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Bioengineering

कार्यप्रवाह Isotopic अनुरेखक प्रयोगों के संयोजन पर आधारित कई पोषक तत्वों के स्रोतों के माइक्रोबियल चयापचय की जांच करने के लिए

doi: 10.3791/56393 Published: January 22, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक प्रयोगात्मक प्रक्रिया के लिए मात्रात्मक और व्यापक कई पोषक तत्वों के स्रोतों के चयापचय की जांच । इस कार्यप्रवाह, isotopic अनुरेखक प्रयोगों और एक विश्लेषणात्मक प्रक्रिया के संयोजन पर आधारित है, भस्म पोषक तत्वों के भाग्य और सूक्ष्मजीवों द्वारा synthetized अणुओं के चयापचय मूल निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है.

Abstract

माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में अध्ययन के तरीके की एक विस्तृत श्रृंखला के कार्यांवयन पर भरोसा करते हैं । विशेष रूप से, उचित तरीकों के विकास में काफी रासायनिक परिभाषित अद्वितीय नाइट्रोजन और कार्बन स्रोतों युक्त मीडिया में बढ़ रही सूक्ष्मजीवों के चयापचय के व्यापक ज्ञान प्रदान करने के लिए योगदान देता है । इसके विपरीत, कई पोषक तत्वों के स्रोतों के चयापचय के माध्यम से प्रबंधन, प्राकृतिक या औद्योगिक वातावरण में अपनी व्यापक उपस्थिति के बावजूद, वस्तुतः बेरोज़गार रहता है । यह स्थिति मुख्य रूप से उपयुक्त तरीके की कमी की वजह से है, जो जांच में बाधा डालती है.

हम मात्रात्मक और व्यापक रूप से पता लगाने के लिए एक प्रायोगिक कार्यनीति की रिपोर्ट करते हैं कि जब एक पोषक तत्व विभिन्न अणुओं, यानी, एक जटिल संसाधन के मिश्रण के रूप में प्रदान किया जाता है, तो चयापचय कैसे संचालित होता है. यहां, हम खमीर चयापचय नेटवर्क के माध्यम से कई नाइट्रोजन स्रोतों के विभाजन का आकलन करने के लिए अपने आवेदन का वर्णन । कार्यप्रवाह चयनित 13C-या 15N-लेबल वाले सब्सट्रेट का उपयोग कर स्थिर आइसोटोप अनुरेखक प्रयोगों के दौरान प्राप्त जानकारी को संयोजित करता है. यह पहले एक ही माध्यम है, जो N-युक्त अणुओं का मिश्रण भी शामिल में समानांतर और प्रतिलिपि किण्वन के होते हैं; हालांकि, एक चयनित नाइट्रोजन स्रोत हर बार लेबल है । विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का एक संयोजन (HPLC, जीसी-MS) लक्षित यौगिकों के लेबलिंग पैटर्न का आकलन करने के लिए और अन्य चयापचयों में सब्सट्रेट्स की खपत और वसूली को बढ़ाता है के लिए लागू किया जाता है. पूर्ण डेटासेट के एक एकीकृत विश्लेषण कोशिकाओं के भीतर भस्म सब्सट्रेट के भाग्य का एक सिंहावलोकन प्रदान करता है. इस दृष्टिकोण नमूनों के संग्रह के लिए एक सटीक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है-एक रोबोट द्वारा सुविधा-किण्वन की ऑनलाइन निगरानी के लिए प्रणाली की सहायता-और कई समय लेने वाले विश्लेषण की उपलब्धि । इन बाधाओं के बावजूद, यह समझने की अनुमति दी, पहली बार के लिए, खमीर चयापचय नेटवर्क भर में एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के विभाजन । हमने अन्य एन-यौगिकों की ओर अधिक प्रचुर स्रोतों से नाइट्रोजन के पुनर्वितरण का आविर्भाव किया और अस्थिर अणुओं और proteinogenic अमीनो अम्लों के चयापचय मूल का निर्धारण किया.

Introduction

समझ कैसे माइक्रोबियल चयापचय संचालित कुशल रणनीतियों के डिजाइन के लिए एक महत्वपूर्ण मुद्दा किण्वन प्रक्रियाओं में सुधार और fermentative यौगिकों के उत्पादन को मिलाना है । इन पिछले दो दशकों में जीनोमिक्स और कार्यात्मक जीनोमिक्स में अग्रिम मोटे तौर पर कई सूक्ष्मजीवों में चयापचय नेटवर्क के टोपोलॉजी के ज्ञान का विस्तार करने के लिए योगदान दिया । सेलुलर समारोह1के एक व्यापक सिंहावलोकन के लिए लक्ष्य दृष्टिकोण के विकास के लिए नेतृत्व इस जानकारी के लिए उपयोग । इन तरीकों अक्सर एक मॉडल पर निर्भर औसत दर्जे का मापदंडों की व्याख्या आधारित है । इन प्रयोगात्मक डेटा में शामिल हैं, एक हाथ पर, metabolite और उत्पादन दर और, दूसरी ओर, मात्रात्मक intracellular जानकारी आइसोटोप अनुरेखक प्रयोगों से प्राप्त की है. इन आंकड़ों में एक परिभाषित चयापचय नेटवर्क2,3,4में विभिंन रास्ते के vivo में गतिविधि की कटौती के लिए आवश्यक जानकारी प्रदान करते हैं । वर्तमान में, उपलब्ध विश्लेषणात्मक तकनीक केवल अणुओं के लेबलिंग पैटर्न का सटीक पता लगाने जब एक एकल तत्व आइसोटोप का उपयोग कर और संभवतः जब सह दो isotopic तत्वों के साथ लेबलिंग सक्षम करें । इसके अलावा, सबसे अधिक वृद्धि की स्थिति के तहत, कार्बन स्रोत केवल एक या दो यौगिकों के होते हैं । नतीजतन, 13सी के आधार पर दृष्टिकोण कार्बन सब्सट्रेट से isotopic अनुरेखकों व्यापक रूप से और सफलतापूर्वक कार्बन चयापचय नेटवर्क आपरेशनों के एक पूर्ण समझ को विकसित करने के लिए लागू किया गया5,6,7 ,8.

इसके विपरीत, कई प्राकृतिक और औद्योगिक वातावरण में, माइक्रोबियल विकास का समर्थन करता है कि उपलब्ध नाइट्रोजन संसाधन अक्सर अणुओं की एक विस्तृत श्रृंखला से बना है । उदाहरण के लिए, शराब या बियर किण्वन के दौरान, नाइट्रोजन 18 अमीनो एसिड और अमोनियम के एक मिश्रण के रूप में चर सांद्रता9पर प्रदान की जाती है । N यौगिकों कि उपचय के लिए सुलभ है इन जटिल मीडिया की स्थिति आमतौर पर शारीरिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल उन लोगों से बहुत अलग बनाता है के इस सरणी, के रूप में बाद नाइट्रोजन का एक अनूठा स्रोत, आमतौर पर अमोनियम का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं ।

कुल मिलाकर, आंतरिक नाइट्रोजन यौगिकों सीधे प्रोटीन या catabolized में शामिल किया जा सकता है । कई सूक्ष्मजीवों में नाइट्रोजन चयापचय के नेटवर्क संरचना, खमीर Saccharomyces cerevisiaeसहित, सब्सट्रेट की विविधता के अनुसार बहुत जटिल है । योजनाबद्ध रूप से, यह प्रणाली नाइट्रोजन चयापचय के केंद्रीय कोर के संयोजन पर आधारित है जो glutamine, ग्लूटामेट, और α-ketoglutarate10,11, ट्रांसएमिनेस और deaminases के साथ catalyzes का रूपांतरण करते हैं । इस नेटवर्क के माध्यम से अमोनियम या अन्य अमीनो एसिड से अमीन समूह इकट्ठे होते हैं और α-कीटो एसिड जारी किया जाता है । ये मध्यवर्ती केंद्रीय कार्बन चयापचय (सीसीएम)१२,१३के माध्यम से भी synthetized हैं. शाखाई प्रतिक्रियाओं और मध्यवर्ती की यह बड़ी संख्या, दोनों catabolism में शामिल exogenous नाइट्रोजन स्रोतों और proteinogenic अमीनो एसिड की उपचय, कोशिकाओं की anabolic आवश्यकताओं को पूरा करता है. इन अलग जुड़े मार्गों के माध्यम से गतिविधि भी चयापचयों के उत्सर्जन में परिणाम है । विशेष रूप से, α-कीटो एसिड Ehrlich मार्ग के माध्यम से पुनर्निर्देशित किया जा सकता है उच्च शराब और उनके एसीटेट एस्टर डेरिवेटिव14है, जो उत्पादों की संवेदी प्रोफाइल के लिए आवश्यक योगदानकर्ताओं के उत्पादन के लिए । इसके बाद, कैसे नाइट्रोजन चयापचय संचालित बायोमास उत्पादन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और अस्थिर अणुओं (सुगंध) के गठन ।

प्रतिक्रियाओं, एंजाइमों, और नाइट्रोजन चयापचय में शामिल जीन बड़े पैमाने पर साहित्य में वर्णित हैं । हालांकि, एक चयापचय नेटवर्क भर में एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के वितरण के मुद्दे को अभी तक संबोधित नहीं किया गया है । वहां दो मुख्य कारण है कि जानकारी के इस कमी की व्याख्या कर रहे हैं । सबसे पहले, नाइट्रोजन चयापचय नेटवर्क की महत्वपूर्ण जटिलता को ध्यान में रखते हुए, मात्रात्मक डेटा की एक बड़ी राशि है कि अब तक उपलब्ध नहीं था अपने अभियान की एक पूरी समझ के लिए आवश्यक है । दूसरा, कई प्रयोगात्मक बाधाओं और विश्लेषणात्मक तरीकों की सीमाओं दृष्टिकोण है कि पहले सीसीएम समारोह के elucidation के लिए इस्तेमाल किया गया के कार्यांवयन को रोका ।

इन समस्याओं को दूर करने के लिए, हम isotopic अनुरेखक प्रयोगों की एक श्रृंखला से डेटा की सुलह पर आधारित है कि एक प्रणाली स्तर दृष्टिकोण विकसित करने के लिए चुना. कार्यप्रवाह में शामिल हैं:
-एक अलग चयनित पोषक तत्व स्रोत (सब्सट्रेट) हर बार लेबल है, जबकि एक ही पर्यावरण की स्थिति के तहत बाहर किए गए किण्वन का एक सेट ।
-एक सटीक दृढ़ संकल्प के लिए विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं का एक संयोजन (HPLC, जीसी-MS), किण्वन के विभिन्न चरणों में, लेबल सब्सट्रेट और एकाग्रता और यौगिकों कि से प्राप्त कर रहे हैं की isotopic संवर्धन के अवशिष्ट एकाग्रता के catabolism से प्राप्त बायोमास सहित, लेबल अणु की ।
-प्रत्येक भस्म लेबल अणु के लिए बड़े पैमाने पर और isotopic संतुलन और डेटासेट के एक और एकीकृत विश्लेषण प्रवाह अनुपात के निर्धारण के माध्यम से सूक्ष्मजीवों द्वारा कई पोषक तत्वों के स्रोतों के प्रबंधन के एक वैश्विक सिंहावलोकन प्राप्त करने के लिए की गणना .

