Summary
Denne protokollen beskriver en eksperimentelle prosedyren kvantitativt og omfattende undersøke metabolismen av flere næringsstoffer kilder. Denne arbeidsflyten, basert på en kombinasjon av isotopanrikning tracer eksperimenter og en analytiske prosedyren kan skjebnen til brukte næringsstoffer og metabolske opprinnelsen til molekyler synthetized av mikroorganismer skal fastsettes.
Abstract
Studier innen mikrobiologi stole på gjennomføringen av en rekke metoder. Spesielt bidrar utviklingen av egnede metoder vesentlig til å gi omfattende kunnskap om metabolismen av mikroorganismer vokser i kjemisk definerte mediet som inneholder unike nitrogen og karbon kilder. Derimot forblir styring gjennom metabolisme av flere næringsstoffer kilder, til tross for sin brede tilstedeværelse i natur- eller industrielle miljøer, nesten ukjente. Denne situasjonen skyldes hovedsakelig mangel på passende metoder, som hindrer undersøkelser.
Vi rapporterer en eksperimentell strategi kvantitativt og omfattende utforske hvordan stoffskiftet fungerer når et næringsstoff som finnes som en blanding av ulike molekyler, i.e., en omfattende ressurs. Her beskriver vi sin søknad for å vurdere partisjonering flere nitrogen kilder gjennom gjær metabolske nettverket. Arbeidsflyten kombinerer informasjon innhentet under stabil isotop tracer eksperimenter med valgte 13C- eller 15N-merket underlag. Den første består av parallelle og reproduserbar fermentations i samme medium, som inneholder en blanding av N inneholder molekyler; men er en valgte nitrogen kilde merket hver gang. En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) er gjennomført å vurdere merking mønstre av målrettet forbindelser og å kvantifisere forbruk og gjenoppretting av underlag i andre metabolitter. En integrert analyse av hele datasettet gir en oversikt over skjebnen til brukte underlag i celler. Dette krever en presis protokoll for innsamling av prøver-tilrettelagt av en robot-assistert system for avlytting av fermentations- og oppnåelse av mange tidkrevende analyser. Til tross for disse begrensningene er lov det forståelse for første gang, partisjonering av flere nitrogen kilder på gjær metabolske nettverket. Vi belyst videreformidling av nitrogen fra mer rikelig kilder mot andre N-forbindelser og bestemt metabolske opprinnelsen til ustabile molekyler og proteinogenic aminosyrer.
Introduction
Forstå er hvordan mikrobiell metabolisme driver en viktig sak for utformingen av effektive strategier for å forbedre gjæring prosesser og modulere produksjonen av fermentative forbindelser. Fremskritt i genomics og funksjonell genomforskning i disse to siste tiårene i stor grad bidratt til å utvide kunnskapen om topologien for metabolske nettverk i mange mikroorganismer. Tilgang til denne informasjonen førte til utviklingen av tilnærminger som mål for en omfattende oversikt over cellulære funksjoner1. Disse metodene er ofte avhengige av en modell-basert tolkning av målbare parametere. Disse eksperimentelle data omfatter, på den ene siden metabolitten opptak og produksjon priser, og på den annen side, kvantitativ intracellulær informasjon som hentes fra isotop tracer eksperimenter. Disse dataene inneholder viktig informasjon om fradrag i vivo aktivitet av ulike veier i en definert metabolske nettverk2,3,4. Foreløpig tilgjengelig analytiske teknikker bare aktiverer nøyaktig påvisning av merking mønstre av molekyler ved en ett element isotop og muligens når co merking med to isotopanrikning elementer. Videre under de fleste vekst forhold består karbon kilde bare av én eller to-forbindelser. Følgelig ble tilnærminger basert på 13C-isotopanrikning tracers fra karbon underlag utbredt og vellykket brukt til å utvikle en fullstendig forståelse av karbon metabolske nettverk operasjoner5,6,7 ,8.
I kontrast i mange naturlige og industrielle miljøer består tilgjengelig nitrogen ressursen som støtter mikrobiell vekst ofte av en rekke molekyler. For eksempel i vin eller øl gjæring leveres nitrogen som en blanding av 18 aminosyrer og ammonium variabel konsentrasjoner9. Dette rekke N forbindelser som er tilgjengelige for anabolism gjør disse komplekse media forholdene svært forskjellig fra de som vanligvis brukes for fysiologiske studier, som sistnevnte er oppnådd ved hjelp av en unik kilde til nitrogen, vanligvis ammonium.
Samlet internalisert nitrogen forbindelser kan være direkte innlemmet i proteiner eller catabolized. Nettverkets struktur av nitrogen stoffskiftet i mange mikroorganismer, inkludert gjær Saccharomyces cerevisiae, er svært kompleks i samsvar med mangfoldet av underlag. Skjematisk, er dette systemet basert på kombinasjonen av den sentrale kjernen av nitrogen stoffskifte som gir interconversion glutamin, glutamat og α-ketoglutarate10,11, transaminaser og deaminases. Gjennom dette nettverket, Amin grupper fra ammonium eller andre aminosyrer er samlet og α-keto syrer utgitt. Disse mellomprodukter er også synthetized til sentrale karbon metabolisme (CCM)12,13. Antall forgrenet reaksjoner og mellomprodukter, involvert i både katabolisme eksogene nitrogen kilder og anabolism av proteinogenic aminosyrer, oppfyller kravene anabole cellene. Aktiviteten gjennom disse forskjellige sammenkoblede ruter resulterer også i utskillelse av metabolitter. Spesielt kan α-keto syrer bli sendt gjennom Ehrlich sti å produsere høyere alkoholer og deres acetate ester derivater14, som er viktige bidragsytere til sensorisk profil av produkter. Deretter spiller hvordan nitrogen metabolisme opererer en nøkkelrolle i biomasse produksjon og dannelsen av flyktige molekyler (aroma).
Reaksjoner, enzymer og gener involvert i nitrogen metabolisme er grundig beskrevet i litteraturen. Men har spørsmålet om distribusjon av flere nitrogen kilder gjennom et metabolske nettverk ikke ennå blitt adressert. Det er to hovedgrunner som forklarer denne mangelen på informasjon. Først lys viktig kompleksiteten av nitrogen metabolisme nettverket, en stor mengde kvantitative data er nødvendig for en fullstendig forståelse av driften som ikke var tilgjengelig før nå. Andre, mange eksperimentelle begrensninger og begrensninger av analytiske metoder hindret gjennomføringen av tilnærminger som tidligere ble brukt til utviklingen av CCM-funksjonen.
For å overvinne disse problemene, valgte vi å utvikle en systemnivå tilnærming basert på avstemming av data fra en rekke isotopanrikning tracer eksperimenter. Arbeidsflyten inneholder:
-Et sett av fermentations utført under samme miljømessige forhold, mens en annen valgte næringsstoffer kilde (substrat) er merket hver gang.
