Summary
Этот протокол описывает экспериментальная процедура количественно и всесторонне расследовать метаболизм нескольких источников питательных веществ. Этот рабочий процесс, основываясь на комбинации изотопный трассирующими экспериментов и аналитические процедуры, позволяет судьба потребленных питательных веществ и метаболизма происхождение молекул синтезированный микроорганизмами, которые будут определены.
Abstract
Исследования в области микробиологии полагаться на осуществление широкого круга методологий. В частности разработки надлежащих методов существенно способствует обеспечению обширные знания метаболизма микроорганизмов, растущих в химически определенных носителей, содержащих уникальные азота и углерода источников. В отличие от управления через метаболизм нескольких источников питательных веществ, несмотря на их широкое присутствие в природных и промышленных средах, остается практически неисследованной. Эта ситуация объясняется главным образом отсутствием подходящих методологий, который препятствует расследований.
Мы приводим экспериментальная стратегия количественно и всесторонне исследовать, как метаболизм работает когда питательных предоставляется как смесь различных молекул, т.е., комплекс ресурс. Здесь мы описываем его применения для оценки разделение нескольких источников азота через сеть метаболических дрожжей. Рабочий процесс сочетает в себе информацию, полученную во время экспериментов трассирующими стабильный изотоп с помощью выбранных 13C - или 15N-меченых субстратов. Первый состоит из параллельных и воспроизводимые брожения в той же среде, которая включает в себя смесь N-содержащих молекул; Однако источник выбранного азота помечается каждый раз. Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) осуществляется для оценки маркировки образцы целевых соединений и количественной оценки потребления и восстановления субстратов в других метаболитов. Комплексный анализ полного набора данных обзор о судьбе потребляемых субстратов внутри клетки. Этот подход требует точной протокол для сбора образцов – способствует робот помощь система онлайн мониторинга брожения – и достижения многочисленных времени анализа. Несмотря на эти ограничения она позволила, понимание, в первый раз, перегородки из нескольких источников азота во всей сети метаболических дрожжей. Мы прояснили перераспределение азота из более обильные источники к другим N-соединений и определяется метаболических происхождение летучих молекул и proteinogenic аминокислоты.
Introduction
Понимание как работает микробного метаболизма является ключевым вопросом для разработки эффективных стратегий для улучшения процессов ферментации и модулировать производства бродильных соединений. Достижения в области геномики и функциональной геномики в эти последние два десятилетия в значительной мере способствовали расширение знаний о топологии метаболических сетей в многих микроорганизмов. Доступ к этой информации привело к разработке подходов, которые направлены на всесторонний обзор сотовой функция1. Эти методологии часто полагаются на основе модели интерпретации измеримых параметров. Эти экспериментальные данные включают, с одной стороны, показатели поглощения и производства метаболит, и, с другой стороны, количественные внутриклеточных информация, которая получена из изотопа трассирующими экспериментов. Эти данные обеспечивают необходимую информацию для вычета в vivo активности различных путей в определенных метаболических сети2,3,4. В настоящее время имеющиеся аналитические методы только включить точное обнаружение маркировки модели молекул при использовании изотопов одного элемента и, возможно, когда совместно маркировки с двух изотопов элементов. Кроме того в большинстве условий роста, источника углерода состоит только из одного или двух соединений. Следовательно подходы, основанные на 13C-изотопные трассеры от углеродных подложках были широко и успешно применяется для полного понимания углерода метаболических сетевых операций5,6,7 ,8.
Напротив во многих природных и промышленных средах, азота ресурс, который поддерживает рост микроорганизмов часто состоит из широкого спектра молекул. Например во время брожения вино или пиво, азота предоставляется как смесь 18 аминокислот и аммония в переменной концентрации9. Этот массив N соединений, которые являются доступными для анаболизма делает эти сложные СМИ условия отличаются от тех, которые обычно используются для физиологических исследований, как последний достигаются с помощью уникальный источник азота, обычно аммония.
В целом внутреннюю азотных соединений могут быть непосредственно включены в белки или голодании. Структура сети метаболизма азота у многих микроорганизмов, в том числе дрожжей Saccharomyces cerevisiae, является весьма сложной, в соответствии с разнообразием субстратов. Схематично эта система основана на сочетании центральное ядро метаболизма азота, который катализирует взаимное преобразование глутамина, глутамата и альфа-кетоглутарата10,11, трансаминазы и деаминазами. Через эту сеть аминов группы аммония или другие аминокислоты собираются и α-кето кислоты выпущено. Эти промежуточные также являются синтезированный через Центральный углерода метаболизм (СКК)12,13. Это большое количество разветвленных реакций и посредников, участвующих в катаболизм источников внешних азота и анаболизм proteinogenic аминокислоты, выполняет анаболические требования клеток. Деятельность через эти различных взаимосвязанных маршрутов также приводит к выведению метаболитов. В частности α-кето кислоты могут перенаправляться через Эрлих путь для получения высших спиртов и их ацетата эфира производные14, которые являются важным вклад сенсорные профилей продукции. Впоследствии как работает метаболизма азота играет ключевую роль в производство биомассы и формирования летучих молекул (арома).
Реакции, ферменты и генов, участвующих в метаболизме азота подробно описаны в литературе. Однако еще не рассматривался вопрос о распределении нескольких источников азота в метаболических сети. Есть две основные причины, которые объясняют это отсутствием информации. Во-первых, с учетом важных сложности сети метаболизм азота, большое количество количественных данных не требуется для полного понимания его работы, которая была недоступна до сих пор. Во-вторых, многие экспериментальные ограничения и ограничения аналитических методов помешало реализации подходов, которые ранее использовались для уточнения функции СКК.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы решили разработать системного уровня подход, основанный на сверки данных из серии экспериментов изотопный трассирующими. Процесс включает в себя:
-Набор брожения осуществляется на тех же условиях окружающей среды, в то время как другой источник отдельных питательных веществ (субстрата) помечается каждый раз.
-Сочетание аналитических процедур (ВЭЖХ, GC-MS) для точного определения, на разных стадиях ферментации, остаточная концентрация помечены субстрата и концентрации и изотопного обогащения соединений, которые являются производными от катаболизм помечены молекулы, включая производные биомассы.
-Расчет массы и изотопного равновесия для каждого потребляется помечены молекулы и дальнейшего комплексного анализа набора данных, чтобы получить глобальный обзор управления источниками питательных веществ, микроорганизмов через определение соотношения потока .
