Summary
Bu iletişim kuralı metabolizma birden çok besin kaynaklarının nicelik ve kapsamlı bir şekilde araştırmak için deneysel bir işlem açıklanır. İzotopik izleyici deneyleri ve analitik bir yordam, bir kombinasyonuna göre bu iş akışı, tüketilen besin kaderi ve molekülleri synthetized metabolik kökenli mikroorganizmalar tarafından belirlenecek sağlar.
Abstract
Mikrobiyoloji alanında çalışmalar çok çeşitli yöntemleri uygulanması konusunda güveniyor. Özellikle, uygun yöntem geliştirme önemli ölçüde benzersiz azot ve karbon kaynakları içeren kimyasal olarak tanımlanan medya içinde büyüyen mikroorganizmaların metabolizması kapsamlı bilgi sunmak için katkıda bulunur. Buna ek olarak, metabolizma ile yönetimi geniş varlıklarını doğal veya endüstriyel ortamlarda rağmen birden çok besin kaynaklarının hemen hemen keşfedilmemiş kalır. Bu durum hangi soruşturma engel esas olarak uygun yöntemleri nedeniyle olmaması.
Biz nicelik ve kapsamlı bir besin karışımı farklı molekül, Yani, karmaşık bir kaynak olarak sağlandığında metabolizma nasıl çalıştığını keşfetmek için deneysel bir strateji raporu. Burada, Maya metabolik ağ üzerinden birden çok azot kaynakları bölümleme değerlendirmek için uygulanması açıklanmaktadır. İş akışını seçilen 13C - ya da 15N etiketli yüzeylerde kullanarak kararlı izotop izleme deneyleri sırasında elde edilen bilgilerle birleştirir. İlk paralel ve tekrarlanabilir fermentations N içeren moleküllerin karışımı içeren aynı ortamda oluşur; Ancak, seçilen azot kaynağı her zaman taşır. Analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) bir arada hedeflenen bileşikler etiketleme şekillerinin değerlendirmek için ve tüketimi ve diğer metabolitler yüzeylerde kurtarılması ölçmek için uygulanır. Tam veri kümesi tümleşik bir analizini tüketilen yüzeylerde hücrelerin içindeki kaderi genel bakış sağlar. Bu yaklaşım doğru bir iletişim kuralı örnekleri – kolaylaştırdı koleksiyon için online fermentations izleme için bir robot destekli sistem tarafından gerektirir- ve çok sayıda zaman alan analizleri başarı. Bu kısıtlamaları rağmen bu anlayış, ilk kez birden fazla azot kaynakları Maya metabolik ağ genelinde bölümleme izin. Biz diğer N-bileşikler doğru daha bol kaynaklardan gelen azot dağıtılması aydınlatılmamıştır ve uçucu moleküllerin ve proteinogenic amino asit metabolik kökenleri belirledi.
Introduction
Mikrobiyal metabolizma çalışır nasıl anlayış fermantasyon süreçlerini geliştirmek ve fermantatif bileşiklerin üretimi modüle için etkili stratejiler tasarımı için önemli bir konudur. Gelişmeler genomik ve fonksiyonel genomik bu son iki yıl içinde büyük ölçüde birçok mikroorganizmaların metabolik ağların topolojisi bilgi genişletilmesi için katkıda bulunmuştur. Bu bilgilere erişimi hücresel işlev1kapsamlı bir genel bakış için amaç yaklaşımlar gelişmesine yol açtı. Bu metodolojileri çoğunlukla bir modeli tabanlı yorumlanması ölçülebilir parametreler üzerinde kullanır. Bu deneysel veriler, bir yandan metaboliti alımı ve üretim fiyatlarına dahildir ve öte yandan, izotop izleyici elde edilen nicel hücre içi bilgi deneyler. Bu veriler tanımlanmış metabolik ağ2,3,4farklı yollar içinde vivo aktivitesi kesinti için gerekli bilgileri sağlar. Şu anda, mevcut analitik teknikler sadece bir tek öğeli izotop kullanırken desenleri moleküllerin etiketleme, doğru algılamasını etkinleştirmek ve muhtemelen iki izotopik öğelerle birlikte etiketleme zaman. Ayrıca, çoğu büyüme koşullar altında karbon kaynağı yalnızca bir veya iki-bileşikler oluşur. Sonuç olarak, 13C-izotopik izleyiciler karbon yüzeyler üzerinden göre yaklaşımlar yaygın ve başarılı bir şekilde karbon metabolik ağ işlemleri5,6,7 tam bir anlayış geliştirmek için uygulanan ,8.
Buna ek olarak, pek çok doğal ve endüstriyel ortamlarda, mikrobiyal büyüme destekler kullanılabilir azot kaynağı kez molekülleri çok çeşitli oluşur. Örneğin, şarap ya da bira fermantasyon sırasında azot 18 amino asitler ve amonyum değişken konsantrasyonları9karışımı sağlanır. Bu dizi anabolizma için erişilebilir N bileşiklerin ikinci azot, genellikle amonyum benzersiz bir kaynak kullanarak elde edilir bu karmaşık medya koşullar büyük ölçüde yaygın olarak fizyolojik çalışmaları için kullanılan farklı yapar.
Genel olarak, azot bileşikleri olabilir doğrudan proteinlerin dahil ya da catabolized içselleştirilmiş. Maya Saccharomyces cerevisiae' de dahil olmak üzere birçok mikroorganizmalar azot metabolizması ağ yapısını yüzeylerde çeşitlilik uygun olarak çok karmaşıktır. Şematik, glutamin, Glutamat ve α-ketoglutarate10,11, enzimleri ve deaminases şekilde tromboksan azot metabolizması merkezi çekirdek bu sistem dayanmaktadır. Bu ağ üzerinden amonyum veya diğer amino asitlerin Amin grupları bir araya geldik ve α-keto asit serbest. Bu ara da synthetized Merkezi karbon metabolizması (CCM)12,13arası vardır. Bu sayıda dallı reaksiyonlar ve ara ürün, eksojen azot kaynakları katabolizma ve proteinogenic amino asitler, anabolizma dahil hücreleri anabolik gereklerini yerine getirir. Aktivite bu farklı birbirine bağlı yolları da metabolitleri atılımı sonuçlanır. Özellikle, α-keto asit yüksek alkoller ve onların asetat ester türevleri14, önemli katkıda bulunan ürünlerin duyusal profiller üretmeye Ehrlich yolu aracılığıyla yönlendirilebilirsiniz. Daha sonra çalışma şeklini azot metabolizması biyokütle üretimi ve uçucu moleküllerin (aroma) oluşumu içinde önemli bir rol oynar.
Tepkiler, enzim ve gen azot üretimiyle literatürde yaygın olarak açıklanmıştır. Ancak, birden fazla azot kaynakları metabolik bir ağ genelinde dağılımı sorunu henüz giderilmiş değil. Bu bilgi eksikliği açıklamak iki ana nedeni vardır. İlk olarak, azot metabolizması ağ önemli karmaşıklığı içinde görüş-in, nicel veri büyük miktarda kullanılamaz faaliyete tam bir anlayış için gerekli şimdiye kadar. İkinci, birçok deneysel kısıtlamaları ve sınırlamaları analitik yöntemleri CCM işlevi aydınlatma için daha önce kullanılan yaklaşımların uygulanması engelledi.
Bu sorunların üstesinden gelmek için mutabakat veri izotopik izleyici deneyler bir dizi dayalı bir sistem düzeyinde yaklaşım geliştirmek seçtik. İş akışı içeren:
-Her seferinde farklı bir seçili besin kaynağı (substrat) etiketli iken fermentations kümesi aynı çevre koşullarında yürütülmüştür.
