sie eine 1:2 Verdünnung der Proben, die vor der Gärung und bei 5 g/L CO2 freigesetzt wurden. Stellen Sie den pH-Wert der Proben bis ca. 8 durch Zugabe von 1 M KOH. Beachten Sie die zusätzlichen Volumen und bei den Verdünnungsfaktor berücksichtigen.
- In 4 mL Spektrofotometer Küvetten Mix 100 µL Probe (ggf. verdünnt), destilliertes Wasser oder standard Ammoniak-Lösung mit 2 mL Reagenz 1 (0,75 mM ADP und 30 U/mL Glutamat-Dehydrogenase in Puffer pH 7,8) und 500 µL Reagenz 2 (1,3 mM NADH). 15 min bei Raumtemperatur inkubieren und lesen NADH Absorption bei 340 nm (A1).
- Hinzufügen 500 µL Reagenz 3 (60 mM α-Ketoglutarate in Puffer pH 8), die Probe für 20 min bei Raumtemperatur inkubieren und lesen die NADH-Absorption bei 340 nm (A2).
- Berechnen Sie Ammoniak Konzentration verwenden:
CAmmoniak (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)Probe- (0,839 x A1-A2)destilliertem Wasser] - Überprüfen Sie, dass die richtige Konzentration bei der standard-Lösung erzielt wird.
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Chromatographische Bestimmung der verbleibenden Aminosäure-Konzentrationen
Hinweis: Die Bestimmung der Konzentrationen der Aminosäure in Überstände erfolgt über eine spezielle Aminosäure-Analyse-System, das auf Ionenaustausch Chromatographie mit Post Spalte Derivatisierung von N-Verbindungen mit Ninhydrin-, wodurch ihre farbmetrische Erkennung.- Bereiten Sie eine Referenzlösung durch Zugabe von 200 µL einer kommerziellen Mischung aus neutralen und sauren Aminosäuren, 200 µL einer kommerziellen Mischung von basischen Aminosäuren und 200 µL 2,5 mM Glutamin zu 400 µL 200 mM Lithium-Citrat-Puffer, pH 2.2. Diese chemisch definierten Referenzlösung wird als eine Probe behandelt.
- Hinzu kommt 200 µL 25 % (w/V) Sulfosalicylic saure Lösung, die 2,5 mM Norleucin (interner Standard) enthält 800 µL der Probe, Moleküle mit hoher Molmasse zu entfernen. Inkubation für 1 h bei 4 ° C, Zentrifuge (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) und Filter durch ein 0,22 µm Porengröße Nitrozellulose-Membran (Spritzensystem).
- Klicken Sie in der Programmierer Software auf die Schaltfläche "Ausführen" zu beginnen, die liquide Chromatography (LC) Analysen mit dem Analyzer, ausgestattet mit einer Kationenaustausch Spalte (Lithium-Form). Eluieren Sie Aminosäuren mit aufeinanderfolgenden Lithium Puffern erstelle ich einen pH-Gradienten und einen Farbverlauf in Counter Ionenkonzentration in Kombination mit einem Temperaturgradienten (Tabelle 2).
- Quantifizieren der Stickstoffverbindungen nach Ninhydrin-Derivatisierung von einem spektralfotometrische Detektor bei 570 nm (lila Färbung: Reaktion zwischen Ninhydrin- und Amin Gruppe von Aminosäuren) und 440 nm (gelbe Färbung: Reaktion zwischen Ninhydrin- und Imin Gruppe von Prolin).
- Führen Sie eine Einzelpunkt-interne Kalibrierung mit der Referenzlösung und Norleucin als interner Standard um zu berechnen, die Konzentrationen der Aminosäuren in den Proben, die mit der Software des Herstellers.
3. Quantifizierung der proteinogene Aminosäuren
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Messung der Trockenzelle Gewicht
- Filtern Sie 10 mL der Kultur durch einen Nitrozellulose-Filter (Pore Größe 0,45 µm), der vorgewogene in eine Aluminium-Schale ist mit einem Vakuum-Gerät. Zweimal mit 50 mL destilliertem Wasser waschen.
- Setzen Sie den Filter in der Aluminium-Cup und trocknen im Backofen bei 105 ° C für 48 h (bis keine weitere Änderung im Gewicht beobachtet wird) Rückwägung des Filters in der Tasse. Der Gewichtsunterschied zu berechnen.
- Berechnen Sie den Mittelwert von mindestens 3 unabhängige Messungen der Trockenzelle Gewicht die Hefekultur genau zu bestimmen.
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Quantifizierung der Eiweißgehalt der Zellen
Hinweis: Die Quantifizierung der Proteinfraktion der Zellen erfolgt mindestens in dreifacher Ausfertigung mit unbeschrifteten Zelle Pellets, die erzielt wurden, wie im Abschnitt 1.3.2 beschrieben.- Extrahieren Sie Proteine durch Zugabe von 1 mL DMSO-Lösung (50 % V/V) zu gefrorenen Pellets zu und inkubieren Sie bei 105 ° C 1 h im Ofen eine trockene Hitze.
- Quantifizieren Sie den Proteingehalt in der DMSO-Extrakte mit biochemischen farbmetrischen Assays, die auf die Reduzierung von Proteinen Cu++ in Cu+ Ionen basiert, die weiter durch Bicinchoninic Säure in einem blauen Komplex (BCA Assay) ausgefällt werden.
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Bestimmung der relativen Beiträge von Aminosäuren in Proteinen
Hinweis: Das Profil des proteinogene Aminosäuren wird mindestens in dreifacher Ausfertigung aus unbeschrifteten Zelle Pellets (1.3.2.) bestimmt.- Bereiten Sie oxidierten Auszug durch Aussetzung der Zelle Pellet in 200 µL Performic Säure (Ameisensäure 90 %, 10 % Wasserstoffperoxid vor). 4 h bei 4 ° C inkubieren und die Reaktion durch die Zugabe von 33,6 mg Natrium Sulfat zu stoppen.