Чтобы применить эту методологию, внимание должно уделяться воспроизводимое поведение штамм/микроорганизма между культурами. Кроме того образцы из различных культур должны приниматься в ходе же четко ферментации. В экспериментальной работе в этой рукописи робот помощь система используется для онлайн мониторинг брожения для учета этих ограничений.
Кроме того важно выбрать набор помечены субстратов (соединение, характер и положение маркировки), подходит для решения проблемы научного исследования. Здесь 15N-меченых аммония, глютамин и аргинина были выбраны в качестве трех основных азота источников в виноградный сок. Это позволило оценить шаблон перераспределение азота из потребляемых соединений для proteinogenic аминокислоты. Мы также стремились исследовать судьбу углерода костяк потребляемых аминокислот и их вклада в производство неустойчивых молекул. Для удовлетворения этой цели, равномерно 13C-меченых лейцина, треонин, изолейцин и валин были включены в исследование как аминокислоты, которые являются производными от основных промежуточных Эрлих пути.
В целом мы количественно исследовать, как дрожжи управляет ресурсом комплекс азота перераспределяя источники экзогенной азота выполнить его анаболических требования по всей брожения Кроме того удаляя избыток углерода прекурсоров как летучие молекулы. Экспериментальная процедура, сообщается в настоящем документе может применяться для расследования других множественные источники питательных веществ, используемые другими микроорганизма. Она, как представляется, соответствующий подход для анализа влияния генетический фон или экологических условий на метаболические поведении микроорганизмов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ферментации и выборки
-
Подготовка средств массовой информации и ферментеров
Примечание: Все брожения являются осуществляются параллельно, используя же нагрузку и в то же химически определены синтетической среде (SM, композиция, приводятся в таблице 1), которая включает в себя смесь аммония и аминокислоты, как источников азота15. Для каждого ферментации единый азота соединения предоставляется исключительно в равномерно помечены 13C или 15N форме (100%), в то время как другие остаются без метки. Для каждого источника помечены азота, который используется в наборе экспериментов (здесь: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-лей, U -13C5-Валь, U -13C6-Иль, U -13C4-чет), два Ферментаторы готовятся. Для каждого условия дубликаты ферментации выполняется с использованием только неподписанных молекул (7 контроль брожения).- Для каждого N-источника быть изучены, подготовить 500 мл SM среды, которая содержит все источников азота, перечисленных в таблице 1, за исключением соединения для использования в 100% помечены формы.
Примечание: Приклеенные этикетку молекулы добавляется в следующих шагах. - Пастеризации каждого носителя в колбе 1 Л (10 мин., 100 ° C) содержащий магнитные перемешивания бар. Взвешивать соответствующее количество помечены молекулы до конечной концентрации, которая приводится в таблице 1 и растворить его в среде.
- Стерилизуйте среды с помощью одноразовой вакуумной фильтрации системы (ацетат целлюлозы мембраны, 0,22 мкм). С помощью стерильных Измерительный цилиндр, разделите между двумя предварительно стерилизованные ферментеров (250 мл), которые содержат магнитные перемешивания бар и оснащены брожения блокировки, чтобы избежать вход кислорода, но позволяют выпуска CO2.
- Тепло ферментации колбы до 28 ° C, поместив их в инкубации номер за 1 ночь (температуры, установленной на 28 ° C).
- Для каждого N-источника быть изучены, подготовить 500 мл SM среды, которая содержит все источников азота, перечисленных в таблице 1, за исключением соединения для использования в 100% помечены формы.
-
Прививки и мониторинг брожения
- Растут штамма S. cerevisiae в стерильные пробирки с 10 мл YPD среды на 28 ° C при встряхивании (150 об/мин) для 12 h. Затем, накапайте 1 мл YPD preculture и перенести его на 10 мл среды SM (в 15 мл стерильные трубы). Инкубируйте культуру для 12 ч при 28 ° C при встряхивании (150 об/мин).
- В разделе ламинарного потока собирать preculture аликвота и количественно популяции клеток, используя счетчик электронный частиц, который оснащен отверстие 100 мкм. Центрифуга preculture (2000 x g, 15 мин, 4 ° C) и приостановить гранулы в соответствующий объем стерильной водой для получения конечной концентрации 2,5 x 108 клеток/мл. Прививать каждый бродильный аппарат с 1 мл суспензии клеток.
Примечание: Роботизированная система, используемая для наблюдения за ходом ферментации описана на рисунке 1. - Подготовьте платформы ферментации, установив ферментеров в поддержку руководства, которые должным образом размещаются на перемешивание пластины 21-положение и установить скорость перемешивания на 270 об/мин. Чтобы начать он-лайн мониторинг каждого ферментации, запустите приложение управления роботом, затем нажмите кнопку «Старт пробирного» и выберите том ферментации осуществляться (300 мл).
- Отображается интерфейс разрешает указание числа и положение ферментеров на платформе. Чтобы убедиться, что это происходит, щелкните правой кнопкой мыши на папке слот и выберите «Включить», чтобы активировать мониторинг ферментёра, находится в этой позиции.
- Инициализируйте вычисления программного обеспечения, постоянно работающих в системе, прежде чем начать приобретение вес. Нажмите на кнопку «Initialiser» и проверить с «ОК». Нажмите на кнопку «Пуск» робот управления приложению начать вес приобретений.
-
Процедура отбора
Примечание: Для каждого ферментёра, берутся образцы когда производство CO2 (значение, показанное он-лайн на компьютере программное обеспечение для расчета) достигает требует уставки: 5, 10, 40 и 90 г/Л в этом исследовании.-
Отбор проб процедуры для культур с метками соединений.
- Центрифугуйте образцы двух 6 мл (2000 x g, 5 мин, 4 ° C). Сохранять и хранить замороженные supernatants в двух аликвоты-80 ° c. Вымойте гранулы дважды с 5 мл дистиллированной воды и хранить при температуре-80 ° C для измерения изотопного обогащения.
- Отбор проб процедуры для культур без помечены соединений
- Урожай 10 мл культуры, который будет использоваться для определения сухого веса. Пелле клетки из двух образцов 10 мл центрифугированием (2000 x g, 5 мин, 4 ° C). Вымойте гранулы дважды с 10 мл дистиллированной воды и хранить их в-80 ° C для определения содержания белков и аминокислот.
-
Отбор проб процедуры для культур с метками соединений.
2. Количественная оценка источников потребляемых азота
-
Ферментативный определение концентраций остаточного аммиака
Примечание: Определение концентрации аммиака в supernatants осуществляется с использованием коммерческих комплект на основе ферментов; Все реагенты предоставляются изготовителем.- Приготовляют раствор Стандартный аммиака (61,4 мг/Л), растворяя 25 мг точно взвешенного (NH4)2так4 в объемный флакон 100 мл.