इस पद्धति को लागू करने के लिए, ध्यान तनाव के प्रतिलिपि व्यवहार करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए/ इसके अलावा, विभिंन संस्कृतियों से नमूने एक ही अच्छी तरह से परिभाषित किण्वन प्रगति के दौरान लिया जाना चाहिए । प्रायोगिक काम में इस पांडुलिपि में रिपोर्ट, एक रोबोट की सहायता प्रणाली के लिए इन बाधाओं के लिए खाते में किण्वन के ऑनलाइन निगरानी के लिए प्रयोग किया जाता है ।

इसके अलावा, यह लेबल सब्सट्रेट (यौगिक, प्रकृति, और लेबलिंग की स्थिति) है कि अध्ययन की वैज्ञानिक समस्या का पता करने के लिए उपयुक्त है का एक सेट का चयन करने के लिए आवश्यक है । यहां, 15N-लेबल अमोनियम, glutamine, और arginine तीन प्रमुख नाइट्रोजन अंगूर के रस में पाया सूत्रों के रूप में चुना गया । यह proteinogenic अमीनो एसिड के लिए भस्म यौगिकों से नाइट्रोजन पुनर्वितरण के पैटर्न का आकलन करने की अनुमति दी । हम भी भस्म अमीनो एसिड की कार्बन रीढ़ की किस्मत की जांच और अस्थिर अणुओं के उत्पादन के लिए उनके योगदान के उद्देश्य से । इस उद्देश्य को पूरा करने के लिए, समान रूप से 13सी-लेबल leucine, isoleucine, threonine, और वैलिन अध्ययन में एमिनो एसिड है कि Ehrlich मार्ग के प्रमुख मध्यवर्ती से प्राप्त कर रहे है के रूप में शामिल थे ।

कुल मिलाकर, हम मात्रात्मक पता लगाया कैसे खमीर redistributing exogenous नाइट्रोजन स्रोतों से एक जटिल नाइट्रोजन संसाधन का प्रबंधन करने के लिए किण्वन भर में अपने anabolic आवश्यकताओं को पूरा करते हुए इसके अलावा कार्बन के रूप में अग्रदूतों की अतिरिक्त हटाने अस्थिर अणुओं । इस पत्र में बताया प्रयोगात्मक प्रक्रिया अन्य कई पोषक तत्वों किसी भी अंय सूक्ष्मजीवों द्वारा इस्तेमाल की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है । यह सूक्ष्मजीवों के चयापचय व्यवहार पर आनुवंशिक पृष्ठभूमि या पर्यावरणीय परिस्थितियों के प्रभाव के विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त दृष्टिकोण प्रतीत होता है ।

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Protocol

1. किण्वन और नमूना

  1. मीडिया और किण्वन की तैयारी
    नोट: सभी किण्वन समानांतर में किया जाता है, एक ही तनाव का उपयोग कर और एक ही रासायनिक रूप से परिभाषित सिंथेटिक माध्यम में (एसएम, तालिका 1में प्रदान की गई संरचना), जिसमें नाइट्रोजन स्रोतों के रूप में अमोनियम और अमीनो एसिड का मिश्रण15शामिल है । प्रत्येक किण्वन के लिए, एक समान रूप से लेबल 13C या 15N प्रपत्र (१००%), जबकि दूसरों unलेबलेड रह में एक एकल नाइट्रोजन यौगिक प्रदान की जाती है । प्रत्येक लेबल नाइट्रोजन स्रोत है कि प्रयोगों के सेट में प्रयोग किया जाता है के लिए (यहां: 15NH4, u-15N4-Arg, u-15N2-Gln, u-13सी 6-लियू, u-13c5-वैल, u-13सी 6-इले, u-13c4- किण्वन तैयार हैं । प्रत्येक स्थिति के लिए, डुप्लिकेट किण्वन केवल unलेबल्ड अणुओं (7 नियंत्रण किण्वन) का उपयोग किया जाता है ।
    1. अध्ययन किया जा करने के लिए प्रत्येक N-स्रोत के लिए, १००% लेबल रूप में उपयोग किया जा करने के लिए यौगिक के अपवाद के साथ, तालिका 1में सूचीबद्ध सभी नाइट्रोजन स्रोत शामिल हैं कि SM माध्यम की ५०० मिलीलीटर तैयार.
      नोट: लेबल अणु अगले चरणों में जोड़ा जाता है ।
    2. Pasteurize प्रत्येक माध्यम को एक 1 L कुप्पी (10 min, १०० ° c) में एक चुंबकीय चमचे पट्टी से युक्त करें । लेबल अणु की उचित मात्रा में अंतिम एकाग्रता है कि तालिका 1 में सूचना दी है तक पहुंचने के लिए और मध्यम में इसे भंग तौलना ।
    3. मध्यम एक डिस्पोजेबल वैक्यूम निस्पंदन सिस्टम (फाइबर एसीटेट झिल्ली, ०.२२ µm) का उपयोग कर निष्फल । एक बाँझ मापने सिलेंडर का उपयोग करना, दो पूर्व निष्फल किण्वक (२५० मिलीलीटर) है कि एक चुंबकीय सरगर्मी बार होते है और किण्वन ताले से सुसज्जित करने के लिए ऑक्सीजन के प्रवेश से बचने के बीच मध्यम विभाजित है, लेकिन सह की रिहाई की अनुमति2
    4. 1 रात (28 डिग्री सेल्सियस पर सेट तापमान) के लिए मशीन के कमरे में उन्हें रखकर 28 डिग्री सेल्सियस के लिए किण्वन कुप्पी गर्मी ।
  2. टीका और किण्वन की निगरानी
    1. 12 एच के लिए मिलाते हुए (१५० rpm) के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर YPD माध्यम के 10 मिलीलीटर युक्त बाँझ ट्यूबों में cerevisiae तनाव बढे फिर, प्लास्टिक YPD संस्कृति के 1 मिलीलीटर और यह SM मध्यम के 10 मिलीलीटर (15 मिलीलीटर बाँझ ट्यूब में) हस्तांतरण । मिलाते हुए (१५० rpm) के साथ 28 डिग्री सेल्सियस पर 12 ज के लिए संस्कृति की मशीन ।
    2. लामिना प्रवाह के तहत, एक संस्कृति aliquot इकट्ठा और कोशिका आबादी एक इलेक्ट्रॉनिक कण काउंटर है कि एक १०० µm एपर्चर के साथ फिट है का उपयोग करता है । संस्कृति (२,००० एक्स जी, 15 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और बाँझ पानी की एक उपयुक्त मात्रा में गोली निलंबित करने के लिए २.५ x 108 कोशिकाओं की एक अंतिम एकाग्रता प्राप्त/ लगाना प्रत्येक किण्वन सेल निलंबन के 1 मिलीलीटर के साथ ।
      नोट: रोबोटिक प्रणाली किण्वन प्रगति की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया चित्रा 1में वर्णित है ।
    3. समर्थन गाइड है कि ठीक से 21-स्थिति सरगर्मी प्लेटों पर रखा जाता है और २७० rpm पर सरगर्मी दर निर्धारित में किण्वनियों स्थापित करके किण्वन मंच तैयार करते हैं । शुरू करने के लिए प्रत्येक किण्वन के ऑन लाइन निगरानी, रोबोट नियंत्रण आवेदन शुरू, तो क्लिक करें "प्रारंभ परख" बटन और किण्वन मात्रा का चयन करने के लिए बाहर किया जा (३०० मिलीलीटर) ।
    4. प्रदर्शित अंतरफलक संख्या के संकेत और मंच पर किण्वन की स्थिति अनुमति देता है । यह सुनिश्चित करने के लिए होता है, स्लॉट स्थान पर दायां क्लिक करें और चुनें "सक्षम" इस स्थिति में स्थित किण्वन की निगरानी को सक्रिय करने के लिए ।
    5. गणना सॉफ्टवेयर प्रारंभ, स्थाई रूप से सिस्टम पर चल रहा है, वजन अधिग्रहण शुरू करने से पहले । "Initialiser" बटन पर क्लिक करें और "ठीक" के साथ मांय । वजन अधिग्रहण शुरू करने के लिए रोबोट नियंत्रण आवेदन के "प्रारंभ बटन" पर क्लिक करें ।
  3. नमूना प्रक्रिया
    नोट: प्रत्येक किण्वन के लिए, नमूने लिया जाता है जब CO2 उत्पादन (गणना सॉफ्टवेयर चला रहे कंप्यूटर पर लाइन पर दिखाया गया मूल्य) आवश्यक सेट-पॉइंट तक पहुंचता है: 5, 10, ४०, और ९० g/L इस अध्ययन में ।
    1. लेबल यौगिकों के साथ संस्कृतियों के लिए नमूना प्रक्रिया ।
      1. दो 6 मिलीलीटर नमूनों (२,००० x g, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) केंद्रापसारक । सहेजें और दो aliquots में-८० डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए supernatants की दुकान । isotopic संवर्धनों की माप के लिए 5 मिलीलीटर आसुत जल और दुकान पर-८० डिग्री सेल्सियस के साथ दो बार छर्रों धो लो ।
    2. नमूना प्रक्रिया संस्कृतियों के लिए लेबल यौगिकों के बिना
      1. फसल 10 मिलीलीटर संस्कृति है, जो शुष्क वजन निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जाएगा । (२,००० एक्स जी, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) द्वारा २ १० मिलीलीटर नमूनों से कोशिकाओं गोली । आसुत जल के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार छर्रों धोने और उंहें में स्टोर-८० ° c प्रोटीन और एमिनो एसिड सामग्री के निर्धारण के लिए ।