Hinweis: Die Oxidationsschritt ist verpflichtet, Cystein und Methionin umwandeln in Methionin Sulfon und Cysteic Säure, die weiter durch Ionenaustausch Chromatographie quantifiziert werden. Jedoch sind einige Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin Histidin und Arginin) während Oxidationsbehandlung denaturiert. Folglich sind zwei Hydrolysate (mit und ohne Oxidation) bereit. - Zelle Pellets 800 µL 6N HCl hinzu oder oxidiert Extrakt und inkubieren Sie die Probe in einer hermetisch geschlossenen Glasröhre für 16 h bei 110 ° C im Ofen eine trockene Hitze. 200 µL 2,5 mM Norleucin hinzufügen und Entfernen von HCl mit einem Strom von Stickstoff. Waschen Sie (resuspending des getrockneten Extraktes und entfernen dann die Flüssigkeit mit einem Stickstoff-Strom), zweimal mit 800 µL destilliertes Wasser und dann mit 800 µL Ethanol. In 800 µL 200 mM Lithium-Acetat-Puffer pH 2.2 aufnehmen.
Hinweis: Um die Inkubationszeit für die Hydrolyse achten wie einige Aminosäuren nicht unter sauren Bedingungen stabil sind. Der Tryptophan-Anteil an Eiweiß ist von Daten in der Literatur16, geschätzt, da diese Aminosäure bei HCl Hydrolyse völlig denaturiert ist. - Die Einpunkt-interne Kalibrierung Hydrolysat Standard vorbereiten. 840 µL 200 mM Lithium-Acetat-Puffer pH 2.2, die 625 µM Methionin Sulfon, 625 µM Cysteic Säure und 625 µM Norleucin enthält fügen Sie 160 µL einer kommerziellen Lösung von hydrolysierten Aminosäuren hinzu.
- Bestimmen Sie die relativen Konzentrationen von Aminosäuren in Proteinen die chromatographische Methode im Abschnitt 2.2 beschrieben.
- Bereiten Sie oxidierten Auszug durch Aussetzung der Zelle Pellet in 200 µL Performic Säure (Ameisensäure 90 %, 10 % Wasserstoffperoxid vor). 4 h bei 4 ° C inkubieren und die Reaktion durch die Zugabe von 33,6 mg Natrium Sulfat zu stoppen.
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Berechnungen
- Berechnen der Gewichtsanteil der einzelnen Aminosäuren in Proteinen durch die Aufteilung der gemessenen Menge von einzelnen Aminosäuren (mg/L) durch die Gesamtmenge der Aminosäure, die in den Proteinextrakt (Summe in mg/L) gemessen wurde.
- Multiplizieren Sie diesen Prozentsatz durch die Konzentration der Proteine in der Kultur (mg/L), d. h., das Produkt zwischen der Proteingehalt der Biomasse und das Trockengewicht, die Konzentration der einzelnen proteinogene Aminosäuren in der Kultur (mg/L) zu beurteilen.
4. Messung der isotopischen Anreicherung von proteinogene Aminosäuren
Hinweis: Für die Messung der isotopischen Anreicherung von proteinogene Aminosäuren, verwenden Sie die markierte Zelle Pellets. Drei verschiedene Wirkstoffe werden für die Derivatisierung Schritt zur isotopische Bereicherung der Aminosäuren zu quantifizieren. Die Intensitäten der Cluster-Ionen werden gemessen, um die Kennzeichnung Muster der Aminosäuren zu schätzen. Das Signal aus jedem Cluster Ion entspricht die Fülle der Masse Isotopomers (m0 = ohne Kennzeichnung, m+ 1 = 1 beschriftete Atom...) von einer Aminosäure-Fragment. Ein Beispiel für ein Chromatogramm, die nach dem DMADMF Verfahren erworben wird ist in Abbildung 2angegeben.
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Biomasse-Hydrolyse
- Hydrolyseneigung die Zelle-Pellets (entsprechend 1 bis 2 mg von getrockneten Biomasse) durch Hinzufügen von 1,2 mL 6 M HCl und Inkubation der Probe 16 h bei 105 ° C in dicht verschlossenen Glasröhrchen im trockenen Hitze gebacken.
- Fügen Sie 1,2 mL destilliertem Wasser und Zentrifuge bei 3.000 X g für 5 min, Zelltrümmer zu entfernen. Verteilen Sie den Überstand in sechs 400 µL Fraktionen in offener Glasröhren. Trocknen Sie die Fraktionen in einem Ofen bei 105 ° C, bis sie die Konsistenz von Sirup (4-5 Std.) erreichen.
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Ethylchloroformate (ECF) Derivatisierung
- Lösen Sie die getrockneten Hydrolysat in 200 µL 20 mm HCl; Fügen Sie 133 µL von Pyridin: Ethanol (1:4). Fügen Sie 50 µL ECF derivatize Aminosäuren und warten, bis alle CO2 ist erschienen. Übertragen Sie die Mischung um Rohre, die enthalten 500 µL von Dichlormethan derivatisierte Verbindungen extrahiert zentrifugieren.
- Wirbel der Rohre für 10 s und Zentrifuge für 4 min bei 10.000 x g; sammeln Sie die untere organische Phase mit Pasteur pipettieren und Transfer GC-Fläschchen, die konische Glaseinsätzen enthalten, so dass die Proben direkt in GC/MS-Instrument injiziert werden können.
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(N, N)-Dimethylformamid Dimethyl Acetal (DMFDMA) Derivatisierung.
- Lösen Sie die getrockneten Hydrolysat in Methanol 50 µL und 200 µL Acetonitril. 300 µL der DMFDMA hinzufügen. Vortex Rohr und Transfer Proben GC Autosampler vials, die konische Glaseinsätzen enthalten.
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N, O-BIZ (Trimethylsilyl) Trifluoroacetamide (BSTFA) Derivatisierung
- Das Hydrolysat in 200 µL Acetonitril auszusetzen. Fügen Sie 200 µL BSTFA, schließen Sie hermetisch das Glasrohr und vor der Übertragung des Extrakts direkt an GC Vials für 4 h bei 135 ° C inkubieren.