-En kombinasjon av analytisk prosedyrer (HPLC, GC-MS) for en nøyaktig bestemmelse, på ulike stadier av gjæring, gjenværende konsentrasjonen av merket substrat og konsentrasjonen og isotopanrikning anriking av forbindelser som er avledet fra katabolisme av merket molekyl, inkludert avledede biomasse.
– En beregning av masse og isotopanrikning saldoen for hver fortært merket molekylet og en mer integrert analyse av datasettet å få en generell oversikt over forvaltningen av flere næringsstoffer kilder av mikroorganismer gjennom bestemmelse av flux prosenter .
Hvis du vil bruke denne metoden, må oppmerksomhet betales i reproduserbar virkemåten til den belastning/microorganism mellom kulturer. Videre må prøver fra ulike kulturer tas under samme veldefinerte gjæring utviklingen. I eksperimentelle arbeidet i dette manuskriptet, brukes en robot-assistert system for avlytting av fermentations å ta hensyn til disse begrensninger.
Det er viktig å velge et sett med merket underlag (sammensatte, natur og plasseringen av merkingen) som passer til til vitenskapelige problemet av studien. Her, ble 15N-merket ammonium, glutamin og arginin valgt som tre store nitrogen kildene funnet i druesaft. Dette tillot vurdere mønster av nitrogen omfordeling fra brukte forbindelser til aminosyrer proteinogenic. Vi har også som mål å undersøke skjebnen til karbon ryggraden i brukte aminosyrer og deres bidrag til produksjonen av flyktige molekyler. For å oppfylle dette målet, jevnt 13C-merket leucine, ble isoleucin, threonin og Valin inkludert i studien som aminosyrer som er avledet fra store intermediates av Ehrlich veien.
Samlet utforsket vi kvantitativt hvordan gjær administrerer en kompleks nitrogen ressurs ved å omfordele eksogene nitrogen kilder for å oppfylle sin anabole krav gjennom gjæring under i tillegg fjerning overskytende av karbon prekursorer som flyktige molekyler. Den eksperimentelle prosedyren i notatet kan brukes for å undersøke andre flere næringsstoffer kilder brukes av noen andre microorganism. Det synes å være en passende tilnærming for analyse av virkningen av genetisk bakgrunn eller miljøforhold på metabolske virkemåten av mikroorganismer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. gjæring og prøvetaking
-
Utarbeidelse av media og fermenters
Merk: Alle fermentations er utført parallelt, bruker den samme stammen og på samme kjemisk definert syntetiske medium (SM, komposisjon i tabell 1), som inneholder en blanding av ammonium og aminosyrer nitrogen kilder15. For hver gjæring tilbys et enkelt nitrogen sammensatt utelukkende i jevnt merket 13C eller 15N skjemaer (100%), mens andre fortsatt umerket. For hver merket nitrogen kilde som brukes i en rekke eksperimenter (her: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), to fermenters tilberedes. For hver tilstand utføres like gjæring med bare umerkede molekyler (7 kontroll fermentations).- For hver N-kilde studeres, forberede 500 mL SM medium som inneholder alle nitrogen kilder oppført i tabell 1, med unntak av sammensatt i 100% merket skjemaet.
Merk: Merket molekylet legges i neste trinn. - Pasteurize medium i en 1 L kolbe (10 min, 100 ° C) som inneholder en magnetisk gripende bar. Veie riktig mengde merket molekyl å nå endelige konsentrasjonen som rapporteres i tabell 1 og oppløse den i medium.
- Sterilisere mediet bruker en engangs vakuum filtreringssystem (celluloseacetat membran, 0.22 µm). Bruker en steril måling sylinder, dele medium mellom to pre-sterilisert fermenters (250 mL) som inneholder en magnetisk gripende bar, og er utstyrt med gjæring låser unngå oppføringen av oksygen, men la utgivelsen av CO2.
- Varme gjæring kolber 28 ° c ved å plassere dem i inkubasjon rom for 1 natt (temperatur satt på 28 ° C).
- For hver N-kilde studeres, forberede 500 mL SM medium som inneholder alle nitrogen kilder oppført i tabell 1, med unntak av sammensatt i 100% merket skjemaet.
-
Vaksinering og overvåking av fermentations
- Vokse S. cerevisiae stamme i sterilt rør som inneholder 10 mL av YPD medium på 28 ° C med skjelvende (150 rpm) 12 h. Deretter Pipetter 1 mL av YPD preculture og overføre den til 10 mL av SM medium (i 15 mL steril rør). Inkuber kultur for 12 h på 28 ° C med skjelvende (150 rpm).
- Under laminær strømning, samle en preculture aliquot og kvantifisere celle befolkningen med en elektronisk partikkel teller som er utstyrt med en 100 µm blenderåpning. Sentrifuge preculture (2000 x g, 15 min, 4 ° C) og suspendere pellet i en passende mengde sterilt vann for å få en endelig konsentrasjon av 2.5 x 108 celler/mL. Vaksinere hver fermentor med 1 mL av cellen suspensjon.
Merk: Robotic systemet brukes til å overvåke fremdriften gjæring er beskrevet i figur 1. - Forberede gjæring plattformen ved å installere fermenters i støtte guider som er riktig plassert på 21-posisjon gripende platene og angi omrøring hastigheten på 270 rpm. For å starte online overvåking av hver gjæring, starte robot-kontroll, og klikk "start analysen" og velg den gjæring volumet utføres (300 mL).
- Vises grensesnittet tillater indikasjon på nummeret og plasseringen av fermenters på plattformen. For å sikre dette skjer, høyreklikk på hvor sporet og velg "Aktiver" for å aktivere overvåking av fermentor i denne posisjonen.
- Initialisere beregning programvaren, permanent kjører på systemet, før du starter vekt oppkjøpet. Klikk på knappen "Initialiser" og bekreft med "ok". Klikk på "startknappen" på robot-kontroll programmet starte vekt oppkjøp.
-
Utvalg prosedyre
Merk: Hver fermentor, prøvene er tatt når CO2 produksjon (verdi vises online på datamaskinen som kjører programmet beregning) når nødvendig set-punkt: 5, 10, 40 og 90 g/L i denne studien.-
Prøvetaking prosedyre for kulturer med merket forbindelser.
- Sentrifuge to 6 mL prøvene (2000 x g, 5 min, 4 ° C). Lagre og lagre de frosne supernatants i to dele på-80 ° C. Vask pellets to ganger med 5 mL destillert vann og butikk på-80 ° C for måling av isotopanrikning enrichments.
- Prøvetaking prosedyre for kulturer uten merket forbindelser
- Innhøstingen 10 mL av kultur, som vil bli brukt for tørr vekt vilje. Pellets cellene fra to 10 mL prøver med sentrifugering (2000 x g, 5 min, 4 ° C). Vask pellets to ganger med 10 mL destillert vann og lagre dem på-80 ° C for fastsettelse av protein og aminosyren innhold.
-
Prøvetaking prosedyre for kulturer med merket forbindelser.