2. भस्म नाइट्रोजन स्रोतों का ठहराव

  1. अवशिष्ट अमोनिया सांद्रता के एंजाइमी निर्धारण
    नोट: supernatants में अमोनिया एकाग्रता का निर्धारण एक वाणिज्यिक एंजाइम आधारित किट का उपयोग कर बाहर किया जाता है; सभी रिएजेंट निर्माता द्वारा प्रदान की जाती हैं ।
    1. एक मानक अमोनिया समाधान तैयार (६१.४ मिलीग्राम/एल) भंग द्वारा ठीक से 25 मिलीग्राम (एनएच4)2तो4 एक १०० मिलीलीटर volumetric कुप्पी में ।
    2. निर्माता के निर्देशों को पूरा करने के लिए, एक 1:2 कमजोर पड़ने के नमूनों कि किण्वन से पहले ले जाया गया और 5 g/L2 का विमोचन किया । 1 एम KOH जोड़कर लगभग 8 करने के लिए नमूनों की पीएच समायोजित करें । जोड़ा मात्रा का ध्यान रखें और इसे कमजोर पड़ने वाले पहलू में खाते में ले लो ।
    3. मे 4 मिलि spectrophotometer cuvettes, मिश्रण १०० नमूना के µ एल (यदि आवश्यक पतला), आसुत जल या मानक अमोनिया समाधान के 2 मिलीलीटर के साथ एजेंट 1 (०.७५ mm ADP और 30 U/एमएल ग्लूटामेट डिहाइड्रोजनेज पीएच ७.८ बफर में) और ५०० µ l के एजेंट 2 (१.३ mm नध) । कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए मशीन और ३४० एनएम (A1) में नध अवशोषक पढ़ें ।
    4. जोड़ें ५०० µ l reagent 3 (६० mM α-ketoglutarate pH 8 बफ़र में), कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए नमूना मशीन, और ३४० एनएम (A2) पर नध अवशोषण पढ़ें ।
    5. का उपयोग कर अमोनिया एकाग्रता की गणना:
      Cअमोनिया (g/L) = ०.०८३ x [(०.८३९ x a1-a2)नमूना-(०.८३९ x a1-a2)आसुत जल]
    6. जांच करें कि सही एकाग्रता मानक समाधान के साथ प्राप्त की है ।
  2. अवशिष्ट अमीनो अम्ल सांद्रता का क्रोमेटोग्राफिक निर्धारण
    नोट: supernatants में एमिनो एसिड सांद्रता का निर्धारण एक समर्पित एमिनो एसिड विश्लेषण प्रणाली है कि आयन पर आधारित है का उपयोग कर प्राप्त किया जाता है-ninhydrin के साथ एन यौगिकों के पोस्ट कॉलम derivatization के साथ विनिमय क्रोमैटोग्राफी, जो अनुमति देता है उनके वर्णमिति डिटेक्शन ।
    1. तटस्थ और अम्लीय एमिनो एसिड, २०० µ एल के एक वाणिज्यिक मिश्रण के २०० µ एल जोड़कर एक संदर्भ समाधान तैयार बुनियादी अमीनो एसिड का एक वाणिज्यिक मिश्रण के, और २.५ mm glutamine के २०० µ एल ४०० mm लिथियम साइट्रेट बफर के २०० µ एल, पीएच २.२ । यह रासायनिक परिभाषित संदर्भ समाधान एक नमूना के रूप में माना जाता है ।
    2. जोड़ें २०० µ एल के 25% (डब्ल्यू/वी) sulfosalicylic एसिड समाधान है कि उच्च आणविक भार के साथ अणुओं को दूर करने के लिए नमूना के ८०० µ एल के लिए २.५ mM norleucine (आंतरिक मानक) शामिल हैं । 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मशीन, (३,००० एक्स जी, 10 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस) और फिल्टर एक ०.२२-µm ताकना आकार nitrocellulose झिल्ली (सिरिंज प्रणाली) के माध्यम से ।
    3. प्रोग्रामर सॉफ्टवेयर में, बटन पर क्लिक करें "भागो" एक कटियन-एक्सचेंज कॉलम (लिथियम फार्म) के साथ सुसज्जित विश्लेषक के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी (नियंत्रण रेखा) विश्लेषण शुरू करने के लिए । Elute लगातार लिथियम बफ़र्स के साथ एमिनो एसिड दोनों एक पीएच ढाल और एक तापमान ढाल (2 तालिका) के साथ संयोजन में काउंटर आयन एकाग्रता में ढाल बनाने के लिए ।
    4. ५७० एनएम (बैंगनी रंगाई: एमिनो एसिड के ninhydrin और अमीन समूह के बीच प्रतिक्रिया) और ४४० एनएम (पीला रंगाई: ninhydrin और िमीन समूह के बीच की प्रतिक्रिया) में एक स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक डिटेक्टर द्वारा ninhydrin derivatization के बाद नाइट्रोजन यौगिकों को बढ़ाता है रेखा) ।
    5. संदर्भ समाधान का उपयोग कर एक एकल बिंदु आंतरिक अंशांकन करने और निर्माता के सॉफ्टवेयर का उपयोग नमूनों में अमीनो एसिड की सांद्रता की गणना करने के लिए एक आंतरिक मानक के रूप में norleucine ।

3. Proteinogenic अमीनो अम्ल की ठहराव

  1. ड्राई सेल वजन का मापन
    1. एक वैक्यूम डिवाइस का उपयोग कर, एक एल्यूमीनियम कप में पूर्व तौला है कि एक nitrocellulose फिल्टर (ताकना आकार ०.४५ µm) के माध्यम से संस्कृति के 10 मिलीलीटर फ़िल्टर. आसुत जल के ५० मिलीलीटर के साथ दो बार धो लें ।
    2. एल्यूमीनियम कप में फिल्टर प्लेस और ४८ घंटे के लिए १०५ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ओवन में सूखी (जब तक वजन में कोई और परिवर्तन मनाया जाता है) कप में फिल्टर वजन से पहले । वजन अंतर की गणना ।
    3. सही ढंग से खमीर संस्कृति के शुष्क कोशिका वजन निर्धारित करने के लिए ंयूनतम 3 स्वतंत्र माप के औसत की गणना ।
  2. ठहराव कोशिकाओं की प्रोटीन सामग्री
    नोट: ठहराव कोशिकाओं के प्रोटीन अंश की कम से तपसिल में खंड 1.3.2 में वर्णित के रूप में प्राप्त किए गए unलेबल्ड सेल छर्रों का उपयोग किया जाता है ।
    1. DMSO समाधान के 1 मिलीलीटर के अलावा प्रोटीन निकालें (५०% v/v) जमे हुए छर्रों और एक सूखी गर्मी ओवन में 1 ज के लिए १०५ डिग्री सेल्सियस पर मशीन ।
    2. DMSO में प्रोटीन सामग्री मात्रा का उपयोग करता है जैव रासायनिक वर्णमिति परख कि घन के प्रोटीन द्वारा कमी पर आधारित है ++ घन में+ आयनों है कि आगे bicinchoninic एसिड द्वारा एक नीला परिसर (बीसीए परख) में उपजी हैं ।
  3. प्रोटीन के भीतर अमीनो एसिड के सापेक्ष योगदान का निर्धारण
    नोट: proteinogenic अमीनो एसिड का प्रोफ़ाइल कम से तपसिल में unलेबल्ड सेल छर्रों (1.3.2.) से निर्धारित होता है ।
    1. प्रदर्शन एसिड (९०% फार्मिक एसिड, 10% हाइड्रोजन पेरोक्साइड) के २०० µ एल में सेल गोली निलंबित द्वारा एक ऑक्सीकरण उद्धरण तैयार करें । 4 ° c पर 4 ज के लिए मशीन और ३३.६ मिलीग्राम सोडियम सल्फेट के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया बंद करो ।
      नोट: ऑक्सीकरण चरण में cysteine और मिथीयोनाईन को मिथीयोनाईन sulfone और cysteic एसिड में परिवर्तित करने की आवश्यकता होती है, जो आयन-एक्सचेंज मात्रा द्वारा आगे क्रोमैटोग्राफी की जाएगी. हालांकि, कुछ एमिनो एसिड (tyrosine, फेनिलएलनिन, histidine, और arginine) ऑक्सीकरण उपचार के दौरान विकृत कर रहे हैं । नतीजतन, दो hydrolysates (के साथ और ऑक्सीकरण के बिना) तैयार कर रहे हैं ।
    2. सेल छर्रों या ऑक्सीकरण उद्धरण के लिए 6N एचसीएल के ८०० µ एल जोड़ें और एक सूखी गर्मी ओवन में ११० डिग्री सेल्सियस पर 16 घंटे के लिए एक भली सील ग्लास ट्यूब में नमूना मशीन । २.५ mM norleucine का २०० µ l जोड़ें और एचसीएल को नाइट्रोजन की एक धारा के साथ हटा दें । धो (सूखे निकालने reसस्पैंड और फिर एक नाइट्रोजन धारा के साथ तरल को हटाने) आसुत जल के ८०० µ एल के साथ दो बार और फिर ८०० इथेनॉल के µ एल के साथ । २०० mM लिथियम एसीटेट बफर, पीएच २.२ के ८०० µ एल में ले लो ।
      नोट: ध्यान hydrolysis के लिए मशीन समय के लिए भुगतान किया जाना चाहिए के रूप में कुछ एमिनो एसिड अंलीय शर्तों के तहत स्थिर नहीं हैं । प्रोटीन में tryptophan अंश का अनुमान साहित्य में पाए गए डेटा से है16, क्योंकि एचसीएल hydrolysis के दौरान यह अमीनो एसिड पूरी तरह से विकृत होता है ।
    3. एकल-बिंदु आंतरिक अंशांकन के लिए एक hydrolysate मानक तैयार करें । hydrolyzed अमीनो एसिड के एक वाणिज्यिक समाधान के १६० µ एल जोड़ें २०० mM लिथियम एसीटेट बफर के ८४० µ एल, पीएच २.२, जिसमें ६२५ µ एम मिथीयोनाईन sulfone, ६२५ µ एम cysteic एसिड, और ६२५ µ मीटर norleucine ।
    4. २.२ खंड में वर्णित क्रोमेटोग्राफिक विधि का उपयोग प्रोटीन के भीतर अमीनो एसिड की सापेक्ष सांद्रता निर्धारित करें ।
  4. गणना
    1. प्रोटीन में प्रत्येक एमिनो एसिड की मापा राशि विभाजित करके वजन प्रतिशत की गणना प्रोटीन निकालने में मापा गया था कि एमिनो एसिड की कुल राशि (mg/l) द्वारा प्रत्येक एमिनो एसिड (मिलीग्राम/l) ।
    2. संस्कृति में प्रोटीन की एकाग्रता द्वारा इस प्रतिशत गुणा (mg/l), यानी, बायोमास और शुष्क वजन के प्रोटीन सामग्री के बीच उत्पाद, संस्कृति में प्रत्येक proteinogenic एमिनो एसिड की एकाग्रता का आकलन करने के लिए (mg/l).

4. Proteinogenic अमीनो अम्लों के Isotopic संवर्धन का मापन

नोट: proteinogenic अमीनो एसिड की isotopic संवर्धन की माप के लिए, लेबल सेल छर्रों का उपयोग करें । तीन अलग एजेंटों derivatization कदम अमीनो एसिड की isotopic संवर्धन मात्रा के लिए उपयोग किया जाता है । क्लस्टर आयनों की तीव्रता अमीनो एसिड के लेबलिंग पैटर्न का अनुमान करने के लिए मापा जाता है । प्रत्येक क्लस्टर आयन से संकेत जन isotopomers की बहुतायत से मेल खाती है (एम0 = लेबल के बिना, m+ 1 = 1 लेबल एटम,...) एक एमिनो एसिड टुकड़ा की. DMADMF कार्यविधि के बाद प्राप्त की गई वर्णलेख का एक उदाहरण आरेख 2में प्रदान किया गया है ।