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GC-MS-Analyse
- Analysieren Sie Proben mit einem Gaschromatographen, der mit einem Autosampler Injektor ausgestattet ist mit einem Massenspektrometer gekoppelt.
- Verwenden Sie gerätespezifischen Software, um das Instrument zu kontrollieren und analysieren die Chromatogramme. Klicken Sie im Menü "Sequence" auf die "Probe-Log-Tabelle" um die Beispielliste zu erstellen, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um die Injektionen zu starten.
Hinweis: Gaschromatographen ist ausgestattet mit einem 30 m x 0,25 mm apolaren Silica Kapillare Spalte mit einer 0,15 µm Schichtdicke. Die Massenspektrometer Quadrupol-Temperatur bei 150 ° C eingestellt und halten der Transferstraße bei 250 ° C für die Analysen. Drei analytische Programme, jeweils ein bestimmtes jeden Derivatisierung Agent dienen. - ECF Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 230 ° C und von der Quelle bei 250 ° C. Programmieren Sie den Autosampler 1 µL der Proben mit einem Split-Verhältnis von 3:1 zu injizieren. Analysen, schrittweise Erhöhung der Ofentemperatur wie folgt ausführen: 130 ° C für 3 min; Gefälle von 15 ° C/min bis 260 ° C; Temperatur bei 260 ° C für 20 Minuten zu halten.
- DMFDMA Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem konstanten Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 230 ° C und von der Quelle bei 250 ° C. Programmieren Sie den Autosampler 1 µL der Proben mit einem Split-Verhältnis von 3:1 zu injizieren. Die Analysen, schrittweise Erhöhung der Ofentemperatur wie folgt: 60 ° C für 1 min; Gradient von 20 ° C/min bis 130 ° C; zweiten Steigung von 4 ° C/min bis 260 ° C; Temperatur bei 260 ° C für 10 min zu halten.
- BSTFA Derivate: Verwendung Helium als der mobilen Phase mit einem konstanten Fluss von 1,2 mL/min stellen Sie die Temperatur des Einlasses bei 275 ° C und von der Quelle bei 300 ° C. Die Analysen (Injektion: 1 µL), allmählich die Ofentemperatur wie folgt erhöht: 110 ° C für 1 min; ersten Steigung von 2 ° C/min bis 154 ° C; zweiten Gradienten von 5 ° C/min bis 300 ° C; Temperatur bei 300 ° C für 10 min zu halten.
- Nachweisverfahren: Injizieren Sie für jeden Modus der Derivatisierung eine Probe (1 µL) im SCAN-Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation bei 70 eV und beachten Sie die Verweilzeit der einzelnen Aminosäuren.
- Verwenden Sie diese Werte definieren die Zeitfenster während das Chromatogramm und für die verschiedenen ausgewählten Ionen, die charakteristisch für jede Aminosäure und in Tabelle 3aufgeführt sind; Diese Werte sollten für jede Aminosäure enthalten sein. Enthalten Sie diese Informationen in das SIM-Erkennung-Programm und führen Sie die Analysen im SIM-Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation bei 70 eV.
- Verwenden Sie gerätespezifischen Software, um das Instrument zu kontrollieren und analysieren die Chromatogramme. Klicken Sie im Menü "Sequence" auf die "Probe-Log-Tabelle" um die Beispielliste zu erstellen, und klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausführen", um die Injektionen zu starten.
- Die Ergebnisse der Analysen zu sammeln; nämlich für jede Aminosäure zeichnen Sie eine Ansammlung von Intensitäten, die entsprechen, seine verschiedenen Masse Isotopomers auf. Die Daten mit Hilfe der Dedicatedsoftware17 für natürliche Kennzeichnung korrigieren und berechnen die isotopische Bereicherung der proteinogene Aminosäuren (definiert als die beschrifteten Bruch eine Aminosäure in Bezug auf die Gesamtmenge des Proteins zu verarbeiten Proben).
Hinweis: Die isotopischen Bereicherung eines Moleküls (dh), ausgedrückt als Prozentsatz, errechnet sich die Summe der korrigierten Intensitäten von der Masse Isotopomers mit Beschriftung (m1, m2,... m-n) durch die Summe der den korrigierten Intensitäten von der Masse Isotopomers (m0, m1, m2,... mn):
I. E. = (m1 und m2 +... + mn) / (m0 + m1m2 +... + mn)
- Analysieren Sie Proben mit einem Gaschromatographen, der mit einem Autosampler Injektor ausgestattet ist mit einem Massenspektrometer gekoppelt.
(5) Quantifizierung und Isotopen Bereicherung der flüchtigen Verbindungen
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Gewinnung von beschrifteten flüchtige Verbindungen
- Fügen Sie 10 µL deuterierte internen Standards bis 5 mL des Überstandes (Endkonzentration deuterierte Verbindungen: 100 µg/L) in einer Glasröhre 15 mL. Fügen Sie 1 mL Dichlormethan, dicht schließen Sie die Röhren und schütteln Sie sie auf einer rockigen Plattform für 20 min. Zentrifuge für 5 min bei 3.000 x g und sammeln Sie die organischen untere Phase in einer Glasröhre 15 mL. Wiederholen Sie die Dichlormethan-Extraktion.
- Trocknen Sie die Bio Extrakt über 500 mg wasserfreiem Natriumsulfat und sammeln Sie die flüssige Phase mit einer Pasteur pipettieren. Den Extrakt mit einem Faktor von vier unter Stickstoff Flussmittel zu konzentrieren und zu einem GC Autosampler Fläschchen übertragen werden.
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GC-MS Quantifizierung von flüchtigen Verbindungen
- Gaschromatographen mit einem 30 m x 0,25 mm Fused-Silica Kapillaren Spalte mit 0,25 μm Schichtdicke auszustatten und einer Konstante Helium Strömung von 1,0 mL/min halten den Injektor und Transferstraße bei 250 ° c anwenden
- 2 µL der Probe mit einem Split-Verhältnis von 10:1 zu injizieren und die extrahierten flüchtige Moleküle unter Verwendung der folgenden Ofen Temperaturprofil zu trennen: die Temperatur für 3 min bei 40 ° C zu halten, um 4 ° C/min erhöht bis zu 220 ° C und dann halt den Ofen bei 220 ° C für 20 Minuten.
