Summary
פרוטוקול זה מתאר תהליך ניסוי לחקור באופן כמותי ומקיף על חילוף החומרים של מקורות מזון רבים. זרימת עבודה זו, המבוססת על שילוב של ניסויים מעקב איזוטרופי שגרת אנליטית, מאפשר את גורלו של חומרים מזינים נצרך המקור מטבולית של מולקולות synthetized על-ידי מיקרואורגניזמים נקבע.
Abstract
מחקרים בתחום המיקרוביולוגיה להסתמך על ביצוע מגוון רחב של מתודולוגיות. בפרט, פיתוח שיטות המתאימות תורמת באופן משמעותי במתן ידע נרחב על חילוף החומרים של המיקרואורגניזמים הגדלים בתקשורת כימית מוגדרים המכילים חנקן ייחודי ומקורות פחמן. לעומת זאת, הניהול באמצעות חילוף החומרים ממספר מקורות מזון, למרות נוכחותם רחבה בסביבה טבעית או תעשייתית, נשאר כמעט שאינו גלוי. המצב הזה הוא בעיקר בגלל חוסר של מתודולוגיות מתאימים, שפוגעת חקירות.
אנחנו מדווחים על אסטרטגיית ניסיוני לחקור באופן כמותי ומקיף איך חילוף החומרים פועל כאשר התזונתי מסופק הוא תערובת של מולקולות שונות, קרי, משאב מורכבים. כאן, אנו מתארים את היישום שלה לשם הערכת חלוקת ממספר מקורות חנקן דרך הרשת מטבולית שמרים. זרימת העבודה משלב מידע שהתקבל במהלך איזוטופ יציב מעקב ניסויים באמצעות שנבחרו 13C - או 15התווית על-ידי N סובסטרטים. תחילה מורכבת fermentations מקבילים, לשחזור במדיום אותו, הכולל תערובת של מולקולות המכילות N; עם זאת, מקור חנקן שנבחר מסומן בכל פעם. שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) מיושמת כדי להעריך את הדפוסים תיוג של תרכובות יישוב וכדי לכמת את צריכת ושחזור של מצעים בשנת מטבוליטים אחרים. ניתוח משולב של ערכת הנתונים השלם מספק מבט על גורלם של סובסטרטים נצרך בתוך התאים. גישה זו דורשת פרוטוקול מדויק עבור האוסף של דוגמאות – הקל על-ידי מערכת בסיוע רובוט לניטור המקוון של fermentations – ואת ההישג של אינספור ניתוחים גוזלת זמן. למרות אילוצים אלה, זה מותר הבנה, בפעם הראשונה, חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי הרשת מטבולית שמרים. מבואר הפצה מחדש של חנקן ממקורות שופע יותר לכיוון N-תרכובות אחרות ואנו נחוש את המקורות מטבולית של מולקולות נדיפות וחומצות אמינו proteinogenic.
Introduction
ההבנה כיצד פועלת מטבוליזם מיקרוביאלי היא סוגיה מרכזית על עיצוב האתר של אסטרטגיות יעילות כדי לשפר תהליכי תסיסה, לווסת את הייצור של תרכובות fermentative. ההתקדמות גנומיקה, גנומיקה תפקודית בשני עשורים האחרונים אלו תרמו במידה רבה הרחבת הידע של הטופולוגיה של רשתות מטבוליות של מיקרואורגניזמים רבים. הגישה למידע זה הוביל לפיתוח גישות המטרה עבור סקירה מקיפה של תפקוד התאים1. מתודולוגיות אלה לעיתים קרובות לסמוך על פרשנות המבוססת על מודל של פרמטרים מדידים. נתונים ניסיוני אלה כוללים, מצד אחד, ספיגת מטבוליט וקצבי ייצור ו, מצד שני, ניסויים כמותיים תאיים המתקבל איזוטופ מעקב. נתונים אלה מספקים מידע חיוני עבור ניכוי של הפעילות ויוו של מסלולים שונים הרשת המוגדרות מטבוליים2,3,4. כיום, טכניקות אנליטיות זמין רק לאפשר את איתור מדויק של תיוג דפוסים של מולקולות בעת שימוש איזוטופ רכיב אחד ואולי גם כאשר תיוג במשותף עם שני אלמנטים איזוטרופי. יתר על כן, תחת רוב תנאי הגידול, מקור פחמן מורכבת רק אחד או שניים-תרכובות. כתוצאה מכך, גישות המבוסס על 13C-איזוטרופי קליעים נותבים של פחמן סובסטרטים נרחב ובהצלחה הוחלו לפתח הבנה מלאה של פחמן רשת מטבולית פעולות5,6,7 ,8.
לעומת זאת, רבים בסביבות טבעיים ותעשייתיים, המשאב חנקן זמין התומך צמיחת חיידקים מורכב לעיתים קרובות של מגוון רחב של מולקולות. לדוגמה, במהלך התסיסה יין או בירה, חנקן מסופק הוא תערובת של 18 חומצות אמינו, אמוניום ריכוזים משתנים9. זה מגוון של תרכובות N הנגישים עבור אנאבוליזם הופך תנאים אלה מדיה מורכבת מאוד שונים מאלה הנפוץ עבור מחקרים פיזיולוגיים, כמו האחרון מושגות באמצעות מקור ייחודי של חנקן, בדרך כלל אמוניום.
בסך הכל, הפנימו עשוי להיות שולבו חלבונים או catabolized ישירות תרכובות חנקן. מבנה הרשת של חילוף החומרים חנקן מיקרואורגניזמים רבים, כולל את השמרים האפייה, מורכב מאוד בהתאם המגוון של סובסטרטים. סכמטי, מערכת זו מבוססת על השילוב של הליבה המרכזית של חילוף החומרים של חנקן אשר מזרז את interconversion של גלוטמין, גלוטמט וα-ketoglutarate10,11, עם הטרנסאמינאז ורמת deaminases. דרך רשת זו, אמין קבוצות אמוניום או חומצות אמיניות אחרות נאספים ושוחררה חומצות α-קטו. Intermediates אלה הם גם synthetized עד12,פחמן מרכזי חילוף החומרים (CCM)13. זה מספר רב של תגובות מסועף, intermediates, מעורב קטבוליזם של מקורות חנקן אקסוגני והן את אנאבוליזם proteinogenic חומצות אמינו, ממלא את הדרישות anabolic של התאים. הפעילות דרך המסלולים מחוברים שונים תוצאות גם הפרשה של מטבוליטים. בפרט, חומצות α-קטו ייתכן שתנותב דרך ארליך בשביל לייצר כהלים גבוה יותר, שלהם אצטט אסתר נגזרים14, אשר חיוני כתורמים הפרופילים חושית של מוצרים. לאחר מכן, איך פועל חנקן מטבוליזם תפקיד המפתח לייצור ביומסה, היווצרות של מולקולות נדיפות (ארומה).
תגובות, אנזימים, גנים המעורבים בחילוף החומרים חנקן מתוארים בהרחבה בספרות. עם זאת, סוגיית חלוקת מקורות חנקן רבים ברחבי רשת מטבולית לא כבר טופלה. ישנן שתי סיבות עיקריות להסביר חוסר מידע. ראשית, על רקע המורכבות חשוב של הרשת חילוף החומרים חנקן, כמות גדולה של נתונים כמותיים נדרשת עבור הבנה מלאה של הפעולה שלו, זה לא היה זמין עד עכשיו. שנית, רבים ניסיוני אילוצים ומגבלות של שיטות אנליטיות מנעו את יישום גישות ששימשו בעבר הבהרה של הפונקציה CCM.
כדי להתגבר על בעיות אלה, בחרנו לפתח גישה ברמת המערכת המבוסס על הפיוס של נתונים מתוך סדרה של ניסויים איזוטרופי מעקב. זרימת העבודה כוללת:
-קבוצת fermentations מתבצעת תחת באותם תנאים סביבתיים, בעוד מקור מזין שנבחר שונה (סובסטרט) נקראת בכל פעם.
-שילוב של תהליכים אנליטיים (HPLC, GC-MS) לקביעת מדויק, בשלבים שונים של התסיסה, של ריכוז המצע שכותרתו וריכוז שיורית והעשרה איזוטרופי של תרכובות הנגזרים קטבוליזם של מולקולת שכותרתו, כולל ביומסה נגזר.
