Summary
Questo protocollo descrive una procedura sperimentale per in modo completo e quantitativamente studiare il metabolismo di più fonti di nutrienti. Questo flusso di lavoro, basato su una combinazione di tracciante isotopico esperimenti e una procedura analitica, permette il destino dei nutrienti consumati e l'origine metabolica delle molecole sintetizzate da microrganismi deve essere determinato.
Abstract
Studi nel campo della microbiologia si basano sull'attuazione di una vasta gamma di metodologie. In particolare, lo sviluppo di metodi appropriati sostanzialmente contribuisce a fornire una vasta conoscenza del metabolismo dei microrganismi crescono in media chimicamente definite che contengono azoto unico e fonti di carbonio. Al contrario, la gestione attraverso il metabolismo di più fonti di nutrienti, nonostante la loro ampia presenza in ambienti naturali o industriali, rimane praticamente inesplorata. Questa situazione è dovuto principalmente alla mancanza di metodologie, che ostacola le indagini.
Segnaliamo una strategia sperimentale in modo completo e quantitativamente esplorare come metabolismo opera quando una sostanza nutriente è fornito come una miscela di molecole diverse, vale a dire, una risorsa complessa. Qui, descriviamo la sua applicazione per valutare il partizionamento di molteplici fonti di azoto attraverso la rete metabolica di lievito. Il flusso di lavoro combina le informazioni ottenute durante gli esperimenti di tracciante isotopo stabile utilizzando selezionati 13C - o 15N-etichettati substrati. In primo luogo è costituito da fermentazioni parallele e riproducibile sullo stesso supporto, che include una miscela di molecole contenenti N; Tuttavia, una fonte di azoto selezionato è etichettata ogni volta. Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) è implementata per valutare i modelli di etichettatura di composti mirati e per quantificare il consumo e il recupero dei substrati in altri metaboliti. Un'analisi integrata del dataset completo fornisce una panoramica del destino di substrati consumati all'interno delle cellule. Questo approccio richiede un preciso protocollo per la raccolta di campioni – agevolato da un sistema di robot-assistita per il monitoraggio online delle fermentazioni – e il raggiungimento di numerose analisi che richiede tempo. Nonostante questi vincoli, essa ha consentito di comprendere, per la prima volta, il partizionamento di molteplici fonti di azoto in tutta la rete metabolica di lievito. Abbiamo determinato le origini metaboliche di molecole volatili e gli aminoacidi proteinogenici e delucidato la ridistribuzione di azoto da fonti più abbondanti verso altri N-composti.
Introduction
Intesa come opera di metabolismo microbico è una questione chiave per la progettazione di strategie efficienti per migliorare i processi di fermentazione e modulano la produzione di composti fermentativi. I progressi nella genomica e genomica funzionale in questi ultimi due decenni in gran parte contribuito ad estendere la conoscenza della topologia delle reti metaboliche in molti microrganismi. Accesso a queste informazioni hanno portato allo sviluppo di approcci che mirano per una panoramica completa della funzione cellulare1. Queste metodologie si basano spesso su un'interpretazione basata su modello di parametri misurabili. Questi dati sperimentali comprendono, da un lato, tassi di produzione e l'assorbimento di metabolita e, d'altra parte, esperimenti di informazioni quantitative intracellulare che sono ottenuti dal tracciante isotopico. Questi dati forniscono informazioni essenziali per la deduzione dell'attività in vivo di diversi percorsi in una rete metabolica definita2,3,4. Attualmente, le tecniche analitiche disponibili solo attivare la rilevazione accurata di modelli di molecole di etichettatura quando si utilizza un elemento singolo isotopo e possibilmente quando co-etichettatura con due elementi isotopici. Inoltre, sotto la maggior parte delle condizioni di crescita, la fonte di carbonio consiste solo di uno o due-composti. Di conseguenza, approcci basati su 13C-isotopica traccianti da substrati di carbonio sono stati ampiamente e correttamente applicati per sviluppare una comprensione completa del carbonio reti metaboliche operazioni5,6,7 ,8.