- Для выполнения инструкции производителя, выполните 1:2 разведение образцов, которые были приняты до брожения и 5 г/Л CO2 выпущена. Отрегулируйте пэ-аш образцов до приблизительно 8, добавив 1 M Кох. Принять к сведению дополнительные тома и принять его во внимание коэффициент разрежения.
- В 4 мл Кюветки спектрофотометра смесь 100 мкл пример (разбавленный при необходимости), дистиллированной воды или раствора аммиака Стандартный с 2 мл реактива 1 (0,75 мм ADP и 30 дегидрогеназа глутамата ед/мл в буфере pH 7,8) и 500 мкл реагента 2 (1,3 мм NADH). Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре и читать NADH поглощения на 340 Нм (А1).
- 500 мкл Реагента 3 (60 мм α-кетоглутарата в буфер рН 8), инкубации образца для 20 мин при комнатной температуре, и читать NADH поглощения на 340 Нм (A2).
- Вычислите с помощью концентрации аммиака:
Cаммиака (г/Л) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)образца- (0.839 x A1-A2)дистиллированной воды] - Убедитесь, что правильной концентрации получается с стандартным решением.
-
Хроматографическое определение концентраций остаточного амино кислоты
Примечание: Определение концентраций аминокислоты в supernatants достигается с помощью системы анализа выделенный аминокислота, которая основана на ионообменной хроматографии с пост колонке деривации N-соединений с Нингидрин, который позволяет их Колориметрическое определение.- Приготовляют раствор ссылки, добавляя 200 мкл коммерческой смеси нейтральные и кислые аминокислоты, промаркированные коммерческой смеси основных аминокислот и 200 мкл глутамина 2,5 мм до 400 мкл 200 мм лития цитрат буфера, рН 2.2. Это химически определенные ссылки решение рассматривается как образец.
- 200 мкл 25% (w/v) сульфосалициловой кислоты раствор, содержащий 2,5 мм Норлейцин (внутренний стандарт), до 800 мкл пример для удаления молекул с большим молекулярным весом. Инкубируйте 1 час при 4 ° C, центрифуги (3000 x g, 10 мин, 4 ° C) и фильтр через мембраны нитроцеллюлозы размер пор 0,22 мкм (шприц системы).
- В программном обеспечении программист нажмите на кнопку «Запустить», чтобы начать жидкостной хроматографии (LC) анализ с помощью анализатора с катион обменной колонны (литий форма). Элюировать аминокислоты с последовательными литий буферов для создания градиента рН и градиент в борьбе с ионной концентрации в сочетании с градиентом температуры (Таблица 2).
- Количественно соединений азота после деривации Нингидрин, спектрофотометрический детектор на 570 Нм (пурпурная окраска: реакция между Нингидрин и амины группы аминокислот) и 440 Нм (желтая окраска: реакция между Нингидрин и Имин группы "ПроЛайн").
- Выполните одной точки внутренней калибровки с использованием эталонного решения и Норлейцин как внутренний стандарт для расчета концентрации аминокислот в образцах используя производителя программного обеспечения.
3. Количественная оценка Proteinogenic аминокислот
-
Измерение веса сухих
- Фильтр 10 мл культуры через фильтр нитроцеллюлозы (поры размер 0,45 мкм), который предварительно взвешенный в Кубке алюминия, с помощью вакуумного устройства. Мыть дважды с 50 мл дистиллированной воды.
- Установите фильтр в чашке алюминия и высушите в духовке тепла при 105 ° C в течение 48 часов (пока не наблюдается никаких дальнейших изменений в весе) перед перевеской фильтр в чашке. Вычислите разницу веса.
- Вычислить среднее значение по крайней мере 3 независимых измерений, чтобы точно определить вес сухой клетки культуры дрожжей.
-
Количественная оценка содержания белка клеток
Примечание: Количественная оценка белковые фракции клеток производится по крайней мере в трех экземплярах с помощью немеченого клеток гранулы, которые были получены, как описано в разделе 1.3.2.- Экстракт белков путем добавления 1 мл ДМСО раствора (50% v/v) замороженных гранул и Инкубируйте на 105 ° C за 1 час в печи сухого тепла.
- Количественно содержание белка в ДМСО экстрактов, используя биохимический колориметрические assay, который основывается на сокращение белки Cu++ в Cu+ ионы, которые осаждаются дальше bicinchoninic кислоты в голубой комплекс (BCA проба).
-
Определение относительного вклада аминокислот в белки
Примечание: Профиль proteinogenic аминокислот определяется по крайней мере в трех экземплярах от немеченого клеток окатышей (1.3.2.).- Подготовьте выдержку окисленных приостановив Пелле клеток в 200 мкл performic кислоты (90% муравьиной кислоты, 10% перекиси водорода). Проинкубируйте 4 ч при температуре 4 ° C и остановить реакции добавлением 33,6 мг натрия сульфата.
Примечание: Окисления шаг необходим для преобразования метионина и цистеина в метионин сульфон и cysteic кислоты, которая будет далее количественно методом ионообменной хроматографии. Однако некоторые аминокислоты (тирозин, фенилаланин, гистидина и аргинина) денатурированы во время лечения окисления. Следовательно готовятся два гидролизаты (с и без окисления). - 800 мкл 6N HCl клеток гранул или экстракт окисленный и инкубации образца в герметично закрытой стеклянной трубки для 16 ч при 110 ° C в печи сухого тепла. 200 мкл Норлейцин 2,5 мм и удалить HCl с потоком азота. Помыть (resuspending сушеного экстракта и затем удаления жидкости с потоком азота), дважды с 800 мкл дистиллированной воды, а затем с 800 мкл этанола. Занимают в 800 мкл 200 мм литий ацетат буфера, рН 2.2.
Примечание: Внимание следует уделять время инкубации для гидролиза как некоторые аминокислоты не являются стабильными в кислых условиях. Триптофан фракция в протеине оценивается от данных, найденных в литературе16, как это аминокислота полностью денатурированный при гидролизе HCl. - Подготовьте гидролизат стандарт для одноточечной внутренней калибровки. Мкл 160 коммерческого решения гидролизованный аминокислот в 840 мкл 200 мм литий ацетат буфера, рН 2.2, который содержит 625 мкм сульфона метионина, 625 мкм cysteic кислоты и 625 мкм Норлейцин.
- Определение относительной концентрации аминокислот в белки, используя хроматографического метода, описанного в разделе 2.2.