-חישוב של האיזון מסה ו איזוטרופי לכל נצרך מולקולה שכותרתו, ניתוח משולב נוסף של ערכת הנתונים כדי לקבל סקירה הכללית של ההנהלה של מקורות מזון רבים על-ידי מיקרואורגניזמים באמצעות הקביעה של יחסי גודל השטף .
כדי להחיל מתודולוגיה זו, ישולם תשומת לב להתנהגות לשחזור של הזן/בקטריה בין תרבויות. יתר על כן, יש לקחת דגימות מתרבויות שונות במהלך התקדמות התסיסה מוגדרים היטב אותו. עבודה ניסיונית דיווח בכתב היד, מערכת בסיוע רובוט משמש לניטור המקוון של fermentations להביא בחשבון אילוצים אלה.
יתר על כן, זה חיוני לבחור סט מצעים עם תוויות (מתחם טבע, המיקום של תיוג) המתאים לדון בבעיית המדעי של המחקר. . הנה, 15התווית על-ידי N אמוניום, גלוטמין וארגינין נבחרו שלושה מקורות חנקן העיקריים שנמצאו מיץ ענבים. פעולה זו מותרת הערכת הדפוס של חנקן הפצה מחדש של תרכובות נצרך כדי חומצות האמינו את proteinogenic. אנחנו נועד גם כדי לחקור את גורלו של עמוד השדרה פחמן של חומצות האמינו נצרך את ותרומתם הייצור של מולקולות נדיפות. לפגוש את המטרה, בצורה אחידה 13התווית על-ידי C לאוצין, איזולאוצין, תראונין, ולין נכללו במחקר כמו חומצות אמינו הנגזרים intermediates העיקריים של הנתיב ארליך.
בסך הכל, באופן כמותי חרשנו שבו שמרים מנהל משאב חנקן מורכבים, בעזרת חנקן אקסוגני מקורות כדי למלא את הדרישות anabolic שלה במהלך התסיסה בעת הסרת בנוסף עודף של פחמן מבשרי כמו מולקולות נדיפות. ניתן להחיל את הליך ניסיוני דיווח בעיתון הזה לחקור מקורות תזונתיים מרובים אחרים בשימוש על ידי כל מיקרואורגניזם אחר. זה נראה גישה המתאים לניתוח של ההשפעה של הרקע הגנטי או תנאי הסביבה על התנהגות מטבולית של מיקרואורגניזמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תסיסה ודגימה
-
הכנת fermenters ומדיה
הערה: כל fermentations מתבצעות בחוץ במקביל, תוך שימוש המתח אותו, באותו כימית מוגדר בינוני סינתטי (SM, קומפוזיציה הניתנים טבלה 1), אשר כוללת תערובת של אמוניה וחומצות אמינו כמו חנקן ממקורות15. עבור כל התסיסה, תרכובת חנקן אחד מסופק באופן בלעדי בצורה אחידה שכותרתו 13C או טופס 15N (100%), בעוד האחרים נותרים ללא תווית. עבור כל מקור חנקן שכותרתו בו נעשה שימוש בערכת ניסויים (כאן: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-אך זה לא נגמר, U -13C6-Leu, U -13C5-ואל, U -13C6-איל, U -13C4-חמישי), שתיים fermenters מוכנות. עבור כל תנאי, כפולים התסיסה מתבצעת באמצעות רק מולקולות ללא תווית (פקד 7 fermentations).- עבור כל N-מקור להילמד, הכנת 500 מ"ל של SM בינוני המכיל את כל מקורות חנקן המפורטים בטבלה 1, למעט המתחם כדי לשמש 100% תוויות הטופס.
הערה: המולקולה שכותרתו נוסף בשלבים הבאים. - Pasteurize כל מדיום בבקבוקון 1 ליטר (10 דקות, 100 ° C) המכילה בר מלהיב מגנטי. שוקל את הכמות המתאימה של מולקולה שכותרתו להגיע הריכוז הסופי המדווחת ב טבלה 1 , לפזר זאת בתוך המדיום.
- לעקר את המדיום באמצעות מערכת סינון חד פעמיים ואקום (ממברנה אצטט תאית, 0.22 מיקרומטר). באמצעות צילינדר מדידה סטרילי, לחלק האמצעי בין fermenters מראש מעוקרות שני (250 מ"ל) מכילים פס מגנטי מלהיב, מצוידים. התססה מנעולים כדי למנוע כניסת חמצן, אך לאפשר את שחרורו של CO2.
- מחממים את המבחנות תסיסה עד 28 ° C על-ידי הצבתם בחדר דגירה ללילה 1 (טמפרטורה להגדיר ב 28 מעלות צלזיוס).
- עבור כל N-מקור להילמד, הכנת 500 מ"ל של SM בינוני המכיל את כל מקורות חנקן המפורטים בטבלה 1, למעט המתחם כדי לשמש 100% תוויות הטופס.
-
חיסון וניטור של fermentations
- לגדל זן cerevisiae ס צינורות סטרילי המכיל 10 מ"ל YPD בינוני ב 28 ° C עם טלטול (150 סל ד) במשך 12 שעות. לאחר מכן, pipet 1 מ"ל של YPD preculture. ולהעביר אותו ל 10 מ"ל של SM בינוני (צינורות סטרילי 15 מ"ל). דגירה התרבות של 12 שעות ב 28 ° C עם טלטול (150 סל ד).
- תחת זרימה שכבתית, לאסוף preculture aliquot, לכמת האוכלוסייה התא באמצעות מונה הניתן חלקיקים אלקטרונית זה מצויד עם צוהר 100 מיקרומטר. Centrifuge את preculture (2,000 x g, 15 דקות, 4 ° C), להשעות את צניפה ףקיהב במים סטריליים בריכוז הסופי של 2.5 x 108 תאים למ"ל המתאים. לחסן כל fermenter עם 1 מ"ל של התליה תא.
הערה: מערכת רובוטית המשמשת לפיקוח ההתקדמות תסיסה מתואר באיור1. - הכן את הפלטפורמה תסיסה על ידי התקנת fermenters את המדריכים תמיכה כמו שצריך להציב על לוחות מלהיב 21-מיקום, לקבוע את שיעור מלהיב בכל סל ד 270. כדי להתחיל מאפשר פיקוח על כל התסיסה, להפעיל את היישום בקרת רובוט, ולאחר מכן לחץ על לחצן "התחל assay" ובחר האחסון תסיסה יבוצע (300 מ ל).
- הממשק המוצג מאפשרת את הסימן של המספר המיקום של fermenters על הרציף. כדי להבטיח שמצב זה מתרחש, לחץ לחיצה ימנית על המיקום חריץ ובחרו 'הפעל' כדי להפעיל פיקוח על fermenter ממוקם במיקום זה.
- אתחל את תוכנת חישוב, לצמיתות הפועלים במערכת, לפני תחילת הרכישה משקל. לחץ על כפתור "Initialiser" ולאמת עם "אישור". לחץ על "לחצן התחל" של היישום בקרת רובוט להתחיל את הרכישות משקל.
-
הליך הדגימה
הערה: עבור כל fermenter, דגימות נלקחים כאשר ההפקה2 CO (הערך המוצג ופשוט במחשב שבו פועל את תוכנת חישוב) מגיעה נקודת-הסט נדרש: 5, 10, 40 ו- 90 g/L במחקר זה.-
דגימה נוהל תרבויות עם תרכובות עם תוויות.
- צנטריפוגה 6 מ ל שני מדגמים (2,000 x גרם, 5 דקות, 4 ° C). לשמור ולאחסן את supernatants קפוא ב- aliquots שני ב-80 מעלות צלזיוס. לשטוף את החבילות פעמיים עם מים מזוקקים מ ל, חנות ב-80 מעלות צלזיוס לשקילת איזוטרופי enrichments.
- דגימה נוהל תרבויות ללא תרכובות עם תוויות
- קציר 10 מ"ל של תרבות, אשר ישמשו לקביעת משקל יבש. גלולה התאים מדגימות 10 מ ל שני על ידי צנטריפוגה (2,000 x גרם, 5 דקות, 4 ° C). לשטוף את החבילות פעמיים עם 10 מ"ל מים מזוקקים ואחסן אותם ב- 80 ° C לקביעת חלבון ותוכן חומצת אמינו.