Al contrario, in molti ambienti naturali ed industriali, la risorsa di azoto disponibile che supporta la crescita microbica è spesso composto di una vasta gamma di molecole. Ad esempio, durante la fermentazione di vino o birra, azoto viene fornito come una miscela di 18 aminoacidi e ammonio alle concentrazioni variabili9. Questa matrice di composti N che sono accessibili per anabolismo rende queste condizioni supporti complessi notevolmente diversi da quelli comunemente utilizzati per gli studi fisiologici, in quanto quest'ultimo si ottiene utilizzando un'unica fonte di azoto, in genere di ammonio.
Nel complesso, interiorizzato azoto composti possono essere direttamente incorporati nelle proteine o catabolizzate. La struttura della rete del metabolismo dell'azoto in molti microrganismi, tra cui il lievito Saccharomyces cerevisiae, è molto complessa, secondo la diversità dei substrati. Schematicamente, questo sistema si basa sulla combinazione del nucleo centrale del metabolismo dell'azoto che catalizza l'interconversione di glutamina, glutammato e α-chetoglutarato10,11, con transaminasi e deaminasi. Attraverso questa rete, sono riuniti gruppi amminici da ammonio o altri aminoacidi e acidi α-cheto rilasciato. Questi intermedi sono anche sintetizzati attraverso il carbonio centrale metabolismo (CCM)12,13. Questo gran numero di reazioni ramificate e intermedi, coinvolti nel catabolismo di fonti esogene di azoto sia l'anabolismo degli amminoacidi proteinogenici, soddisfa i requisiti anabolizzanti delle cellule. L'attività attraverso questi diversi percorsi interconnessi comporta anche l'escrezione dei metaboliti. In particolare, α-chetoacidi possono essere reindirizzati attraverso il pathway di Ehrlich per la produzione di alcoli superiori e loro acetato estere derivati14, che contribuiscono in maniera essenziale ai profili sensoriali dei prodotti. Successivamente, come funziona il metabolismo dell'azoto svolge un ruolo chiave nella produzione di biomassa e la formazione di molecole volatili (aroma).
Le reazioni, enzimi e geni coinvolti nel metabolismo dell'azoto sono ampiamente descritti nella letteratura. Tuttavia, il problema della distribuzione delle molteplici fonti di azoto attraverso una rete metabolica non è ancora stato risolto. Ci sono due ragioni principali che spiegano questa mancanza di informazioni. In primo luogo, alla luce della complessità importante della rete di metabolismo dell'azoto, una grande quantità di dati quantitativi è richiesta per una completa comprensione del suo funzionamento che non era disponibile fino ad ora. Secondo, molti vincoli sperimentali e le limitazioni dei metodi analitici ha impedito l'attuazione di approcci che sono stati precedentemente utilizzati per la delucidazione della funzione CCM.
Per superare questi problemi, abbiamo scelto di sviluppare un approccio di livello di sistema che si basa sulla riconciliazione dei dati da una serie di esperimenti di tracciante isotopico. Il flusso di lavoro comprende:
-Una serie di fermentazioni effettuate nelle stesse condizioni ambientali, mentre una diversa fonte di nutrienti selezionata (substrato) è etichettata ogni volta.
-Una combinazione di procedure analitiche (HPLC, GC-MS) per una determinazione accurata, nelle diverse fasi della fermentazione, la concentrazione residua di substrato con etichetta e la concentrazione e l'arricchimento isotopico di composti che sono derivati da il catabolismo della molecola con etichetta, compresa la biomassa derivata.
-Un calcolo del saldo massa ed isotopico per ciascuno consumati con etichetta molecola e un'ulteriore analisi integrata del set di dati per ottenere una panoramica globale della gestione delle molteplici fonti di nutrienti da parte dei microrganismi attraverso la determinazione dei coefficienti di flusso .
Per applicare questa metodologia, si deve prestare attenzione al comportamento riproducibile del ceppo/microrganismo tra culture. Inoltre, si devono prelevare campioni da diverse culture durante lo stesso progresso di fermentazione ben definito. Nel lavoro sperimentale segnalato in questo manoscritto, un sistema robot-assistita è utilizzato per il monitoraggio online delle fermentazioni per rappresentare questi vincoli.