2. kvantifisering av brukte Nitrogen kilder
-
Enzymatisk fastsettelse av gjenværende ammoniakk konsentrasjoner
Merk: Bestemmelse av ammoniakk konsentrasjon i supernatants er gjennomført med en kommersiell enzym-baserte kit; alle reagenser leveres av produsenten.- Forberede en standard ammoniakk løsning (61,4 mg/L) av oppløsende 25 mg nettopp vektet (NH4)2så4 i en 100 mL volumetriske kolbe.
- For å oppfylle produsentens instruksjoner, kan du utføre en 1:2 fortynning av prøver som ble tatt før gjæring og 5 g/L av CO2 utgitt. Justere pH i prøvene til ca 8 ved å legge til 1 M KOH. Legg merke til ekstra volumet og ta det i betraktning i fortynning faktor.
- I 4 mL spektrofotometer cuvettes, blanding 100 µL av prøven (utvannet om nødvendig), destillert vann eller standard ammoniakk løsning med 2 mL reagens 1 (0,75 mM ADP og 30 U/mL glutamat dehydrogenase pH 7,8 buffer) og 500 µL til reagensen 2 (1,3 mM NADH). Inkuber i 15 min ved romtemperatur og lese NADH absorbans ved 340 nm (A1).
- Legge til 500 µL til reagensen 3 (60 mM α-ketoglutarate i pH 8 buffer), ruge utvalget for 20 min ved romtemperatur og lese NADH absorbansen på 340 nm (A2).
- Beregne ammoniakk konsentrasjon bruke:
Cammoniakk (finans) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)eksempel- (0.839 x A1-A2)destillert vann] - Kontroller at riktig konsentrasjonen oppnås med standard løsningen.
-
Brukt kromatografiske besluttsomhet for gjenværende aminosyre
Merk: Bestemmelse av aminosyre konsentrasjonene i supernatants oppnås ved å bruke en dedikert aminosyre analyse basert på ion-exchange kromatografi med innlegget kolonnen derivatization N-forbindelser med ninhydrin, som gjør deres kolorimetrisk gjenkjenning.- Forberede en referanse løsning ved å legge til 200 µL av en kommersiell blanding av nøytral og sure aminosyrer, 200 µL av en kommersiell blanding av grunnleggende aminosyrer og 200 µL av 2,5 glutamin 400 µL av 200 mM litium citrate buffer, pH 2.2. Kjemisk definerte referanse løsningen behandles som et eksempel.
- Legge til 200 µL av 25% (w/v) sulfosalicylic sur løsning som inneholder 2,5 norleucine (intern standard) 800 µL av prøve å fjerne molekyler med høy molekylvekt. Inkuber 1t på 4 ° C, sentrifuger (3000 x g, 10 min, 4 ° C) og filtrere gjennom en 0.22-µm pore-størrelse nitrocellulose membran (sprøyte system).
- I programmerer programvare, klikk på knappen "Kjør" for å begynne den flytende kromatografi (Langbane) analyser med analyzer utstyrt med en cation exchange kolonne (litium skjema). Elute aminosyrer med påfølgende litium buffere å lage både en pH gradering og en forløpning i mot konsentrasjon i kombinasjon med en temperaturgradient (tabell 2).
- Kvantifisere nitrogenholdige forbindelser etter ninhydrin derivatization av en Spektrofotometri detektor på 570 nm (lilla farge: reaksjon mellom ninhydrin og Amin gruppe aminosyrer) og 440 nm (gul farge: reaksjon mellom ninhydrin og imine gruppe proline).
- Utføre en ett-punkts interne kalibrering bruker referanse løsningen og norleucine som en intern standard beregne konsentrasjonen av aminosyrer i eksemplene bruker produsentens programvare.
3. kvantifisering av Proteinogenic aminosyrer
-
Måling av tørr celle vekt
- Filtrere 10 mL kultur gjennom en nitrocellulose filter (pore størrelse 0.45 µm) som er pre vektet i en aluminium cup, bruker en vakuum enhet. Vask to ganger med 50 mL destillert vann.
- Plasser filteret i aluminium cup og tørke i en varme ovn ved 105 ° C i 48 timer (inntil ingen ytterligere endring i vekt er observert) før reweighing filteret i koppen. Beregne vekten forskjellen.
- Beregne gjennomsnittet av minst 3 uavhengige mål å nøyaktig fastslå tørr celle vekten av gjær kultur.
-
Kvantifisering av proteininnhold av celler
Merk: Kvantifisering av protein fraksjon i cellene utføres minst i tre eksemplarer bruker umerkede celle pellets som er oppnådd som beskrevet i delen 1.3.2.- Ekstra proteiner ved tillegg av 1 mL av DMSO løsning (50% v/v) til frosset pellets og ruge på 105 ° C i 1 time i en tørr varme ovnen.
- Kvantifisere proteininnholdet i DMSO ekstrakter bruker biokjemiske kolorimetrisk analysen som er basert på reduksjon av proteiner av Cu++ i Cu+ ioner som er videre utløst av bicinchoninic syre i en blå kompleks (BCA analysen).
-
Fastsettelse av den relative bidrag av aminosyrer i proteiner
Merk: Profil proteinogenic aminosyrer bestemmes minst i tre eksemplarer fra umerkede celle pellets (1.3.2.).- Forberede en oksidert ekstrakt av suspendere celle pellet i 200 µL performic syre (90% maursyre, 10% hydrogenperoksid). Inkuber 4 h på 4 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 33,6 mg natrium sulfat.
Merk: Oksidasjon trinn kreves for å konvertere cystein og metionin til metionin sulfone og cysteic syre, som vil bli ytterligere kvantifisert ved ion-exchange kromatografi. Men er noen aminosyrer (tyrosin, fenylalanin, histidin og arginin) denaturert under oksidasjon behandling. Derfor tilberedes to hydrolyserte (med og uten oksidasjon). - Legge til 800 µL av 6N HCl celle pellets eller oksidert ekstrakt og ruge prøven i et hermetisk lukket glassrør 16 h på 110 ° C i en tørr varme ovnen. Legge til 200 µL av 2,5 norleucine og fjerne HCl med en strøm av nitrogen. Vask (resuspending tørket ekstrakt og deretter fjerne væske med en nitrogen strøm) to ganger med 800 µL destillert vann og deretter med 800 µL av etanol. Ta i 800 µL av 200 mM litium acetate buffer, pH 2.2.
Merk: Oppmerksomhet bør vies til inkubasjon tiden for hydrolyse, som noen aminosyrer ikke er stabil Sure forhold. Den tryptofan fraksjon i protein er anslått fra dataene i litteratur16, som denne aminosyren er helt denaturert under HCl hydrolyse. - Forberede en hydrolyse standard ett-punkts interne kalibreringen. Legge til 160 µL av en kommersiell løsning av hydrolyzed aminosyrer 840 µL av 200 mM litium acetate buffer, pH 2.2, som inneholder 625 µM metionin sulfone, 625 µM cysteic syre og 625 µM norleucine.