- Подготовьте выдержку окисленных приостановив Пелле клеток в 200 мкл performic кислоты (90% муравьиной кислоты, 10% перекиси водорода). Проинкубируйте 4 ч при температуре 4 ° C и остановить реакции добавлением 33,6 мг натрия сульфата.
-
Расчеты
- Рассчитайте процент веса каждой аминокислоты в белки путем деления отмеренное количество каждой аминокислоты (мг/Л), общее количество аминокислота, которая была измерена в белка выдержке (сумма в мг/Л).
- Умножьте этот процент концентрации белков в культуре (мг/Л), т.е., продукт между содержание белка биомассы и сухой вес, чтобы оценить концентрацию аминокислот каждый proteinogenic в культуре (мг/Л).
4. Измерение изотопного обогащения Proteinogenic аминокислот
Примечание: Для измерения изотопного обогащения proteinogenic аминокислот, используйте гранулы меткой ячейки. Три различные агенты используются для деривации шаг для количественного определения изотопного обогащения аминокислот. Интенсивностей кассетных ионов измеряются оценить маркировки образцы аминокислот. Сигнал от каждого кластера Ион соответствует обилие массовых isotopomers (m0 = без маркировки, m+ 1 = 1 помечены атома,...) аминокислоты фрагмента. Хроматограмма, которая получается после процедуры DMADMF примера на рисунке 2.
-
Гидролиз биомассы
- Гидролизуют ячейки гранулы (соответствует 1-2 мг сухой биомассы), добавляя 1,2 мл 6 М HCl и инкубации образца для 16 ч при 105 ° С в плотно закрытых стеклянных трубок в печи сухого тепла.
- Добавьте 1,2 мл дистиллированной воды и центрифуги на 3000 x g 5 мин для удаления сотовой мусора. Распространите супернатант в шести 400 мкл фракции в открытых стеклянных трубок. Сухие фракций в духовке тепла при 105 ° C, до консистенции сиропа (4-5 ч).
-
Ethylchloroformate (ЭШФ) деривации
- Распустить сушеные гидролизат в 200 мкл 20 мм HCl; затем 133 мкл пиридина: этаноле (1:4). Добавьте 50 мкл ЭШФ derivatize аминокислоты и подождать до тех пор, пока все CO2 была выпущена. Передача смеси для центрифуг трубок, содержащих 500 мкл дихлорметан для извлечения derivatized соединений.
- Вихревой трубы для 10 s и центрифуги для 4 мин на 10000 x g; Соберите нижней органические фазы с Pasteur накапайте и передачи GC флаконов, содержащих конические стеклянными вставками, что образцы могут вводиться непосредственно в ГХ/МС инструмент.
-
(N, N)-диметилформамид диметил деривации ацеталя (DMFDMA).
- Растворите сушеные гидролизат в 50 мкл метанола и 200 мкл ацетонитриле. Добавьте 300 мкл DMFDMA. Вихревой трубе и передачи образцов GC Автоматический пробоотборник ампул содержащие конические стеклянными вставками.
-
N, O-бис (триметилсилиловые) trifluoroacetamide (BSTFA) деривации
- Приостановите гидролизат в 200 мкл ацетонитриле. 200 мкл BSTFA, герметично закройте стеклянную трубку и инкубировать в течение 4 часов при 135 ° C перед передачей экстракт непосредственно к GC флаконов.
-
GC-MS анализ
- Анализ образцов с газового хроматографа, который оснащен Автоматический пробоотборник инжектор и соединена с масс-спектрометром.
- Используйте инструмент конкретной программное обеспечение для управления инструмент и анализировать хроматограммы. В меню «Последовательность» нажмите «образец таблицы журнала» для создания списка образца и нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать инъекции.
Примечание: Газовый хроматограф оснащен 30 м х 0,25 мм apolar кремнезема капиллярной колонки с толщиной 0,15 мкм-фильм. Установите температуру квадрупольный масс-спектрометр при 150 ° C и провести линию передачи при 250 ° C для всех анализов. Используются три аналитические программы, каждый относящийся к каждому агенту деривации. - ЭШФ производные: Использование гелий как подвижная фаза с потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 230 ° C и что из источника на 250 ° C. Программа Автоматический пробоотборник придать 1 мкл образцов с Сплит соотношении 3:1. Запустить анализ, постепенно увеличивая температуру печи следующим: 130 ° C 3 мин; градиент 15 ° C/мин до 260 ° C; поддерживать температуру на 260 ° C в течение 20 мин.
- DMFDMA производные: Использование гелий как подвижная фаза с постоянным потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 230 ° C и что из источника на 250 ° C. Программа Автоматический пробоотборник придать 1 мкл образцов с Сплит соотношении 3:1. Запустить анализ, постепенно увеличивая температуру печи следующим: 60 ° C в течение 1 мин; градиент 20 ° C/мин до 130 ° C; второй градиент 4 ° C/мин до 260 ° C; поддерживать температуру на 260 ° C в течение 10 мин.
- BSTFA производные: Использование гелий как подвижная фаза с постоянным потоком 1,2 мл/мин температура на входе заход 275 ° C и что из источника при 300 ° C. Запустить анализ (инъекции: 1 мкл), постепенно увеличивая температуру печи следующим: 110 ° C в течение 1 мин; первый градиент 2 ° C/мин до 154 ° C; второй градиент 5 ° C/мин до 300 ° C; поддержание температуры на 300 ° C в течение 10 мин.
- Процедура обнаружения: Для каждого режима деривации придать образца (в 1 мкл) в режиме СКАНИРОВАНИЯ с положительный электрон отдачи ионизации в 70 eV и принять к сведению время хранения каждой аминокислоты.
- Использовать эти значения для определения времени windows на протяжении Хроматограмма и для различных отдельных ионов, которые являются характерным каждой аминокислоты и перечисленных в таблице 3; Эти значения должны быть включены для каждой аминокислоты. Включить эту информацию в программе обнаружения SIM и запустите анализ в режиме SIM с ионизацией воздействия положительный электрон в 70 eV.
- Используйте инструмент конкретной программное обеспечение для управления инструмент и анализировать хроматограммы. В меню «Последовательность» нажмите «образец таблицы журнала» для создания списка образца и нажмите кнопку «Запустить», чтобы начать инъекции.
- Собирать результаты анализов; а именно для каждой аминокислоты, запись кластера интенсивности, которые соответствуют его различных массовых isotopomers. Обработка данных с использованием dedicatedsoftware17 исправить для естественных маркировки и рассчитать изотопного обогащения proteinogenic аминокислот (определяемой как помечены фракция аминокислоты в отношении ее сумму в протеине образцы).