-
דגימה נוהל תרבויות עם תרכובות עם תוויות.
2. כימות של מקורות חנקן נצרך
-
נחישות אנזימטי של ריכוזי אמוניה שיורית
הערה: קביעת ריכוז אמוניה supernatants מתבצעת באמצעות ערכת מבוססי אנזים מסחרי; כל ריאגנטים מסופקים על ידי היצרן.- להכין פתרון אמוניה סטנדרטי (61.4 mg/L) על ידי המסת 25 מ ג של דיוק שנשקל (NH4)2אז4 ב 100 מ ל סטריליות.
- כדי ליישם הוראות היצרן, לבצע לדילול 1:2 הדגימות שנלקחו לפני התסיסה ו- 5 g/L של CO2 שוחרר. התאם את רמת החומציות של הדגימות כ 8 על-ידי הוספת 1 מ' KOH. שימו לב האחסון הוסיף, קח את זה בחשבון הגורם לדילול.
- ב- 4 מ"ל ספקטרופוטומטרים וואקום, µL 100 מיקס מדגם (מדולל במידת הצורך), מזוקק מים או פתרון אמוניה סטנדרט עם 2 מ של ריאגנט 1 (0.75 מ מ ADP ו- U/mL 30 גלוטמט דהידרוגנאז במאגר pH 7.8) ו- 500 µL של ריאגנט 2 (1.3 מ'מ NADH). תקופת דגירה של 15 דקות בטמפרטורת החדר, קרא NADH ספיגת-340 nm (A1).
- להוסיף 500 µL של ריאגנט 3 (60 מ מ α-ketoglutarate במאגר pH 8), דגירה המדגם במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולקרוא את ספיגת NADH-340 nm (A2).
- לחשב באמצעות ריכוז אמוניה:
גאמוניה (g/L) = 0.083מדגםx [(0.839 x A1-A2) - (0.839 x A1-A2)מים מזוקקים] - בדוק הריכוז הנכון מתקבל עם הפתרון הסטנדרטי.
-
כרומטוגרפי קביעת ריכוזי חומצת אמינו שיורית
הערה: קביעת ריכוזי חומצת אמינו ב supernatants מושגת באמצעות מערכת ניתוח חומצת אמינו ייעודי המבוסס על יונים כרומטוגרפיה עם פוסט derivatization עמודה של N-תרכובות עם ninhydrin, אשר מאפשר שלהם זיהוי ערכי צבע מוחלטים.- להכין פתרון הפניה על-ידי הוספת µL 200 של תערובת מסחרית של חומצות אמינו ניטרליים, חומצי, 200 µL של תערובת מסחרית של חומצות אמינו בסיסיות, 200 µL של 2.5 מ מ גלוטמין µL 400 מ מ 200 ליתיום ציטרט מאגר, pH 2.2. פתרון זה מוגדרים כימי התייחסות כאל מדגם.
- להוסיף 200 µL של 25% (w/v) sulfosalicylic תמיסה חומצית המכיל norleucine 2.5 מ מ (תקן פנימי) µL 800 של הדגימה כדי להסיר את מולקולות עם משקולות מולקולרית גבוהה. תקופת דגירה של h 1-4 ° C, צנטריפוגה (3,000 x גרם, 10 דקות, 4 ° C), מסנן דרך קרום גודל הנקבוביות ניטרוצלולוזה 0.22-מיקרומטר (מערכת מזרק).
- בתוכנה מתכנת, לחץ על לחצן "הפעל" כדי להתחיל את כרומטוגרפיה נוזלית (LC) ניתוחים במנתח מצויד עמודה קטיון (ליתיום טופס). Elute של חומצות אמינו עם מאגרי ליתיום רצופים כדי ליצור מעבר הדרגתי pH והן הדרגתי בריכוז נגד יון בשילוב עם מעבר צבע חום (טבלה 2).
- לכמת את תרכובות חנקן לאחר ninhydrin derivatization על ידי גלאי spectrophotometric-570 nm (סגול הגיוון: תגובה בין ninhydrin וקבוצת אמין של חומצות אמינו), 440 ננומטר (צהוב הגיוון: תגובה בין ninhydrin ואימין קבוצת פרולין).
- לבצע כיול פנימי של נקודה אחת באמצעות הפניה פתרון norleucine כמו תקן פנימי כדי לחשב את ריכוזי חומצות אמינו הדגימות באמצעות התוכנה של היצרן.
3. כימות של חומצות אמינו Proteinogenic
-
מידת משקל יבש תא
- סנן 10 מ"ל של תרבות דרך מסנן ניטרוצלולוזה (נקבובית גודל 0.45 מיקרומטר) כי היא מראש שנשקל במשקע אלומיניום, באמצעות מכשיר ואקום. לשטוף פעמיים עם 50 מ ל מים מזוקקים.
- מקם את המסנן בגביע אלומיניום ויבש בתנור החום ב 105 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (עד ללא שינוי נוסף במשקל נצפית) לפני ושקילה המסנן בגביע. חישוב הפרש המשקל.
- חישוב הממוצע של מדידות עצמאי לפחות 3 כדי לקבוע באופן מדויק את המשקל תאים יבשים של התרבות שמרים.
-
כימות של תכולת החלבון של תאים
הערה: כימות של השבר חלבונים מהתאים מבוצע לפחות שהפקידים באמצעות כדורי תא ללא תווית כי התקבלו כמתואר בסעיף 1.3.2.- תמצית חלבונים על ידי תוספת של 1 מ"ל של פתרון דימתיל סולפוקסיד (50% v/v) כדורי קפוא, דגירה ב 105 ° C לשעה בתנור חום יבש.
- לכמת את תכולת חלבון תמציות דימתיל סולפוקסיד באמצעות וזמינותו ערכי צבע מוחלטים הביוכימי מבוססת על צמצום על ידי חלבונים של Cu++ לתוך Cu+ יונים יש נוספת שבגינו החומצה bicinchoninic במתחם כחול (BCA assay).
-
קביעת התרומה של חומצות אמינו בתוך חלבונים
הערה: פרופיל חומצות אמינו proteinogenic נקבע לפחות שהפקידים מן התא ללא תווית כדורי (1.3.2.).- להכין תמצית חמצון על ידי השעיית בגדר תא ב 200 µL של חומצה performic (חומצה פורמית 90%, 10% חמצן). תקופת דגירה של 4 שעות ב 4 ° C ולהפסיק את התגובה על ידי התוספת של 33.6 מ ג נתרן גופרתי.
הערה: השלב חמצון נדרש כדי להמיר מתיונין sulfone ו- cysteic חומצה, אשר ניתן לכמת עוד יותר על ידי יונים כרומטוגרפיה ציסטאין ומתיונין. עם זאת, כמה חומצות אמיניות (טירוזין פנילאלנין, היסטידין, ארגינין) הם שפגע בסימני במהלך הטיפול חמצון. כתוצאה מכך, שני hydrolysates (עם ובלי חמצון) מוכנות. - להוסיף µL 800 של 6N HCl תא כדורי או מחומצן תמצית, דגירה המדגם שפופרת זכוכית הרמטית עבור h 16 ב 110 מעלות צלזיוס בתנור חום יבש. להוסיף 200 µL של 2.5 מ מ norleucine ולהסיר HCl עם זרם של חנקן. לשטוף (resuspending את תמצית יבשים ולאחר מכן להסיר את הנוזל עם זרם חנקן) פעמיים עם 800 µL של מים מזוקקים ולאחר מכן עם 800 µL של אתנול. לקחת µL 800 200 מ"מ ליתיום אצטט מאגר, pH 2.2.