-Bir arada etiketli substrat ve konsantrasyonu kalan konsantrasyon ve izotopik zenginlik üzerinden elde edilen bileşiklerin fermantasyon farklı aşamalarında bir doğru belirlenmesi için analitik işlemleri (HPLC, GC-MS) katabolizma etiketli molekülünün türetilmiş biyokütle dahil olmak üzere.
-Bir hesaplama her kitle ve izotopik dengesinin etiketli molekül ve akı oranları belirlenmesi yoluyla mikroorganizmalar tarafından birden çok besin kaynaklarının yönetimi genel bir bakış elde etmek için veri kümesi bir daha fazla entegre analiz tüketilen .
Bu yöntemi uygulamak için dikkat zorlanma/mikroorganizma kültürler arası tekrarlanabilir davranışındaki ödenmelidir. Ayrıca, farklı kültürlerden gelen örnekleri aynı iyi tanımlanmış fermantasyon devam ederken alınması gerekir. Bu el yazması bildirdi deneysel çalışmalarında bir robot destekli sistem fermentations online izlemek için bu kısıtlamalar için hesap için kullanılır.
Ayrıca, çalışmanın bilimsel sorunla ilgili olarak uygun etiketli yüzeylerde (bileşik, doğa ve konumu maddelerinin etiketlenmesi) kümesi seçmek önemlidir. Burada, 15N etiketli amonyum, glutamin ve arginin üzüm suyu bulunan üç büyük azot kaynağı olarak seçilmiştir. Bu üzerinden tüketilen bileşikler azot yeniden dağıtım proteinogenic amino asitler için desen değerlendirmek izin verdi. Ayrıca tüketilen amino asitler ve uçucu moleküllerin üretimini yaptıkları katkı karbon omurgası kaderi araştırmak amaçladık. Bu amaç, liflerin düzenli bir biçimde 13lösin C harfiyle karşılamak için isoleucine, treonin ve Valin çalışmada Ehrlich yolu büyük ara ürün elde edilen amino asitler olarak dahil edilmiştir.
Genel olarak, biz kantitatif Maya fermantasyon Ayrıca karbon öncüleri fazlalığı çıkarmadan süre boyunca anabolik gereksinimleri yerine getirmek için eksojen azot kaynakları yeniden dağıtma tarafından bir karmaşık azot kaynağı nasıl yönettiğini araştırdı uçucu moleküllerin. Bu gazetede bildirdi deneysel işlemin diğer mikroorganizma tarafından kullanılan diğer birden çok besin kaynaklarını araştırmak için uygulanabilir. Bu mikroorganizmaların metabolik davranışını genetik arka plan veya çevre koşullarının etkisi analizi için uygun bir yaklaşım gibi görünüyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. fermantasyon ve örnekleme
-
Medya ve fermenters hazırlanması
Not: Tüm fermentations taşınan dışarı aynı soy kullanarak paralel ve aynı kimyasal sentetik orta (SM, Tablo 1' de sağlanan kompozisyon), tanımlanan15azot kaynakları olarak amonyum ve amino asitler içerir. Diğerleri etiketsiz kalır her fermantasyon için sadece bir düzgün etiketli 13C veya 15N form (% 100), bir tek azot bileşik sağlanır. Deney grubunda kullanılan her etiketli azot kaynağı için (burada: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Ley, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), iki fermenters hazırlanır. Her koşul için yinelenen fermantasyon sadece etiketlenmemiş molekülleri (7 kontrol fermentations) kullanılarak gerçekleştirilir.- Her N-belirlenmesi için 500 mL SM hazırlamak için kaynak Tablo 1' de, % 100 kullanılmak üzere bileşik dışında listelenen tüm azot kaynakları içeren orta form etiketli.
Not: Sonraki adımda etiketli molekül eklenir. - Her ortamda (10 min, 100 ° C) bir 1 L şişe pastörize bir manyetik karıştırma çubuğunu içeren. Tablo 1 ' de rapor son toplama ulaşmak için etiketli molekül uygun miktarda tartmak ve ortamda çözülür.
- Bir tek kullanımlık vakum filtrasyon sistemi (selüloz asetat membran, 0,22 µm) kullanarak orta sterilize. Steril bir ölçüm silindir kullanarak, CO2sürümü izin ama oksijen girişini önlemek için fermantasyon kilitleri ile donatılmıştır ve manyetik bir karıştırma çubuğu içeren önceden sterilize iki fermenters (250 mL) arasında orta bölün.
- Fermantasyon şişeler 28 ° C için 1 gecelik (sıcaklık 28 ° C'de ayarla) kuluçka odasında yerleştirerek ısı.
- Her N-belirlenmesi için 500 mL SM hazırlamak için kaynak Tablo 1' de, % 100 kullanılmak üzere bileşik dışında listelenen tüm azot kaynakları içeren orta form etiketli.
-
Aşılama ve fermentations izleme
- S. cerevisiae zorlanma YPD orta 28 ° c (150 devir/dakika) için 12 h sallayarak ile 10 mL içeren steril tüpler içinde büyümek. Sonra YPD 1 mL damlalıklı preculture ve SM ortamda (15 mL steril tüpler) 10 mL transfer. Kültür 28 ° c (150 devir/dakika) sallayarak ile 12 h için kuluçkaya.
- Laminar akış altında bir preculture aliquot toplamak ve 100 µm diyafram ile donatılmış bir elektronik parçacık sayaç kullanarak hücre nüfus ölçmek. Preculture (2.000 x g, 15 dk, 4 ° C) santrifüj kapasitesi ve Pelet steril su 2.5 x 108 hücre/mL nihai bir konsantrasyon elde etmek için uygun bir hacim içinde askıya alma. Her fermenterler hücre süspansiyon 1 mL ile aşılamak.
Not: fermantasyon ilerlemesini izlemek için kullanılan Robotik sistem şekil 1' de anlatılan. - Fermantasyon platformu düzgün 21-pozisyon karıştırma Tabaklarda girdiği ve 270 rpm'de karıştırma oranını ayarlamak destek kılavuzları fermenters yükleyerek hazırlayın. On-line her fermantasyon izlemeye başlamak için robot-denetim uygulamayı başlatmak sonra "Başlat tahlil" düğmesini tıklatın ve (300 mL) yapılacak fermantasyon birimini seçin.
- Görüntülenen arabirim numarası göstergesi ve fermenters konumunu platformda izin verir. Bunun gerçekleşmesini sağlamak için yuvası konumu sağ tıklatın ve "Bu konumda bulunan fermenterler izleme etkinleştirmek için etkinleştir" seçin.
- Kalıcı olarak kilo alma başlamadan önce sistemde çalışan hesaplama yazılımı başlatmak. "Initialiser" butonuna tıklayın ve "ok" sağlam temele oturtulmuş. "" Kilo alımları başlatmak için robot kontrol uygulamasının tıkırtı üstünde başlamak düğme.
-
Örnekleme yordamı
Not: CO2 üretim (hesaplama yazılımı çalıştıran bilgisayar üzerinde on-line gösterilen değer) gerekli ayar noktası ulaştığında her fermenterler için örnekler alınır: 5, 10, 40 ve 90 g/L Bu çalışmada.-
Yordam etiketli bileşikler ile kültürler için örnekleme.
- İki 6 mL örnek (2.000 x g, 5 dk, 4 ° C) santrifüj kapasitesi. Kaydedin ve donmuş supernatants iki aliquots-80 ° C'de depolayın Granül iki kez 5 mL distile su ve mağaza izotopik enrichments ölçümü için-80 ° C'de ile yıkayın.