Примечание: Изотопного обогащения молекулы (т.е.), выраженный в процентах, рассчитывается разделительных сумма исправленной интенсивность массовых isotopomers с маркировки (m1, m2,...mn) на сумму исправлениями интенсивностей всех массовых isotopomers (m0,1m, m2,...nm):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 +1m + m2 +... +nm)
- Анализ образцов с газового хроматографа, который оснащен Автоматический пробоотборник инжектор и соединена с масс-спектрометром.
5. Количественная оценка и изотопного обогащения летучих соединений
-
Извлечение помечены летучих соединений
- 10 мкл транс внутренних стандартов до 5 мл супернатант (конечная концентрация транс соединений: 100 мкг/Л) в 15 мл стеклянной трубки. Добавьте 1 mL дихлорметан, плотно закройте трубы и встряхнуть их на качающейся платформе для 20 мин центрифуги для 5 мин на 3000 x g и собирать этапа органических ниже в 15 мл стеклянной трубки. Повторите дихлорметан добычи.
- Органический экстракт свыше 500 мг безводный сульфат натрия и собирать жидкой фазы с пипетки Пастера. Концентрат экстракта в четыре раза под флюсом азота и перенести его на флаконе Автоматический пробоотборник GC.
-
GC-MS количественное определение летучих соединений
- Оборудовать газовый хроматограф с 30 м х 0,25 мм кварцевое капиллярной колонки пленки толщиной 0,25 мкм и применять постоянно гелиевый поток 1,0 мл/мин удерживайте инжектора и линии передачи на 250 ° C.
- Придать 2 мкл пример с Сплит соотношении 10:1 и отделить извлеченные летучих молекул с помощью следующего профиля температуры духовки: держать температуру 3 мин при 40 ° C, увеличить его на 4 ° C/мин до 220 ° C и затем удерживайте духовке при 220 ° C для 20 мин.
- Обнаружить соединений с помощью масс-спектрометра с его источник температуры установлен на 230 ° C и температурой квадрупольный масс-спектрометр на 150 ° C. Запись массы спектры в режиме мониторинга выбранных Ион (SIM) с ионизацией положительный электрон воздействия на 70 eV и использование кластеров Ион конкретных летучих соединений, которые приведены в таблице 4.
- Использование внешнего 7-точечная калибровка для количественного определения концентрации летучих молекул из сумм интенсивность соответствующего кластера Ион. Подготовка запасов решения каждого комплекса (10 г/Л) в 100% этанола. Затем подготовьте стандартные решения для каждого класса летучих молекул (этиловый эфиры, ацетаты, спирты и кислоты) путем смешивания запасов решения. Наконец разбавляют различное количество стандартных решений в 12% водноспиртовой раствор, содержащий винной кислоты 5 г/Л с pH, скорректированы до 3,3 подготовить калибровочные растворы.
- Параллельно исправить для естественной маркировки интенсивности каждого иона кластера и рассчитать изотопного обогащения летучих соединений, которая определяется как Приклеенные этикетку часть молекулы и выражается в процентах, с помощью специализированного программного обеспечения 17.
6. расчеты для комплексного анализа набора данных
-
Сбор исходных данных
- С использованием таблиц, показано в таблицах 5, 6, 7 и 8, введите значения необработанных данных, которые соответствуют концентрации внеклеточного аминокислоты, сухой вес клеток, содержание белка клеток, концентрация летучих молекул и изотопные обогащение proteinogenic аминокислоты и неустойчивых молекул.
Примечание: Данные, приведенные в таблицах выражается в мм. Все результаты выражаются также в мг/Л путем умножения значения в мм молекулярный вес каждой молекулы или мг N/Л, умножив атомная масса азота millimolar концентрация proteinogenic аминокислоты (14 u) и на количество азота АТО MS, которые предоставляются катаболизма этой молекулы. - Вычислить массовые доли каждой аминокислоты белков путем деления суммы в мг/Л в гидролизат общее количество аминокислот (их сумма в мг/Л).
- Расчет средств, стандартных отклонений и стандартные ошибки означают от данных, которые были получены в независимых экспериментах.
- Рассчитать proteinogenic концентрация (мг/Л) для каждой аминокислоты путем умножения доли этой аминокислоты в белки (мг АА/g белки), белковых фракций в биомассе (белки г/DW) и содержание сухого веса (биомассы) в Средний (g DW/Л).
- С использованием таблиц, показано в таблицах 5, 6, 7 и 8, введите значения необработанных данных, которые соответствуют концентрации внеклеточного аминокислоты, сухой вес клеток, содержание белка клеток, концентрация летучих молекул и изотопные обогащение proteinogenic аминокислоты и неустойчивых молекул.
-
15 N изотопный трассирующими эксперименты
- Вычисления с использованием таблиц, которые представлены в таблице 9, маркировку и непомеченного фракции азота, которые присутствуют в proteinogenic аминокислоты (выражается в мг N/Л) от их общей концентрации (выражается в мг N/Л) и их изотопного обогащения. Для каждой аминокислоты обозначенные фракция соответствует продукт между его общая концентрация и изотопного обогащения, и немеченого часть является разница между общей и помечены сумм.
- Затем определить долю общего азота в белки, содержащиеся в proteinogenic аминокислоты, количественно суммирования общее количество Ала, Gly, Валь, Asp, Phe, леи, Иль, Чет, Ser, Pro, Lys, его, Glu и Arg (в мг N/Л) и деления общей суммы в этом исследовании Гора азота, содержащихся в белках эту сумму.
- Вычислить азота, аргинин, глютамин или аммония, которая была восстановлена в proteinogenic кислот, количественно в этом исследовании путем суммирования помечены фракции (в мг N/Л) proteinogenic аминокислот, которые были количественно в исследовании (Ала, Gly, Валь, Asp, Пластинчатые теплообменники, леи, Иль, Чет, Ser, Pro, Lys, его, Glu и Arg) во время экспериментов в присутствии 15N-меченых аргинин, глютамин, или аммония и деления этой фракции помечены азота на общее количество азота в количественных proteinogenic аминокислот кислоты.
- Оценить вклад 3 наиболее распространенных аминокислот в внутриклеточного пул азота используется для биосинтеза de novo путем объединения данных из 13C и 15N изотоп трассирующими экспериментов (таблицы в таблицу 7).
- Из общей суммы (выраженная в мм) proteinogenic вал, леи, Иль или Чет, вычитать часть производная от прямого включения потребляемых соединений (13C эксперименты) и та часть, которая была синтезированный de novo с помощью азота от 3 Основные источники для того, чтобы оценить долю, что синтезированный de novo с помощью азота из других аминокислот.