הערה: תשומת הלב צריך להיות משולם את זמן הדגירה הידרוליזה כמה חומצות אמיניות אינם יציבים בתנאים חומציים. השבר טריפטופן חלבון מוערך מהנתונים שנמצאו בספרות16, כמו זו חומצת אמינו לחלוטין שפגע בסימני במהלך HCl הידרוליזה. - להכין תקן hydrolysate כיול פנימי של נקודה אחת. להוסיף µL 160 של פתרון מסחרי של חומצות אמינו הידרוליזה µL 840 200 מ"מ ליתיום אצטט מאגר, pH 2.2, המכיל 625 מיקרומטר מתיונין sulfone, 625 חומצה cysteic מיקרומטר, 625 norleucine מיקרומטר.
- לקבוע את הריכוזים היחסיים של חומצות אמינו בתוך חלבונים בשיטת כרומטוגרפי המתוארות בסעיף 2.2.
- להכין תמצית חמצון על ידי השעיית בגדר תא ב 200 µL של חומצה performic (חומצה פורמית 90%, 10% חמצן). תקופת דגירה של 4 שעות ב 4 ° C ולהפסיק את התגובה על ידי התוספת של 33.6 מ ג נתרן גופרתי.
-
חישובים
- לחשב את אחוז משקל כל חומצת אמינו בחלבונים על-ידי חלוקת כמות כל חומצה אמינית (mg/L) נמדד לפי הסכום הכולל של חומצת אמינו נמדד תמצית חלבון (סכום ב- mg/L).
- אחוז זה להכפיל הריכוז של חלבונים התרבות (mg/L), כלומר, המוצר בין התוכן חלבון של ביומסה משקל יבש, כדי להעריך את הריכוז של כל חומצת אמינו proteinogenic בתרבות (mg/L).
4. מדידה של העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו Proteinogenic
הערה: עבור המידה של העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic, השתמש כדורי תאים עם תוויות. שלושה סוכנים שונים משמשים עבור השלב derivatization לכמת את העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו. עוצמות אשכול יונים נמדדים כדי להעריך את דפוסי תיוג חומצות אמינו. האות של כל יון אשכול מקביל השפע isotopomers המונית (m0 = ללא תיוג, מ'+1 = 1 אטום עם תוויות,...) של קטע חומצה אמינית. דוגמה chromatogram המתקבל לאחר ההליך DMADMF מסופק באיור2.
-
ביומסה הידרוליזה
- Hydrolyze כדורי תא (תואם ל- 1-2 מ"ג של ביומסה מיובשים) על ידי הוספת 1.2 מ ל 6 M HCl המקננת המדגם עבור h 16 ב 105 ° C בצינורות זכוכית סגורים היטב בתנור חום יבש.
- להוסיף 1.2 מ ל מים מזוקקים, צנטריפוגה x 3000 g עבור 5 דקות כדי הסרת לכלוך הסלולר. להפיץ את תגובת שיקוע לתוך שברים µL 400 ששה צינורות זכוכית פתוח. יבש השברים בתנור החום ב 105 ° C עד שיגיעו מרקם של סירופ (4-5 שעות).
-
Derivatization Ethylchloroformate (ECF)
- להמיס את hydrolysate יבשים ב 200 µL של 20 מ מ HCl; לאחר מכן, להוסיף µL 133 פירידין: אתנול (1:4). הוסף µL 50 של ECF derivatize של חומצות אמינו ולהמתין עד כל CO2 שוחררה. להעביר את התערובת צנטריפוגה צינורות המכילות 500 µL של דיכלורומתאן לסחוט את תרכובות derivatized.
- מערבולת הצינורות עבור 10 s ו צנטריפוגה אותם במשך 4 דקות ב 10,000 x g; לאסוף את השלב אורגני התחתון עם פסטר pipet, העברה ל- GC בקבוקונים המכילים זכוכית חרוט מוסיף כך הדגימות עשוי להיות מוזרק ישירות לתוך הכלי GC/MS.
-
(N, N)-Dimethylformamide דימתיל אצטל (DMFDMA) derivatization.
- להמיס את hydrolysate מיובשים 50 µL של מתנול, 200 µL של acetonitrile. להוסיף 300 µL של DMFDMA. מערבולת הצינור ולהעביר הדוגמאות כדי GC תעשיה שבקבוקי המכילים זכוכית חרוט מוסיף.
-
N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
- להשעות את hydrolysate ב 200 µL של acetonitrile. להוסיף 200 µL של BSTFA, לסגור הרמטית את מבחנה, דגירה במשך 4 שעות ב 135 ° C לפני העברת התמצית ישירות GC בקבוקונים.
-
ניתוח GC-MS
- לנתח דגימות עם שמוצאים את זה מצויד עם מזרק תעשיה, מצמידים ספקטרומטר מסה.
- השתמש בתוכנה כלי ספציפי לשלוט המכשיר ולנתח את chromatograms. בתפריט "רצף", לחץ על "בטבלה יומן לדוגמה" כדי ליצור את רשימת הדגימה ולחץ על לחצן "הפעל" כדי להתחיל את הזריקות.
הערה: שמוצאים מצויד עם 30 מ' x 0.25 מ"מ apolar סיליקה נימי עמודה עם עובי הסרט μm 0.15. השוכן הטמפרטורה פאול ספקטרומטר מסה 150 ° C והחזק את הקו העברה ב 250 מעלות צלזיוס במשך כל הבדיקות. שלוש תוכניות אנליטית, כל אחד ספציפי לכל סוכן derivatization, משמשים. - ECF נגזרים: שימוש הליום כשלב ניידים עם קיבולת של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 230 ° C ושל המקור ב- 250 מעלות צלזיוס. תוכנית של תעשיה להחדיר µL 1 דוגמאות של פיצול יחס של 3:1. להפעיל את הבדיקות, והגדילו בהדרגה את טמפרטורת התנור כדלקמן: 130 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות; שיפוע של 15 ° C/min 260 מעלות; לשמור על הטמפרטורה ב 260 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- נגזרים DMFDMA: שימוש הליום כשלב ניידים עם זרם קבוע של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 230 ° C ושל המקור ב- 250 מעלות צלזיוס. תוכנית של תעשיה להחדיר µL 1 דוגמאות של פיצול יחס של 3:1. להפעיל את הבדיקות, והגדילו בהדרגה את טמפרטורת התנור כדלקמן: 60 מעלות צלזיוס במשך 1 דקה; שיפוע של 20 ° C/דקה עד 130 מעלות צלזיוס; הדרגה השנייה של 4 ° C/min 260 מעלות; לשמור על הטמפרטורה ב 260 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- נגזרים BSTFA: הליום שימוש כמו השלב ניידים עם זרם קבוע של 1.2 מ ל לדקה השוכן הטמפרטורה של הים 275 מעלות צלזיוס ושל המקור ב 300 º C. להפעיל את הבדיקות (הזרקת: 1 µL), בהדרגה להגדיל את טמפרטורת התנור כדלקמן: 110 ° C עבור 1 דקות; הדרגה הראשונה של 2 ° C/min 154 מעלות; הדרגה השנייה של 5 ° C/דקה עד 300 ° C; לשמור על הטמפרטורה ב 300 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
- להליך זיהוי: עבור כל מצב של derivatization, להזריק מדגם (1 µL) במצב סריקה עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV ו לרשום משך הזמן של כל חומצת אמינו.
- השתמש בערכים אלה כדי להגדיר החלונות. הזמן ברחבי chromatogram את ועבור היונים שנבחר שונה, אשר אופיינית לכל חומצה אמינית המפורטים בטבלה 3; ערכים אלה צריך להיות כלולות עבור כל חומצת אמינו. לכלול מידע זה בתוכנית זיהוי ה-SIM, להפעיל את הבדיקות במצב ה-SIM עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV.
- השתמש בתוכנה כלי ספציפי לשלוט המכשיר ולנתח את chromatograms. בתפריט "רצף", לחץ על "בטבלה יומן לדוגמה" כדי ליצור את רשימת הדגימה ולחץ על לחצן "הפעל" כדי להתחיל את הזריקות.
- לאסוף את התוצאות של הבדיקות; כלומר, עבור כל חומצת אמינו, להקליט מקבץ של עוצמות המתאימות כדי שלה isotopomers מסה שונה. לעבד נתונים באמצעות ה-dedicatedsoftware17 לתקן עבור תיוג טבעי, לחשב את העשרת איזוטרופי חומצות אמינו proteinogenic (כהגדרתו השבר שכותרתו של חומצת אמינו ביחס שלה הסכום הכולל חלבון דוגמאות).