Inoltre, è fondamentale scegliere un set di substrati con etichettate (composto, natura e posizione di etichettatura) che è opportuno affrontare il problema scientifico dello studio. Qui, arginina, glutamina e 15N-labeled ammonio sono stati selezionati come le tre fonti principali azoto trovate in succo d'uva. Questo ha permesso di valutare il modello di ridistribuzione di azoto dai composti consumati per gli aminoacidi proteinogenici. Abbiamo anche il compito di indagare sulla sorte della spina dorsale del carbonio di aminoacidi consumati e il loro contributo alla produzione di molecole volatili. Per soddisfare questo obiettivo, uniformemente 13C-etichetta leucina, isoleucina, treonina e valina sono stati inclusi nello studio come gli aminoacidi che sono derivati da importanti intermedi del pathway di Ehrlich.
Nel complesso, abbiamo esplorato quantitativamente come lievito gestisce una risorsa complessa azoto ridistribuendo le fonti di azoto esogene per soddisfare le proprie esigenze anabolizzanti per tutta la fermentazione mentre inoltre rimuovono l'eccesso di precursori di carbonio come molecole volatili. La procedura sperimentale riferita in questa carta può essere applicata per studiare altre fonti di nutrienti più utilizzati da qualsiasi altro microrganismo. Sembra essere un approccio adeguato per l'analisi dell'impatto del background genetico o condizioni ambientali sul comportamento metabolico dei microrganismi.
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Protocol
1. fermentazione e campionamento
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Preparazione dei media e fermentatori
Nota: Tutte le fermentazioni vengono svolte in parallelo, utilizzando lo stesso sforzo e nello stesso chimicamente definite mezzo sintetico (SM, composizione indicati nella tabella 1), che include una miscela di ammonio e gli aminoacidi come fonti di azoto15. Per ogni fermentazione, un composto unico azoto viene fornito esclusivamente in un uniformemente con etichetta 13C o 15N modulo (100%), mentre gli altri rimangono senza etichetta. Per ogni fonte di azoto con etichetta utilizzata nel set di esperimenti (qui: 15NH4, U -15N4-Arg, U -15N2-Gln, U -13C6-Leu, U -13C5-Val, U -13C6-Ile, U -13C4-Thr), due fermentatori sono preparati. Per ogni condizione, duplicata fermentazione viene eseguita utilizzando soltanto le molecole senza etichetta (fermentazioni 7 controllo).- Per ogni N-origine per essere studiato, preparare 500 mL di SM mezzo che contiene tutte le fonti di azoto elencate nella tabella 1, fatta eccezione per il composto da utilizzarsi in 100% con etichetta forma.
Nota: La molecola con etichetta viene aggiunto nei passaggi successivi. - Pastorizzare ogni mezzo in un pallone da 1 L (10 min, 100 ° C) contenente una barra di agitazione magnetica. Pesare la quantità appropriata di molecola con etichetta per raggiungere la concentrazione finale che è riportata nella tabella 1 e scioglierla nel mezzo.
- Sterilizzare il mezzo utilizzando un sistema di filtrazione sotto vuoto monouso (membrana in acetato di cellulosa, da 0,22 µm). Utilizzando un cilindro graduato sterile, dividere la via di mezzo tra due fermentatori pre-sterilizzati (250 mL) contenenti una barra agitazione magnetica e sono dotate di serrature di fermentazione per evitare l'entrata di ossigeno, ma consentire il rilascio di CO2.
- Le beute di fermentazione a 28 ° C di calore ponendoli nella camera di incubazione per 1 notte (temperatura impostata a 28 ° C).
- Per ogni N-origine per essere studiato, preparare 500 mL di SM mezzo che contiene tutte le fonti di azoto elencate nella tabella 1, fatta eccezione per il composto da utilizzarsi in 100% con etichetta forma.
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Inoculazione e monitoraggio delle fermentazioni
- Crescere il S. cerevisiae ceppo in provette sterili contenenti 10 mL di terreno YPD a 28 ° C con agitazione (150 rpm) per 12 h. Quindi, dispensare 1 mL di YPD preculture e trasferirlo in 10 mL di terreno di SM (in provette sterili da 15 mL). Incubare la cultura per 12 ore a 28 ° C con agitazione (150 rpm).
- Sotto flusso laminare, raccogliere una coltura aliquota e quantificare la popolazione delle cellule utilizzando un contatore di particelle elettroniche che è dotato di un'apertura di µm 100. Centrifugare la coltura (2.000 x g, 15 min, 4 ° C) e sospendere il pellet in un volume adeguato di acqua sterile per ottenere una concentrazione finale di 2,5 x 108 cellule/mL. Inoculare ogni fermentatore con 1 mL di sospensione cellulare.