- Bestem de relative konsentrasjonene av aminosyrer i proteiner med brukt kromatografiske metoden beskrevet i delen 2.2.
- Forberede en oksidert ekstrakt av suspendere celle pellet i 200 µL performic syre (90% maursyre, 10% hydrogenperoksid). Inkuber 4 h på 4 ° C og stoppe reaksjonen ved tilsetning av 33,6 mg natrium sulfat.
-
Beregninger
- Beregne ønsket vekt hver aminosyrer i proteiner ved det målte beløpet av hver aminosyre (mg/L) av den totale mengden aminosyre som ble målt i protein ekstrakt (summen i mg/L).
- Multiplisere denne prosentandelen av konsentrasjonen av proteiner i kultur (mg/L), dvs, produktet mellom proteininnholdet i biomasse og tørr vekt, vurdere konsentrasjonen av hver proteinogenic aminosyre i kultur (mg/L).
4. måling av isotopanrikning anriking av Proteinogenic aminosyrer
Merk: For måling av isotopanrikning anriking av proteinogenic aminosyrer, bruke merket celle pellets. Tre forskjellige agenter brukes for derivatization trinn for å kvantifisere isotopanrikning anriking av aminosyrer. Intensiteten av klyngen ioner måles for å anslå merking mønstre av aminosyrer. Signalet fra hver klynge ion tilsvarer overflod av masse isotopomers (m0 = uten merking, m1 = 1 merket atom,...) av en aminosyre fragment. Et eksempel på en chromatogram som er innhentet etter DMADMF prosedyren finnes i figur 2.
-
Biomasse hydrolyse
- Hydrolyze celle pellets (tilsvarende 1-2 mg tørket biomasse) ved å legge 1,2 mL av 6 M HCl og rugende utvalget for 16 h på 105 ° C i tett lukket BILLEDRØR i en tørr varme ovnen.
- Legge til 1,2 mL destillert vann og sentrifuger 3000 x g i 5 min fjerne mobilnettet rusk. Distribuere nedbryting i seks 400 µL brøker i åpne BILLEDRØR. Tørr fraksjoner i en varme ovn ved 105 ° C før de når konsistensen av sirup (4-5 h).
-
Ethylchloroformate (ECF) derivatization
- Oppløse det tørkede hydrolysatet i 200 µL 20 mm HCl; Legg deretter til 133 µL av pyridine: etanol (1:4). Legge til 50 µL av ECF derivatize aminosyrer og vent til alle CO2 har blitt utgitt. Overføre blandingen til å sentrifuge rør som inneholder 500 µL av diklormetan å pakke den derivatized forbindelser.
- Vortex rør for 10 s og sentrifuger dem for 4 min 10 000 x g; samle den lavere organiske fasen Pasteur Pipetter og overføring til GC ampuller som inneholder konisk glass setter slik at prøvene kan injiseres direkte inn i GC/MS apparatet.
-
(N, N)-vannistedenfor dimethyl acetal (DMFDMA) derivatization.
- Oppløse det tørkede hydrolysatet i 50 µL av metanol og 200 µL av acetonitrile. Legge til 300 µL av DMFDMA. Vortex tube og overføre prøvene til GC autosampler ampuller som inneholder konisk glass setter inn.
-
N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
- Avbryte hydrolysatet 200 µL av acetonitrile. Legge til 200 µL av BSTFA, hermetisk tett til røret og ruge 4 h på 135 ° C før du overfører ekstrakt direkte til GC hetteglass.
-
GC-MS analyse
- Analysere prøver med en gasskromatograf som er utstyrt med en autosampler-injektor og er koblet til en masse spectrometer.
- Bruk instrument-spesifikk programvare å styre maskinen og analysere chromatograms. Klikk "Logg eksempeltabellen" for å opprette eksempellisten i "Sequence"-menyen, og klikk "Kjør" for å starte injeksjoner.
Merk: Gasskromatograf er utstyrt med en 30 m x 0,25 mm apolar silica kapillær kolonne med 0,15 μm filmen tykkelse. Still inn masse spectrometer quadrupole temperaturen på 150 ° C og holde overføringslinjen til 250 ° C for alle analyser. Tre analyseprogrammer, en spesielt for hver derivatization agent, brukes. - ECF derivater: Bruk helium som den mobile fasen med en flyt av 1,2 mL/min. Still inntemperaturen inntakets på 230 ° C og for kilden til 250 ° C. Programmet autosampler å injisere 1 µL av prøver med delt forholdet 3:1. Kjøre analyser, gradvis øke ovn temperatur som følger: 130 ° C i 3 min; gradering av 15 ° C/min 260 ° c; opprettholde temperaturen på 260 ° C i 20 min.
- DMFDMA derivater: Bruk helium som den mobile fasen med en konstant flyt av 1,2 mL/min. Still inntemperaturen inntakets på 230 ° C og for kilden til 250 ° C. Programmet autosampler å injisere 1 µL av prøver med delt forholdet 3:1. Kjøre analyser, gradvis øke ovn temperatur som følger: 60 ° C i 1 min; gradering av 20 ° C/min til 130 ° C; andre gradient 4 ° C/min 260 ° c; opprettholde temperaturen på 260 ° C i 10 min.
- BSTFA derivater: Bruk helium som den mobile fasen med en konstant flyt av 1,2 mL/min. Still inntemperaturen inntakets på 275 ° C og for kilden på 300 grader C. Kjøre analysene (injeksjon: 1 µL), gradvis økende ovn temperatur som følger: 110 ° C i 1 min; første stigning på 2 ° C/min 154 ° c; andre gradient på 5 ° C/min 300 ° c; opprettholde temperaturen på 300 ° C i 10 min.
- Detection prosedyre: For hver modus av derivatization, injisere en prøve (1 µL) i skannemodus med positiv elektron innvirkning ionisering på 70 eV og Legg merke til tiden av hver aminosyre.
- Bruk disse verdiene til å definere tidsvinduer gjennom chromatogram og de ulike valgte ionene, som er karakteristisk for hver aminosyre og oppført i tabell 3; disse verdiene skal inkluderes for hver aminosyre. Inkludere denne informasjonen i programmet SIM gjenkjenning og kjøre analysene i SIM-modus med positiv elektron innvirkning ionisering på 70 eV.
- Bruk instrument-spesifikk programvare å styre maskinen og analysere chromatograms. Klikk "Logg eksempeltabellen" for å opprette eksempellisten i "Sequence"-menyen, og klikk "Kjør" for å starte injeksjoner.
- Samle resultatene av analyser; nemlig, for hver aminosyre, registrere en klynge av intensitet som svarer til sine ulike masse isotopomers. Behandle dataene med de dedicatedsoftware17 rette for naturlig merking og beregne isotopanrikning anriking av proteinogenic aminosyrer (definert som merket brøkdel av en aminosyre forhold til totale beløpet i protein eksempler).