הערה: את העשרת איזוטרופי של מולקולה (קרי), המבוטא באחוזים, חישוב חלוקת הסכום של עוצמות המתוקן isotopomers המוני עם תיוג (ז1, m2,. קובי בn) בסכום המתוקן עוצמות של כל isotopomers המוני (m0, מ'1, m2,. mn):
כלומר אני = (ז1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + mn)
- לנתח דגימות עם שמוצאים את זה מצויד עם מזרק תעשיה, מצמידים ספקטרומטר מסה.
5. כמת והעשרה איזוטרופי של תרכובות נדיפות
-
מיצוי של תרכובות נדיפות שכותרתו
- להוסיף 10 µL של סטנדרטים פנימיים deuterated 5 מ של תגובת שיקוע (הריכוז הסופי של תרכובות deuterated: µg 100/L) שפופרת זכוכית 15 מ"ל. להוסיף 1 מ"ל של דיכלורומתאן, בחוזקה לסגור את הצינורות ואת לנער אותם בפלטפורמה נדנדה 20 דק צנטריפוגה למשך 5 דקות ב g x 3000 ולאסוף השלב התחתון אורגני שפופרת זכוכית 15 מ"ל. חזור על החילוץ דיכלורומתאן.
- יבש את תמצית אורגנית מעל 500 מ"ג נתרן גופרתי נטול מים ולאסוף את שלב נוזלי עם pipet פסטר. לרכז את התמצית בפקטור של ארבעה מתחת שטף חנקן, להעביר אותו בקבוקון תעשיה GC.
-
GC-MS כימות של תרכובות נדיפות
- לצייד את הדגימות עם עמודה נימי של סיליקה fused 30 מ' x 0.25 מ"מ עם עובי הסרט μm 0.25 ולהחיל זרם קבוע הליום של 1.0 מ"ל לדקה להחזיק את מזרק לבין הקו העברה ב- 250 מעלות צלזיוס.
- להזריק µL 2 מדגם עם יחס פיצול של 10:1 ויש להפריד בין מולקולות נדיפות חילוץ באמצעות הפרופיל טמפרטורת התנור הבא: להחזיק את הטמפרטורה למשך 3 דקות ב 40 מעלות צלזיוס, להגדיל אותו על ידי 4 ° C/דקה עד 220 ° C, ולאחר מכן הקש התנור ב 220 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
- לזהות את תרכובות באמצעות ספקטרומטר מסה עם הטמפרטורה שלו המקור שוכן בגובה 230 ° C ו את הטמפרטורה פאול ספקטרומטר המסה שלו, שוכן בגובה 150 ° C. שיא מסת ספקטרום במצב נבחר יון ניטור (SIM) עם אלקטרון חיובית השפעה יינון-70 eV ושימוש האשכולות יון ספציפיים כדי תרכובות נדיפות המדווחות בטבלה4.
- השתמש כיול חיצוני של 7 נקודות כדי לכמת את ריכוזי מולקולות נדיפות מן הסכומים של עוצמות של האשכול יון המתאימים. להכין מלאי פתרונות של כל המתחם (10 גרם/ליטר) ב- 100% אתנול. לאחר מכן, הכן פתרונות סטנדרטיים עבור כל מחלקה של מולקולות נדיפות (אסטרים אתיל, מיוצרות, כהלים וחומצות) על ידי ערבוב פתרונות מניות. לבסוף, לדלל כמויות שונות של פתרונות סטנדרטיים בפתרון hydroalcoholic 12% המכיל חומצה טרטרית 5 g/L עם ה-pH להתאים ל- 3.3 להכין כיול פתרונות.
- במקביל, לתקן עבור תיוג הטבעי של עוצמות של כל אשכול יון, לחשב את העשרת איזוטרופי של תרכובות נדיפות, אשר מוגדר השבר שכותרתו של המולקולות ומבוטא כאחוז שימוש בתוכנה ייעודית 17.
6. חישובים עבור ניתוח משולב של הנתונים (dataset)
-
איסוף הנתונים הגולמיים
- באמצעות הפירוט המוצגת טבלאות 5, 6, 7, ו- 8, הזן את ערכי הנתונים הגולמיים התואמים ריכוז חומצות אמינו חוץ-תאית, משקל יבש של תאים, חלבון התוכן של תאים, ריכוז של מולקולות נדיפות, ואת איזוטרופי העשרה של חומצות אמינו proteinogenic ומולקולות נדיף.
הערה: הנתונים המוצגים בטבלאות מבוטאים מ מ. כל התוצאות מתבטאים גם ב- mg/L על ידי הכפלת הערכים מ מ משקל מולקולרי של כל מולקולה או ב- mg N/L על ידי הכפלת ריכוז חומצת אמינו proteinogenic millimolar המסה האטומית של חנקן (14 u) ועל -ידי המספר של חנקן ato ms המסופקים על-ידי קטבוליזם של מולקולה זו. - לחשב את אחוז מסת כל חומצת אמינו בחלבונים על-ידי חלוקת הכמות שלו ב- mg/L ב- hydrolysate לפי הסכום הכולל של חומצות אמינו (סכומן ב- mg/L).
- לחשב את האמצעים, סטיות תקן, תקן שגיאות של הממוצע מן הנתונים התקבלו בניסויים עצמאית.
- לחשב את ריכוז proteinogenic (mg/L) עבור כל חומצת אמינו על-ידי הכפלת האחוז של זו חומצת אמינו בחלבונים (mg aa/g חלבונים) על-ידי השבר חלבון ביומסה (גרם חלבונים/g DW) ואת תוכן משקל יבש (ביומסה ייצור) ב- בינוני (g DW/L).
- באמצעות הפירוט המוצגת טבלאות 5, 6, 7, ו- 8, הזן את ערכי הנתונים הגולמיים התואמים ריכוז חומצות אמינו חוץ-תאית, משקל יבש של תאים, חלבון התוכן של תאים, ריכוז של מולקולות נדיפות, ואת איזוטרופי העשרה של חומצות אמינו proteinogenic ומולקולות נדיף.
-
15 N מעקב איזוטרופי ניסויים
- באמצעות הפירוט המוצגים בטבלה 9, לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של חנקן הקיימים חומצות אמינו proteinogenic (מבוטא במ ג N/L) של ריכוזי הכולל שלהם (מבוטא במ ג N/L) שלהם enrichments איזוטרופי. עבור כל חומצת אמינו, השבר עם תוויות מקביל המוצר בין הריכוז שלו את העשרת איזוטרופי, החלק ללא תווית הוא ההפרש בין סך הכמויות המסומנות בתווית.
- לאחר מכן, לקבוע את השבר של חנקן הכולל בחלבונים מכילה חומצות אמינו את proteinogenic לכמת במחקר זה מסכם את הסכום הכולל של Ala, Gly, וואל, Asp, Phe, Leu, איל, חמישי, Ser, Pro, ליס, שלו, Glu, Arg (ב מ ג N/L), חלוקת סה כ הר של חנקן הכלול חלבונים על ידי סכום זה.
- לחשב את החנקן שסופקו על-ידי ארגינין, גלוטמין או אמוניום זה שוחזר בחומצות proteinogenic לכמת במחקר זה על-ידי סיכום השבר שכותרתו (ב מ ג N/L) של חומצות אמינו proteinogenic אשר היו לכמת במחקר (Ala, Gly, וואל, Asp, Phe, Leu, איל, חמישי, Ser, Pro, ליס, שלו, Glu ו Arg) במהלך הניסויים בנוכחות 15התווית על-ידי N ארגינין, גלוטמין, או אמוניום, חילוק שבר החנקן בתווית זו הסכום הכולל של חנקן ב proteinogenic כימות אמינו חומצות.
- להעריך את התרומה 3 חומצות אמינו הנפוץ ביותר לבריכה תאיים של חנקן משמש דה נובו ביוסינטזה על-ידי שילוב נתונים מן 13C ו 15N איזוטופ מעקב ניסויים (גיליון אלקטרוני, טבלה מס ' 7).