- Затем рассчитайте отношение количества аминокислоты de novo синтезированный с помощью азота, предоставляемые Gln, Arg и NH4+ (сумма, выраженная в мм) на общую сумму proteinogenic аминокислот (в мм) для количественной оценки вклада аргинин, глютамин и аммония в внутриклеточного азота пул.
-
13 C изотопный трассирующими эксперименты
- Вычислить маркировку и непомеченного фракций proteinogenic аминокислот от концентрации, выраженная в мм и изотопного обогащения proteinogenic аминокислот, которые были получены в ходе экспериментов в присутствии 13C-меченых леи, вал, Иль или чет. (см. 6.2.1, Таблица 10).
- Вычислить маркировку и непомеченного доли летучих соединений от концентрации, выраженная в мм и изотопного обогащения летучих соединений, которые были получены в ходе экспериментов в присутствии 13C-меченых леи, Валь, Иль или чет ( Таблица 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
На рисунке 3 представлена схема рабочего процесса, который был реализован для расследования Управление дрожжей несколько источников азота, которые находятся в процессе брожения вина.
Для различных точек выборки, характеристики биологических параметров – роста, структуры потребления азота и профиль proteinogenic аминокислоты – шоу высокая воспроизводимость среди брожения (рис. 4). Эта согласованность проверяет актуальность подхода, основанного на комбинации данных, который был создан во время набор 14 независимых брожения.
Рисунок 5 показывает всесторонний обзор перераспределение азота из источников, которые доступны в виноградный сок для всех proteinogenic аминокислоты. Этот анализ поддерживается главным образом результаты, которые были получены из экспериментов, проведенных в присутствии 15N-меченых соединений. В сочетании с определением массового и изотопного равновесия, измерения изотопного обогащения proteinogenic аминокислот представила первый количественной оценки вклада азота возникла аргинин, глютамин, аммония и другие источники для групп Амин каждого из этих соединений. Важные перераспределение азота, который подчеркнул здесь отражает существенную роль de novo синтеза аминокислот в поддержании роста дрожжей.
Кроме того это исследование, сравнивая количество помечены соединений в белках с их потреблением, позволяет часть потребляемых N-содержащих молекул, которые непосредственно встроены в белки, когда они входят клетки, чтобы оценить. Proteinogenic аминокислоты продифференцированы согласно их уровень прямого включения в биомассе; Некоторые из них являются исключительно (Asp, Glu) или больше, чем 80% de novo синтезированный, в то время как лишь небольшое количество других соединений создаются путем de novo синтеза. Интересно, что эта последняя группа включает в себя лизина и гистидина, которые являются единственной аминокислоты, в которых все потребляемой источники, непосредственно включены.
Рисунок 5B также представляет, некоторые аминокислоты, сравнение между количество потребляемых аминокислота, которая непосредственно восстанавливается в биомассу, рассчитанные на основе данных полученных в экспериментах 15N-маркировки и экспериментально измерены в 13 C-маркировки экспериментов. Небольшие различия между этими значениями показывают, достоверность и надежность подхода, который был реализован в этом исследовании.
Рисунок 6 показывает пример количественных секционирования (коэффициенты) потоков через метаболические пути, который был получен путем реализации процесса сообщил в этом документе. Эта карта было привлечено путем объединения информации от изотопного трассирующими эксперименты с использованием 15N - и 13C-меченых субстратов и описывает секционирование потребляемых алифатического ряда аминокислот в метаболических сети, которая участвует в валин и биосинтез лейцина в дрожжи (для расчетов, обратитесь к таблице 1 и таблице 2). Путем измерения производства и изотопного обогащения proteinogenic аминокислоты и летучих соединений, мы оценили количество этих соединений, которые были синтезированный из углерода магистралей потребляемых U-C13- валина и U-C13- лейцин, который соответствует помечены часть соединений. Впоследствии мы смогли определить вклад CCM их формирования (немеченого доли соединений). Балансы масс углерода созданы с использованием рабочего процесса и процедуры расчета, которая предлагается здесь показывают, что более 96% потребляемого валин и лейцина восстанавливаются в их продуктов конверсии, а именно, proteinogenic лейцин и валин и летучих выше спирты. Этот вывод подтверждает пригодность сообщил подхода для количественных исследований метаболизма. Комплексный и всеобъемлющий анализ набора данных предлагает новые идеи в судьбе потребляемых аминокислот. Удивительно несмотря на значительный дисбаланс между наличием этих соединений в средне- и их содержание в биомассы являются голодании существенную часть лейцин и валин. Однако долю экзогенных соединений N, непосредственно включены в белков зависит от характера аминокислоты. Еще один ключевой момент касается метаболических происхождения proteinogenic аминокислоты и неустойчивых молекул. Анализ маркировки C модель 13proteinogenic лейцин и валин показывает, что углеродного скелета этих аминокислот главным образом исходит из прекурсоров, которые были синтезированный через СКК. С учетом этого замечания низкая включение маркировки в изобутанол и изоамилового спирта демонстрирует весьма ограниченное участие катаболизма валина и лейцина, которые были израсходованы на дрожжах в формировании этих высших спиртов.