- Erkennen Sie die Verbindungen mit einem Massenspektrometer mit seiner Quelltemperatur bei 230 ° C und seine Massenspektrometer Quadrupol-Temperatur auf 150 ° c eingestellt Notieren Sie die Massenspektren in ausgewählten Ion Monitoring (SIM) Modus mit positiven Elektrons Auswirkungen Ionisation zu 70 eV und mit der Ionen-Cluster bestimmte flüchtigen Verbindungen, die in Tabelle 4gemeldet werden.
- Verwenden Sie eine externe 7-Punkt-Kalibrierung, um die Konzentrationen der flüchtigen Moleküle aus den Summen der Intensitäten des entsprechenden Ionen-Clusters zu quantifizieren. Stammlösungen von jeder Verbindung (10 g/L) in 100 % igem Ethanol vorbereiten. Dann bereiten Sie Standardlösungen für jede Klasse von flüchtigen Molekülen (Ethyl ester, Acetate, Alkohole und Säuren) durch Mischen auf Lagerlösungen. Zu guter Letzt verdünnen Sie unterschiedliche Mengen an Standardlösungen in einer 12 % wässrige Lösung mit 5 g/L Weinsäure mit der pH-Wert eingestellt auf 3.3 Kalibrierlösungen vorzubereiten.
- Parallel zur natürlichen Kennzeichnung der Intensitäten der einzelnen Ionen-Cluster zu korrigieren und Isotopen Bereicherung der flüchtige Verbindungen, die ist definiert als die beschrifteten Bruchteil der Moleküle und wird als Prozentwert mit Hilfe der speziellen Software ausgedrückt zu berechnen 17.
(6) Berechnungen für eine integrierte Analyse des Datasets
-
Sammlung der Rohdaten
- Mit Hilfe von Tabellen, die in den Tabellen 5, 6, 7 und 8 gezeigt geben Sie die raw-Daten-Werte, die die Konzentration der extrazellulären Aminosäuren, Zelle Trockengewicht, Protein-Inhalt von Zellen, Konzentration der flüchtigen Moleküle und Isotopen entsprechen, Anreicherung von proteinogene Aminosäuren und flüchtige Moleküle.
Hinweis: Die Daten in Tabellen sind in mM angegeben. Die Ergebnisse werden auch ausgedrückt in mg/L multipliziert die Werte in mM durch das Molekulargewicht von jedem Molekül oder in mg N/L durch Multiplikation der millimolaren Konzentration eine proteinogene Aminosäure mit der Atommasse von Stickstoff (14 u) und durch die Anzahl der Stickstoff Ato MS, die durch den Abbau dieses Moleküls bereitgestellt werden. - Berechnen der Massenanteil der einzelnen Aminosäuren in Proteine durch die Aufteilung seiner Menge in mg/L in dem Hydrolysat durch den Gesamtbetrag der Aminosäuren (ihre Summe in mg/L).
- Berechnen Sie Mittel und Standardabweichung Standardfehler des Mittelwertes aus den Daten, die in der unabhängigen Experimenten gewonnen wurden.
- Berechnen die proteinogene Konzentration (mg/L) für jede Aminosäure durch Multiplikation den Anteil dieser Aminosäure in einem Protein (mg-aa/g-Proteine) durch die Proteinfraktion in der Biomasse (g Proteine/g DW) und das Trockengewicht Inhalt (Biomasse-Produktion) in die Medium (g DW/L).
- Mit Hilfe von Tabellen, die in den Tabellen 5, 6, 7 und 8 gezeigt geben Sie die raw-Daten-Werte, die die Konzentration der extrazellulären Aminosäuren, Zelle Trockengewicht, Protein-Inhalt von Zellen, Konzentration der flüchtigen Moleküle und Isotopen entsprechen, Anreicherung von proteinogene Aminosäuren und flüchtige Moleküle.
-
15 N isotopischen Tracer Experimente
- Die beschriftete und unbeschriftete Anteile an Stickstoff, die in die proteinogene Aminosäuren (ausgedrückt in mg N/L) aus ihrer gesamten Konzentrationen (ausgedrückt in mg N/L) berechnen mit Hilfe von Tabellen, die in Tabelle 9dargestellt werden und ihre Isotopen Bereicherungen. Für jede Aminosäure beschriftete Bruchteil entspricht das Produkt zwischen seine volle Konzentration und seinen Isotopen Bereicherung und der unbeschriftete Teil ist die Differenz zwischen der Summe und die beschrifteten Beträge.
- Bestimmen Sie anschließend den Bruchteil der Gesamt-Stickstoff in den Proteinen, die in die proteinogene Aminosäuren, die in dieser Studie quantifiziert durch Summierung der Gesamtbetrag der Ala, GJ, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu und Arg (in mg N/L) und teilt die Summe enthalten ist eine Montage von dieser Summe in Proteinen enthaltenen Stickstoff.
- Berechnen Sie den Stickstoff zur Verfügung gestellt von Arginin, Glutamin oder Ammonium, die wiederhergestellt wurde, in die proteinogene Säuren durch Summierung den beschrifteten Bruchteil (in mg N/L) proteinogene Aminosäuren, die in der Studie (Ala, GJ, Val, Asp, quantifiziert wurden in dieser Studie quantifiziert Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, His, Glu und Arg) während der Experimente in Anwesenheit von 15N beschriftet Arginin, Glutamin, oder Ammonium und Teilung dieser beschriftet-Stickstoff-Anteil durch die Gesamtmenge an Stickstoff in der quantifizierten proteinogene Aminosäuren Säuren.
- Bewerten Sie den Beitrag der die 3 am häufigsten vorkommende Aminosäuren in den intrazellulären Pool von Stickstoff zur de-Novo -Biosynthese durch die Kombination von Daten aus den 13C und 15N Isotop Tracer Experimente (Tabelle in Tabelle 7).