- מתוך הסכום הכולל (מבוטא במ מ) של proteinogenic ואל, Leu, איל או חמישי, לנכות את החלק נגזר שיתוף ישיר של תרכובות נצרך (13C ניסויים), החלק synthetized דה נובו באמצעות חנקן מן 3 מקורות עיקריים כדי להעריך את השבר היה synthetized דה נובו באמצעות חנקן מחומצות אמינו אחרות.
- לאחר מכן, לחשב את היחס שבין כמות חומצת אמינו דה נובו synthetized באמצעות חנקן שמספק זאת שוב Arg, NH4+ (סכום לידי ביטוי מ"מ) לסכום הכולל של proteinogenic חומצות אמינו (במ מ) לכמת את התרומה של ארגינין, גלוטמין ו אמוניום לבריכה חנקן תאיים.
-
13 C מעקב איזוטרופי ניסויים
- לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של חומצות האמינו את proteinogenic של ריכוזי לידי ביטוי מ"מ ו איזוטרופי enrichments של חומצות אמינו proteinogenic אשר התקבלו במהלך הניסויים בנוכחות 13התווית על-ידי C Leu, ואל, איל או חמישי. (ראה 6.2.1, טבלה 10).
- לחשב שברים שכותרתו, ללא תווית של תרכובות נדיפות של ריכוזי לידי ביטוי מ"מ ו איזוטרופי enrichments של תרכובות נדיפות התקבלו במהלך הניסויים בנוכחות 13התווית על-ידי C Leu, וואל, איל או חמישי ( טבלה 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תרשים 3 מציג תרשים סכימטי של זרימת העבודה שיושמה כדי לחקור את הניהול על ידי שמרים של מקורות חנקן מרובות שנמצאו במהלך התסיסה היין.
עבור נקודות שונות של הדגימה, המאפיינים ביולוגי פרמטרי – צמיחה, דפוסי צריכת החנקן לפרופיל של proteinogenic חומצות אמינו – הצג הפארמצבטית גבוהה בקרב fermentations (איור 4). עקביות זו מאמתת את הרלוונטיות של הגישה מבוססת על השילוב של נתונים שנוצר במהלך סט של 14 fermentations עצמאית.
איור 5 מציג סקירה מקיפה של הפצה מחדש של חנקן מן המקורות הזמינים ב מיץ ענבים על כל חומצות האמינו proteinogenic. ניתוח זה נתמכת בעיקר התוצאות התקבלו ניסויים במעמד 15התווית על-ידי N תרכובות. בשילוב עם הקביעה של היתרות מסה ו איזוטרופי, מדידת העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic בתנאי הראשון כימות התרומה של חנקן-מקורו ארגינין, גלוטמין, אמוניום, ועוד מקורות לקבוצות אמין של כל אחד ממרכיבים אלו. חשוב הפצה מחדש של חנקן שמסומנת בקו תחתון כאן משקף את תפקיד משמעותי דה נובו סינתזה של חומצות אמינו הסדירה צמיחת שמרים.
יתר על כן, מחקר זה, השוואת כמויות תרכובות שכותרתו בחלבונים עם הצריכה שלהם, מאפשרת את השבר של מולקולות המכילות N נצרך כי משולבים ישירות לחלבונים כאשר הם מזינים את התאים לפנות לבדיקה. חומצות אמינו Proteinogenic מובחנים לפי רמת התאגדות ישירה ביומסה; חלק מהם הם באופן בלעדי (Asp, Glu) או יותר מ- 80% דה נובו synthetized, ואילו רק כמויות קטנות של תרכובות אחרות מופקים על ידי דה נובו סינתזה. מעניין, הקבוצה האחרונה כוללת ליזין, היסטידין, אשר הם חומצות האמינו את היחידה שבה כל המקורות נצרך ישירות משולבים.
איור 5B גם מתנות, כמה חומצות אמיניות, השוואה בין כמות חומצת אמינו נצרך הוא התאושש ישירות לתוך ביומסה, מחושב מנתונים שהתקבלו בניסויים תיוג-N 15ומדד השפעול ב- 13 C-תיוג ניסויים. הבדלים קטנים בין ערכים אלה להציג את המהימנות ואת החוסן של הגישה שיושמה במחקר זה.
איור 6 מציג דוגמה כמותיים למחיצות (יחסי) של פלקסים באמצעות מסלולים מטבוליים שהושגה על-ידי ביצוע זרימת העבודה דיווח בעיתון הזה. מפה זו צוירה על ידי שילוב של מידע מעקב איזוטרופי ניסויים באמצעות N - ו 13סובסטרטים 15התווית על-ידי C ומתאר חלוקת חומצות אמינו אליפטיות נצרך ברשת מטבולית מעורב ולין, לאוצין ביוסינטזה של שמרים (לצורך חישובים, עיין טבלה 1 ו- 2 בטבלה). על ידי מדידת את הייצור ואת העשרת איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic והן תרכובות נדיפות, אנחנו העריכו את כמות תרכובות אלו שהיו synthetized של התווך פחמן של נצרך U-C13- ולין ו- U-C13- לאוצין, המתאים השבר עם תוויות של תרכובות. לאחר מכן, הצלחנו לקבוע את התרומה של CCM היווצרות שלהם (השבר ללא תווית של תרכובות). יתרות המוני פחמן להגדיר באמצעות זרימת העבודה ואת נוהל חישוב זה מוצע כאן להראות כי יותר מ 96% המתכלה ולין, לאוצין התאוששו במוצרים המרה שלהם, כלומר, proteinogenic לאוצין, ולין, נדיף גבוה יותר כהלים. ממצא זה מאשרת את התאמתו של הגישה דיווח על מחקרים כמותיים של חילוף החומרים. ניתוח משולב ומקיף הנתונים (dataset) מציע תובנות חדשות בגורלו של חומצות אמינו המתכלה. באופן מפתיע, חלק ניכר של ולין, לאוצין הם catabolized למרות חוסר איזון משמעותי בין הזמינות של תרכובות אלו במדיום התוכן שלהם ביומסה. עם זאת, השבר של אקסוגני N-תרכובות שולבו ישירות החלבונים תלויה הטבע של החומצה אמינית. נקודה מרכזית נוספת נוגעת המקור חילוף החומרים של חומצות אמינו proteinogenic ומולקולות נדיף. הניתוח של התבנית תיוג-C 13של proteinogenic לאוצין, ולין מגלה כי השלד פחמן של חומצות אמינו אלו בעיקר נובע מבשרי שהיו synthetized דרך CCM. בקנה אחד עם התבוננות זו, שילוב נמוך של תיוג באלכוהול isobutanol ו- isoamyl מדגים במעורבות קטבוליזם של ולין, לאוצין זה נאכלו על ידי שמרים היווצרות אלה כהלים גבוה מאוד מוגבל.