Merk: Isotopanrikning anriking av et molekyl (dvs.), uttrykt som en prosentandel, beregnes dividere summen av korrigert intensiteten av masse isotopomers med merking (m1, m2,... .mn) med summen av den korrigerte intensiteter av alle masse isotopomers (m0, m1, m2,... mn):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + mn)
- Analysere prøver med en gasskromatograf som er utstyrt med en autosampler-injektor og er koblet til en masse spectrometer.
5. kvantifisering og isotopanrikning berikelse av flyktige forbindelser
-
Utvinning av merket flyktige forbindelser
- Legge til 10 µL deuterated interne standarder 5 mL av nedbryting (siste konsentrasjon av deuterated forbindelser: 100 µg/L) i 15 mL røret. Legge 1 mL av diklormetan, tett lukke rør og riste dem på en rocking plattform for 20 min. sentrifuge for 5 min på 3000 x g og samle den organiske lavere fasen i 15 mL røret. Gjenta diklormetan utvinning.
- Tørt organisk ekstrakt over 500 mg av vannfri natrium sulfat og samle flytende fase med en Pasteur pipetter. Konsentrere utdrag med en faktor på fire under nitrogen flux og overføre den til GC autosampler ampuller.
-
GC-MS kvantifisering av flyktige forbindelser
- Utstyre gasskromatograf 30 m x 0,25 mm smeltet silica kapillær kolonnen med 0,25 μm filmen tykkelse og bruke en konstant helium flyt av 1,0 mL/min. Hold injektoren og overføringslinjen til 250 ° C.
- Injisere 2 µL av prøve med en del 10:1 og skille utdraget flyktige molekylene ved hjelp av følgende ovn temperatur profilen: holder temperaturen i 3 minutter på 40 ° C, øke den med 4 ° C/min opp til 220 ° C og deretter hold ovn ved 220 ° C for 20 min.
- Oppdage forbindelsene med en masse spectrometer med sin kilde temperatur satt på 230 ° C og sin masse spectrometer quadrupole temperatur satt på 150 ° C. Registrere til masse spectra i valgt Ion overvåking (SIM)-modus med positiv elektron innvirkning ionisering på 70 eV og bruke ion klynger spesifikke til de flyktige forbindelsene som er rapportert i Tabell 4.
- Bruk en ekstern 7-punkts kalibrering for å kvantifisere konsentrasjonen av flyktige molekyler fra summene av intensiteten av tilsvarende ion klyngen. Klargjør lager løsninger av hver sammensatte (10 g/L) i 100% etanol. Deretter forberede standard løsninger for hver klasse av flyktige molekyler (etyl estere, acetates, alkoholer og syrer) ved å blande lager løsninger. Til slutt, fortynne ulike mengder av standard løsninger i en 12% hydroalcoholic løsning med 5 g/L tartaric syre pH tilpasset 3.3 å forberede kalibrering løsninger.
- Parallelt, korrigere naturlig merkingen av intensiteten av hver ion sektorgruppe og beregne isotopanrikning anriking av flyktige forbindelser, som er definert som merket brøkdel av molekyler og er uttrykt i prosent ved hjelp av dedikert programvare 17.
6. beregninger for en integrert analyse av datasettet
-
Samling av rådata
- Bruk regneark i tabeller 5, 6, 7 og 8, angi rå dataverdiene som tilsvarer konsentrasjonen av ekstracellulære aminosyrer, celle tørr vekt, proteininnhold av celler, konsentrasjon av flyktige molekyler, og isotopanrikning anriking av proteinogenic aminosyrer og flyktige molekyler.
Merk: Dataene i tabeller er uttrykt i mM. Alle resultatene er også uttrykt i mg/L ved å multiplisere verdiene i mM med molekylvekt av hvert molekyl eller i mg N finans ved å multiplisere millimolar konsentrasjonen av en proteinogenic aminosyren av atomic massen av nitrogen (14 u) og antall nitrogen ato MS som leveres av nedbrytningen av dette molekylet. - Beregne den masse hver aminosyrer i proteiner ved beløpet i mg/L i hydrolysatet med den totale mengden aminosyrer (deres sum i mg/L).
- Beregne betyr, standardavvik og standardfeil for gjennomsnittet fra data som ble innhentet i den uavhengige eksperimenter.
- Beregne proteinogenic konsentrasjonen (mg/L) for hver aminosyre ved å multiplisere prosentandelen av denne aminosyren i proteiner (mg aa/g proteiner) av protein fraksjon i biomasse (g proteiner/g DW) og tørr vekt innholdet (biomasse produksjon) i den medium (g DW/L).
- Bruk regneark i tabeller 5, 6, 7 og 8, angi rå dataverdiene som tilsvarer konsentrasjonen av ekstracellulære aminosyrer, celle tørr vekt, proteininnhold av celler, konsentrasjon av flyktige molekyler, og isotopanrikning anriking av proteinogenic aminosyrer og flyktige molekyler.
-
15 N isotopanrikning tracer eksperimenter
- Ved hjelp av regneark som er presentert i tabell 9, beregne med og uten etiketter fraksjoner av nitrogen som finnes i proteinogenic aminosyrer (uttrykt i mg N/L) fra deres totale konsentrasjoner (uttrykt i mg N/L) og deres isotopanrikning enrichments. For hver aminosyre, merket brøken tilsvarer produktet mellom totale konsentrasjonen og en isotopanrikning berikelse, og den umerkede delen er forskjellen mellom totalen og merket beløpene.
- Deretter kan du se delen av totalt nitrogen i proteiner som finnes i proteinogenic aminosyrer kvantifisert i denne studien ved summere den totale mengden Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu og Arg (i mg N/L) og dele totalen en montering av nitrogen finnes i proteiner denne summen.
- Beregne nitrogen fra arginine og glutamin ammonium som ble gjenopprettet i proteinogenic syrer kvantifisert i denne studien ved å summere merket brøkdel (i mg N/L) av proteinogenic aminosyrer som kvantifisert i studien (Ala Gly Val, Asp, Phe Leu Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, hans, Glu og Arg) under eksperimenter i nærvær av 15N-merket arginin, glutamin, eller ammonium og dele dette merket nitrogen brøkdel av den totale mengden av nitrogen i den kvantifisert proteinogenic aminosyre syrer.
- Vurdere bidrag av 3 rikeste aminosyrer til intracellulær pool av nitrogen brukes for de novo biosyntesen ved å kombinere data fra 13C og 15N isotop tracer eksperimenter (regneark i Tabell 7).
- Av det totale beløpet (uttrykt i mM) av proteinogenic Val, Leu, Ile eller Thr, trekke delen av direkte inkorporering av brukte forbindelser (13C eksperimenter) og delen som var de novo synthetized med nitrogen fra 3 viktige kilder for å vurdere brøken som var de novo synthetized med nitrogen fra andre aminosyrer.