  1. बायोमास hydrolysis
    1. Hydrolyze सेल छर्रों (सूखे बायोमास के 1-2 मिलीग्राम के लिए इसी) 6 एम एचसीएल के १.२ मिलीलीटर जोड़कर और 16 ज के लिए १०५ डिग्री सेल्सियस में नमूना मशीन एक सूखी गर्मी ओवन में कसकर बंद ग्लास ट्यूबों में ।
    2. आसुत जल के १.२ मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिनट के लिए ३,००० एक्स जी में सेलुलर मलबे को हटाने के लिए केंद्रापसारक । supernatant में वितरित ६ ४०० µ l भागों में खुला ग्लास ट्यूबों. १०५ डिग्री सेल्सियस पर एक गर्मी ओवन में भागों सूखी जब तक वे सिरप (4-5 एच) की निरंतरता तक पहुंचने ।
  2. Ethylchloroformate (ECF) derivatization
    1. 20 मिमी एचसीएल के २०० µ एल में सूखे hydrolysate को भंग; फिर, जोड़ें १३३ µ pyridine के एल: इथेनॉल (1:4) । जोड़ें ५० µ ECF के एल एमिनो एसिड derivatize और इंतजार जब तक सभी सह2 जारी किया गया है । मिश्रण ट्यूब कि dichloromethane के ५०० µ एल शामिल करने के लिए स्थानांतरण derivatized यौगिकों निकालने के लिए ।
    2. भंवर 10 एस के लिए ट्यूबों और उंहें 4 मिनट के लिए १०,००० x g पर केंद्रापसारक; एक पाश्चर प्लास्टिक के साथ कम कार्बनिक चरण लीजिए और gc शीशियों है कि शंकु कांच आवेषण होते हैं ताकि नमूनों सीधे gc/MS साधन में इंजेक्ट किया जा सकता है शामिल करने के लिए स्थानांतरण ।
  3. (n, n)-Dimethylformamide dimethyl acetal (DMFDMA) derivatization.
    1. सूखे hydrolysate को भंग कर मेथनॉल के ५० µ l में और २०० µ l का acetonitrile. DMFDMA के ३०० µ l को जोड़ें । ट्यूब भंवर और शंकु कांच आवेषण शामिल है कि जीसी नमूना शीशियों के लिए नमूनों हस्तांतरण ।
  4. N, O-भा (trimethylsilyl) trifluoroacetamide (BSTFA) derivatization
    1. acetonitrile के २०० µ l में hydrolysate को सस्पेंड कर दीजिये. जोड़ें २०० µ BSTFA के एल, भली ग्लास ट्यूब बंद करो और 4 एच के लिए मशीन के लिए १३५ डिग्री सेल्सियस पर सीधे GC शीशियों को निकालने के हस्तांतरण से पहले ।
  5. जीसी-एमएस विश्लेषण
    1. एक नमूना इंजेक्टर के साथ सुसज्जित है और एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमीटर के लिए युग्मित है कि एक गैस chromatograph के साथ नमूनों का विश्लेषण.
      1. साधन नियंत्रण और chromatograms का विश्लेषण करने के लिए साधन विशेष सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें । "अनुक्रम" मेनू में, नमूना सूची बनाने के लिए "नमूना लॉग तालिका" क्लिक करें, और इंजेक्शन प्रारंभ करने के लिए "चलाएँ" बटन क्लिक करें ।
        नोट: गैस chromatograph एक ०.१५ माइक्रोन फिल्म मोटाई के साथ एक 30 मीटर x ०.२५ mm apolar सिलिका केशिका कॉलम के साथ फिट है । १५० डिग्री सेल्सियस पर जन स्पेक्ट्रोमीटर quadrupole तापमान सेट और सभी विश्लेषण के लिए २५० डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरण लाइन पकड़ । तीन विश्लेषणात्मक प्रोग्राम, प्रत्येक derivatization एजेंट के लिए विशिष्ट प्रत्येक एक का उपयोग किया जाता है ।
      2. ECF डेरिवेटिव: १.२ मिलीलीटर/मिनट के प्रवाह के साथ मोबाइल चरण के रूप में हीलियम का प्रयोग करें २३० डिग्री सेल्सियस पर प्रवेश के तापमान सेट और २५० डिग्री सेल्सियस पर स्रोत की है कि । कार्यक्रम 3:1 के एक विभाजन अनुपात के साथ नमूनों की 1 µ एल इंजेक्षन करने के लिए. विश्लेषणों भागो, धीरे से इस प्रकार के रूप में ओवन तापमान में वृद्धि: 3 मिनट के लिए १३० ° c; 15 ° c/२६० डिग्री सेल्सियस के लिए ढाल; 20 मिनट के लिए २६० डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें ।
      3. DMFDMA डेरिवेटिव: १.२ मिलीलीटर की एक निरंतर प्रवाह के साथ मोबाइल चरण के रूप में हीलियम का उपयोग करें/२३० डिग्री सेल्सियस पर प्रवेश के तापमान सेट और २५० डिग्री सेल्सियस पर स्रोत है । कार्यक्रम 3:1 के एक विभाजन अनुपात के साथ नमूनों की 1 µ एल इंजेक्षन करने के लिए. विश्लेषणों भागो, धीरे से इस प्रकार के रूप में ओवन तापमान में वृद्धि: 1 मिनट के लिए ६० ° c; 20 ° c/१३० डिग्री सेल्सियस के लिए ढाल; 4 ° c/२६० डिग्री सेल्सियस के लिए दूसरा ढाल; 10 मिनट के लिए २६० डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें ।
      4. BSTFA डेरिवेटिव: १.२ मिलीलीटर की एक निरंतर प्रवाह के साथ मोबाइल चरण के रूप में हीलियम का उपयोग करें/२७५ डिग्री सेल्सियस पर प्रवेश के तापमान सेट और ३०० डिग्री सेल्सियस पर स्रोत है । भागो विश्लेषणों (इंजेक्शन: 1 µ एल), धीरे से इस प्रकार के रूप में ओवन तापमान में वृद्धि: 1 मिनट के लिए ११० ° c; 2 डिग्री सेल्सियस/१५४ डिग्री सेल्सियस के पहले ढाल; 5 ° c/३०० डिग्री सेल्सियस के लिए दूसरा ढाल; 10 मिनट के लिए ३०० डिग्री सेल्सियस पर तापमान बनाए रखें ।
      5. जांच प्रक्रिया: derivatization के प्रत्येक विधा के लिए, ७० eV में सकारात्मक इलेक्ट्रॉन प्रभाव ionization के साथ एक नमूना (1 µ l) स्कैन मोड में सुई और प्रत्येक एमिनो एसिड की अवधारण समय का ध्यान रखना ।
      6. वर्णलेख भर में और विभिंन चयनित आयनों, जो प्रत्येक एमिनो एसिड की विशेषता है और तालिका 3में सूचीबद्ध के लिए समय खिड़कियों को परिभाषित करने के लिए इन मूल्यों का प्रयोग करें; इन मूल्यों प्रत्येक एमिनो एसिड के लिए शामिल किया जाना चाहिए । सिम पता लगाने के कार्यक्रम में इस जानकारी को शामिल करें और ७० eV पर सकारात्मक इलेक्ट्रॉन प्रभाव ionization के साथ सिम मोड में विश्लेषण चलाते हैं ।
    2. विश्लेषण के परिणामों को इकट्ठा; अर्थात्, प्रत्येक एमिनो एसिड के लिए, अपने विभिन्न मास isotopomers के अनुरूप है कि तीव्रता के एक क्लस्टर रिकॉर्ड. dedicatedsoftware17 का उपयोग कर डेटा संसाधित करने के लिए प्राकृतिक लेबल के लिए सही है और proteinogenic अमीनो एसिड की isotopic संवर्धन की गणना (प्रोटीन में अपनी कुल राशि के संबंध में एक एमिनो एसिड के लेबल अंश के रूप में परिभाषित नमूने) ।
      नोट: एक अणु (ie) के isotopic संवर्धन, एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है, सही की राशि से (एम1, एम2,... mn) लेबलिंग के साथ जन isotopomers के सुधार की तीव्रता की राशि विभाजित गणना की है सभी मास isotopomers की तीव्रता (एम0, एम1, एम2,... एमएन):
      I. E. = (मी + मी +... + mn)/(एम0 + एम1+ एम2 +... + एमएन)

5. अस्थिर यौगिकों के ठहराव और Isotopic संवर्धन

  1. लेबल अस्थिर यौगिकों का निष्कर्षण
    1. supernatant के 5 मिलीलीटर (deuterated यौगिकों के अंतिम एकाग्रता: १०० µ g/l) में एक 15 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब के लिए deuterated आंतरिक मानकों के 10 µ एल जोड़ें । dichloromethane के 1 मिलीलीटर जोड़ें, कसकर ट्यूबों बंद करो और उंहें 20 मिनट के लिए एक कमाल का मंच पर शेक 5 मिनट के लिए ३,००० x g पर और एक 15 मिलीलीटर ग्लास ट्यूब में कार्बनिक निचले चरण लीजिए । dichloromethane निष्कर्षण को दोहराएँ ।
    2. निर्जल सोडियम सल्फेट के ५०० मिलीग्राम से अधिक कार्बनिक निकालने सूखी और एक पाश्चर प्लास्टिक के साथ तरल चरण इकट्ठा । नाइट्रोजन प्रवाह के तहत चार के एक कारक द्वारा निकालने ध्यान केंद्रित करने और यह एक GC नमूना शीशी को हस्तांतरण ।
  2. ठहराव-सुश्री वाष्पशील यौगिकों के एमएस
    1. गैस chromatograph से लैस एक 30 एम एक्स ०.२५ मिमी के साथ सिलिका केशिका स्तंभ ०.२५ माइक्रोन फिल्म मोटाई के साथ जुड़े और १.० मिलीलीटर की एक निरंतर हीलियम प्रवाह लागू//इंजेक्शन और स्थानांतरण लाइन २५० डिग्री सेल्सियस पर पकड़ो ।
    2. 10:1 के एक विभाजित अनुपात के साथ नमूना के 2 µ एल सुई और निकाले अस्थिर निम्न ओवन तापमान प्रोफाइल का उपयोग कर अणुओं अलग: ४० डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए तापमान पकड़, 4 ° c से वृद्धि हुई/२२० ° c करने के लिए मिनट तक और फिर 20 मिनट के लिए २२० ° c पर ओवन पकड़ ।
    3. २३० डिग्री सेल्सियस पर सेट अपने स्रोत तापमान और इसके द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर quadrupole तापमान १५० डिग्री सेल्सियस पर सेट के साथ एक जन स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग यौगिकों का पता लगाएं । ७० eV में सकारात्मक इलेक्ट्रॉन प्रभाव ionization के साथ चयनित आयन निगरानी (सिम) मोड में मास स्पेक्ट्रा रिकॉर्ड और वाष्पशील यौगिकों कि तालिका 4में रिपोर्ट कर रहे हैं के लिए विशिष्ट आयन क्लस्टर का उपयोग कर ।
    4. एक बाहरी 7-बिंदु अंशांकन का उपयोग करने के लिए इसी आयन क्लस्टर की तीव्रता की रकम से अस्थिर अणुओं की सांद्रता यों तो । प्रत्येक यौगिक के स्टॉक समाधान तैयार करें (10 g/L) १००% इथेनॉल में । फिर, अस्थिर अणुओं के प्रत्येक वर्ग के लिए मानक समाधान तैयार (एथिल एस्टर, acetates, शराब, और एसिड) स्टॉक समाधान के मिश्रण से । अंत में, एक 12% hydroalcoholic समाधान में मानक समाधान के विभिंन मात्रा में पतला 5 ग्राम/३.३ करने के लिए समायोजित पीएच के साथ tartaric एसिड अंशांकन समाधान तैयार करने के लिए ।
    5. समानांतर में, प्रत्येक आयन क्लस्टर की तीव्रता के प्राकृतिक लेबलिंग के लिए सही और वाष्पशील यौगिकों, जो अणुओं के लेबल अंश के रूप में परिभाषित किया गया है और एक समर्पित सॉफ्टवेयर का उपयोग प्रतिशत के रूप में व्यक्त की है isotopic संवर्धन की गणना 17.