- Vom Gesamtbetrag (ausgedrückt in mM) der proteinogene Val, Leu, Ile oder Thr, ziehen Sie den Teil die direkte Einbindung von verbrauchten Verbindungen (13C-Experimente) und der Teil, das de Novo können mit Stickstoff aus den 3 wurde abgeleitet ab Hauptquellen um den Bruch zu bewerten, die de Novo können mit Stickstoff aus den anderen Aminosäuren.
- Berechnen Sie das Verhältnis der Menge der Aminosäure de Novo können mit Stickstoff zur Verfügung gestellt von Gln, Arg und NH4+ (Summe in mM ausgedrückt) auf den Gesamtbetrag von proteinogene Aminosäuren (in mM) Quantifizierung des Beitrags der Arginin, Glutamin und Ammonium in den intrazellulären Stickstoff-Pool.
-
13 C isotopischen Tracer Experimente
- Berechnen Sie die beschriftete und unbeschriftete Brüche der proteinogene Aminosäuren aus Konzentrationen ausgedrückt in mM und Isotopen Bereicherungen proteinogene Aminosäuren, die während der Experimente im Beisein von 13C beschriftet Leu, Val erzielt wurden, Ile oder Thr. (siehe 6.2.1, Tabelle 10).
- Berechnen Sie die beschriftete und unbeschriftete Bruchteile von flüchtigen Verbindungen von Konzentrationen ausgedrückt in mM und Isotopen Bereicherungen der flüchtige Verbindungen, die während der Experimente im Beisein von 13C beschriftet Leu, Val, Ile oder Thr ( gewonnen wurden Tabelle 10).
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Representative Results
Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung des Workflows, die implementiert wurde zur Untersuchung der Verwaltungs durch Hefe der Stickstoff mehrere Quellen, die während der Weingärung gefunden werden.
Für verschiedene Punkte der Probenahme, der biologischen Parameter – Wuchsmerkmalen, Stickstoff Konsummuster und das Profil der proteinogene Aminosäuren – zeigen eine hohe Reproduzierbarkeit unter Fermentationen (Abbildung 4). Diese Konsistenz überprüft die Relevanz des Ansatzes basiert auf der Kombination von Daten, die während einer Reihe von 14 unabhängigen Fermentationen generiert wurde.
Abbildung 5 zeigt einen umfassenden Überblick über die Umverteilung von Stickstoff aus den Quellen, die in den Traubensaft, die proteinogene Aminosäuren zur Verfügung stehen. Diese Analyse stützt sich hauptsächlich auf die Ergebnisse, die aus Experimenten in Anwesenheit von 15N-markierten Verbindungen gewonnen wurden. In Kombination mit der Bestimmung der Masse und Isotopen Salden, zur Verfügung gestellt der Messung der isotopischen Bereicherung proteinogene Aminosäuren der erste Quantifizierung des Beitrags der Stickstoff entstanden Arginin, Glutamin, Ammonium und andere Quellen zu Amin Gruppen jedes dieser Verbindungen. Die wichtige Umverteilung von Stickstoff, die hier unterstrichen ist spiegelt die wesentliche Rolle der de-Novo -Synthese von Aminosäuren in Hefe Wachstum zu unterstützen.
Darüber hinaus ermöglicht diese Studie vergleicht die Beträge von beschrifteten Verbindungen in Proteine mit ihren Verbrauch den Anteil der verbrauchten N-haltige Moleküle, die Proteine direkt, beim Betreten der Zellen integriert sind zu beurteilenden. Proteinogene Aminosäuren unterscheiden sich nach dem Grad ihrer direkte Einbindung in die Biomasse; einige von ihnen sind ausschließlich (Asp, Glu) oder mehr als 80 % de Novo können, während Sie nur geringe Mengen von anderen Verbindungen entstehen durch de-Novo -Synthese. Interessanterweise enthält dieser letzten Gruppe Lysin und Histidin, die welche die einzige Aminosäuren sind in denen alle konsumierten Quellen direkt integriert sind.
Abbildung 5 b stellt für einige Aminosäuren, auch einen Vergleich zwischen der Menge des verbrauchten Aminosäure, die direkt in die Biomasse, berechnet aus den Daten erhielt 15N-Kennzeichnung Experimente und experimentell gemessen in 13 wiederhergestellt ist C-Kennzeichnung Experimente. Die kleinen Unterschiede zwischen diesen Werten zeigen die Zuverlässigkeit und die Robustheit des Konzepts, das in dieser Studie umgesetzt wurde.
Abbildung 6 zeigt ein Beispiel der quantitativen Partitionierung (Verhältnisse) von Flussmittel durch Stoffwechselwege, die durch die Umsetzung des Workflows berichtet in diesem Dokument abgerufen wurde. Diese Karte wurde durch die Kombination von Informationen aus isotopischen Tracer Experimente mit 15N und 13C-markierten Substraten und beschreibt die Partitionierung der verbrauchten aliphatische Aminosäuren in den metabolischen Netzwerkes, das Valin beteiligt ist und Leucin-Biosynthese in der Hefe (für Berechnungen, siehe Tabelle 1 und Tabelle 2). Durch die Messung der Produktion und Isotopen Bereicherung der proteinogene Aminosäuren und flüchtige Verbindungen, untersuchten wir die Menge dieser Substanzen, die dazu von der Kohlenstoff-Backbones der verbrauchten U-C-13- Valin und U-C-13- Leucin, das entspricht der beschrifteten Bruch der Verbindungen. Anschließend konnten wir den Beitrag von CCM zu ihrer Entstehung (die unbeschriftete Bruch der Verbindungen) bestimmen. Carbon Massenbilanzen richten Sie mit Hilfe der Workflow und das Berechnungsverfahren, das hier vorgeschlagen wird zeigen, dass mehr als 96 % der verbrauchten Valin und Leucin in ihre Umwandlungsprodukte nämlich wieder aufgefunden werden, proteinogene Leucin und Valin und flüchtige höher Alkoholen. Dieser Befund bestätigt die Eignung des gemeldeten Ansatzes für quantitative Studien des Stoffwechsels. Die integrierte und umfassende Analyse des Datasets bietet neue Einblicke in das Schicksal der verbrauchten Aminosäuren. Überraschenderweise sind ein wesentlicher Teil Valin und Leucin trotz erheblichen Ungleichgewicht zwischen der Verfügbarkeit dieser Verbindungen in das Medium und deren Inhalt in Biomasse catabolized. Der Bruchteil von exogenen N-Verbindungen direkt in die Proteine eingebaut hängt jedoch von der Art der Aminosäure. Ein weiterer wichtiger Punkt betrifft die metabolische Herkunft proteinogene Aminosäuren und flüchtige Moleküle. Die Analyse des Musters 13C-Kennzeichnung proteinogene Leucin und Valin zeigt, dass das Kohlenstoffskelett dieser Aminosäuren kommt hauptsächlich aus Vorstufen, die dazu durch die CCM waren. Im Einklang mit dieser Beobachtung zeigt die geringe Einbeziehung der Kennzeichnung in Isobutanol und Isoamyl Alkohol sehr eingeschränkte Beteiligung der Abbau von Valin und Leucin, die durch die Hefe bei der Bildung dieser höhere Alkohole verbraucht wurden.