- Deretter beregne forholdet mellom mengden av aminosyre de novo synthetized med nitrogen tilbys av Gln og Arg NH4+ (summen i mM) til den totale mengden proteinogenic aminosyrer (i mM) å kvantifisere bidrag av arginin, glutamin og ammoniumsulfat til intracellulær nitrogen bassenget.
-
13 C isotopanrikning tracer eksperimenter
- Beregne med og uten etiketter fraksjoner av proteinogenic aminosyrer fra konsentrasjoner i mM og isotopanrikning enrichments av proteinogenic aminosyrer som ble innhentet under eksperimenter i nærvær av 13C-merket Leu, Val, Ile eller Thr. (se 6.2.1, Tabell 10).
- Beregne med og uten etiketter fraksjoner av flyktige forbindelser fra konsentrasjoner i mM og isotopanrikning enrichments av flyktige forbindelser som ble innhentet under eksperimenter i nærvær av 13C-merket Leu, Val, Ile eller Thr ( Tabell 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 3 viser en skjematisk diagram for arbeidsflyten som ble gjennomført for å undersøke forvaltningen av gjær flere nitrogen kilder finnes i vin gjæring.
For ulike steder av prøvetaking, biologiske parametere-vekst egenskapene, nitrogen forbruksmønstre og profilen proteinogenic aminosyrer-Vis en høy reproduserbarhet blant fermentations (Figur 4). Konsistens validerer relevansen av tilnærming basert på en kombinasjon som ble generert et sett av 14 uavhengig fermentations.
Figur 5 viser en omfattende oversikt over videreformidling av nitrogen fra kilder som er tilgjengelige i druesaft å alle proteinogenic aminosyrer. Denne analysen støttes hovedsakelig av resultatene som ble oppnådd fra eksperimenter utført i nærvær av 15N-merket forbindelser. Kombinert med fastsettelse av masse og isotopanrikning saldoene, gitt måling av isotopanrikning anriking av proteinogenic aminosyrer den første kvantifiseringen av bidrag av nitrogen opprinnelse arginin, glutamin, ammonium og andre kilder til Amin grupper av hver av disse forbindelsene. Viktig omfordeling av nitrogen som er understreket her gjenspeiler betydelige rollen de novo syntese av aminosyrer i opprettholde gjær vekst.
Videre kan denne studien, sammenligne beløpene av merket forbindelser i proteiner med forbruket sitt, brøkdel av brukte N inneholder molekyler som er direkte tatt inn proteiner når de angir cellene skal vurderes. Proteinogenic aminosyrer er differensiert etter graden av direkte innlemmelse i biomasse; noen av dem er utelukkende (Asp, Glu) eller mer enn 80% de novo synthetized, mens bare små mengder av andre forbindelser genereres av de novo syntese. Interessant, omfatter denne siste gruppen lysin og histidin, som er den eneste aminosyrer som alle brukte kildene er direkte tatt.
Figur 5B også presenterer, for noen aminosyrer, en sammenligning mellom mengden av fortært aminosyre som gjenvinnes direkte i biomasse, beregnet ut fra data innhentet i 15N-merking eksperimenter og målt eksperimentelt i 13 C-merking eksperimenter. Små forskjeller mellom disse verdiene viser påliteligheten og robustheten av tilnærming som ble implementert i denne studien.
Figur 6 viser et eksempel på kvantitative partisjonering (prosenter) av flukser gjennom metabolske veier som ble oppnådd ved å implementere arbeidsflyten rapportert i dette papiret. Dette kartet ble trukket ved å kombinere informasjon fra isotopanrikning tracer eksperimenter ved hjelp av 15N- og 13C-merket underlag og beskriver partisjonering av brukte alifatisk aminosyrer i metabolske nettverket som er involvert i Valin og leucine biosyntesen i gjær (beregninger, se tabell 1 og tabell 2). Ved å måle produksjon og isotopanrikning anriking av både proteinogenic aminosyrer og flyktige forbindelser, vurdert vi hvor mye disse forbindelser som ble synthetized fra karbon-infrastruktur brukte U-C13- Valin og U-C13- leucine, som svarer til merket brøk av forbindelser. Senere, klarte vi å finne ut bidrag av CCM til deres dannelse (umerket brøkdel av forbindelser). Karbon masse saldoer som er definert ved hjelp av arbeidsflyten og fremgangsmåten som foreslås her viser at mer enn 96% av brukte Valin og leucine gjenopprettes i deres konvertering produkter, nemlig, proteinogenic leucine og Valin og flyktig høyere alkoholer. Dette funnet bekrefter hensiktsmessigheten av de rapporterte tilnærming for kvantitative studier av stoffskiftet. Integrert og omfattende analyse av datasettet gir ny innsikt i skjebnen til brukte aminosyrer. Overraskende, er en betydelig del av Valin og leucine catabolized til tross for en betydelig ubalanse mellom tilgjengeligheten av disse forbindelsene i medium og innholdet i biomasse. Imidlertid brøkdel av eksogene N-forbindelser direkte tatt inn proteiner, avhenger av hva slags aminosyren. Et annet viktig poeng gjelder metabolske opprinnelsen til proteinogenic aminosyrer og flyktige molekyler. Analyse av 13C-merking mønsteret av proteinogenic leucine og Valin avslører at karbon skjelettet av disse aminosyrer hovedsakelig kommer fra prekursorer som var synthetized gjennom CCM. I tråd med denne observasjonen viser lav inkorporering av merking i isobutanol og isoamyl alkohol svært begrenset involvering av nedbrytningen av Valin og leucine som ble brukt av gjær i dannelsen av disse høyere alkoholer.