- Yordam etiketli bileşikler olmadan kültürler için örnekleme
- 10 mL kuru ağırlığı tayini için kullanılan kültür hasat. Santrifüjü (2.000 x g, 5 dk, 4 ° C) tarafından iki 10 mL örnek hücrelerden cips. Granül iki kez 10 mL distile su ile yıkama ve-80 ° c protein ve amino asit içeriği tayini için stok onları.
-
Yordam etiketli bileşikler ile kültürler için örnekleme.
2. miktar tüketilen azot kaynakları
-
Enzimatik kalan amonyak konsantrasyonu tayini
Not: Ticari bir enzim tabanlı kiti kullanılarak supernatants amonyak konsantrasyonu tayini yapılır; tüm reaktifler üreticisi tarafından sağlanır.- Bir standart amonyak çözüm (61,4 mg/L) tam olarak tartılır (NH4)225 mg kadar çözülerek hazırlamak4 ' te 100 mL volumetric flask.
- Üreticinin yönergelerini yerine getirmek için fermantasyon öncesi ve 5 g/L CO2 serbest bırakmak, alınan örneklerin bir 1:2 seyreltme gerçekleştirin. Yaklaşık 8 örnekleri pH 1 M KOH ekleyerek ayarlayın. Eklenen birim dikkat ve seyreltme faktörü dikkate almak.
- 4 mL Spektrofotometre cuvettes, (gerekirse seyreltilmiş) örneğinin mix 100 µL distile su veya standart amonyak çözüm ile 2 mL reaktif 1 (0,75 mM ADP ve 30 U/mL Glutamat dehidrojenaz pH 7.8 arabelleği) ve reaktif 2 (1.3 mM NADH) 500 µL. 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya ve 340 Absorbans NADH okumak nm (A1).
- Reaktif 3 (60 mM pH 8 arabelleği α-ketoglutarate) 500 µL eklemek, oda sıcaklığında 20 dk için örnek kuluçkaya ve 340 NADH Absorbans okuma nm (A2).
- Amonyak konsantrasyonu kullanarak hesaplama:
Camonyak (g/L) = 0,083 x [(0.839 x A1-A2)örnek- (0.839 x A1-A2)distile su] - Kontrol doğru konsantrasyon ile standart çözüm elde edilir.
-
Kromatografik kalan amino asit konsantrasyonu tayini
Not: Supernatants konsantrasyonlarda amino asit tayini sağlar ninhydrin ile yazı sütun derivatization N-bileşikler ile iyon değiştirme Kromatografi dayalı bir özel amino asit analiz sistemi kullanılarak elde onların Renkölçer algılama.- Bir başvuru çözüm 200 µL tarafsız ve asidik amino asitlerin ticari bir karışımı, 200 µL temel amino asitler ticari bir karışımı ve 2.5 mM glutamin 200 µL 200 mM lityum sitrat arabellek, pH 2.2 400 µL için ekleyerek hazırlayın. Bu kimyasal olarak tanımlanmış başvuru çözüm bir örnek olarak kabul edilir.
- 2.5 mM norleucine (iç standart) içeren % 25 (w/v) sulfosalicylic asit solüsyonu 200 µL 800 µL molekülleri ile yüksek moleküler ağırlık kaldırmak için örnek ekleyin. 4 ° C, santrifüj (3000 x g, 10 min, 4 ° C) ve 0,22-µm gözenek boyutu nitroselüloz membran (şırınga sistemi) filtreden 1 h için kuluçkaya.
- Programcı yazılım, katyon değişim sütun (lityum formu) ile donatılmış analyzer ile (LC) analizleri sıvı Kromatografi başlatmak için "Run" butonuna tıklayın. Amino asitler ile Counter iyonu konsantrasyonu sıcaklık değişimi (Tablo 2) ile birlikte bir pH degrade ve degrade oluşturmak için art arda gelen lityum tampon elute.
- 570, spektrofotometrik bir Dedektör tarafından ninhydrin derivatization sonra azotlu bileşikler ölçmek nm (mor rengi: amino asitler ninhydrin ve Amin grubu arasındaki reaksiyon) ve 440 nm (sarı rengi: ninhydrin ve aldehit grubu arasındaki reaksiyon prolin).
- Tek-noktaya iç kalibrasyon referans çözüm ve norleucine üreticinin yazılımını kullanarak örnekleri amino asitlerin konsantrasyonları hesaplamak için bir iç standart olarak kullanarak gerçekleştirin.
3. miktar Proteinogenic Amino asit
-
Kuru hücre kalınlığı ölçümü
- 10 mL kültürünün bir alüminyum Kupası, bir vakum cihazı kullanarak önceden asılı bir nitroselüloz filtre (gözenek boyutu 0.45 µm) filtre. İki kez 50 mL distile su yıkayın.
- Filtre alüminyum Kupası'na yerleştirin ve filtre Kupası'nda reweighing önce 48 (ağırlık daha fazla bir değişiklik yok kutlanan kadar) h için 105 ° C ısı fırında kuru. Ağırlık farkı hesaplamak.
- Doğru Maya kültür kuru hücre ağırlığını belirlemek için bağımsız en az 3 ölçüm ortalamasını hesaplamak.
-
Miktar hücrelerin protein içeriğinin
Not: Hücrelerin protein fraksiyonu miktar en az nüsha 1.3.2 bölümünde açıklandığı gibi elde edilmiştir etiketlenmemiş hücre topakları kullanarak gerçekleştirilir.- Proteinler buna ek olarak 1 mL DMSO çözeltisi (% 50 v/v) tarafından dondurulmuş granül özü ve 105 ° c kuru sıcak fırında 1 saat için kuluçkaya.
- Cu++ proteinlerin içine bicinchoninic asit mavi Kompleks (BCA tahlil) içinde daha fazla çöktürülmüş Cu+ iyonlar tarafından azaltılmasına dayanan biyokimyasal Renkölçer tahlil kullanarak DMSO özleri protein içeriğinde ölçmek.
-
Amino asitler proteinler içinde göreli katkılarıyla belirlenmesi
Not: Profil proteinogenic amino asitlerin en az nüsha etiketlenmemiş hücre granül (1.3.2.) üzerinden belirlenir.- Performic asit (%90 formik asit, % 10 hidrojen peroksit) 200 µL içinde hücre Pelet askıya tarafından okside ekstresi hazırlayın. 4 h 4 ° C'de için kuluçkaya ve reaksiyon 33.6 mg sodyum sülfat eklenmesi tarafından durdurmak.
Not: Oksidasyon adım iyon değiştirme Kromatografi tarafından sayısal daha fazla metiyonin sulfone ve cysteic asit, sistein ve metionin dönüştürmek için gereklidir. Ancak, bazı amino asitler (tirozin, fenilalanin, histidin ve arginin) oksidasyon tedavi sırasında denatüre. Sonuç olarak, iki hidrolizatlarının (ve oksidasyon olmadan) hazırlanır. - 6N HCL 800 µL hücre topakları eklemek veya okside özü ve örnek bir hermetik kapatılmış cam tüp 16 h 110 ° c kuru sıcak fırında için kuluçkaya. 2.5 mM norleucine 200 µL ekleyin ve HCl azot bir akışı ile kaldırın. (Kurutulmuş özü resuspending ve sıvı azot akışı kaldırma) ve daha sonra 800 µL etanol ile iki kez 800 µL distile su ile yıkayın. 200 mM lityum asetat arabellek, pH 2.2 800 µL içinde hallet.
Not: bazı amino asitler asitli koşullarda kararlı değil gibi dikkat hidroliz kuluçka süresine ödenmesi gerekmektedir. Bu amino asit HCl hidroliz sırasında tamamen denatüre gibi protein triptofan kesir Edebiyat '16, bulundu verilerinden tahmin edilmektedir. - Bir hidrolizat standart tek-noktaya iç kalibrasyon için hazırlayın. Amino asitlerin hidrolize ticari bir çözümün 160 µL 200 mM lityum asetat arabellek, 625 µM metiyonin sulfone, 625 µM cysteic asit ve 625 µM norleucine içeren pH 2.2, 840 µL için ekleyin.