איור 1. אוטומטית רובוטית מערכת לניטור תפוקה גבוהה fermentations. פלטפורמה רובוטית (A). Fermenters (א) מוצבים מדריכי תמיכה במגנטי מלהיב צלחות (b). וילון אור בטיחות (ג) מגן על המשתמשים. זרוע רובוטית (ד) מעביר את fermenters במרוכז מהמיקום שלהם באחד 6 זע צלחות איזון דיוק (e) בצד השמאל של שולחן, כדי למדוד את המשקל כל 4 שעות. פלטפורמה רובוטית ממוקם בחדר טמפרטורה מבוקרת. (B) ייצוג סכמטי של ארכיטקטורת תוכנה. ממשק גרפי מאפשר למשתמשים להגדיר את הגדרות ניסיוני. מידע זה מועבר יישום הבקרה ששולט בזרוע רובוטית ומתעדת את משקל שונה בקבצי data.xlm גלם שונים (קובץ 1/תסיסה). חישוב התוכנה אוספת את הקבצים xlm ואז מחשבת, עבור כל נקודת זמן, כמות CO2 הוא שוחרר (כפי שהדבר בא לידי ביטוי g/L), אשר ביחס לסכום של סוכרים שלא נצרכו על הפעם ואת קצב התסיסה, אשר תואמת קצב הייצור של2 CO, בסול CO2/L/h (פרופורציונליים להקצב של צריכת סוכר). הנתונים מאוחסנים במסד נתונים יחסי, visualized באמצעות ממשק גרפי מסור. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 2. GC-MS ניתוח של חומצות אמינו proteinogenic: דוגמה של אלנין- Chromatogram (א) לאחר derivatization של חומצות אמינו proteinogenic באמצעות DMFDMA. (B) המונית, ספקטרום של אלנין derivatized. שתי הפסגות הראשי שיתאימו באופן חלקי עם m0/z = 99 ו m0/z = 158. (ג) Derivatization התגובה של אלנין עם DMFDMA. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3. זרימת עבודה עבור ניתוח כמותי של חילוף החומרים של חנקן מספר מקורות על ידי שמרים- התהליך כולל fermentations (i) ערכה של 28 (7 מקורות חנקן ו- fermentations עם או בלי תרכובות חנקן כפילויות); (ii) תפקיד אנליטי המערבת תהליכים שונים של חילוץ ו derivatization של מולקולות, hplc, קורס או GM-MS (iii) עיבוד נתונים גולמיים, ניתוח משולב של קבצי הנתונים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
באיור 4. הפארמצבטית של ביולוגי פרמטרי מתוך קבוצת fermentations עצמאי. (A-B) כלומר סטיות תקן של משקל יבש ותוכן חלבון שהושג fermentations עצמאית 14 מתבצעות בעזרת תרכובות ללא תווית וערכים. (C-D) כלומר סטיות תקן של proteinogenic ושל חומצות אמינו נצרך אשר נמדדו במהלך 14 fermentations עצמאית מתבצעות בעזרת תרכובות ללא תווית וערכים. ייצור CO2 : 5 (ירוק), 10 (כחול), 40 (ורוד) ו- 90 גר'/ל' (סגול) אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5. הפצה של חנקן מן המקורות העיקריים חנקן שלוש חומצות אמינו proteinogenic במהלך התסיסה. (א) מקור חילוף החומרים של חומצות אמינו proteinogenic: ישיר התאגדות של עמיתו נצרך (כחול), באמצעות חנקן שסופקו על-ידי נצרך ארגינין (כתום), גלוטמין (ירוק), אמוניום (ורוד) או אחרים (חומצות אמינו סינתזה דה נובו סגול). באחוזים מהסכום הכולל של כל חומצת אמינו proteinogenic. (B) השוואה בין כמות חומצת אמינו נצרך (כחול) והחלק של חומצה אמינו נצרך אשר הוא התאושש ישירות בחלבונים, מחושב מן הנתונים התקבלו 15N ניסויים מעקב (סגול) או ניסיוניים נמדד במהלך התסיסה עם 13התווית על-ידי C מולקולות (ורוד). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6. ניתוח כמותי של חילוף החומרים ולין, לאוצין. חלוקה למחיצות של לאוצין נצרך (ירוק), ולין (כחול) דרך הרשת מטבולית כאשר 40 g/L של CO2 מיוצרים. הסורגים ביחס לסכום של כל המתחם, באים לידי ביטוי מיקרומטר, כולל השבר היה synthetized של פחמן מרכזי חילוף החומרים (כתום). ערכים בגופן רגיל: הכמות במיקרומטר; ערכים בגופן נטוי: אחוז נצרך ולין (כחול) או לאוצין (ירוק) זה היה catabolized דרך השביל. החישובים ניתנים טבלה 1 ו- 2 בטבלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| תרכובות | כמות לליטר |
| גלוקוז C-6H-12O-6 | 240 גר' |
| חומצה מאלית C4H6O5 | 6 g |
| חומצה ציטרית C6H8O7 | 6 g |
| אשלגן פוספט ח'2PO4 | 0.75g |
| אשלגן גופרתי K2SO4 | 0.5 ג'י |
| MgSO מגנזיום גופרתי4, 7 שעות2O | 0.25 g |
| CaCl סידן כלורי2, 2 H2O | 0.155g |
| נתרן כלורי NaCl | 0.2g |
| Myo-אינוזיטול | 20 מ ג |
| סידן pantothenate | 1.5 mg |
| תיאמין הידרוכלוריד | 0.223 מ ג |
| Nicotinic חומצה | 2 מ ג |
| פירידוקסין | 0.25 מ ג |
| ביוטין | 0.003 |
| MnSO4· H2O | 4 מ ג |
| ZnSO4·7H2O | 4 מ ג |
| CuSO4·5H2O | 1 מ ג |
| CoCl2·6H2O | 0.4 מ ג |
| H3בו3 | 1 מ ג |
| (NH4) 6 מו7O24 | 1 מ ג |
| Ergosterol | 3.75 מ ג |
| חומצה אולאית | 1.25 ΜL |
| Tween 80 | 125 ΜL |
| טירוזין | 8.6 מ ג |
| טריפטופן | 84.4 מ ג |
| איזולאוצין | 15.4 מ ג |
| אספרטט | 20.9 mg |
| גלוטמט | 56.7 mg |
| ארגינין | 176.2 מ ג |
| לאוצין | 22.8 מ ג |
| תראונין | 35.7 מ ג |
| גליצין | 8.6 מ ג |
| גלוטמין | 237.8 מ ג |
| אלנין | 68.4 מ ג |
| ולין | 20.9 mg |
| מתיונין | 14.8 מ ג |
| פנילאלנין | 17.9 mg |
| סרין | 37.0 מ ג |
| היסטידין | 15.4 מ ג |
| ליזין | 8.0 מ ג |
| ציסטאין | 6.2 מ ג |
| פרולין | 288.3 מ ג |
| אמוניה כלוריד NH4קלרנית | 220 מ ג |
| ה-pH של המדיום היה להתאים ל- 3.3 עם NaOH 10 מ'. | |
טבלה 1. ההרכב של המדיום סינתטי השתמשו במחקר זה. מוגדרים כימי בינוני מחקה את ההרכב של מיץ ענבים.
| • תנאי מאגר | טמפרטורה | |
| בין 0 ל- 6 דקות | ליתיום ציטרט, 200 מ מ, pH 2.8 | 32 ° C |
| 6-38 דקות | ליתיום ציטרט, 300 מ"מ, pH 3 | 32 ° C |
| מ- 38 ל 57 דקות | ליתיום ציטרט, 500 מ מ, pH 3.15 | 64.5 ° C |
| מ 57 ל 83 דקות | ליתיום ציטרט, 900 מ"מ, pH 3.5 | 75 ° C |
| מ- 83 עד 120 דקות | ליתיום ציטרט, 1650 מ מ, pH 3.55 | 75 ° C |
| בין 120 ל 130 דקות | הידרוקסיד ליתיום, 300 מ"מ |
בטבלה 2. התנאים בהם נעשה שימוש לצורך הקמת מכשול ההפרדה של חומצות אמינו על ידי יונים כרומטוגרפיה. • תנאי מאגרי עם ריכוז מלח מוגבר משמשים במרוכז בשילוב עם מעבר צבע חום כדי לאפשר את ההפרדה חומצות אמינו.
| חומצות אמינו | ריאגנט derivatizing | RT (דקות) | יון אשכולות (מ/z) |
| אלנין | ECF | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| גליצין | ECF | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECF | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| ולין | ECF | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| לאוצין | ECF | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| איזולאוצין | ECF | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| תראונין | ECF | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECF | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| סרין | ECF | 6.53 | 132 133, 134, 135 |
| ECF | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| פרולין | ECF | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| אספרטט | ECF | 7.89 | 188 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| גלוטמט | ECF | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| פנילאלנין | ECF | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| ליזין | ECF | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| היסטידין | ECF | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| ארגינין | BSTFAג | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| . ECF, אתיל chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-dimethylformamide dibutyl אצטל; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
בטבלה 3. פרמטרים אנליטיים בשימוש מצפני איזוטרופי enrichments של חומצות אמינו באמצעות יון שנבחר ניטור מצב (SIM). טבלה זו מסכמת את חומרים כימיים המשמשים derivatization, את משך הזמן של תרכובות derivatized, מקבץ של יונים השיג ב MS (מצב ההשפעה אלקטרון) עבור כל חומצת אמינו.
| חומצות אמינו | ריאגנט derivatizing | RT (דקות) | יון אשכולות (מ/z) |
| אלנין | ECF | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| גליצין | ECF | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECF | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| ולין | ECF | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| לאוצין | ECF | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| איזולאוצין | ECF | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECF | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECF | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| סרין | ECF | 6.53 | 132 133, 134, 135 |
| ECF | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| פרולין | ECF | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| אספרטט | ECF | 7.89 | 188 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| גלוטמט | ECF | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| פנילאלנין | ECF | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| ליזין | ECF | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| היסטידין | ECF | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| ארגינין | BSTFAג | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
בטבלה 4. פרמטרים אנליטיים בשימוש הקביעה של enrichments איזוטרופי כימות של תרכובות נדיפות באמצעות יון שנבחר ניטור (SIM) במצב. טבלה זו מסכמת את משך הזמן של האשכול של יונים שהושג ב MS (מצב ההשפעה אלקטרון) עבור כל תרכובת נדיפים.