Nota: Il sistema robotico utilizzato per monitorare l'avanzamento di fermentazione è descritto nella Figura 1. - Preparare la piattaforma di fermentazione installando i fermentatori nelle guide di supporto che sono correttamente collocate sulle piastre agitazione 21-posizione e impostare la velocità di agitazione a 270 giri/min. Per avviare il monitoraggio on-line di ogni fermentazione, lanciare l'applicazione di controllo del robot, quindi fare clic sul pulsante "start test" e selezionare il volume di fermentazione da effettuarsi (300 mL).
- L'interfaccia visualizzata permette l'indicazione del numero e la posizione di fermentatori sulla piattaforma. Per garantire che ciò si verifica, fare clic con il pulsante destro sulla posizione dello slot e scegliere "attiva" per attivare il monitoraggio del fermentatore che si trova in questa posizione.
- Inizializzare il software di calcolo, permanentemente in esecuzione sul sistema, prima di iniziare l'acquisizione di peso. Fare clic sul pulsante "Initialiser" e confermare con "ok". Fare clic sul pulsante"Start" dell'applicazione controllo di robot per iniziare le acquisizioni di peso.
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Procedura di campionamento
Nota: Per ogni fermentatore, vengono prelevati campioni quando la produzione di CO2 (valore indicato on-line sul computer che esegue il software di calcolo) raggiunge il set-point richiesto: 5, 10, 40 e 90 g/L in questo studio.-
Procedura per le culture con composti con etichettate di campionamento.
- Centrifughi i due campioni di 6 mL (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Salvare e memorizzare i surnatanti congelati in due aliquote a-80 ° C. Lavare il pellet due volte con 5 mL di acqua distillata e conservare a-80 ° C per la misurazione degli arricchimenti isotopici.
- Procedura per culture senza composti con etichettate di campionamento
- Raccolta 10 mL di coltura, che verrà utilizzato per la determinazione del peso secco. Appallottolare le celle da due campioni di 10 mL per centrifugazione (2.000 x g, 5 min, 4 ° C). Lavare il pellet due volte con 10 mL di acqua distillata e conservarli a-80 ° C per la determinazione del contenuto di proteine e aminoacidi.
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Procedura per le culture con composti con etichettate di campionamento.
2. quantificazione delle fonti di azoto consumato
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Determinazione enzimatica delle concentrazioni di ammoniaca residua
Nota: La determinazione della concentrazione di ammoniaca in surnatanti viene effettuata utilizzando un kit commerciale basato su enzima; tutti i reagenti sono forniti dal produttore.- Preparare una soluzione di ammoniaca standard (61,4 mg/L) sciogliendo così 25 mg di precisamente pesato (NH4)24 in un matraccio tarato da 100 mL.
- Per soddisfare le istruzioni del produttore, eseguire una diluizione di 1:2 dei campioni che sono state prese prima della fermentazione e a 5 g/L di CO2 rilasciato. Regolare il pH dei campioni a circa 8 con l'aggiunta di 1 M di KOH. Prendere nota del volume aggiunto e prendere in considerazione il fattore di diluizione.
- In cuvette spettrofotometro di 4ml, mix 100 µ l di campione (diluito se necessario), acqua distillata o soluzione standard di ammoniaca con 2 mL di reagente 1 (0,75 mM ADP e della deidrogenasi del glutammato a 30 U/mL in tampone a pH 7,8) e 500 µ l di reagente 2 (NADH 1,3 mM). Incubare per 15 min a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza del NADH a 340 nm (A1).
- Aggiungere 500 µ l di Reagente 3 (60 mM α-chetoglutarato in tampone a pH 8), incubare il campione per 20 min a temperatura ambiente e leggere l'assorbanza del NADH a 340 nm (A2).
- Calcolare la concentrazione di ammoniaca utilizzando:
Cammoniaca (g/L) = 0.083 x [(0.839 x A1-A2)campione- (0.839 x A1-A2)acqua distillata] - Verificare che la concentrazione corretta è ottenuta con la soluzione standard.