Рисунок 1. Автоматизированная роботизированная система для мониторинга высок объём брожения. (A) Роботизированная платформа. Ферментеры (), помещаются в поддержку гиды пластин магнитных перемешивания (b). Безопасность световой занавес (c) защищает пользователей. Манипулятор (d) перемещает ферментеров последовательно от их расположения на одном из 6 перемешивание пластины прецизионные (e) в левой части рабочего стола, чтобы измерить вес каждые 4 часа. Роботизированная платформа расположен в зале под контролем температуры. (B) схематическое представление архитектуры программного обеспечения. Графический интерфейс позволяет пользователям определить экспериментальные параметры. Эта информация передается в приложение управления, которое управляет робот-манипулятор и записывает различные веса в различных data.xlm сырье файлы (1 файл/брожения). Программное обеспечение для расчета затем собирает файлы xlm и вычисляет для каждой точке времени, количество CO2 , освобождается (выраженный в г/Л), которая пропорциональна количество сахара, которые были потреблены на этот раз и уровень ферментации, что соответствует темпы производства CO2 , г CO2/L/h (пропорционально темпам потребления сахара). Данные хранятся в реляционной базе данных и визуализируется с помощью выделяемых графического интерфейса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. GC-MS анализ proteinogenic аминокислот: пример аланина. (A) Хроматограмма получена после деривации proteinogenic аминокислот с помощью DMFDMA. (B) масса спектры дериватные аланина. Два основных пика, которые соответствуют фрагментов с0m/z = 99 и0m/z = 158. (C) реакция деривации аланина с DMFDMA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Рабочий процесс для количественного анализа метаболизма азота нескольких источников дрожжей. Этот процесс включает в себя (i) набор 28 брожения (7 азот источники и брожения с или без соединений азота в двух экземплярах); (ii аналитическая часть, которая включает различные процедуры извлечения и деривации молекул и ВЭЖХ или GM-MS анализов и (iii) обработки необработанных данных и комплексный анализ наборов данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Воспроизводимость биологических параметров из набора независимых брожения. (A-B) Значит, ценности и стандартных отклонений сухого веса и содержания белка, которые были получены из 14 независимых брожения, осуществляется с использованием немеченого соединения. (C-D) Средние значения и стандартных отклонений proteinogenic и потребляемых аминокислот, которые были измерены в течение 14 независимых брожения осуществляется с помощью немеченого соединения. CO2 производство: 5 (зеленый), 10 (синий), 40 (розовый) и 90 (фиолетовый) г/л пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Перераспределение азота из трех источников основных азота в proteinogenic аминокислоты во время ферментации. (A) метаболических происхождения proteinogenic аминокислот: прямое включение потребляемых коллегой (синий) и de novo синтеза, с использованием азота, предоставляемые потребляемых аргинин (оранжевый), глютамин (зеленый), аммония (розовый) или других аминокислот ( фиолетовый). Выраженная в процентах от общей суммы каждой аминокислоты proteinogenic. (B) сравнение между количество потребляемых аминокислоты (синий) и часть потребляемых аминокислота, которая непосредственно восстанавливается в белках, исходя из данных, которые были получены в 15N трассирующими экспериментов (фиолетовый) или экспериментально измеряется в процессе брожения с 13C-меченых молекул (розовый). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6. Количественный анализ метаболизма лейцин и валин. Секционирование потребляемых лейцина (зеленый) и валин (синий) через метаболические сеть, когда производятся 40 г/Л CO2 . Бары, пропорционально на количество каждого соединения и выражаются в мкм, включая дроби, что синтезированный из Центральной углерода метаболизм (оранжевый). Значения в обычный шрифт: сумма в мкм; значения в курсив: процент потребляемого валина (синий) или лейцина (зеленый), который был голодании через пути. Расчеты приведены в таблице 1 и таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Соединения | Сумма за литр |
| Глюкоза C6H12O6 | 240 г |
| Яблочная кислота C4H6O5 | 6 g |
| Лимонная кислота C6H8O7 | 6 g |
| Калия фосфат KH2PO4 | 0,75 g |
| Сульфат калия K2SO4 | 0.5 g |
| Сульфат магния MgSO4, 7 H2O | 0,25 г |
| Кальция хлорид CaCl2, 2 H2O | 0,155 g |
| Хлорид натрия NaCl | 0,2 г |
| MYO инозитол | 20 мг |
| Пантотенат кальция | 1.5 мг |
| Тиамина гидрохлорид | 0,223 мг |
| Никотиновая кислота | 2 мг |
| Пиридоксин | 0,25 мг |
| Биотин | 0.003 |
| MnSO4· H2O | 4 мг |
| ZnSO4·7H2O | 4 мг |
| O CuSO4·5H2 | 1 мг |
| CoCl2·6H2O | 0,4 мг |
| H3Бо3 | 1 мг |
| (NH4) 6 Пн7O24 | 1 мг |
| Эргостерол | 3,75 мг |
| Олеиновая кислота | 1,25 МКЛ |
| Анимации 80 | 125 МКЛ |
| Тирозин | 8,6 мг |
| Триптофан | 84,4 мг |
| Изолейцин | 15,4 мг |
| Аспартат | 20,9 мг |
| Глутамат | 56.7 мг |
| Аргинин | 176.2 мг |
| Лейцина | 22.8 мг |
| Треонин | 35.7 мг |
| Глицин | 8,6 мг |
| Глютамин | 237,8 мг |
| Аланинаминотрансфераза | 68.4 мг |
| Валин | 20,9 мг |
| Метионин | 14.8 мг |
| Фенилаланин | 17,9 мг |
| Серина | 37.0 мг |
| Гистидин | 15,4 мг |
| Лизин | 8,0 мг |
| Цистеин | 6.2 мг |
| "ПроЛайн" | 288.3 мг |
| Аммиака хлорид NH4Cl | 220 мг |
| РН среды была скорректирована до 3,3 с NaOH 10 М. | |
Таблицы 1. Состав синтетических среды, используемые в данном исследовании. Это химически определенное средство имитирует состав виноградного сока.
| Элюирующий буфер | Температура | |
| От 0 до 6 мин | Лития цитрат, 200 мм, pH 2.8 | 32 ° C |
| От 6 до 38 мин | Лития цитрат, рН 3, 300 мм | 32 ° C |
| От 38 до 57 мин | Лития цитрат, рН 3.15, 500 мм | 64,5 ° C |
| От 57 до 83 мин | Лития цитрат, 900 мм, рН 3,5 | 75 ° C |
| От 83 до 120 мин | Лития цитрат, 1650 мм, pH 3.55 | 75 ° C |
| От 120 до 130 мин | Гидроксид лития, 300 мм |
В таблице 2. Условия, используемые для разделения двух аминокислот-ионообменной хроматографии. Элюирующий буфер с повышенной концентрацией соли используются последовательно в сочетании с градиентом температуры для включения разделения аминокислот.
| Аминокислоты | Derivatizing реагент | RT (мин) | Ион кластеры (m/z) |
| Аланинаминотрансфераза | ЭШФ | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Глицин | ЭШФ | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ЭШФ | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Валин | ЭШФ | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Лейцина | ЭШФ | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Изолейцин | ЭШФ | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Треонин | ЭШФ | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ЭШФ | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Серина | ЭШФ | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ЭШФ | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| "ПроЛайн" | ЭШФ | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Аспартат | ЭШФ | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Глутамат | ЭШФ | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Фенилаланин | ЭШФ | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Лизин | ЭШФ | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Гистидин | ЭШФ | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Аргинин | BSTFAc | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| ЭШФ, этиловый chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-диметилформамид Дибутил ацеталя; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
В таблице 3. Аналитические параметры, используемые для определения изотопного обогащения аминокислот, с использованием выбранных Ион (SIM) режим мониторинга. Этой таблице химических агентов, используемых для деривации, время удерживания дериватные соединений и кластер ионов, полученные в мс (режим электрон воздействия) для каждой аминокислоты.