Abbildung 1: Automatische Roboter-System zur Überwachung von Hochdurchsatz-Fermentationen. (A) Roboterplattform. Fermenter (a) in Unterstützung Reiseführer magnetische rühren-Platten (b) befinden. Sicherheits-Lichtvorhang (c) schützt den Anwender. Ein Roboterarm (d) bewegt sich der Fermenter nacheinander von ihrem Speicherort auf eines der 6 Platten, eine Präzisionswaage (e) auf der linken Seite des Arbeitstisches, um das Gewicht messen alle 4 Stunden rühren. Die Roboterplattform befindet sich in einem temperierten Raum. (B) schematische Darstellung der Software-Architektur. Eine grafische Oberfläche ermöglicht den Benutzern, die experimentelle Einstellungen definieren. Diese Informationen werden zur Kontrolle Anwendung übertragen, das steuert den Roboterarm und zeichnet das unterschiedliche Gewicht in verschiedenen rohen data.xlm Dateien (1 Datei/Fermentation). Die Berechnungssoftware dann sammelt die Xlm-Dateien und berechnet für jeden Zeitpunkt, die Menge an CO2 , die freigesetzt werden (ausgedrückt in g/L), die proportional zu der Menge an Zucker, die zu dieser Zeit, und die Gärung Rate verbraucht wurde, die Rate der CO2 -Produktion in g CO2/L/h (proportional zur der Zuckerverbrauch) entspricht. Daten werden in einer relationalen Datenbank gespeichert und mit einer gewidmet grafischen Oberfläche visualisiert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: GC-MS-Analyse von proteinogene Aminosäuren: Beispiel für Alanin. (A) Chromatogramm nach Derivatisierung von proteinogene Aminosäuren mit DMFDMA erhalten. (B) Masse Spektren von derivatisierte Alanin. Zwei Hauptgipfel, die Fragmente mit m0Standardfall entsprechen = 99 und m0Standardfall = 158. (C) Derivatisierung Reaktion von Alanin mit DMFDMA. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3. Workflow für die Quantitative Analyse des Stoffwechsels von mehreren Stickstoff Quellen durch Hefe. Dieser Prozess umfasst (i) eine Reihe von 28 Fermentationen (7 Stickstoff Quellen und Fermentationen mit oder ohne Stickstoffverbindungen in zweifacher Ausfertigung); (Ii) eine analytische Teil, der verschiedenen Verfahren der Extraktion und Derivatisierung von Molekülen und HPLC oder GM-MS-Analysen und (Iii) Verarbeitung von raw-Daten und eine integrierte Analyse der Datensätze beinhaltet. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4. Reproduzierbarkeit der biologischen Parameter aus einer Reihe von unabhängigen Fermentationen. (A-B) Meine Werte und Standardabweichungen Trockengewicht und Eiweißgehalt, die aus den 14 unabhängige Fermentationen durchgeführten benutzen unbeschriftete Verbindungen gewonnen wurden. (C-D) Mittelwerte und Standardabweichungen von proteinogene und verbrauchten Aminosäuren, die bei 14 unabhängige Fermentationen gemessen wurden mit unbeschriftete Verbindungen durchgeführt. CO-2 -Produktion: 5 (grün), 10 (blau), 40 (rosa) und 90 (lila) g/L. Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5. Umverteilung von Stickstoff aus den drei großen Stickstoff-Quellen, proteinogene Aminosäuren während der Gärung. (A) metabolische Herkunft proteinogene Aminosäuren: direkte Einbeziehung der verbrauchten Gegenstück (blau) und de-Novo -Synthese mit Stickstoff von verbrauchten Arginin (orange), Glutamin (grün), Ammonium (rosa) oder andere Aminosäuren (zur Verfügung gestellt (lila). Ausgedrückt als Prozentsatz der Gesamtsumme der einzelnen proteinogene Aminosäuren. (B) Vergleich zwischen der Menge des verbrauchten Aminosäure (blau) und der Teil der verbrauchten Aminosäure, die direkt in den Proteinen, wiederhergestellt wird berechnet aus den Daten, die in 15N Tracer Experimente (lila) oder experimentell gewonnen wurden während der Gärung mit 13C-markierte Moleküle (rosa) gemessen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6. Quantitative Analyse von Valin und Leucin Stoffwechsel. Partitionierung des verbrauchten Leucin (grün) und Valin (blau) durch die metabolischen Netzwerkes bei 40 g/L CO2 produziert werden. Die Bars sind proportional zu der Menge von jeder Verbindung und drücken sich in µM, darunter den Bruch, der dazu vom zentralen Kohlenstoff-Stoffwechsel (Orange) war. Werte in der normalen Schriftart: Betrag in µM; Werte in kursiver Schrift: Prozentsatz der verbrauchten Valin (blau) oder Leucin (grün), die durch den Pfad catabolized war. Die Berechnungen sind in Tabelle 1 und Tabelle 2zur Verfügung gestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Verbindungen | Menge pro liter |
| Glukose C6H12O6 | 240 g |
| Apfelsäure C4H6O5 | 6 g |
| Zitronensäure C6H8O7 | 6 g |
| Kalium Phosphat KH2PO4 | 0,75 g |
| Kaliumsulfat-K2SO4 | 0,5 g |
| Magnesium-Sulfat MgSO4, 7 H2O | 0,25 g |
| Kalzium-Chlorid CaCl2, 2 H2O | 0,155 g |
| Natriumchlorid NaCl | 0,2 g |
| Myo-Inosit | 20 mg |
| Calciumpantothenat | 1,5 mg |
| Thiamin Hydrochlorid | 0,223 mg |
| Nikotinsäure | 2 mg |
| Pyridoxin | 0,25 mg |
| Biotin | 0,003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 mg |
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterin | 3,75 mg |
| Ölsäure | 1,25 ΜL |
| Tween 80 | 125 ΜL |
| Tyrosin | 8,6 mg |
| Tryptophan | 84,4 mg |
| Isoleucin | 15,4 mg |
| Aspartate | 20,9 mg |
| Glutamat | 56,7 mg |
| Arginin | 176,2 mg |
| Leucin | 22,8 mg |
| Threonin | 35,7 mg |
| Glycin | 8,6 mg |
| Glutamin | 237,8 mg |
| Alanin | 68,4 mg |
| Valin | 20,9 mg |
| Methionin | 14,8 mg |
| Phenylalanin | 17,9 mg |
| Serin | 37,0 mg |
| Histidin | 15,4 mg |
| Lysin | 8,0 mg |
| Cystein | 6,2 mg |