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Determinazione cromatografica delle concentrazioni di residui dell'amminoacido
Nota: La determinazione delle concentrazioni di aminoacidi in surnatanti è realizzata utilizzando un sistema di analisi dell'amminoacido dedicato che si basa sulla cromatografia di scambio ionico con derivatizzazione di colonna post di N-composti con ninidrina, che permette loro rilevazione colorimetrica.- Preparare una soluzione di riferimento con l'aggiunta di 200 µ l di una miscela commerciale degli aminoacidi neutri e acidi, 200 µ l di una miscela commerciale di amminoacidi basici e 200 µ l di glutammina 2,5 mM a 400 µ l di tampone citrato del litio di 200 mM, pH 2.2. Questa soluzione di riferimento chimicamente definito viene trattata come un campione.
- Aggiungere 200 µ l di soluzione di acido solfosalicilico 25% (p/v) contenente 2,5 mM norleucine (standard interno) a 800 µ l di campione per rimuovere molecole ad alto peso molecolare. Incubare per 1 h a 4 ° C, centrifuga (3.000 x g, 10 min, 4 ° C) e filtrare attraverso una membrana di nitrocellulosa dimensioni dei pori di 0.22 µm (sistema a siringa).
- Nel software programmatore, fate clic sul pulsante "Esegui" per iniziare la cromatografia liquida (LC) analisi con l'analizzatore dotato di una colonna di scambio cationico (modulo di litio). Eluire gli aminoacidi con buffer di litio successivi per creare un gradiente di pH e una sfumatura in concentrazione di contro-ioni in combinazione con un gradiente di temperatura (tabella 2).
- Quantificare i composti di azoto dopo derivatizzazione di ninidrina da un rivelatore spettrofotometrico a 570 nm (viola colorazione: reazione tra ninidrina e ammina gruppo di amminoacidi) e 440 nm (colorazione gialla: reazione tra gruppo di ninidrina e immina prolina).
- Eseguire una calibrazione interna di singolo-punto utilizzando la soluzione di riferimento e norleucine come standard interno per calcolare le concentrazioni di aminoacidi nei campioni utilizzando il software del produttore.
3. quantificazione degli aminoacidi proteinogenici
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Misurazione del peso a secco delle cellule
- Filtro 10ml di cultura attraverso un filtro di nitrocellulosa (poro dimensioni 0,45 µm) che è pre-pesato in una tazza di alluminio, utilizzando un dispositivo di vuoto. Lavare due volte con 50 mL di acqua distillata.
- Inserire il filtro nella tazza in alluminio e asciugare in forno a calore a 105 ° C per 48 h (fino a quando non si osserva nessun ulteriore cambiamento nel peso) prima di ripesare il filtro nella tazza. Calcolare la differenza di peso.
- Calcolare la media di almeno 3 misurazioni indipendenti per determinare con precisione il peso di pila a secco della cultura lievito.
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Quantificazione del tenore di proteine delle cellule
Nota: La quantificazione della frazione proteica delle cellule viene eseguita almeno in triplice copia utilizzando palline di adenoide delle cellule che sono state ottenute come descritto in sezione 1.3.2.- Estrarre proteine con aggiunta di 1 mL di soluzione di DMSO (50% v/v) di pellet congelati e incubare a 105 ° C per 1 ora in forno a calore secco.
- Quantificare il contenuto di proteine negli estratti di DMSO utilizzando il saggio colorimetrico biochimico che si basa sulla riduzione di proteine di Cu ++ in ioni Cu+ , che sono ulteriormente precipitati dall'acido bicinconinico in un complesso blu (analisi di BCA).
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Determinazione dei contributi relativi di amminoacidi in proteine
Nota: Il profilo degli aminoacidi proteinogenici è determinato almeno in triplice copia da palline delle cellule senza etichetta (1.3.2.).- Preparare un estratto ossidato sospendendo il pellet cellulare in 200 µ l di acido performico (acido formico 90%, 10% di perossido di idrogeno). Incubare per 4 h a 4 ° C e interrompere la reazione con l'aggiunta di solfato di sodio 33,6 mg.
Nota: Il passaggio di ossidazione è richiesto per convertire cisteina e metionina in acido del solfone e cisteico metionina, che sarà ulteriormente quantificato dalla cromatografia di scambio ionico. Tuttavia, alcuni amminoacidi (tirosina, fenilalanina, istidina e arginina) sono denaturate durante il trattamento di ossidazione. Di conseguenza, vengono preparati due idrolizzati (con e senza ossidazione). - Aggiungere 800 µ l di HCl 6N a palline delle cellule o ossidato estratto e incubare il campione in un tubo di vetro sigillato ermeticamente per 16 h a 110 ° C in forno a calore secco. Aggiungere 200 µ l di 2,5 mM norleucine e rimuovere HCl con un flusso di azoto. Lavare (risospendere l'Estratto secco e quindi rimuovere il liquido con un flusso di azoto), due volte con 800 µ l di acqua distillata e poi con 800 µ l di etanolo. Richiedere fino a 800 µ l di tampone di 200 mM al litio acetato, pH 2.2.