טבלה 5. עיבוד נתונים גולמיים המתקבל כימות של משקעי חומצות אמינו הנתונים (dataset) מכיל נתוני מדידות של חומצות אמינו הראשונית שיורית. ערכים אלה משמשים כדי לחשב את כמות חומצת אמינו נצרך (על-ידי חיסור). סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
טבלה 6. עיבוד נתונים גולמיים המתקבל כימות של חומצות אמינו proteinogenic. זו ערכת נתונים מכיל נתונים על ההרכב בחומצות אמינו של ביומסה hydrolysates (A) לבין השבר של חלבונים ביומסה (B). ערכים אלה משמשים כדי להעריך את אחוז מסת כל חומצת אמינו בחלבונים (C). סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
טבלה מס ' 7. Proteinogenic חומצות אמינו. גיליון אלקטרוני זה משמש כדי לחשב את הריכוז (במ מ) של חומצות אמינו proteinogenic נתונים מסוכמים בטבלה 5 , טבלה 6. סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
בטבלה 8. עיבוד נתונים גולמיים המתקבל כימות של כהלים גבוה יותר. הנתונים (dataset) כולל נתונים המידות של ריכוזים תרכובת נדיפים (A) וממיר הנתונים ביחידות של mg/L מיקרומטר (B). סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
בטבלה 9. עיבוד נתונים גולמיים המתקבל הקביעה של enrichments איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic באמצעות 15סובסטרטים התווית על-ידי N.
סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
טבלה 10. עיבוד נתונים גולמיים המתקבל הקביעה של enrichments איזוטרופי של חומצות אמינו proteinogenic, תרכובות נדיפות באמצעות 13סובסטרטים התווית על-ידי ג.
סטיות תקן ואמצעים מחושבים לחישובים נוספים. אנא לחץ כאן כדי להוריד את השולחן הזה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
לכימות חלוקת תרכובות דרך רשתות מטבוליות באמצעות מעקב איזוטרופי הניסויים היא גישה מבטיחה להבנת פעולת חילוף החומרים מיקרוביאלי. מתודולוגיה זו, בעוד הוחלו בהצלחה עם מצעים עם תוויות אחד או שניים, כעת אפשרות ליישם ללמוד מטבוליזם של מקורות שונים באמצעות מספר איזוטופים אלמנטלים שכותרתו (קרי, מצעים יותר משני). אכן, טכניקות אנליטיות הזמינים מאפשרים הקביעה מדויקת של הדפוסים תיוג של חומצות אמינו proteinogenic ומולקולות אך ורק בעת שימוש איזוטופים של רכיב יחיד ואולי גם כאשר תיוג במשותף עם שני אלמנטים. כתוצאה מכך, כתובת מגבלות אלה, להעריך את הניהול של מקורות מזון רבים על-ידי מיקרואורגניזמים, בחרנו לחזור על ערכה של תרבויות מתחת לאותם תנאים סביבתיים תוך תיוג מצע שנבחרו עם 13C או 15 N איזוטופים. . אז, עוד שילוב של המידע הספציפי הניתן על ידי כל 13C או 15N מעקב הניסוי מציע תצוגה מורחבת כמותית של חילוף החומרים של מקורות רבים.
ההישג של הגישה שדווחה מסתמך על היישום של סדרת לשחזור תרבויות בתנאים סטנדרטיים, על האוסף של דגימות מתוך אוכלוסיה של תאים במצב פיזיולוגי מוגדרים אשר זהה עבור כל התרבויות (תא צמיחה, הצריכה של סובסטרט, וכו '). תנאים אלה צריכים להתקיים כך והנתונים שהתקבלו בניסויים עצמאי יכול להיות מעורב ניתח ביחד. סיפוק אילוצים אלה דורש תכופים ומדויקים פיקוח על פעילות מיקרוביאלית אשר בוצע, עבודה ניסויית דיווחו כאן, באמצעות מערכת בסיוע רובוט עבור ניטור מקוונת של פעילות התסיסה השמרים. עם זאת, שיטות קונבנציונליות יותר מיקרואורגניזם טיפוח וניטור, כגון הקביעה של צמיחת תאים על ידי מדידת צפיפות אופטית, יכול לשמש כדי לנרמל את הליך הדגימה.
עוד תנאי הכרחי לביצוע מתודולוגיה זו הוא צריך חזון ברור של מסלולים מטבוליים המעורבים הרשת להיחקר. הידע הזה הוא חיוני לבחירת קבוצת מצעים עם תוויות שאינן המתאים ביותר להתמודדות עם הנושא נחקר. תרכובות שכותרתו כמו גם את הטבע והמיקום של תיוג (13ג, 15N או אחרים) בתוך המולקולות יש לבחור כראוי על מנת אני) לשחזר את כל התוויות שמספק את מצעים בשנת תרכובות הנגזרים קטבוליזם שלהם. והם עוד ניתח הליך, ii) להשיג נתונים יתירים הממחישים את הדיוק של המתודולוגיה, את תוקפו של הממצאים. ההליך המתואר כאן כולל גם מספר חשוב של ניתוח זה יכול להיות זמן רב ויקרות משאבים אנושיים וכספיים. יתר על כן, מספר אילוצים אנליטית ניתן להגביל את השימוש מתודולוגיה זו. ראשית, משתמשים צריכים להבטיח כי כל השיטות אנליטי נדרשות עבור כימות של תרכובות המיוצרים במהלך חילוף החומרים מיקרוביאלי, מצפני שלהם העשרה איזוטרופי הינם זמינים. שנית, גישה זו חלה רק על הערכת חילוף החומרים של סובסטרטים אילו כל שההמרה תרכובות מיוצרים בכמויות מספיקות כדי ניתן לכמת במדויק.
בנייר זה, נוכל להחיל זרימת עבודה זו כדי לחקור את הניהול של מספר מקורות חנקן על ידי שמרים במהלך התסיסה היין. דו ח זה הציע תובנות חדשות על שמרים מטבוליזם, כולל את קטבוליזם משמעותי של חומצות אמינו הנצרכים ביותר, בשילוב עם שלהם נמוכה ישירה שהשתלבה חלבונים, וההשתתפות העיקריים של CCM לספק סימנים מקדימים המשמשות נוסף שני דה נובו הסינתזה של חומצות אמינו proteinogenic, היווצרות של מולקולות נדיפות.
להפכה, הגישה המתוארת כאן ניתן לכימות תנועת חלוקת סובסטרטים מרובים באמצעות רשת מטבולית של מיקרואורגניזם כלשהו. זה יאפשר חוקרים התירי את גורלו של כל התרכובות נצרך לאחר כניסתם לתאים כדי לטפל הזיהוי של המקור מטבולית של סימנים מקדימים ומוצרים. מידע זה יכול להיות שימושי כדי להשוות את הפעילות המטבולית של זנים בעלי מרקע גנטי או לגדול בתנאים שונים, וכתוצאה מכך עבור תכנון רציונלי אסטרטגיות לשיפור תהליכי תסיסה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים ז'אן רוש מורה, סילבי Dequin ו ז'אן-מארי Sabalyrolles לתרום התפיסה של מערכת רובוטית בסיוע תסיסה, מרטין Pradal, ניקולא בובייה, פסקל Brial לתמיכה טכנית שלהם. מימון עבור פרוייקט זה סופק על ידי Ministère de l'Education נאסיונאל, דה לה רשרש et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