- Amino asitler proteinler 2.2 bölümünde açıklanan Kromatografik yöntemle içinde göreli konsantrasyonları belirlemek.
- Performic asit (%90 formik asit, % 10 hidrojen peroksit) 200 µL içinde hücre Pelet askıya tarafından okside ekstresi hazırlayın. 4 h 4 ° C'de için kuluçkaya ve reaksiyon 33.6 mg sodyum sülfat eklenmesi tarafından durdurmak.
-
Hesaplamalar
- Her amino asit proteinlerde ağırlık yüzdesi her amino asit (mg/L) ölçülen miktarı bölerek amino asit protein özü (mg/L Özetle) ölçülen toplam miktarı hesaplamak.
- Bu yüzde konsantrasyon (mg/L) kültür, Yani, biyokütle protein içeriği ve konsantrasyon (mg/L) kültüründe her proteinogenic amino asitin değerlendirmek için Kuru ağırlığı arasında ürün proteinlerin tarafından çarpın.
4. Proteinogenic Amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçümü
Not: proteinogenic amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçüm için etiketli hücre topakları kullanın. Üç farklı ajanlar için derivatization adım amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçmek için kullanılır. Küme iyonları yoğunluklarda amino asitler etiketleme şekillerinin tahmin etmek için ölçülür. Her küme iyon sinyalini kitle isotopomers bereket için karşılık gelen (m0 etiketleme olmadan, m+ 1 = 1 etiketli atom, =...) bir amino asit parçasının. DMADMF işlem sonrası elde edilen bir Kromatografik örneği Şekil 2' de verilmiştir.
-
Biyokütle hidroliz
- 1.2 mL 6 M HCL ekleyerek ve örnek bir kuru ısı fırın sıkıca kapalı cam tüplerde 105 ° C'de 16 h için kuluçka (1-2 mg kurutulmuş biyokütle karşılık gelen) hücre topakları hidrolize.
- 1.2 mL distile su ve santrifüj 3000 x g hücresel enkaz kaldırmak 5 min için ekleyin. Süpernatant altı 400 µL kesirler açık cam tüpler içine dağıtmak. Onlar şurubu (4-5 h) tutarlılığını ulaşana kadar kesirler 105 ° C ısı fırında kuru.
-
Ethylchloroformate (ECF) derivatization
- 20 mm HCl 200 µL kurutulmuş hidrolizat dağıtılması; daha sonra pyridine: etanol (1:4) 133 µL ekleyin. ECF amino asitler derivatize ve tüm CO2 serbest kadar beklemek için 50 µL ekleyin. Derivatized bileşikleri ayıklamak için diklorometan 500 µL içeren tüpler santrifüj kapasitesi karışımı aktarın.
- Girdap 10 s ve santrifüj tüpleri 10.000 x g; de 4 dk için onlara Böylece örnekleri doğrudan GC/MS araç enjekte konik cam ekler içeren GC şişeleri için daha düşük organik faz Pasteur damlalıklı ve transferi ile toplanır.
-
(N, N)-Dimethylformamide Dimetil asetal (DMFDMA) derivatization.
- Metanol 50 µL ve Asetonitril 200 µL kurutulmuş hidrolizat geçiyoruz. DMFDMA 300 µL ekleyin. Girdap tüp ve transfer konik cam ekler içeren sulandırıldığında GC otomatik örnekleyici için örnekler.
-
N, O-Bis (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
- Hidrolizat Asetonitril 200 µL içinde askıya alma. Cam tüp sıkıca kapatın ve özü doğrudan GC şişeleri aktarmadan önce 4 h 135 ° c için kuluçkaya BSTFA 200 µL ekleyin.
-
GC-MS analizi
- Bir Otomatik Örnekleyici enjektör ile donatılmış ve bir Kütle Spektrometre birleştiğinde bir gaz Kromatograf örnekleriyle analiz.
- Araç kontrol etmek ve chromatograms analiz aracı özel yazılımı kullanın. "Sequence" menüsünde, "Örnek günlük örnek liste oluşturmak için tablo"'ı tıklatın ve enjeksiyonları başlatmak için "Çalıştır" düğmesini tıklatın.
Not: Gaz Kromatograf bir 30 m x 0,25 mm apolar silika Kapiler sütun 0.15 mikron film kalınlığı ile donatılmıştır. 150 ° C'de Kütle Spektrometre quadrupole sıcaklığı ayarlamak ve transfer satırı 250 ° c tüm analizleri için basılı tutun. Üç analitik programları, her bir özel her derivatization aracı için kullanılır. - ECF türevleri: 230 ° C ve bu 250 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Örnekleri 1 µL split oranı 3:1 ile enjekte etmek için Otomatik Örnekleyici programı. Aşağıdaki gibi Fırın Sıcaklık yavaş yavaş artan analizleri, çalıştırın: 130 ° C 3 dakika; Degrade 15 ° C/dk 260 ° c; sıcaklık 20 dk için 260 ° C'de muhafaza.
- DMFDMA türevleri: 230 ° C ve bu 250 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak sürekli bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Örnekleri 1 µL split oranı 3:1 ile enjekte etmek için Otomatik Örnekleyici programı. Aşağıdaki gibi Fırın Sıcaklık yavaş yavaş artan analizleri, çalıştırın: 60 ° C için 1 dk; Degrade 20 ° C/dk 130 ° c; İkinci gradyan 4 ° C/dk 260 ° c; Sıcaklık 10 min için 260 ° C'de muhafaza.
- BSTFA türevleri: 275 ° C ve bu 300 ° C'de kaynağının giriş sıcaklık kullanım helyum 1.2 mL/dak sürekli bir akış ile mobil faz olarak ayarlayın Analizleri çalıştırmak (enjeksiyon: 1 µL), yavaş yavaş aşağıdaki gibi fırın sıcaklığı artan: 110 ° C için 1 dk; ilk gradyan 2 ° C/dk 154 ° c; İkinci gradyan 5 ° C/dk ila 300 ° C; Sıcaklık 10 min için 300 ° C'de muhafaza.
- Algılama yordamı: Derivatization her modu, bir örnek (1 µL) pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV, tarama modunda enjekte ve tutma zamanı her amino asitin dikkat ediniz.
- Zaman pencereleri Kromatografik boyunca tanımlamak için bu değerler kullanın ve her amino asitin karakteristik ve Tablo 3' te listelenen farklı seçili iyonları için olan; Bu değerler her amino asit için dahil edilmelidir. Bu bilgiler SIM algılama programa ekleyin ve analizleri pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV, SIM modunda çalıştırmak.
- Araç kontrol etmek ve chromatograms analiz aracı özel yazılımı kullanın. "Sequence" menüsünde, "Örnek günlük örnek liste oluşturmak için tablo"'ı tıklatın ve enjeksiyonları başlatmak için "Çalıştır" düğmesini tıklatın.
- Analizlerin sonuçlarını toplamak; Yani, her amino asit için farklı onun kitle isotopomers kümesine karşılık gelen yoğunluklarını kaydedin. Doğal etiketleme için düzeltmek ve proteinogenic amino asitler (protein onun toplam tutarı ile ilgili olarak bir amino asitin etiketli kesir olarak tanımlanmış izotopik zenginleştirme hesaplamak için dedicatedsoftware17 kullanarak verileri işlemek örnekleri).