6. डेटासेट के एक एकीकृत विश्लेषण के लिए गणना

  1. रॉ डेटा का संग्रह
    1. तालिकाओं 5, 6, 7, और 8 में दिखाए गए स्प्रेडशीट का उपयोग कर , कच्चे डेटा मूल्यों है कि extracellular अमीनो एसिड की एकाग्रता के लिए अनुरूप दर्ज करें, कोशिका सूखी वजन, कोशिकाओं के प्रोटीन सामग्री, अस्थिर अणुओं की एकाग्रता, और isotopic proteinogenic अमीनो एसिड और अस्थिर अणुओं के संवर्धन ।
      नोट: तालिकाओं में दिखाया गया डेटा मिमी में अभिव्यक्त होता है. सभी परिणाम भी मिलीग्राम में व्यक्त कर रहे हैं/एल में प्रत्येक अणु के आणविक भार से या मिलीग्राम N/एल में एक proteinogenic एमिनो एसिड की millimolar एकाग्रता गुणा द्वारा mM में मूल्यों को नाइट्रोजन के परमाणु द्रव्यमान (14 यू) द्वारा और नाइट्रोजन ातो की संख्या द्वारा एमएस है कि इस अणु के catabolism द्वारा प्रदान की जाती हैं ।
    2. hydrolysate में एमिनो एसिड की कुल मात्रा (mg/l में उनकी राशि) द्वारा मिलीग्राम में अपनी राशि विभाजित करके प्रोटीन में प्रत्येक एमिनो एसिड की जन प्रतिशत की गणना करें ।
    3. मतलब है, मानक विचलन, और डेटा है कि स्वतंत्र प्रयोगों में प्राप्त किए गए से मतलब की मानक त्रुटियों की गणना ।
    4. proteinogenic एकाग्रता की गणना (मिलीग्राम/एल) प्रोटीन में इस एमिनो एसिड का प्रतिशत गुणा द्वारा प्रत्येक एमिनो एसिड के लिए (मिलीग्राम ए. जी. प्रोटीन) बायोमास (जी प्रोटीन/g DW में प्रोटीन अंश द्वारा) और शुष्क वजन सामग्री (बायोमास उत्पादन) में मध्यम (g DW/
  2. 15 N isotopic अनुरेखक उपाययोजना
    1. स्प्रेडशीट है कि तालिका 9में प्रस्तुत कर रहे है का उपयोग करना, लेबल और proteinogenic एमिनो एसिड में मौजूद है कि नाइट्रोजन के लेबल और unlabeld भागों की गणना (mg n/l में व्यक्त) उनके कुल सांद्रता से (mg n/l में व्यक्त) और उनके isotopic संवर्धनों । प्रत्येक एमिनो एसिड के लिए, लेबल अंश अपनी कुल एकाग्रता और उसके isotopic संवर्धन के बीच उत्पाद से मेल खाती है, और unलेबल्ड हिस्सा कुल और लेबल राशि के बीच अंतर है ।
    2. फिर, इस अध्ययन में proteinogenic अमीनो एसिड मात्रा में निहित है कि प्रोटीन में कुल नाइट्रोजन के अंश का निर्धारण ाला की कुल राशि को संक्षेप में, Gly, वैल, एएसपी, Phe, लियू, इले,, Ser, प्रो, Lys, उसक, Glu और Arg (mg N/L में) और कुल एक विभाजन इस योग के द्वारा प्रोटीन में निहित नाइट्रोजन की माउंट ।
    3. arginine द्वारा प्रदान की गई नाइट्रोजन की गणना, glutamine या अमोनियम कि proteinogenic एसिड में मात्रा (एमजी N/एल) proteinogenic अमीनो एसिड है कि अध्ययन में मात्रा थे (अला, Gly, वैल, एएसपी, लेबल अंश संक्षेप द्वारा इस अध्ययन में बरामद किया गया था Phe, लियू, इले,, Ser, प्रो, Lys, उसकी, Glu, और Arg) 15N-लेबल arginine, glutamine, या अमोनियम की उपस्थिति में प्रयोगों के दौरान और इस लेबल-नाइट्रोजन अंश को मात्रा proteinogenic एमिनो में नाइट्रोजन की कुल मात्रा द्वारा विभाजित एसिड.
    4. 13सी और 15एन आइसोटोप अनुरेखक प्रयोगों ( तालिका 7में स्प्रेडशीट) से डेटा के संयोजन के द्वारा de नोवो संश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया नाइट्रोजन के intracellular पूल के लिए 3 सबसे प्रचुर मात्रा में अमीनो एसिड के योगदान का आकलन करें ।
    5. कुल राशि (मिमी में व्यक्त की) से proteinogenic वैल, लियू, इले, या,, भस्म यौगिकों (13सी प्रयोगों) और हिस्सा है कि 3 से नाइट्रोजन का उपयोग डी नोवो synthetized था भाग के प्रत्यक्ष निगमन से व्युत्पंन हिस्सा घटा प्रमुख सूत्रों के आदेश में अंश है कि de नोवो synthetized अंय अमीनो एसिड से नाइट्रोजन का उपयोग कर रहा था का आकलन करने के लिए ।
    6. फिर, एमिनो एसिड de नोवो synthetized की मात्रा के अनुपात की गणना Gln, Arg, और एनएच4+ द्वारा प्रदान की नाइट्रोजन का उपयोग (मिमी में व्यक्त की राशि) proteinogenic अमीनो एसिड की कुल राशि (मिमी में) के योगदान को यों तो arginine, glutamine, और अमोनियम intracellular नाइट्रोजन पूल के लिए ।
  3. 13 C isotopic अनुरेखक उपाययोजना
    1. मिमी में व्यक्त सांद्रता से proteinogenic अमीनो एसिड की लेबल और अनलेबल्ड अंशों और proteinogenic अमीनो एसिड की उपस्थिति में प्रयोगों के दौरान प्राप्त किया गया था कि isotopic संवर्धनों की गणना करें-लेबल लियू, वैल, इले. (6.2.1, तालिका 10) देखें ।
    2. मिमी में व्यक्त सांद्रता और अस्थिर यौगिकों कि 13सी-लेबल लियू, वैल, इले, या (के लिए की उपस्थिति में प्रयोगों के दौरान प्राप्त किए गए isotopic संवर्धनों से अस्थिर यौगिकों के लेबल और unlabeld भागों की गणना ( तालिका 10) ।

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Representative Results

चित्रा 3 कि शराब किण्वन के दौरान पाया जाता है कि कई नाइट्रोजन स्रोतों के खमीर से प्रबंधन की जांच करने के लिए लागू किया गया था कि कार्यप्रवाह के एक योजनाबद्ध आरेख प्रस्तुत करता है ।
नमूने के विभिंन बिंदुओं के लिए, जैविक मानकों-विकास विशेषताओं, नाइट्रोजन की खपत पैटर्न, और proteinogenic अमीनो एसिड की प्रोफ़ाइल-किण्वन के बीच एक उच्च reproducibility दिखाएं (चित्रा 4) । इस संगतता 14 स्वतंत्र किण्वन का एक सेट के दौरान उत्पन्न किया गया था जो डेटा के संयोजन पर आधारित दृष्टिकोण की प्रासंगिकता सत्यापित करता है ।

चित्रा 5 स्रोत है कि सभी proteinogenic अमीनो एसिड के लिए अंगूर के रस में उपलब्ध है से नाइट्रोजन के पुनर्वितरण के एक व्यापक सिंहावलोकन से पता चलता है । यह विश्लेषण मुख्य रूप से उन परिणामों द्वारा समर्थित है जो 15N-लेबल वाले यौगिकों की उपस्थिति में किए गए प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे । जन और isotopic संतुलन के निर्धारण के साथ संयुक्त, proteinogenic अमीनो एसिड के isotopic संवर्धन की माप नाइट्रोजन की उत्पत्ति arginine, glutamine, अमोनियम के योगदान के पहले ठहराव प्रदान की है, और अंय इन यौगिकों में से प्रत्येक के अमीन समूहों के लिए सूत्रों का. नाइट्रोजन के महत्वपूर्ण पुनर्वितरण कि यहां रेखांकित किया है खमीर विकास को बनाए रखने में अमीनो एसिड की डी नोवो संश्लेषण की पर्याप्त भूमिका को दर्शाता है ।

इसके अलावा, इस अध्ययन, उनके उपभोग के साथ प्रोटीन में लेबल यौगिकों की मात्रा की तुलना, भस्म N-अणुओं है कि सीधे प्रोटीन में शामिल कर रहे है जब वे कोशिकाओं को दर्ज करने के लिए मूल्यांकन किया जा करने वाले के अंश की अनुमति देता है । Proteinogenic एमिनो एसिड बायोमास में प्रत्यक्ष शामिल करने के अपने स्तर के अनुसार विभेदित कर रहे हैं; उनमें से कुछ विशेष रूप से कर रहे हैं (Asp, Glu) या अधिक से अधिक ८०% de नोवो synthetized, जबकि अन्य यौगिकों की केवल छोटी मात्रा में डी नोवो संश्लेषण द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं. दिलचस्प है, यह पिछले समूह lysine और histidine, जो केवल अमीनो एसिड जिसमें सभी खपत स्रोतों सीधे शामिल कर रहे है शामिल हैं ।

चित्रा 5B भी प्रस्तुत करता है, कुछ अमीनो एसिड के लिए, खपत एमिनो एसिड है कि सीधे बायोमास में बरामद किया है की मात्रा के बीच तुलना, 15एन में प्राप्त डेटा से गणना-लेबल प्रयोगों और 13 में प्रयोग मापा C-लेबलिंग प्रयोग । इन मूल्यों के बीच छोटे अंतर विश्वसनीयता और दृष्टिकोण है कि इस अध्ययन में लागू किया गया था की मजबूती दिखाते हैं ।

चित्रा 6 इस पत्र में सूचना दी कार्यप्रवाह को लागू करने के द्वारा प्राप्त किया गया था कि चयापचय रास्ते के माध्यम से प्रवाह के परिमाण के विभाजन (अनुपात) का एक उदाहरण से पता चलता है. इस नक्शे isotopic अनुरेखक 15एन-और 13सी-लेबल का उपयोग कर प्रयोगों से जानकारी के संयोजन द्वारा तैयार किया गया था और चयापचय नेटवर्क है कि वैलिन में शामिल है और भस्म aliphatic अमीनो एसिड के विभाजन का वर्णन खमीर में leucine (परिकलनों के लिए, तालिका 1 और तालिका 2) का संदर्भ लें । दोनों proteinogenic अमीनो एसिड और अस्थिर यौगिकों के उत्पादन और isotopic संवर्धन को मापने के द्वारा, हम इन यौगिकों कि भस्म यू-सी13-वैलिन और यू-सी13की कार्बन रीढ़ की संख्या से synthetized थे की राशि का आकलन- leucine, जो यौगिकों के लेबल अंश से मेल खाती है । इसके बाद, हम अपने गठन के लिए सीसीएम के योगदान का निर्धारण करने में सक्षम थे (यौगिकों के अनलेबल्ड अंश). कार्बन मास संतुलित रखता का उपयोग कर सेट करें कार्यप्रवाह और गणना प्रक्रिया है कि यहां प्रस्तावित है कि अधिक से अधिक ९६% भस्म वैलिन और leucine के अपने रूपांतरण उत्पादों, अर्थात् में बरामद कर रहे हैं, proteinogenic leucine और वैलिन और अस्थिर उच्च शराब. यह खोज चयापचय की मात्रात्मक अध्ययन के लिए रिपोर्ट दृष्टिकोण की उपयुक्तता की पुष्टि करता है । dataset के एकीकृत और व्यापक विश्लेषण खपत अमीनो एसिड के भाग्य में नए अंतर्दृष्टि प्रदान करता है । आश्चर्य की बात है, वैलिन और leucine के एक पर्याप्त अंश मध्यम में इन यौगिकों और बायोमास में उनकी सामग्री की उपलब्धता के बीच एक काफी असंतुलन के बावजूद catabolized हैं । हालांकि, सीधे प्रोटीन में शामिल exogenous N-यौगिकों के अंश अमीनो एसिड की प्रकृति पर निर्भर करता है । एक अंय प्रमुख बिंदु proteinogenic अमीनो एसिड और अस्थिर अणुओं की चयापचय मूल से संबंधित है । proteinogenic leucine और वैलिन के 13सी-लेबलिंग पैटर्न के विश्लेषण से पता चलता है कि इन अमीनो एसिड्स का कार्बन कंकाल मुख्य रूप से उन पुरोगामी से आता है जो सीसीएम के माध्यम से synthetized थे । इस अवलोकन के साथ लाइन में, isobutanol और isoamyl शराब में लेबलिंग के कम शामिल है कि इन उच्च शराब के गठन में खमीर द्वारा भस्म किया गया वैलिन और leucine के catabolism की बहुत सीमित भागीदारी को दर्शाता है ।