Figur 1. Automatisert robot system for overvåking høy gjennomstrømming fermentations. (A) robot plattform. Fermenters (a) er plassert i støtte guider på magnetiske gripende plater (b). En sikkerhet lys gardin (c) beskytter brukerne. En robotarm (d) flytter fermenters suksessivt fra sin beliggenhet på en av 6 røring platene til en presisjon balanse (e) til venstre på skrivebordet, måle vekten hver 4 timer. Robotic plattformen ligger i et temperaturkontrollerte rom. (B) skjematisk fremstilling av programvaren arkitekturen. Et grafisk grensesnitt lar brukerne definere eksperimentelle innstillinger. Denne informasjonen overføres til programmet kontroll som kontrollerer robotarmen og registrerer de forskjellige veier i forskjellige rå data.xlm filer (1 fil/gjæring). Beregning programvaren deretter samler xlm-filer og beregner, for hvert punkt, mengden CO2 som utgitt (uttrykt i finans), som er proporsjonal med hvor mye sukker som har blitt brukt på denne tiden, og gjæring hastigheten, som tilsvarer frekvensen av CO2 produksjon i g CO2/L/h (proporsjonal med sukker forbruksraten). Dataene er lagret i en relasjonsdatabase, og visualisert ved hjelp av et viet grafisk grensesnitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. GC-MS analyse av proteinogenic aminosyrer: eksempel på alanin. (A) Chromatogram oppnådd etter derivatization proteinogenic aminosyrer med DMFDMA. (B) masse spektra av derivatized alanin. To viktigste toppene som tilsvarer fragmenter med m0z = 99 og m0z = 158. (C) Derivatization reaksjon alanin med DMFDMA. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Arbeidsflyt for kvantitativ analyse av metabolismen av flere nitrogen kilder av gjær. Denne prosessen inneholder (i) en rekke 28 fermentations (7 nitrogen kilder og fermentations med eller uten nitrogenholdige forbindelser i duplikat); (ii) en analytisk del som involverer ulike prosedyrer utvinning og derivatization molekyler, HPLC eller GM-MS analyser og (iii) behandling av rådata og en integrert analyse av datasett. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Reproduserbarhet biologiske parametere fra et sett med uavhengige fermentations. (A-B) Mener verdier og standardavvik av tørr vekt og proteininnhold som ble Hentet fra de 14 uavhengig fermentations utført med umerkede forbindelser. (C-D) Mener verdier og standardavvik av proteinogenic og brukte aminosyrer som ble målt under 14 uavhengig fermentations utført med umerkede forbindelser. CO2 produksjon: 5 (grønn), 10 (blå), 40 (rosa) og 90 (lilla) finans Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Videreformidling av nitrogen fra tre store nitrogen kilder til proteinogenic aminosyrer under gjæringen. (A) metabolske opprinnelsen til proteinogenic aminosyrer: direkte innlemmelse av brukte motpart (blå) og de novo syntese med nitrogen brukte arginine (oransje), glutamin (grønn), ammonium (rosa) eller andre aminosyrer ( lilla). Uttrykt som en prosentandel av den totale mengden aminosyre hver proteinogenic. (B) sammenligning mellom mengden av fortært aminosyre (blå) og delen av den brukte aminosyren som gjenvinnes direkte i proteiner, beregnes fra data som ble innhentet i 15N tracer eksperimenter (lilla) eller eksperimentelt målt i gjæring med 13C-merket molekyler (rosa). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6. Kvantitativ analyse av Valin og leucine stoffskifte. Partisjonering av brukte leucine (grønn) og Valin (blå) gjennom metabolske nettverket når 40 g/L av CO2 er produsert. Barer er proporsjonal med hvor mye hver sammensatte og uttrykkes i µM, inkludert delen som ble synthetized fra sentrale karbon metabolisme (oransje). Verdier i vanlig skrift: beløpet i µM; verdier i kursiv skrift: prosentandel av brukte Valin (blå) eller leucine (grønn) som var catabolized gjennom sti. Beregningene er gitt i tabell 1 og tabell 2. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Forbindelser | Beløp per liter |
| Glukose C6H12O6 | 240 g |
| Eplesyre C4H6O5 | 6 g |
| Sitronsyre C6H8O7 | 6 g |
| Kalium fosfat KH2PO4 | 0,75 g |
| Kalium sulfate K2SO4 | 0,5 g |
| Magnesium sulfat MgSO4, 7 H2O | 0,25 g |
| Veisalt CaCl2, 2 H2O | 0.155g |
| Natriumklorid NaCl | 0.2g |
| Myo-inositol | 20 mg |
| Kalsium pantothenate | 1.5 mg |
| Thiamin hydrochloride | 0.223 mg |
| Nikotinsyre | 2 mg |
| Pyridoksin | 0,25 mg |
| Biotin | 0.003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 mg |
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterol | 3.75 mg |
| Oljesyre | 1,25 ΜL |
| Tween 80 | 125 ΜL |
| Tyrosin | 8.6 mg |
| Tryptofan | 84.4 mg |
| Isoleucin | 15,4-tommers mg |
| Aspartate | 20.9 mg |
| Glutamat | 56,7 mg |
| Arginin | 176.2 mg |
| Leucine | 22.8 mg |
| Threonin | 35.7 mg |
| Glysin | 8.6 mg |
| Glutamin | 237.8 mg |
| Alanin | 68.4 mg |
| Valin | 20.9 mg |
| Metionin | 14.8 mg |
| Fenylalanin | 17,9 mg |
| Serine | 37.0 mg |
| Histidin | 15,4-tommers mg |
| Lysin | 8.0 mg |
| Cystein | 6.2 mg |
| ProLine | 288.3 mg |
| Ammoniakk klorid NH4Cl | 220 mg |
| PH i mediet ble justert til 3.3 med NaOH 10 M. | |
Tabell 1. Sammensetningen av syntetiske mediet som brukes i denne studien. Dette kjemisk definerte mediet etterligner sammensetningen av drue juice.
| Elueringsbufferen | Temperatur | |
| Fra 0 til 6 min | Litium citrate, 200 mM, pH 2.8 | 32 ° C |
| Fra 6 til 38 min | Litium citrate, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| Fra 38 til 57 min | Litium citrate, 500 mM, pH 3.15 | 64,5 ° C |
| Fra 57 til 83 min | Litium citrate, 900 mM, pH 3,5 | 75 ° C |
| Fra 83 til 120 min | Litium citrate, 1650 mM, pH 3,55 | 75 ° C |
| Fra 120 til 130 min | Litium hydroxyde, 300 mM |
Tabell 2. Betingelsene brukes for separasjon av aminosyrer av ion-exchange kromatografi. Elueringsrør buffere med økt salt konsentrasjoner brukes suksessivt i kombinasjon med en temperaturgradient aktivere separasjon av aminosyrer.
| Aminosyrer | Derivatizing reagensen | RT (min) | Ion klynger (m/z) |
| Alanin | ECFen | 3.86 | 116 117 118, 119 |
| DMFDMAb | 6,37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6,37 | 158 159 160, 161 | |
| Glysin | ECFen | 4,19 | 102, 103, 104 |
| ECFen | 4,19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFen | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186 187 188, 189, 190, 191 | |
| Leucine | ECFen | 5,67 | 158 159 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFen | 5.85 | 158 159 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFen | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFen | 6.48 | 175 176 177, 178, 179 | |
| Serine | ECFen | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFen | 6.53 | 175 176 177, 178 | |
| ProLine | ECFen | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECFen | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216 217 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFen | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenylalanin | ECFen | 9.53 | 192 193 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFen | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFen | 12,54 | 327 328 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174 175 176, 177, 178, 179 |
| en ECF, etyl chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-vannistedenfor dibutyl acetal; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tabell 3. Analytiske parametere brukt for fastsettelse av isotopanrikning enrichments av aminosyrer med valgte ion overvåking (SIM)-modus. Denne tabellen oppsummerer de kjemiske stoffer brukt for derivatization, tiden av derivatized forbindelser og klyngen ioner innhentet i MS (modus Electron virkningen) for hver aminosyre.
| Aminosyrer | Derivatizing reagensen | RT (min) | Ion klynger (m/z) |
| Alanin | ECFen | 3.86 | 116 117 118, 119 |
| DMFDMAb | 6,37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6,37 | 158 159 160, 161 | |
| Glysin | ECFen | 4,19 | 102, 103, 104 |
| ECFen | 4,19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFen | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186 187 188, 189, 190, 191 | |
| Leucine | ECFen | 5,67 | 158 159 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucin | ECFen | 5.85 | 158 159 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFen | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFen | 6.48 | 175 176 177, 178, 179 | |
| Serine | ECFen | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFen | 6.53 | 175 176 177, 178 | |
| ProLine | ECFen | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartate | ECFen | 7,89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216 217 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFen | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenylalanin | ECFen | 9.53 | 192 193 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lysin | ECFen | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFen | 12,54 | 327 328 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174 175 176, 177, 178, 179 |
Tabell 4. Analytiske parametere brukt for fastsettelse av isotopanrikning enrichments og måling av flyktige forbindelser med valgte ion overvåking (SIM) modus. Denne tabellen oppsummerer oppbevaringsperioden og klyngen ioner innhentet i MS (modus Electron virkningen) for hver flyktige sammensatte.