| ProLine | 288,3 mg |
| Ammoniak-Chlorid NH4Cl | 220 mg |
| Der pH-Wert des Mediums wurde 3.3 mit NaOH 10 M angepasst. | |
Tabelle 1. Zusammensetzung des Mediums in dieser Studie verwendeten synthetischen. Dieses chemisch definierte Medium imitiert die Zusammensetzung von Traubensaft.
| Elution buffer | Temperatur | |
| Von 0 bis 6 min. | Lithium-Citrat, 200 mM, pH 2,8 | 32 ° C |
| Von 6 bis 38 min | Lithium-Citrat, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| Von 38 bis 57 Min. | Lithium-Citrat, 500 mM, pH 3,15 | 64,5 ° C |
| Von 57 bis 83 min. | Lithium-Citrat, 900 mM, pH 3,5 | 75 ° C |
| Von 83 bis 120 min. | Lithium-Citrat, 1650 mM, pH 3.55 | 75 ° C |
| Von 120 bis 130 min | Lithium Hydroxyde, 300 mM |
Tabelle 2: Bedingungen für die Trennung von Aminosäuren durch Ionenaustausch Chromatographie verwendet. Elution Buffer mit erhöhten Salzkonzentrationen sind sukzessive in Kombination mit einem Temperaturgradienten verwendet, um die Trennung von Aminosäuren ermöglichen.
| Aminosäuren | Derivatizing Reagenz | RT (min) | Ionen-Cluster (m/Z) |
| Alanin | ECFein | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glycin | ECFein | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFein | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFein | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucin | ECFein | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFein | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFein | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFein | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFein | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFein | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| ProLine | ECFein | 6,83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECFein | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFein | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Phenylalanin | ECFein | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFein | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFein | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| ein ECF, Ethyl Chloroformate; b DMFDMA (N, N)-Dimethylformamid Dibutyl Acetal; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tabelle 3. Analytische Parameter zur Bestimmung von Isotopen Bereicherungen von Aminosäuren mit ausgewählten Ion monitoring-Modus (SIM) verwendet werden. Diese Tabelle fasst die chemische Mittel für die Derivatisierung, die Retentionszeit des derivatisierte Verbindungen und Ionen erwarb MS (Modus Electron Impact) für jede Aminosäure-Cluster verwendet.
| Aminosäuren | Derivatizing Reagenz | RT (min) | Ionen-Cluster (m/Z) |
| Alanin | ECFein | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glycin | ECFein | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFein | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFein | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucin | ECFein | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFein | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFein | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFein | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFein | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFein | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| ProLine | ECFein | 6,83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECFein | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFein | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12,75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12,75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Phenylalanin | ECFein | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFein | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFein | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Tabelle 4. Analytische Parameter für die Bestimmung der isotopischen Bereicherungen und Quantifizierung der flüchtige Verbindungen mit ausgewählten Ion (SIM) Überwachungsmodus verwendet. Diese Tabelle fasst die Verweildauer und die Ansammlung von Ionen in MS (Modus Electron Impact) erhalten für jede flüchtige Verbindung.
Tabelle 5. Verarbeitung von Rohdaten aus der Quantifizierung der restlichen Aminosäuren gewonnen Dataset enthält Daten aus Messungen von aus- und restlichen Aminosäuren. Diese Werte werden zur Berechnung der verbrauchten Aminosäure (durch Subtraktion). Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 6. Verarbeitung von Rohdaten aus der Quantifizierung der proteinogene Aminosäuren gewonnen. Dieser Datensatz enthält Daten über die Zusammensetzung an Aminosäuren von Biomasse Hydrolysate (A) und der Anteil der Proteine in Biomasse (B). Diese Werte dienen zur Beurteilung der Massenanteil der einzelnen Aminosäuren in einem Protein (C). Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 7. Proteinogene Aminosäuren. Diese Tabelle dient zur Berechnung der Konzentration (in mM) der proteinogene Aminosäuren aus Daten in Tabelle 5 und Tabelle 6zusammengefasst. Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 8. Verarbeitung von Rohdaten aus der Quantifizierung der höheren Alkoholen gewonnen. Dataset enthält Daten aus den Messungen der flüchtige Verbindung Konzentrationen (A) und wandelt Daten ausgedrückt in Einheiten von mg/L bis µM (B). Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 9. Verarbeitung von raw-Daten erhalten von der Ermittlung der isotopischen Bereicherungen proteinogene Aminosäuren mit 15N beschriftet Substrate.
Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
Tabelle 10. Verarbeitung von raw-Daten erhalten von der Ermittlung der isotopischen Bereicherungen proteinogene Aminosäuren und flüchtige Verbindungen mit 13C-markierten Substraten.
Für weitere Berechnungen sind Mittel und Standardabweichungen berechnet. Klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.
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Discussion
Quantifizierung der Partitionierung von Verbindungen durch metabolische Netzwerke mit isotopischen Tracer Experimente ist ein vielversprechender Ansatz für die Funktionsweise des mikrobiellen Stoffwechsels verstehen. Diese Methode kann nicht während erfolgreich mit ein oder zwei beschriftete Substraten angewendet derzeit implementiert werden, um Stoffwechsel von verschiedenen Quellen mit Hilfe mehrere beschriftete elementare Isotope (d.h. mehr als zwei Substrate) zu studieren. In der Tat, verfügbaren analytische Techniken ermöglichen die genaue Bestimmung der Kennzeichnung Muster proteinogene Aminosäuren und Moleküle ausschließlich Verwendung Isotope eines einzelnen Elements und möglicherweise bei der Beschriftung mit zwei Elementen zusammen. Folglich um diese Einschränkungen zu beheben und die Verwaltung von mehreren Nährstoffquellen durch Mikroorganismen zu bewerten, haben wir uns entschieden, eine Reihe von Kulturen unter den gleichen Umweltbedingungen zu wiederholen, während die Kennzeichnung einer ausgewählten Substrat mit 13C oder 15 N Isotope. Dann bietet weitere Kombination von spezifischen Informationen, der von jedem 13C oder 15N Tracergas-Experiment zur Verfügung gestellt wird eine quantitative erweiterte Ansicht des Stoffwechsels von mehreren Quellen.
Die Erreichung der gemeldeten Ansatz basiert auf der Umsetzung einer reproduzierbaren Reihe von Kulturen unter Standardbedingungen und die Entnahme von Proben aus einer Population von Zellen in einem definierten physiologischen Zustand, der für alle Kulturen (Zelle gleich Wachstum, Konsum von Substrat, etc.). Diese Bedingungen müssen erfüllt sein, damit unabhängigen Experimenten gewonnene Daten gemischt und gemeinsam analysiert werden können. Sehr befriedigend, diese Einschränkungen erfordert eine genaue und häufige Überwachung der mikrobiellen Aktivität durchgeführt wurde, berichtet in die experimentellen Arbeit hier, mit einem Roboter-gestützte System zur Online-Überwachung der Gärung Hefeaktivität. Konventionellere Methoden zur Kultivierung von Mikroorganismen und -Überwachung, wie die Bestimmung des Zellwachstums durch Messung der optischen Dichte ist jedoch lässt sich das Stichprobenverfahren zu normalisieren.
Eine weitere Voraussetzung für die Durchführung dieser Methodik ist eine klare Vision der Stoffwechselwege, die im Netz zu untersuchenden beteiligt sind. Dieses Wissen ist wichtig für die Wahl des Satzes von beschrifteten Substrate, die am besten geeignet für den Umgang mit dem Thema untersucht werden. Die beschrifteten Verbindungen sowie Art und Position der Beschriftung (13C, 15N oder andere) innerhalb der Moleküle muss entsprechend in Ordnung, ich ausgewählt werden) wiederherstellen alle Etiketten, die von den Substraten in den Verbindungen, die von abgeleitet werden zur Verfügung gestellt Ihre Katabolismus und weiter analysiert in dem Verfahren und Ii) redundante Daten, die zeigen, die Genauigkeit der Methode und die Validität der Ergebnisse zu erhalten. Die hier beschriebene Vorgehensweise enthält auch eine bedeutende Anzahl von Analysen, die Zeit- und kostenaufwendige in personeller und finanzieller Ressourcen werden könnte. Darüber hinaus können einige analytische Einschränkungen der Verwendung dieser Methodik einschränken. Erstens sollten Benutzer sicherstellen, dass die analytischen Methoden, die für die Quantifizierung der beim mikrobiellen Stoffwechsel hergestellten Verbindungen sind erforderlich und für die Bestimmung ihrer isotopischen Anreicherung stehen zur Verfügung. Zweitens gilt dieser Ansatz nur für die Beurteilung des Stoffwechsels von Substraten für welche alle die Umwandlung in ausreichender Menge genau quantifiziert werden Verbindungen hergestellt werden.
In diesem Papier rechneten wir diesen Workflow um die Verwaltung von mehreren Quellen von Stickstoff durch Hefe während der Weingärung zu erkunden. Dieser Bericht bietet neue Einblicke auf Hefe Stoffwechsel, einschließlich der wesentlichen Katabolismus der am meisten konsumierten Aminosäuren, kombiniert mit ihren niedrigen direkte Einbindung in Proteinen und den wichtigen Beitrag des CCM, Vorläufer zu liefern, die weiter verwendet werden die de-Novo -Synthese von proteinogene Aminosäuren und die Bildung von flüchtigen Molekülen.
Darüber hinaus kann der Ansatz, der hier beschrieben wird zur Quantifizierung der Partitionierung von mehreren Substraten durch die metabolischen Netzwerkes Mikroorganismen verwendet werden. Es erlaubt Forschern, die das Schicksal aller verbrauchten Verbindungen zu erhellen, nachdem sie die entsprechenden Körperzellen gelangen und an der Identifizierung der metabolischen Herkunft der Ausgangsstoffe und Produkte. Diese Informationen kann nützlich sein für die Stoffwechselaktivität der Stämme, die verschiedene genetische Hintergründe zu vergleichen oder wachsen unter verschiedenen Bedingungen und damit für die Gestaltung von rationale Strategien zur Verbesserung der Gärungsprozesse.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin und Jean-Marie Sabalyrolles für Ihren Beitrag zur Konzeption des Systems der Roboter-assistierte Gärung und Martine Pradal, Nicolas Bouvier und Pascale Brial für ihre technische Unterstützung. Finanzierung für dieses Projekt vom Ministère de l Nationale De La Recherche et bereitgestellt wurde De La Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