Figure 1
चित्र 1. उच्च प्रवाह किण्वन की निगरानी के लिए स्वचालित रोबोट प्रणाली । () रोबोट मंच । किण्वन (ए) चुंबकीय उभार प्लेटों (ख) पर समर्थन गाइड में रखा जाता है । एक सुरक्षा प्रकाश परदा (c) उपयोगकर्ताओं की सुरक्षा करता है । एक रोबोट हाथ (घ) एक सटीक संतुलन के लिए 6 उभार प्लेटों में से एक पर उनके स्थान से किण्वन क्रमिक चालें (ई) worktable के बाईं ओर, वजन मापने के लिए हर 4 घंटे । रोबोट प्लेटफार्म एक तापमान नियंत्रित कमरे में स्थित है । (B) सॉफ़्टवेयर आर्किटेक्चर का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण । एक ग्राफिकल इंटरफेस उपयोगकर्ताओं को प्रयोगात्मक सेटिंग्स को परिभाषित करने के लिए सक्षम बनाता है । यह जानकारी नियंत्रण अनुप्रयोग है कि रोबोट बांह नियंत्रण और विभिंन कच्चे data. xlm फ़ाइलों में अलग वजन रिकॉर्ड करने के लिए फैलता है (1 फ़ाइल/किण्वन) । गणना सॉफ्टवेयर तो xlm फ़ाइलों को इकट्ठा और गणना करता है, प्रत्येक समय बिंदु के लिए,2 कि जारी की है (जी में व्यक्त की राशि/एल), जो शर्करा है कि इस समय भस्म हो गया है की राशि के लिए आनुपातिक है, और किण्वन दर, जो कं2 उत्पादन की दर के अनुरूप है, जी सह2/L/h में (चीनी की खपत की दर से आनुपातिक) । डेटा एक संबंधपरक डेटाबेस में जमा हो जाती है और एक समर्पित चित्रमय अंतरफलक का उपयोग कर visualized । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. GC-एमएस proteinogenic अमीनो एसिड का विश्लेषण: alanine का उदाहरण । () DMFDMA का उपयोग proteinogenic अमीनो अम्ल के derivatization के बाद प्राप्त वर्णलेख. () मास स्पेक्ट्रा ऑफ derivatized alanine. दो मुख्य चोटियों कि एम0/z = ९९ और एम के साथ टुकड़े के अनुरूप0/z = १५८ । () DMFDMA के साथ alanine की Derivatization प्रतिक्रिया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. खमीर द्वारा एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के चयापचय के मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कार्यप्रवाह । इस प्रक्रिया में शामिल है (i) 28 किण्वन का एक सेट (7 नाइट्रोजन स्रोतों और के साथ या डुप्लिकेट में नाइट्रोजन यौगिकों के बिना); (ii) एक विश्लेषणात्मक हिस्सा है कि निष्कर्षण और अणुओं और HPLC या जीएम-एमएस विश्लेषण के derivatization और (iii) कच्चे डेटा के प्रसंस्करण और डेटासेट के एक एकीकृत विश्लेषण की विभिन्न प्रक्रियाओं शामिल है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. स्वतंत्र किण्वन का एक सेट से जैविक मापदंडों के Reproducibility । (A-B) मतलब मूल्यों और शुष्क वजन और प्रोटीन सामग्री है कि 14 स्वतंत्र unलेबल्ड यौगिकों का उपयोग बाहर किए गए किण्वन से प्राप्त किए गए मानक विचलन । (C-D) मतलब मूल्यों और proteinogenic के मानक विचलन और खपत अमीनो एसिड है कि 14 स्वतंत्र unलेबल्ड यौगिकों का उपयोग कर बाहर किए गए किण्वन के दौरान मापा गया । सह2 उत्पादन: 5 (हरा), 10 (नीला), ४० (गुलाबी) और ९० (बैंगनी) जी/ कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5. तीन प्रमुख नाइट्रोजन स्रोतों से नाइट्रोजन का पुनर्वितरण किण्वन के दौरान एमिनो एसिड proteinogenic । (A) proteinogenic अमीनो एसिड का चयापचय मूल: भस्म समकक्ष (नीला) और डी नोवो संश्लेषण का उपयोग कर भस्म arginine (नारंगी), glutamine (हरा), अमोनियम (गुलाबी) या अंय एमिनो एसिड द्वारा प्रदान की नाइट्रोजन का प्रयोग ( बैंगनी) । प्रत्येक proteinogenic एमिनो एसिड की कुल राशि के एक प्रतिशत के रूप में व्यक्त किया । () खपत एमिनो एसिड की मात्रा के बीच तुलना (नीला) और भस्म एमिनो एसिड है कि सीधे प्रोटीन में बरामद का हिस्सा है, डेटा है कि 15N अनुरेखक प्रयोगों (बैंगनी) या प्रयोग में प्राप्त किए गए से गणना 13सी-लेबल वाले अणुओं (गुलाबी) के साथ किण्वन के दौरान मापा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्रा 6. वैलिन और leucine चयापचय का मात्रात्मक विश्लेषण. जब ४० g/L2 का उत्पादन किया जाता है, तो चयापचय नेटवर्क के माध्यम से भस्म leucine (हरा) और वैलिन (नीला) का विभाजन । सलाखों के प्रत्येक यौगिक की राशि के लिए आनुपातिक हैं और µ मीटर में व्यक्त कर रहे हैं, अंश है कि मध्य कार्बन चयापचय (नारंगी) से synthetized था सहित. नियमित फ़ॉन्ट में मान: µ m में राशि; इटैलिक फ़ॉन्ट में मान: का प्रतिशत भस्म वैलिन (नीला) या leucine (हरा) जो मार्ग के माध्यम से catabolized गया था. परिकलन तालिका 1 और तालिका 2में प्रदान किए जाते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

यौगिकों राशि प्रति लीटर
ग्लूकोज सी6एच126 २४० छ
मैलिक एसिड C4H6O5 6 ग्राम
साइट्रिक एसिड सी6एच87 6 ग्राम
पोटेशियम फॉस्फेट KH2पीओ4 0.75 ग्राम
पोटेशियम सल्फेट K2SO4 ०.५ छ
मैग्नीशियम सल्फेट MgSO, 7Hहे ०.२५ छ
कैल्शियम क्लोराइड CaCl, 2Hहे 0.155 जी
सोडियम क्लोराइड NaCl 0.2 ग्राम
Myo-inositol 20 मिलीग्राम
कैल्शियम pantothenate १.५ मिलीग्राम
Thiamin हाइडरोक्लॉराइड ०.२२३ मिलीग्राम
कोर्टेक्स अम्ल 2 मिलीग्राम
pyridoxine ०.२५ मिलीग्राम
बायोटिन ०.००३
MnSO· H2O 4 मिलीग्राम
ZnSO· 7Hहे 4 मिलीग्राम
CuSO· 18hहे 1 मिलीग्राम
CoCl· 6Hहे ०.४ मिलीग्राम
3बो3 1 मिलीग्राम
(एनएच4) मो724 1 मिलीग्राम
Ergosterol ३.७५ मिलीग्राम
ओलिक अम्ल १.२५ µ l
८० के बीच १२५ µ l
tyrosine ८.६ मिलीग्राम
tryptophan ८४.४ मिलीग्राम
Isoleucine १५.४ मिलीग्राम
aspartate २०.९ मिलीग्राम
ग्लूटामेट ५६.७ मिलीग्राम
arginine १७६.२ मिलीग्राम
leucine २२.८ मिलीग्राम
Threonine ३५.७ मिलीग्राम
glycine ८.६ मिलीग्राम
glutamine २३७.८ मिलीग्राम
alanine ६८.४ मिलीग्राम
वैलिन २०.९ मिलीग्राम
मिथीयोनाईन १४.८ मिलीग्राम
फेनिलएलनिन १७.९ मिलीग्राम
Serine ३७.० मिलीग्राम
Histidine 15.4 मिलीग्राम
lysine ८.० मिलीग्राम
cysteine ६.२ मिलीग्राम
proline २८८.३ मिलीग्राम
अमोनिया क्लोराइड एनएच4सीएल २२० मिलीग्राम
यम का पीएच NaOH 10 मीटर के साथ ३.३ को समायोजित किया गया ।

तालिका 1. इस अध्ययन में प्रयुक्त सिंथेटिक माध्यम की संरचना । इस रासायनिक परिभाषित माध्यम अंगूर का रस की संरचना नकल ।

रेफरेंस बफर तापमान
0 से 6 मिनट लिथियम साइट्रेट, २०० मिमी, पीएच २.८ ३२ ° c
6 से ३८ मिनट लिथियम साइट्रेट, ३०० mM, पीएच 3 ३२ ° c
३८ से ५७ मिनट लिथियम साइट्रेट, ५०० मिमी, पीएच ३.१५ ६४.५ ° c
५७ से ८३ मिनट लिथियम साइट्रेट, ९०० मिमी, पीएच ३.५ ७५ ° c
८३ से १२० मिनट लिथियम साइट्रेट, १६५० मिमी, पीएच ३.५५ ७५ ° c
१२० से १३० मिनट लिथियम hydroxyde, ३०० मिमी

तालिका 2. शर्तों आयन द्वारा अमीनो एसिड की जुदाई के लिए इस्तेमाल किया-विनिमय क्रोमैटोग्राफी । वृद्धि हुई नमक सांद्रता के साथ रेफरेंस बफ़र्स अमीनो एसिड की जुदाई को सक्षम करने के लिए एक तापमान ढाल के साथ संयोजन में क्रमिक का उपयोग किया जाता है ।

एमिनो एसिड Derivatizing रिएजेंट भ (min) आयन क्लस्टर (एम जेड/
alanine ECFएक ३.८६ ११६, ११७, ११८, ११९
DMFDMAबी ६.३७ ९९, १००, १०१, १०२
DMFDMAबी ६.३७ १५८, १५९, १६०, १६१
glycine ECFएक ४.१९ १०२, १०३, १०४
ECFएक ४.१९ १७५, १७६, १७७
DMFDMAबी ६.६१ ८५, ८६, ८७
DMFDMAबी ६.६१ १४४, १४५, १४६
वैलिन ECFएक ४.९७ १४४, १४५, १४६, १४७, १४८, १४९
DMFDMAबी ७.३७ १२७, १२८, १२९, १३०, १३१, १३२
DMFDMAबी ७.३७ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८
DMFDMAबी ७.३७ १८६, १८७, १८८, १८९, १९०, १९१
leucine ECFएक ५.६७ १५८, १५९, १६०, १६१, १६२, १६३, १६४
Isoleucine ECFएक ५.८५ १५८, १५९, १६०, १६१, १६२, १६३, १६५
Threonine ECFएक ६.४८ १४६, १४७, १४८, १४९, १५०
ECFएक ६.४८ १७५, १७६, १७७, १७८, १७९
Serine ECFएक ६.५३ १३२, १३३, १३४, १३५
ECFएक ६.५३ १७५, १७६, १७७, १७८
proline ECFएक ६.८३ १४२, १४३, १४४, १४५, १४६, १४७
aspartate ECFएक ७.८९ १८८, १८९, १९०, १९१, १९२
DMFDMAबी ११.७७ ११५, ११६, ११७, ११८, ११९
DMFDMAबी ११.७७ २१६, २१७, २१८, २१९, २२०
ग्लूटामेट ECFएक ८.८१ २०२, २०३, २०४, २०५, २०६, २०७
DMFDMAबी १२.७५ १११, ११२, ११३, ११४, ११५, ११६
DMFDMAबी १२.७५ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८
DMFDMAबी १२.७५ २३०, २३१, २३२, २३३, २३४, २३५
फेनिलएलनिन ECFएक ९.५३ १९२, १९३, १९४, १९५, १९६, १९७, १९८, १९९, २००, २०१
DMFDMAबी १३.६७ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८, १४९, १५०, १५१, १५२
lysine ECFएक ११.९५ १५६, १५७, १५८, १५९, १६०, १६१, १६२
Histidine ECFएक १२.५४ ३२७, ३२८, ३२९, ३३०, ३३१, ३३२, ३३३
arginine BSTFA १८.८ १७४, १७५, १७६, १७७, १७८, १७९
एक ECF, एथिल chloroformate; DMFDMA, (n, n)-dimethylformamide dibutyl acetal; BSTFA, (एन, ओ-भा (trimethylsilyl) trifluoroacetamide).