Not: Bir molekül izotopik zenginleştirme (yani), yüzde ifade edilen, kitle isotopomers etiketleme ile düzeltilmiş yoğunluklarda toplamı bölen hesaplanır (m1, m2,.. anladımn) düzeltilmiş toplamına kitle isotopomers yoğunluklarda (m0, m1, m2,... mn):
I. E. = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1+ m2 +... + mn)
- Bir Otomatik Örnekleyici enjektör ile donatılmış ve bir Kütle Spektrometre birleştiğinde bir gaz Kromatograf örnekleriyle analiz.
5. miktar ve uçucu bileşiklerin izotopik zenginleştirme
-
Etiketli uçucu bileşikler çıkarımı
- Deuterated iç standartların 10 µL süpernatant için 5 mL ekleyin (deuterated bileşiklerin son konsantrasyonu: 100 µg/L) 15 mL cam tüp içinde. Diklorometan 1 mL ekleyin, sıkıca tüpler kapatın ve 20 dakika santrifüj 3000 x g de 5 dk süreyle sallanan bir platformda sallamak ve 15 mL cam tüp organik alt aşamasında toplamak. Diklorometan ayıklama yineleyin.
- Organik özü üzerinde 500 mg susuz sodyum sülfatın kuru ve sıvı faz Pasteur damlalıklı ile toplamak. Dört azot akı altında bir faktörle özü konsantre ve GC otomatik örnekleyici şişe aktar.
-
GC-MS miktar uçucu bileşiklerin
- Bir 30 m x 0,25 mm erimiş silis kapiller sütunla gaz Kromatograf 0,25 mikron film kalınlığı ile donatmak ve enjektör ve transfer satırı 250 ° C'de sabit helyum akışı 1.0 mL/dk. tutun, uygulama
- Örnek 2 µL split oranı 10:1 ile enjekte ve ayıklanan uçucu moleküllerin aşağıdaki Fırın Sıcaklık profili kullanarak ayrı: 40 ° C'de 3 dk için sıcaklık tutun, 4 ° C/min tarafından artış 220 ° C'ye kadar ve sonra 20 dk bekleyin 220 ° C fırında.
- 230 ° C ve 150 ° C'de ayarla Kütle Spektrometre quadrupole sıcaklık ayarlanan kaynak sıcaklık ile bir Kütle Spektrometre kullanarak bileşikler tespit Kitle spectra ile pozitif elektron etkisi iyonlaşma 70 eV ve Tablo 4' te rapor edilen uçucu bileşikler için belirli iyon kümelerini kullanarak seçili iyon izleme (SIM) modunda kaydedin.
- Bir dış 7-nokta kalibrasyon yoğunluklarda karşılık gelen iyon kümesinin toplamı üzerinden uçucu moleküllerin konsantrasyonları ölçmek için kullanın. Hisse senedi çözümler her bileşik (10 g/M) % 100 etanol hazırlayın. O zaman, standart çözümler hisse senedi çözümleri karıştırılarak uçucu moleküllerin (etil esterler, asetatlar, alkoller ve asitler) her sınıf için hazır olun. Son olarak, bir % 12 hydroalcoholic çözüm pH kalibrasyon çözüm hazırlamak için 3,3 düzeltilmiş ile 5 g/L tartarik asit içeren standart çözümlerinde farklı miktarlarda oranında seyreltin.
- Paralel, doğal her iyon küme yoğunluklarını etiketleme için düzeltmek ve uçucu bileşiklerin molekülleri etiketli kesir olarak tanımlanmış ve özel yazılım kullanarak bir yüzde olarak ifade edilen izotopik zenginleştirme hesaplamak 17.
6. veri kümesi tümleşik bir analizini hesaplamalarını
-
Ham veri toplama
- Tablo 5, 6, 7 ve 8, gösterilen elektronik tablolarını kullanarak hücre dışı amino asit, hücre kuru ağırlığı, protein içeriği hücre, konsantrasyon uçucu moleküllerin ve izotopik konsantrasyonu için karşılık gelen ham veri değerleri girin proteinogenic amino asitler ve uçucu moleküllerin zenginleştirme.
Not: tablolarda gösterilen veriler mM olarak ifade edilir. Tüm sonuçlar de mM değerleri ile molekül ağırlığı her molekül veya mg N/M tarafından atom ağırlığı azot proteinogenic amino asit millimolar konsantrasyonu çarparak çarparak mg/L ifade edilir (14 u) ve azot ato sayısına göre Bu molekül katabolizma tarafından sağlanan ms. - Amino asitler (mg/L olarak bunların toplamı) toplam tutarı, tutar ın mg/L hidrolizat içinde bölünerek her amino asit proteinlerde kitle yüzdesini hesaplamak.
- Anlamına gelir, standart sapma ve standart hataları verilerden bağımsız deneylerde elde edilmiştir ortalamaya hesaplamak.
- Her amino asit proteinogenic konsantrasyon (mg/L) proteinler (mg aa/g protein) bu amino asit yüzdesi çarparak biyokütle (g protein/g DW) protein fraksiyonu ve kuru ağırlık içerik (biyokütle üretimi) tarafından içinde hesaplamak Orta (g DW/M).
- Tablo 5, 6, 7 ve 8, gösterilen elektronik tablolarını kullanarak hücre dışı amino asit, hücre kuru ağırlığı, protein içeriği hücre, konsantrasyon uçucu moleküllerin ve izotopik konsantrasyonu için karşılık gelen ham veri değerleri girin proteinogenic amino asitler ve uçucu moleküllerin zenginleştirme.
-
15 N izotopik izleyici deneyler
- Tablo 9' da sunulan elektronik tablolarını kullanarak hesaplamak proteinogenic amino asitler (mg N/M ifade) onların toplam konsantrasyon (mg N/M ifade) üzerinden mevcut etiketli ve etiketsiz kesirler azot ve onların izotopik enrichments. Her amino asit için etiketli kesir onun toplam konsantrasyon ve onun izotopik zenginleştirme arasında ürün karşılık gelir ve etiketsiz bölümü toplam etiketli tutarları arasındaki farktır.
- O zaman, proteinler (mg içinde N/M) Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leyi, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys toplam miktarı, onun, Glu ve Arg özetliyor ve toplam bölen bu çalışmada sayısal proteinogenic amino asitler içeren toplam azot kısmını belirlemek bir Bu miktar tarafından proteinler arasında bulunan azot monte edin.
- Arginin, glutamin veya proteinogenic amino asit (Ala, Gly, Val, Asp, çalışmada sayılabilir (içinde mg N/M) kesir etiketli toplayarak bu çalışmada sayısal proteinogenic asitler kurtarıldı amonyum tarafından sağlanan azot hesaplamak Phe, Leyi, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, onun, Glu ve Arg) 15N etiketli arginin, glutamin, veya amonyum ve azot quantified proteinogenic amino toplam miktarı ile bu etiketli-azot kesir bölen huzurunda deneyler sırasında asitler.
- 3 en bol bulunan amino asitler de novo sentezi için 13C ve 15N izotop izleyici deneyler (elektronik tabloda Tablo 7) veri birleştirerek kullanılan azot hücre içi havuzuna katkısı değerlendirmek.
- Tüketilen bileşikler (13C deneyler) doğrudan birleşme ve azot 3 kullanarak de novo synthetized yapıldı kesiminde elde edilen bölümü (mM ifade) toplam tutarı proteinogenic Val, Leyi, Ile veya Thr, düşeriz diğer amino asitler azot kullanarak de novo synthetized yapıldı kesir değerlendirmek için büyük kaynaklar.
- Sonra amino asit de novo synthetized azot proteinogenic amino asitler (mM) cinsinden toplam tutarı için Gln, Arg ve NH4+ (mM olarak ifade edilen toplam) tarafından sağlanan kullanarak miktarı oranını hesaplamak katkısını ölçmek için arginin, glutamin ve amonyum hücre içi azot havuzuna.