Tabell 5. Behandling av rådata fra kvantifisering av gjenværende aminosyrer Dataset inneholder data fra målinger av første og gjenværende aminosyrer. Disse verdiene brukes til å beregne hvor mye brukte aminosyre (ved subtraksjon). Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Tabell 6. Behandling av rådata fra kvantifisering av proteinogenic aminosyrer. Dataset inneholder opplysninger om sammensetningen på aminosyrer av biomasse hydrolyserte (A) og brøkdel av proteiner i biomasse (B). Disse verdiene brukes til å vurdere masse andelen hver aminosyrer i proteiner (C). Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Tabell 7. Proteinogenic aminosyrer. Dette regnearket brukes til å beregne konsentrasjonen (i mM) av proteinogenic aminosyrer fra dataene oppsummert i tabell 5 og tabell 6. Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Tabell 8. Behandling av rådata fra kvantifisering av høyere alkoholer. Datasett inkluderer data fra målinger av flyktige sammensatte konsentrasjoner (A) og konverterer data uttrykt i enheter av mg/L til µM (B). Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Tabell 9. Behandling av rådata fra fastsettelse av isotopanrikning enrichments proteinogenic aminosyrer med 15N-merket underlag.
Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Tabell 10. Behandling av rådata fra fastsettelse av isotopanrikning enrichments proteinogenic aminosyrer og flyktige forbindelser med 13C-merket underlag.
Midler og standardavvik beregnes for ytterligere beregninger. Klikk her for å laste ned denne tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvantifisere partisjonering av forbindelser via metabolske nettverk som bruker isotopanrikning tracer eksperimenter er en lovende tilnærming for å forstå drift av mikrobielle metabolisme. Nå denne metodikken, mens ble brukt med en eller to merket underlag, kan ikke implementeres for å studere metabolisme av ulike kilder ved hjelp av flere merket elementær isotoper (dvs., mer enn to underlag). Faktisk kan tilgjengelig analytiske teknikker nøyaktig bestemmelse av merking mønstre av proteinogenic aminosyrer og molekyler utelukkende når du bruker isotoper for ett enkelt element og muligens når co merking med to elementer. Derfor, for å håndtere disse begrensningene og vurdere styring av flere næringsstoffer kilder av mikroorganismer, valgte vi å gjenta en rekke kulturer under samme miljøforholdene mens merking en valgte underlaget med 13C eller 15 N isotoper. Deretter videre tilbyr kombinasjon av bestemt informasjon som gis av hver 13C eller 15N tracer eksperiment en kvantitativ utvidet visning av metabolismen av flere kilder.
Oppnåelse av den rapporterte tilnærmingen avhenger på gjennomføringen av en reproduserbar rekke kulturer under standard betingelser og innsamling av utvalg fra en populasjon av celler i en definert fysiologisk tilstand som er den samme for alle kulturer (celle vekst, forbruk av underlaget, etc.). Disse forholdene må tilfredsstilles slik at data fra uavhengige eksperimenter kan blandes og analysert sammen. Tilfredsstillende disse begrensningene krever nøyaktig og hyppige overvåking av mikrobiell aktivitet som ble gjennomført, i eksperimentelle arbeidet rapporterte her med en robot-assistert system for avlytting gjær fermentering aktivitet. Mer konvensjonelle metoder for microorganism dyrking og overvåking, som fastsettelse av cellevekst ved å måle optisk densitet, kan imidlertid brukes til å normalisere prøvetaking prosedyren.
En annen forutsetning for å utføre denne metoden er å ha en klar visjon av metabolske veier som er involvert i nettverket undersøkes. Denne kunnskapen er avgjørende for å velge hvilke merket underlag som er den mest hensiktsmessige for å håndtere problemet blir studert. Merket forbindelser samt natur og plasseringen av merkingen (13C, 15N eller andre) i molekylene velges passende for jeg) gjenopprette alle etikettene som substrater i forbindelsene som er avledet fra deres katabolisme og er videre analysert i prosedyren og ii) få overflødige data som viser nøyaktigheten av metodikken og gyldigheten av funnene. Fremgangsmåten som er beskrevet her inkluderer også en viktig antall analyser som kan være tidkrevende og kostbare i menneskelige og økonomiske ressurser. Videre kan noen analytisk begrensninger begrense bruken av denne metoden. Brukerne bør forsikre at alle analytiske metoder som er nødvendige for kvantifisering av forbindelser produsert under mikrobiell metabolisme og er tilgjengelig for fastsettelse av deres isotopanrikning berikelse. Andre gjelder denne tilnærmingen bare vurdere metabolismen av underlag for som alle omdanne forbindelser er produsert i tilstrekkelige mengder til kvantifiseres nøyaktig.
I dette papiret brukt vi denne arbeidsflyten for å utforske styring av flere nitrogen kilder av gjær i vin gjæring. Denne rapporten tilbudt ny innsikt i gjær metabolismen, inkludert den betydelige katabolisme av mest brukte aminosyrer, kombinert med deres lave direkte inkorporering proteiner og store bidrag av CCM levere prekursorer som brukes videre til både de novo syntese av proteinogenic aminosyrer og dannelsen av flyktige molekyler.
Videre, fremgangsmåten som er beskrevet her kan brukes for kvantifisere partisjonering av flere underlag gjennom metabolske nettverket av noen mikroorganismen. Det vil tillate forskere å belyse skjebnen til alle brukte forbindelser etter de inn cellene og å ta identifikasjon av metabolske opprinnelsen til prekursorer og produkter. Denne informasjonen kan være nyttig for å sammenligne metabolske aktiviteten av stammer som har forskjellig genetisk bakgrunn eller vokse under ulike forhold, og derfor utforme rasjonell strategier for å forbedre gjæring prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin og Jean-Marie Sabalyrolles for å bidra til oppfatningen av robot-assistert gjæring og Martine Pradal, Nicolas Bouvier og Pascale Brial deres kundestøtte. Midler til prosjektet ble gitt av Ministère de l'Education Nationale de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