तालिका 3. विश्लेषणात्मक चयनित आयन निगरानी (सिम) मोड का उपयोग अमीनो एसिड की isotopic संवर्धन के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों । यह तालिका derivatization, derivatized यौगिकों के प्रतिधारण समय और प्रत्येक एमिनो एसिड के लिए एमएस (मोड इलेक्ट्रॉन प्रभाव) में प्राप्त आयनों के क्लस्टर के लिए इस्तेमाल रासायनिक एजेंटों संक्षेप ।

एमिनो एसिड Derivatizing रिएजेंट भ (min) आयन क्लस्टर (एम जेड/
alanine ECFएक ३.८६ ११६, ११७, ११८, ११९
DMFDMAबी ६.३७ ९९, १००, १०१, १०२
DMFDMAबी ६.३७ १५८, १५९, १६०, १६१
glycine ECFएक ४.१९ १०२, १०३, १०४
ECFएक ४.१९ १७५, १७६, १७७
DMFDMAबी ६.६१ ८५, ८६, ८७
DMFDMAबी ६.६१ १४४, १४५, १४६
वैलिन ECFएक ४.९७ १४४, १४५, १४६, १४७, १४८, १४९
DMFDMAबी ७.३७ १२७, १२८, १२९, १३०, १३१, १३२
DMFDMAबी ७.३७ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८
DMFDMAबी ७.३७ १८६, १८७, १८८, १८९, १९०, १९१
leucine ECFएक ५.६७ १५८, १५९, १६०, १६१, १६२, १६३, १६४
Isoleucine ECFएक ५.८५ १५८, १५९, १६०, १६१, १६२, १६३, १६५
Threonin ECFएक ६.४८ १४६, १४७, १४८, १४९, १५०
ECFएक ६.४८ १७५, १७६, १७७, १७८, १७९
Serine ECFएक ६.५३ १३२, १३३, १३४, १३५
ECFएक ६.५३ १७५, १७६, १७७, १७८
proline ECFएक ६.८३ १४२, १४३, १४४, १४५, १४६, १४७
aspartate ECFएक ७.८९ १८८, १८९, १९०, १९१, १९२
DMFDMAबी ११.७७ ११५, ११६, ११७, ११८, ११९
DMFDMAबी ११.७७ २१६, २१७, २१८, २१९, २२०
ग्लूटामेट ECFएक ८.८१ २०२, २०३, २०४, २०५, २०६, २०७
DMFDMAबी १२.७५ १११, ११२, ११३, ११४, ११५, ११६
DMFDMAबी १२.७५ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८
DMFDMAबी १२.७५ २३०, २३१, २३२, २३३, २३४, २३५
फेनिलएलनिन ECFएक ९.५३ १९२, १९३, १९४, १९५, १९६, १९७, १९८, १९९, २००, २०१
DMFDMAबी १३.६७ १४३, १४४, १४५, १४६, १४७, १४८, १४९, १५०, १५१, १५२
lysine ECFएक ११.९५ १५६, १५७, १५८, १५९, १६०, १६१, १६२
Histidine ECFएक १२.५४ ३२७, ३२८, ३२९, ३३०, ३३१, ३३२, ३३३
arginine BSTFA १८.८ १७४, १७५, १७६, १७७, १७८, १७९

तालिका 4. विश्लेषणात्मक isotopic संवर्धनों और वाष्पशील यौगिकों का ठहराव चयनित आयन निगरानी (सिम) मोड का उपयोग कर के निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया मापदंडों । यह तालिका अवधारण समय और प्रत्येक अस्थिर यौगिक के लिए एमएस (मोड इलेक्ट्रॉन प्रभाव) में प्राप्त आयनों के क्लस्टर संक्षेप.

तालिका 5. अवशिष्ट अमीनो अम्ल Dataset के ठहराव से प्राप्त कच्चे डेटा के प्रसंस्करण प्रारंभिक और अवशिष्ट अमीनो एसिड के माप से डेटा शामिल हैं । इन मूल्यों (घटाव द्वारा) भस्म एमिनो एसिड की मात्रा की गणना करने के लिए उपयोग किया जाता है । मतलब है और मानक विचलन आगे की गणना के लिए गणना कर रहे हैं । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 6. proteinogenic अमीनो एसिड के ठहराव से प्राप्त कच्चे डेटा के प्रसंस्करण. इस dataset में बायोमास hydrolysates (A) और बायोमास (B) में प्रोटीन के अंश के अमीनो एसिड में संरचना पर डेटा होता है. इन मूल्यों में प्रोटीन (C) में प्रत्येक अमीनो अम्ल के द्रव्यमान प्रतिशत का आंकलन किया जाता है । मतलब है और मानक विचलन आगे की गणना के लिए गणना कर रहे हैं । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 7. Proteinogenic अमीनो एसिड होता है । इस स्प्रेडशीट के लिए एकाग्रता की गणना करने के लिए प्रयोग किया जाता है (मिमी में) डेटा से proteinogenic अमीनो एसिड की तालिका 5 और तालिका 6में संक्षेप । मतलब है और मानक विचलन आगे की गणना के लिए गणना कर रहे हैं । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 8. उच् चतर अल्कोहल के ठहराव से प्राप् त कच् ची डेटा की प्रोसेसिंग । Dataset अस्थिर यौगिक सांद्रता (A) की माप से डेटा शामिल करता है और µ m (B) के लिए mg/L की इकाइयों में व्यक्त डेटा धर्मान्तरित. मतलब है और मानक विचलन आगे की गणना के लिए गणना कर रहे हैं । इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

तालिका 9. कच्चे डेटा के प्रसंस्करण proteinogenic एमिनो एसिड के isotopic संवर्धनों के निर्धारण से प्राप्त 15N-लेबल सब्सट्रेटका उपयोग कर ।
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तालिका 10. कच्चे डेटा के प्रसंस्करण proteinogenic अमीनो एसिड और वाष्पशील यौगिकों के isotopic संवर्धनों के निर्धारण से प्राप्त 13सी-लेबल सब्सट्रेटका उपयोग कर ।
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Discussion

चयापचय नेटवर्क के माध्यम से यौगिकों के विभाजन को बढ़ाता है isotopic अनुरेखक प्रयोगों का उपयोग माइक्रोबियल चयापचय के संचालन को समझने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है. इस पद्धति, एक या दो लेबल सब्सट्रेट के साथ सफलतापूर्वक लागू करते समय, वर्तमान में कई लेबल तात्विक आइसोटोप (यानी, दो से अधिक सब्सट्रेट) का उपयोग विभिन्न स्रोतों के चयापचय का अध्ययन करने के लिए लागू नहीं किया जा सकता. वास्तव में, उपलब्ध विश्लेषणात्मक तकनीक proteinogenic अमीनो एसिड और अणुओं के लेबलिंग पैटर्न का सही निर्धारण को विशेष रूप से सक्षम जब एक तत्व का आइसोटोप का उपयोग कर और संभवतः जब सह दो तत्वों के साथ लेबल । नतीजतन, इन सीमाओं को संबोधित करने और सूक्ष्मजीवों द्वारा कई पोषक तत्वों के प्रबंधन का आकलन करने के लिए, हम एक ही पर्यावरण की स्थिति के तहत संस्कृतियों का एक सेट दोहराने चुना है जबकि 13सी या 15 के साथ एक चयनित सब्सट्रेट लेबल N आइसोटोप । फिर, प्रत्येक 13C या 15N अनुरेखक प्रयोग द्वारा प्रदान की गई विशिष्ट जानकारी के आगे संयोजन एकाधिक स्रोतों के चयापचय की मात्रात्मक विस्तारित दृश्य प्रस्तुत करता है ।

रिपोर्ट दृष्टिकोण की उपलब्धि मानक शर्तों के तहत संस्कृतियों की एक प्रतिलिपि श्रृंखला के कार्यांवयन पर निर्भर करता है और एक परिभाषित शारीरिक राज्य में कोशिकाओं की आबादी से नमूनों के संग्रह पर है कि सभी संस्कृतियों के लिए एक ही है (सेल विकास, सब्सट्रेट की खपत, आदि). इन शर्तों से संतुष्ट होना चाहिए ताकि स्वतंत्र प्रयोगों से प्राप्त आंकड़ों को मिलाया जा सके और एक साथ विश्लेषण किया जा सके. इन बाधाओं को संतोषजनक सटीक और लगातार निगरानी माइक्रोबियल गतिविधि जो बाहर किया गया था की आवश्यकता है, प्रयोगात्मक काम में यहां की सूचना दी, एक रोबोट का उपयोग कर, खमीर किण्वन गतिविधि की ऑनलाइन निगरानी के लिए प्रणाली की सहायता की । हालांकि, इस तरह के ऑप्टिकल घनत्व को मापने के द्वारा सेल विकास के निर्धारण के रूप में सूक्ष्मजीवों की खेती और निगरानी, के लिए और अधिक परंपरागत तरीकों, नमूना प्रक्रिया को सामान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

इस पद्धति को ले जाने के लिए एक और शर्त है कि नेटवर्क में शामिल कर रहे है की जांच करने के लिए चयापचय रास्ते की एक स्पष्ट दृष्टि है । इस ज्ञान का अध्ययन किया जा रहा मुद्दे से निपटने के लिए सबसे उपयुक्त हैं कि लेबल सब्सट्रेट के सेट को चुनने के लिए आवश्यक है. लेबल यौगिकों के रूप में के रूप में के रूप में अच्छी तरह से (13सी, 15एन, या दूसरों) की प्रकृति के रूप में चिह्नित और अणुओं के भीतर उपयुक्त चयनित किया जाना चाहिए क्रम में मैं) सभी लेबल से प्राप्त कर रहे हैं यौगिकों में सब्सट्रेट्स द्वारा प्रदान की वसूली उनके catabolism और आगे की प्रक्रिया और द्वितीय में विश्लेषण कर रहे हैं) निरर्थक डेटा है कि कार्यप्रणाली की सटीकता और निष्कर्षों की वैधता का प्रदर्शन प्राप्त करते हैं । यहां वर्णित प्रक्रिया भी विश्लेषण है कि समय लेने वाली और मानव और वित्तीय संसाधनों में महंगा हो सकता है की एक महत्वपूर्ण संख्या में शामिल हैं । इसके अलावा, कुछ विश्लेषणात्मक बाधाओं इस पद्धति के उपयोग को सीमित कर सकते हैं । सबसे पहले, उपयोगकर्ताओं को यह सुनिश्चित करना चाहिए कि सभी विश्लेषणात्मक तरीके कि माइक्रोबियल चयापचय के दौरान उत्पादित यौगिकों के ठहराव के लिए आवश्यक हैं और उनके isotopic संवर्धन के निर्धारण के लिए उपलब्ध हैं । दूसरा, यह दृष्टिकोण केवल सब्सट्रेट के चयापचय का आकलन करने के लिए लागू होता है जिसके लिए सभी रूपांतरण यौगिकों पर्याप्त मात्रा में उत्पादित कर रहे हैं सही मात्रा.