-
13 C izotopik izleyici deneyler
- MM ve 13C harfiyle Ley, Val huzurunda deneyler sırasında elde edilmiştir proteinogenic amino asitlerin izotopik enrichments ifade konsantrasyonları proteinogenic amino asitlerden etiketli ve etiketsiz kesirler hesaplama, Ile veya Thr. (bkz: 6.2.1, Tablo 10).
- Etiketli ve etiketsiz kesirler konsantrasyonları mM ve 13C harfiyle Ley, Val, Ile veya Thr ( huzurunda deneyler sırasında elde edilen uçucu bileşiklerin izotopik enrichments ifade edilen uçucu bileşiklerin hesaplamak Tablo 10).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 3 şematik diyagramı yönetimi araştırmak için maya şarap fermantasyon sırasında bulunan birden fazla azot kaynakları tarafından uygulanan iş akışı sunar.
Örnekleme, biyolojik parametreler-büyüme özellikleri, azot tüketim kalıpları ve gösterinin proteinogenic amino asitler – fermentations (şekil 4) arasında yüksek bir tekrarlanabilirlik profil farklı noktaları için. Bu tutarlılık 14 bağımsız fermentations bir dizi sırasında oluşturulan veri birleşimi dayalı yaklaşım uygunluğunu doğrular.
Şekil 5 azot tüm proteinogenic amino asitler için üzüm suyu kullanılabilir kaynaklardan yeniden dağıtılması kapsamlı bir bakış gösterir. Bu analizi esas olarak 15N etiketli bileşikler huzurunda yapılan deneyler elde sonuçları tarafından desteklenmektedir. Kitle ve izotopik bakiyelerinin belirlenmesi ile birlikte, proteinogenic amino asitlerin izotopik zenginleştirme ölçümü ilk miktar azot kaynağı arginin, glutamin, amonyum ve diğer katkı sağlanan her biri bu bileşiklerin Amin grupları kaynaklarına. Burada altı çizilir azot önemli dağıtılması Maya büyüme sürdürülmesi olarak amino asitler de novo sentezi önemli rolü yansıtır.
Ayrıca, proteinlerin kendi tüketimi içeren etiketli bileşikler miktarda karşılaştırarak bu çalışmada değerlendirilmek hücrelere girdikleri zaman doğrudan proteinlerin dahil edilmiştir tüketilen N içeren moleküller kısmını sağlar. Proteinogenic amino asitler biyokütle doğrudan şirketleşme kendi düzeylerine göre farklılaşmış; Sadece bazıları (Asp, Glu) veya daha fazla süre diğer bileşikler yalnızca az miktarda % 80'i de novo synthetized de novo sentezi tarafından üretilir. İlginçtir, bu son grup lizin ve histidin, tüm doğrudan tüketilen kaynaklar dahil edilmiştir sadece amino asitler içerir.
Şekil 5B de sunar, bazı amino asitler için 15N etiketleme deneylerde elde edilen ve deneysel 13 ölçülen verilerden hesaplanan biyokütle, içine doğrudan kurtarıldı tüketilen amino asit miktarı arasında bir karşılaştırma C-etiketleme deneyler. Bu değerler arasındaki küçük farklar güvenilirlik ve sağlamlık bu çalışmada uygulanan yaklaşım göster.
Şekil 6 bu gazetede bildirdi iş akışı uygulayarak elde edildi Cerayanlar metabolik yollar ile kantitatif (oranlar) bölümleme bir örnek göstermektedir. Bu harita 15N - ve 13C harfiyle yüzeylerde kullanarak izotopik izleyici deneyleri gelen birleştirme tarafından çizilmiş ve tüketilen Alifatik amino asitler Valin içinde dahil metabolik ağ bölümleme açıklar ve Maya içinde biyosentezi lösin ( Tablo 1 ve Tablo 2hesaplamaları için bakın). Üretim ve proteinogenic amino asitler ve uçucu bileşikler izotopik zenginleştirme ölçerek, biz karbon omurgalarına tüketilen U-C13- Valin ve U-C13- dan synthetized olan bu bileşiklerin miktarı değerlendirilir lösin, bileşikleri etiketli kısmı için karşılık gelen. Daha sonra biz CCM katkısı düzenlerini (bileşikleri etiketlenmemiş kısmını) belirlemek başardık. İş akışı ve burada önerilmiştir hesaplama yordamını 96 %'den fazla tüketilen Valin ve lösin yani dönüşüm ürünlerinde kurtarılmasını göstermek kullanarak, proteinogenic lösin ve Valin ve geçici yüksek karbon kitle bakiyeleri ayarlayın alkoller. Bu bulgu metabolizmasının nicel çalışmalar için bildirilen yaklaşım uygunluğu teyit eder. Veri kümesi tümleşik ve kapsamlı analiz yeni anlayışlar içinde tüketilen amino asitler kaderi sunuyor. Doğal olarak, Valin ve lösin önemli bir kısmını catabolized rağmen bu bileşiklerin orta kullanılabilirliğini ve içeriklerini biyokütle arasında önemli bir dengesizlik. Ancak, doğrudan proteinlerin dahil eksojen N-bileşikler kısmını amino asit niteliğine bağlıdır. Bir diğer önemli nokta proteinogenic amino asitler ve uçucu moleküllerin metabolik kökeni ile ilgili. Proteinogenic lösin ve Valin 13C etiketleme desen analizini amino asit karbon iskeleti ağırlıklı olarak CCM ile synthetized vardı öncüleri nereden geldiğini ortaya koymaktadır. Bu gözlem doğrultusunda izobütanol ve izoamil alkol etiketleme düşük ana katabolizma Valin ve Maya bu yüksek alkoller oluşumunda tarafından tüketilen edildi lösin çok sınırlı tutulumu gösterir.