| Аминокислоты | Derivatizing реагент | RT (мин) | Ион кластеры (m/z) |
| Аланинаминотрансфераза | ЭШФ | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Глицин | ЭШФ | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ЭШФ | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Валин | ЭШФ | 4.97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7.37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7.37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Лейцина | ЭШФ | 5.67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Изолейцин | ЭШФ | 5.85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ЭШФ | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ЭШФ | 6.48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Серина | ЭШФ | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ЭШФ | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| "ПроЛайн" | ЭШФ | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Аспартат | ЭШФ | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11.77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11.77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Глутамат | ЭШФ | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Фенилаланин | ЭШФ | 9.53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Лизин | ЭШФ | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Гистидин | ЭШФ | 12.54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Аргинин | BSTFAc | 18.8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Таблица 4 . Аналитические параметры, используемые для определения изотопного обогащения и количественной оценки летучих соединений, с использованием выбранных Ион (SIM) режим мониторинга. В следующей таблице перечислены время сохранения и кластер ионов, полученные в мс (режим электрон воздействия) для каждой летучих соединений.
В таблице 5. Обработка необработанных данных, полученных от количественной оценки остатков аминокислот набор данных содержит данные из измерений первоначальных и остатков аминокислот. Эти значения используются для расчета количества потребляемых аминокислоты (вычитание). Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
В таблице 6. Обработка необработанных данных, полученных от количественной оценки proteinogenic аминокислот. Этот набор данных содержит данные о составе в аминокислоты биомассы гидролизаты (A) и фракция белков в биомассе (B). Эти значения используются для оценки массовые доли каждой аминокислоты в белки (C). Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
В таблице 7. Proteinogenic аминокислоты. Эта таблица используется для расчета концентрации (в мм) proteinogenic аминокислот из данных, которые обобщены в таблице 5 и Таблица 6. Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
В таблице 8. Обработка необработанных данных, полученных из количественная оценка высших спиртов. Набора данных включает данные из измерения концентраций летучих соединений (A) и преобразует данные выражены в единицах мг/л до мкм (B). Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Таблица 9. Обработка первичных данных, полученные из определения изотопного обогащения proteinogenic аминокислот с помощью 15N-меченых субстратов.
Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
В таблице 10. Обработка необработанных данных, полученные из определения изотопного обогащения proteinogenic аминокислот и летучих соединений, используя 13C-меченых субстратов.
Средства и стандартные отклонения вычисляются для дальнейших вычислений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Количественная оценка разбиения соединений через метаболических сетей с использованием изотопных трассирующими экспериментов является перспективным подходом для понимания функционирования микробного метаболизма. Эта методология, в то время как успешно применяется с одним или двумя метками субстратов, в настоящее время невозможно изучать метаболизм различных источников, с использованием нескольких помечены Элементаль изотопов (т.е., более чем двух субстратов). Действительно имеющиеся аналитические методы позволяют точного определения маркировки моделей proteinogenic аминокислоты и молекул исключительно при использовании изотопов одного элемента и, возможно, при совместной маркировки с двумя элементами. Следовательно для устранения этих недостатков и оценки управления нескольких источников питательных веществ микроорганизмами, мы решили повторить набор культур в одинаковых экологических условиях при маркировке выбранной подложки с 13C или 15 N изотопов. Затем далее сочетание конкретной информации, которая предоставляется каждому 13C или 15N трассирующими эксперимент с видом количественных расширенный метаболизма нескольких источников.
Достижение сообщаемых подход основывается на осуществлении воспроизводимый серии культур при стандартных условиях и на коллекции образцов из популяции клеток в определенных физиологическое состояние, которое является одинаковым для всех культур (ячейка рост потребления субстрата и т.д.). Эти условия должны быть удовлетворены тем, что данные, полученные от независимых экспериментов могут быть смешанные и проанализированы вместе. Удовлетворение этих ограничений требует точной и частые мониторинг активности микроорганизмов, которая была проведена, в экспериментальной работе сообщили здесь, с помощью системы при содействии робот для онлайн мониторинг активности ферментации дрожжей. Однако более традиционные методы выращивания микроорганизмов и мониторинга, такие как определения роста клеток путем измерения оптической плотности, может использоваться для нормализации процедуры выборки.
Еще одной предпосылкой для проведения этой методологии должна иметь четкое видение метаболических путей, которые участвуют в сети, чтобы быть исследованы. Это знание имеет важное значение для выбора набора помечены субстратов, которые являются наиболее подходящими для решения этого вопроса изучаются. Приклеенные этикетку соединений, а также характер и положение маркировки (13C, 15N или другие) внутри молекулы должен быть выбран должным образом в целях i) восстановить все ярлыки, предоставляемые субстратов в соединения, которые являются производными от их катаболизма и далее анализируются в процедуры и ii) получить избыточные данные, которые демонстрируют точность методологии и обоснованность выводов. Процедура, описанная здесь также включает в себя большое количество анализов, которые могли бы быть длительным и дорогостоящим в людских и финансовых ресурсов. Кроме того некоторые аналитические трудности могут ограничить использование этой методологии. Во-первых пользователи должны обеспечить все аналитические методы, которые требуются для количественной оценки во время микробного метаболизма соединений и для определения их изотопного обогащения доступны. Во-вторых этот подход применим только к оценке метаболизма субстратов, для которых все преобразования соединения производятся в достаточном количестве, чтобы быть точно количественно.
В этой статье мы применили этот рабочий процесс для изучения управления нескольких источников азота дрожжей в процессе брожения вина. В настоящем докладе предлагаются новые идеи на метаболизм дрожжей, включая существенные катаболизма наиболее потребляемых аминокислот, в сочетании с их низкой прямого включения в белки и значительный вклад CCM для поставок прекурсоров, которые в дальнейшем используются для de novo синтез аминокислот, proteinogenic и формированию неустойчивых молекул.
Более широком смысле подход, который описан здесь может использоваться для количественной оценки разделение нескольких субстратов через метаболические сеть любого микроорганизма. Это позволит исследователям выяснить судьбу всех потребляемых веществ после того, как они входят клетки и идентификации метаболических происхождения прекурсоров и продуктов. Эта информация может быть полезной для сравнения метаболической активности штаммов, которые имеют различные генетические предпосылки или растут в разных условиях и, следовательно, для разработки рациональных стратегий для улучшения процессов заквашивания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарим Jean-Roch Mouret, Сильви Dequin и Жан-Мари Sabalyrolles для содействия концепции системы роботов с помощью ферментации и Martine бокс, Николя Бувье и Паскаль Brial за их техническую поддержку. Финансирование этого проекта была предоставлена министерство образование и окружение де Nationale de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