इस पत्र में, हम शराब किण्वन के दौरान खमीर द्वारा एकाधिक नाइट्रोजन स्रोतों के प्रबंधन का पता लगाने के लिए इस कार्यप्रवाह लागू किया । इस रिपोर्ट में खमीर चयापचय पर नए अंतर्दृष्टि की पेशकश की, सबसे अधिक खपत अमीनो एसिड की पर्याप्त catabolism सहित, प्रोटीन में अपने कम प्रत्यक्ष शामिल करने के साथ संयुक्त, और सीसीएम का प्रमुख योगदान है कि आगे के लिए इस्तेमाल कर रहे है पुरोगामी की आपूर्ति के लिए proteinogenic अमीनो एसिड और अस्थिर अणुओं के गठन के दोनों डी नोवो संश्लेषण ।

अधिक मोटे तौर पर, दृष्टिकोण है कि यहां वर्णित है किसी भी सूक्ष्मजीवों के चयापचय नेटवर्क के माध्यम से कई सब्सट्रेट के विभाजन को बढ़ाता है के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यह शोधकर्ताओं की अनुमति के बाद वे कोशिकाओं में प्रवेश और पुरोगामी और उत्पादों के चयापचय मूल की पहचान को संबोधित करने के लिए सभी यौगिकों भस्म के भाग्य स्पष्ट करने के लिए कर देगा । यह जानकारी अलग आनुवंशिक पृष्ठभूमि है कि उपभेदों की चयापचय गतिविधि की तुलना करने के लिए उपयोगी हो सकता है या विभिन्न परिस्थितियों के तहत हो जाना और, नतीजतन, किण्वन प्रक्रियाओं में सुधार करने के लिए तर्कसंगत रणनीतियों को डिजाइन करने के लिए.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम जीन रॉच Mouret, सिल्वी Dequin और जीन मैरी Sabalyrolles की अवधारणा में योगदान के लिए धंयवाद के लिए रोबोट की सहायता किण्वन प्रणाली और मार्टिन Pradal, निकोलस Bouvier और पास्कल Brial उनके तकनीकी सहायता के लिए । इस परियोजना के लिए धन Ministère de l'Education राष्ट्रीयकरण, de la सूक्ष्म एट डे ला Technologie द्वारा प्रदान किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
D-Glucose PanReac 141341.0416
D-Fructose PanReac 142728.0416
DL-Malic acid Sigma Aldrich M0875
Citric acid monohydrate Sigma Aldrich C7129
Potassium phosphate monobasic Sigma Aldrich P5379
Potassium sulfate Sigma Aldrich P0772
Magnesium sulfate heptahydrate Sigma Aldrich 230391
Calcium chloride dihydrate Sigma Aldrich C7902
Sodium chloride Sigma Aldrich S9625
Ammonium chloride Sigma Aldrich A4514
Sodium hydroxide Sigma Aldrich 71690
Manganese sulfate monohydrate Sigma Aldrich M7634
Zinc sulfate heptahydrate Sigma Aldrich Z4750
Copper (II) sulfate pentahydrate Sigma Aldrich C7631
Potassium iodine Sigma Aldrich P4286
Cobalt (II) chloride hexahydrate Sigma Aldrich C3169
Boric acid Sigma Aldrich B7660
Ammonium heptamolybdate Sigma Aldrich A7302
Myo-inositol Sigma Aldrich I5125
D-Pantothenic acid hemicalcium salt Sigma Aldrich 21210
Thiamine, hydrochloride Sigma Aldrich T4625
Nicotinic acid Sigma Aldrich N4126
Pyridoxine Sigma Aldrich P5669
Biotine Sigma Aldrich B4501
Ergostérol Sigma Aldrich E6510
Tween 80 Sigma Aldrich P1754
Ethanol absolute VWR Chemicals 101074F
Iron (III) chloride hexahydrate Sigma Aldrich 236489
L-Aspartic acid Sigma Aldrich A9256
L-Glutamic acid Sigma Aldrich G1251
L-Alanine Sigma Aldrich A7627
L-Arginine Sigma Aldrich A5006
L-Cysteine Sigma Aldrich C7352
L-Glutamine Sigma Aldrich G3126
Glycine Sigma Aldrich G7126
L-Histidine Sigma Aldrich H8000
L-Isoleucine Sigma Aldrich I2752
L-Leucine Sigma Aldrich L8000
L-Lysine Sigma Aldrich L5501
L-Methionine Sigma Aldrich M9625
L-Phenylalanine Sigma Aldrich P2126
L-Proline Sigma Aldrich P0380
L-Serine Sigma Aldrich S4500
L-Threonine Sigma Aldrich T8625
L-Tryptophane Sigma Aldrich T0254
L-Tyrosine Sigma Aldrich T3754
L-Valine Sigma Aldrich V0500
13C5-L-Valine Eurisotop CLM-2249-H-0.25
13C6-L-Leucine Eurisotop CLM-2262-H-0.25
15N-Ammonium chloride Eurisotop NLM-467-1
ALPHA-15N-L-Glutamine Eurisotop NLM-1016-1
U-15N4-L-Arginine Eurisotop NLM-396-PK
Ethyl acetate Sigma Aldrich 270989
Ethyl propanoate Sigma Aldrich 112305
Ethyl 2-methylpropanoate Sigma Aldrich 246085
Ethyl butanoate Sigma Aldrich E15701
Ethyl 2-methylbutanoate Sigma Aldrich 306886
Ethyl 3-methylbutanoate Sigma Aldrich 8.08541.0250
Ethyl hexanoate Sigma Aldrich 148962
Ethyl octanoate Sigma Aldrich W244910
Ethyl decanoate Sigma Aldrich W243205
Ethyl dodecanoate Sigma Aldrich W244112
Ethyl lactate Sigma Aldrich W244015
Diethyl succinate Sigma Aldrich W237701
2-methylpropyl acetate Sigma Aldrich W217514
2-methylbutyl acetate Sigma Aldrich W364401
3-methyl butyl acetate Sigma Aldrich 287725
2-phenylethyl acetate Sigma Aldrich 290580
2-methylpropanol Sigma Aldrich 294829
2-methylbutanol Sigma Aldrich 133051
3-methylbutanol Sigma Aldrich 309435
Hexanol Sigma Aldrich 128570
2-phenylethanol Sigma Aldrich 77861
Propanoic acid Sigma Aldrich 94425
Butanoic acid Sigma Aldrich 19215
2-methylpropanoic acid Sigma Aldrich 58360
2-methylbutanoic acid Sigma Aldrich 193070
3-methylbutanoic acid Sigma Aldrich W310212
Hexanoic acid Sigma Aldrich 153745
Octanoic acid Sigma Aldrich W279900
Decanoic acid Sigma Aldrich W236403
Dodecanoic acid Sigma Aldrich L556
Fermentor 1L Legallais AT1357 Fermenter handmade for fermentation
Disposable vacuum filtration system Dominique Deutscher 029311
Fermenters (250 ml) Legallais AT1352 Fermenter handmade for fermentation
Sterile tubes Sarstedt 62.554.502
Fermentation locks Legallais AT1356 Fermetation locks handmade for fermentation
BactoYeast Extract Becton, Dickinson and Company 212750
BactoPeptone Becton, Dickinson and Company 211677
Incubator shaker Infors HT
Particle Counter Beckman Coulter 6605697 Multisizer 3 Coulter Counter
Centrifuge Jouan GR412
Plate Butler Robotic system Lab Services BV PF0X-MA Automatic instrument
Plate Butler Software Lab Services BV Robot monitor software
RobView In-house developed calculation software
My SQL International source database
Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers Thermo Fisher Scientific 50088009 String Drive 60
BenchBlotter platform rocker Dutscher 60903
Ammonia enzymatic kit R-Biopharm AG 5390
Spectrophotometer cuvettes VWR 634-0678
Spectrophotometer UviLine 9400 Secomam
Amino acids standards physiological - acidics and neutrals Sigma Aldrich A6407
Amino acids standards physiological - basics Sigma Aldrich A6282
Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent Biochrom BC80-6000-06
Sulfosalycilic acid Sigma Aldrich S2130
Norleucine Sigma Aldrich N1398
Biochrom 30 AAA Biochrom
EZChrom Elite Biochrom Instrument control and Data analysis software
Ultropac 8 resin Lithium Biochrom BC80-6002-47 Lithium High Resolution Physiological Column
Filter Millex GV Merck Millipore SLGVX13NL Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm)
Membrane filter PALL VWR 514-4157 Supor-450 47mm 0.45µm
Vacuum pump Millivac Mini Millipore XF5423050
Aluminium smooth weigh dish 70mm VWR 611-1380
Precision balance Mettler Specifications AE163
Dimethyl sulfoxid dried Merck 1029310161 (max. 0.025% H2O) SeccoSolv
Combustion oven Legallais
Pierce BCA protein assay kit Interchim UP40840A
Formic acid Fluka 94318
Hydrogen peroxide Sigma Aldrich H1009
Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure Merck 1003171000 Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur
Lithium acetate buffer Biochrom 80-2038-10
Commercial solution of hydrolyzed amino acids Sigma Aldrich AAS18
L-Methionine sulfone Sigma Aldrich M0876
L-Cysteic acid monohydrate Sigma Aldrich 30170
Pyrex glass culture tubes Sigma Aldrich Z653586
Pyridine Acros Organics 131780500 99% Extrapure
Ethyl chloroformate Sigma Aldrich 23131
Dichloromethane Sigma Aldrich 32222
Vials Sigma Aldrich 854165
Microinserts for 1.5ml vials Sigma Aldrich SU860066
GC/MS Agilent Technologies 5890 GC/5973 MS
Chemstation Agilent Technologies Instrument control and data analysis software
Methanol Sigma Aldrich 34860 Chromasolv, for HPLC
Acetonitrile Sigma Aldrich 34998 ChromasolvPlus, for HPLC
N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal Sigma Aldrich 394963
BSTFA Sigma Aldrich 33024
DB-17MS column Agilent Technologies 122-4731 30m*0.25mm*0.15µm
Sodium sulfate, anhydrous Sigma Aldrich 238597
Technical nitrogen Air products 14629
Zebron ZB-WAX column Phenomenex 7HG-G007-11 30m*0.25mm*0.25µm
Helium BIP Air products 26699
Glass Pasteur pipettes VWR 612-1702

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References

  1. Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts. Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).
  2. Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression. J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).
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कार्यप्रवाह Isotopic अनुरेखक प्रयोगों के संयोजन पर आधारित कई पोषक तत्वों के स्रोतों के माइक्रोबियल चयापचय की जांच करने के लिए
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Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).More

Bloem, A., Rollero, S., Seguinot, P., Crépin, L., Perez, M., Picou, C., Camarasa, C. Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources. J. Vis. Exp. (131), e56393, doi:10.3791/56393 (2018).

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