Şekil 1. Otomatik yüksek üretilen iş fermentations izlemek için robot sistemi. (A)robot platformu. Fermenters destek kılavuzları üzerinde manyetik karıştırma tabak (b) yerleştirilir (a). Bir emanet ışık perdesi (c) kullanıcıları korur. Robotik Kol (d) fermenters gittikçe konumlarından birinde plakaları için bir hassas denge (e) her 4 saatte ağırlığı ölçmek için worktable, sol tarafta karıştırarak 6 taşır. Robot platformu ısı kontrollü bir odada yer alır. (B) yazılım mimarisi şematik gösterimi. Bir grafik arayüz deneysel ayarlarını tanımlamak kullanıcılar sağlar. Bu bilgi robotik kol denetler ve farklı ağırlık farklı ham data.xlm dosyaları (1 dosya/fermantasyon) kaydeden denetim uygulamasına iletilir. Hesaplama yazılımı xlm dosyaları toplar ve, her zaman bir nokta için bu zaman ve fermantasyon oranı tüketilen şeker miktarı ile orantılı olan (g/L ifade edilir), yayımlanan CO2 miktarını hesaplar, hangi g CO2/L/h (şeker tüketimi oranı için orantılı) CO2 üretim hızına karşılık gelir. Veri ilişkisel bir veritabanında depolanır ve sadık bir grafik arayüz kullanarak görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. GC-MS analizi proteinogenic amino asit: alanin örneği. (A)Kromatografik proteinogenic amino asitlerin DMFDMA kullanarak derivatization sonra elde edilen. (B) kitle derivatized alanin spectra. Parçaları m0/z ile karşılık gelen iki ana doruklarına 99 = ve m0/z 158 =. (C) alanin DMFDMA ile Derivatization reaksiyon. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Kantitatif analiz birden fazla azot metabolizması için iş akışı kaynakları tarafından Maya. Bu işlem, (i) 28 bir dizi fermentations (7 azot kaynakları ve fermentations veya yinelenen azotlu bileşikler olmadan); içeriyor (II) ekstraksiyon farklı yordamlar ve derivatization moleküller ve HPLC ve GM-MS çözümlemeleri ve ham veri (III) işleme ve veri kümelerini entegre bir analizini içerir analitik bir parçası. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. Bir dizi bağımsız fermentations biyolojik parametrelerin tekrarlanabilirlik. (A-B) Yani değerleri ve standart sapmalar kuru ağırlık ve protein içeriği etiketlenmemiş bileşikleri kullanarak yürütülen 14 bağımsız fermentations elde edilmiştir. (C-D) Değerleri ve standart sapmalar etiketlenmemiş bileşikleri kullanarak yürütülen 14 bağımsız fermentations sırasında ölçüldü tüketilen amino asitler ve proteinogenic anlamına gelir. CO2 üretim: 5 (yeşil), 10 (mavi), 40 (pembe) ve 90 (mor) g/l Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. Proteinogenic amino asitler için üç önemli azot kaynaklarından azot yeniden dağıtılması fermantasyon sırasında. Proteinogenic amino asitler(a)metabolik kökeni: doğrudan tüketilen muadili (mavi) ve azot tüketilen arginin (turuncu), glutamin (yeşil), amonyum (pembe) veya diğer amino asitler () tarafından sağlanan kullanarak de novo sentezi mor). Her proteinogenic amino asit miktarı yüzde olarak ifade edilir. (B) karşılaştırma tüketilen amino asit (mavi) miktarı ve proteinler arasında doğrudan kurtarılır tüketilen amino asit parçası arasında 15N izleyici deneyler (mor) veya deneysel olarak elde edilen verilerden hesaplanan 13C harfiyle molekülleri (pembe) ile fermantasyon sırasında ölçülen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6. Kantitatif analiz Valin ve lösin metabolizmasının. 40 g/L CO2 üretilen tüketilen lösin (yeşil) ve metabolik ağ üzerinden (mavi) Valin bölümleme. Bar her bileşik miktarı ile orantılıdır ve µM synthetized Merkezi karbon metabolizması (turuncu) üzerinden yapıldı kesir dahil olmak üzere, ifade edilir. Değerleri normal yazı: tutarı µM; italik yazı tipinde değerler: tüketilen Valin (mavi) ya da yolu ile catabolized lösin (yeşil) yüzdesi. Hesaplamaları Tablo 1 ve Tablo 2' sağlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Bileşikler | Litre başına miktar |
| Glikoz C6H12O6 | 240 g |
| Malik asit C4H6O5 | 6 g |
| Sitrik asit C6H8O7 | 6 g |
| Potasyum fosfat KH2PO4 | 0.75g |
| Potasyum sülfat K2SO4 | 0,5 g |
| Magnezyum sülfat MgSO4, 7 H2O | 0, 25 g |
| Kalsiyum klorür CaCl2, 2 H2O | 0,155 g |
| Sodyum Klorür NaCl | 0.2g |
| MYO-inositol | 20 mg |
| Kalsiyum pantothenate | 1,5 mg |
| Tiamin hidroklorür | 0.223 mg |
| Nikotinik asit | 2 mg |
| Piridoksin | 0,25 mg |
| Biotin | 0,003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 mg |
| CoCl2·6H2O | 0.4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterol | 3.75 mg |
| Oleik asit | 1,25 ΜL |
| Tween 80 | 125 ΜL |
| Tirozin | 8.6 mg |
| Triptofan | 84.4 mg |
| İsoleucine | 15,4 mg |
| Aspartat | 20,9 mg |
| Glutamat | 56.7 mg |
| Arginin | 176.2 mg |
| Lösin | 22,8 mg |
| Treonin | 35,7 mg |
| Glisin | 8.6 mg |
| Glutamin | 237.8 mg |
| Alanin | 68.4 mg |
| Valin | 20,9 mg |
| Metiyonin | 14,8 mg |
| Fenilalanin | 17.9 mg |
| Serin | 37,0 mg |
| Histidin | 15,4 mg |
| Lizin | 8.0 mg |
| Sistein | 6,2 mg |
| Prolin | 288.3 mg |
| Amonyak klorür NH4Cl | 220 mg |
| Ortamın pH NaOH 10 M ile 3.3 için ayarlandı. | |
Tablo 1. Bu çalışmada kullanılan sentetik orta bileşimi. Bu kimyasal olarak tanımlanmış orta üzüm suyu oluşumunu taklit eder.
| Elüsyon arabellek | Sıcaklık | |
| 0 ile 6 dk | Lityum sitrat, 200 mM, pH 2.8 | 32 ° C |
| 6-38 min | Lityum sitrat, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| 57 dk 38 | Lityum sitrat, 500 mM, pH 3,15 | 64,5 ° C |
| 57-83 dk | Lityum sitrat, 900 mM, pH 3,5 | 75 ° C |
| 120 dk 83 | Lityum sitrat, 1650 mM, pH 3,55 | 75 ° C |
| 120 130 dk | Lityum ürünleri, 300 mM |
Tablo 2. Amino asitler ayrılması için iyon değiştirme Kromatografi tarafından kullanılan koşullar. Elüsyon arabellekleri artan tuz konsantrasyonları ile amino asitler ayrımını etkinleştirmek için sırayla bir sıcaklık değişimi ile birlikte kullanılır.
| Amino asitler | Saptırma reaktifi | RT (dk) | İyon kümeleri (m/z) |
| Alanin | ECFbir | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160 161 | |
| Glisin | ECFbir | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFbir | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFbir | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Lösin | ECFbir | 5,67 | 158 159 160, 161, 162, 163, 164 |
| İsoleucine | ECFbir | 5.85 | 158 159 160, 161, 162, 163, 165 |
| Treonin | ECFbir | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFbir | 6.48 | 175 176 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFbir | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFbir | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolin | ECFbir | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartat | ECFbir | 7.89 | 188 189 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFbir | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230 231 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanin | ECFbir | 9,53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lizin | ECFbir | 11,95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFbir | 12,54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| bir ECF, etil chloroformate; b DMFDMA, (N, N)-dimethylformamide Dibutil asetal; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tablo 3. Analitik amino asitlerin seçili iyon (SIM) modu izleme kullanarak izotopik enrichments belirlenmesi için kullanılan parametreler. Derivatization, derivatized bileşiklerin tutma zamanı ve kümenin MS (modu elektron etkisi) için her amino asit elde iyonlar için kullanılan kimyasal maddeler bu tabloda özetlenmiştir.
| Amino asitler | Saptırma reaktifi | RT (dk) | İyon kümeleri (m/z) |
| Alanin | ECFbir | 3.86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160 161 | |
| Glisin | ECFbir | 4.19 | 102, 103, 104 |
| ECFbir | 4.19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6.61 | 144, 145, 146 | |
| Valin | ECFbir | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Lösin | ECFbir | 5,67 | 158 159 160, 161, 162, 163, 164 |
| İsoleucine | ECFbir | 5.85 | 158 159 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFbir | 6.48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFbir | 6.48 | 175 176 177, 178, 179 | |
| Serin | ECFbir | 6.53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFbir | 6.53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolin | ECFbir | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartat | ECFbir | 7.89 | 188 189 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutamat | ECFbir | 8.81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230 231 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanin | ECFbir | 9,53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13.67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lizin | ECFbir | 11,95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Histidin | ECFbir | 12,54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginin | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Tablo 4. Analitik izotopik enrichments belirlenmesi ve uçucu bileşiklerin seçili iyon (SIM) modu izleme kullanarak miktar için kullanılan parametreler. Bu tablo tutma zamanı ve kümenin iyonlar MS (modu elektron etkisi) elde edilen uçucu her bileşik için özetler.
Tablo 5. Artık amino asitler miktar elde edilen ham veri işleme veri kümesi ilk ve kalan amino asit ölçümleri gelen verileri içerir. Bu değerler (çıkarma tarafından) tüketilen amino asit miktarını hesaplamak için kullanılır. Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 6. Proteinogenic amino asitler miktar elde edilen ham veri işleme. Bu veri kümesi veri biyokütle hidrolizatlarının(a)ve kesir biyokütle (B) proteinlerin amino asitleri bileşimi içerir. Bu değerler her amino asit proteinler (C) kitle yüzdesi değerlendirmek için kullanılır. Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 7. Proteinogenic amino asitler. Bu elektronik konsantrasyon (mM) proteinogenic amino asitlerin Tablo 5 ve Tablo 6' da özetlenen verileri hesaplamak için kullanılır. Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 8. Daha yüksek alkoller miktar elde edilen ham veri işleme. Veri kümesi verileri geçici bileşik konsantrasyonları(a)ölçümleri içerir ve verilerini birimleri mg/m µM (B) için ifade. Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 9. Proteinogenic amino asit kullanarak izotopik enrichments belirlenmesi elde edilen ham veri işleme 15N etiketli yüzeylerde.
Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Tablo 10. Proteinogenic amino asitler ve uçucu bileşikler kullanarak izotopik enrichments belirlenmesi elde edilen ham veri işleme 13C harfiyle yüzeylerde.
Standart sapmalar ve anlamına gelir daha fazla hesaplamalar için hesaplanır. Bu tabloyu indirmek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bileşikler metabolik ağlarına izotopik izleyici deneyler kullanarak bölümleme miktarının mikrobiyal metabolizma işleyişini anlamak için umut verici bir yaklaşımdır. Bu yöntemi başarıyla uygulanan bir ya da iki etiketli yüzeyler ile iken şu anda birden çok etiketli elemental izotoplar (Yani, birden fazla iki yüzeylerde) kullanarak çeşitli kaynaklardan metabolizma çalışmaya uygulanması olamaz. Nitekim, mevcut analitik teknikler etiketleme desenleri proteinogenic amino asitler ve moleküllerin doğru belirlenmesi sadece izotoplar tek bir öğe ve muhtemelen iki öğe ile birlikte etiketleme zaman kullanırken etkinleştirin. Sonuç olarak, bu sınırlamaları gidermek ve birden çok besin kaynaklarının yönetimi mikroorganizmalar tarafından değerlendirmek için bir küme aynı çevre koşullarında kültürlerin 13C veya 15 ile seçilen bir substrat etiketleme süre yinelemek seçtik N izotopları. Sonra daha fazla kombinasyon her 13C veya 15N izleyici deneme tarafından sağlanan belirli bilgileri birden çok kaynak metabolizmasının nicel bir genişletilmiş görünüm sunar.
Kültürler standart koşullar altında tekrarlanabilir bir dizi uygulanması ve hücreleri tüm kültürler (hücre için aynıdır bir tanımlanmış fizyolojik devlet nüfusu örnekleri topluluğu bildirilen yaklaşım ulaşılmasına bağlıdır büyüme, tüketim substrat, vb). Böylece karışık ve birlikte analiz bağımsız deneylerden elde edilen veriler bu koşullar sağlanmalıdır. Bu kısıtlamaları gerektirir gerçekleştirildiği mikrobiyal aktiviteyi doğru ve sık izlenmesi tatmin edici, deneysel çalışmalarında, online Maya fermantasyon etkinliğini izlemeye yönelik bir robot yardımlı sistemi kullanarak bildirdi. Ancak, mikroorganizma yetiştiriciliği ve izleme hücre büyümesini optik yoğunluk ölçme tarafından belirlenmesi gibi daha geleneksel yöntemleri örnekleme yordamı normalleştirmek için kullanılabilir.
Bu metodoloji taşımak için başka bir ağda araştırılması için söz konusu olan metabolik yollar açık bir vizyon için önkoşuldur. Bu bilgi okudu sorunu ile başa çıkmak için en uygun olan etiketli yüzeylerde kümesi seçtiğiniz için esastır. Etiketli bileşikleri gibi doğa ve etiketleme (13C, 15N veya diğerleri) konumunda molekülleri içinde ben amacıyla uygun seçilmesi gerekir) türetilir bileşikler yüzeyler tarafından sağlanan tüm etiketleri yeniden elde etmek onların katabolizma ve daha fazla olan analiz yordam ve II) metodolojisi doğruluğunu ve bulgular geçerliliğini göstermek gereksiz verileri elde etmek. Burada açıklanan yordamı Ayrıca insan ve mali kaynakları pahalı ve zaman alıcı olabilir analizleri önemli bir sayıda içerir. Ayrıca, bazı analitik kısıtlamaları bu metodoloji kullanımını sınırlayabilirsiniz. İlk olarak, kullanıcıların bu bileşiklerin mikrobiyal metabolizma sırasında üretilen miktar için gereklidir ve onların izotopik zenginleştirme belirlenmesi için kullanılabilir tüm analitik yöntemleri sağlamalıdır. İkinci olarak, bu yaklaşım için tüm dönüşüm bileşikler doğru sayısal için yeterli miktarlarda üretilmektedir yüzeylerde metabolizmasını değerlendirmek için geçerlidir.
Bu yazıda, biz birden fazla azot kaynakları yönetimi tarafından maya şarap fermantasyon sırasında keşfetmek için bu iş akışını uygulanır. Maya metabolizmasına, en çok tüketilen amino asitler, proteinler ve daha fazla için kullanılan öncüleri sağlamak için CCM büyük katkısı düşük onların doğrudan birleşme ile birlikte önemli katabolizma dahil olmak üzere yeni anlayışlar bu rapor sundu hem proteinogenic amino asitler de novo sentezi ve uçucu moleküllerin oluşumu.
Daha geniş, burada açıklanan yaklaşım herhangi bir mikroorganizma metabolik ağ üzerinden birden çok yüzeylerde bölümleme miktarının için kullanılabilir. Araştırmacılar hücreleri girdikten sonra tüm tüketilen bileşikler kaderi aydınlatmak için ve metabolik kökenli öncüleri ve ürün tanımlaması adresine izin verir. Bu bilgiler farklı genetik geçmişlere sahip suşları metabolik aktivite karşılaştırmak için yararlı veya farklı koşullar altında ve sonuç olarak, fermantasyon süreçlerinin iyileştirilmesi için rasyonel stratejiler tasarlamak için büyümek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin ve Jean-Marie fermantasyon robot destekli sistem anlayışı katkıda bulunmak için Sabalyrolles ve Martine Pradal, Nicolas Bouvier ve Pascale Brial teknik desteklerinden dolayı teşekkür ederiz. Bu proje Recherche et Ministère de l'Education Nationale, de la tarafından sağlanan için finansman de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
- Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
- Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
- Wiechert, W. 13C metabolic flux analysis. Metab Eng. 3, 195-206 (2001).
- Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints. Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).
- Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments. BMC Bioinformatics. 9, 266 (2008).
- Zamboni, N. 13C metabolic flux analysis in complex systems. Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).
- Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis. Biochimie. 91, 697-702 (2009).
- Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. Metabolic flux analysis in mammalian cell culture. Metab Eng. 12, 161-171 (2010).
- Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value. J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).
- Magasanik, B., Kaiser, C. A. Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae. Gene. 290, 1-18 (2002).
- Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 190, 885-929 (2012).
- Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).
- Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).
- Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism. Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).
- Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions. J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).
- Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network. Genome Res. 13, 244-253 (2003).
- Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments. Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).