Nota: Attenzione dovrebbe essere pagato per il tempo di incubazione per l'idrolisi alcuni amminoacidi non sono stabili in condizioni acide. La frazione di triptofano in proteina è stimata dai dati trovati in letteratura16, come questo aminoacido è completamente denaturato durante l'idrolisi di HCl. - Predisporre un idrolizzato standard per la taratura interna di singolo-punto. Aggiungere 160 µ l di una soluzione commerciale di amminoacidi idrolizzati a 840 µ l di tampone di 200 mM al litio acetato, pH 2.2, che contiene 625 del solfone di metionina µM, 625 acido cisteico µM e 625 norleucine µM.
- Determinare le concentrazioni relative di amminoacidi in proteine usando il metodo cromatografico descritto nella sezione 2.2.
- Preparare un estratto ossidato sospendendo il pellet cellulare in 200 µ l di acido performico (acido formico 90%, 10% di perossido di idrogeno). Incubare per 4 h a 4 ° C e interrompere la reazione con l'aggiunta di solfato di sodio 33,6 mg.
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Calcoli
- Calcolare la percentuale in peso di ciascun amminoacido in proteine dividendo la quantità misurata di ciascun amminoacido (mg/L) dalla quantità totale di aminoacido che è stata misurata nell'estratto della proteina (somma in mg/L).
- Moltiplicare questa percentuale per la concentrazione delle proteine in cultura (mg/L), vale a dire, il prodotto tra il contenuto proteico della biomassa e il peso secco, di valutare la concentrazione di ciascun amminoacido proteinogenici nella cultura (mg/L).
4. misurazione di arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici
Nota: Per la misurazione di arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici, utilizzare il pellet cellulare con etichetta. Tre diversi agenti sono utilizzati per il passaggio di derivatizzazione di quantificare l'arricchimento isotopico di aminoacidi. Le intensità di ioni cluster sono misurate per stimare i modelli di etichettatura degli aminoacidi. Il segnale da ogni ione cluster corrisponde all'abbondanza della massa isotopomers (m0 = senza etichettatura, m+ 1 = 1 atomo con etichetta,...) di un frammento dell'amminoacido. Nella Figura 2è riportato un esempio di un cromatogramma ottenuto dopo la procedura DMADMF.
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Idrolisi di biomassa
- Idrolizzare il pellet cellulare (corrispondente a 1-2 mg di biomassa secca) aggiungendo 1,2 mL di 6 M HCl e incubando il campione per 16 ore a 105 ° C in tubi di vetro ermeticamente chiuso in un forno a calore secco.
- Aggiungere 1,2 mL di acqua distillata e centrifugare a 3.000 x g per 5 min rimuovere i detriti cellulari. Distribuire il supernatante in frazioni di sei 400 µ l in tubi di vetro aperto. Asciugare le frazioni in forno a calore a 105 ° C fino a raggiungere la consistenza di sciroppo (4-5 h).
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Derivatizzazione Ethylchloroformate (ECF)
- Sciogliere l'idrolizzato essiccata in 200 µ l di 20mm HCl; quindi, aggiungere 133 µ l di piridina: etanolo (1:4). Aggiungere 50 µ l di ECF di derivatizzare gli aminoacidi e aspettare fino a quando tutte le CO2 è stato rilasciato. Trasferire il composto per Centrifugare le provette contenenti 500 µ l di diclorometano per estrarre i composti derivatizzati.
- Vortex le provette per 10 s e centrifugare per 4 min a 10.000 x g; raccogliere la fase organica inferiore con una pipetta Pasteur e trasferimento a fiale di GC che contengono inserti in vetro conico, in modo che i campioni possono essere iniettati direttamente nello strumento GC/MS.
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(N, N)-derivatizzazione di dimetilformammide dimetil acetale (DMFDMA).
- Sciogliere l'idrolizzato secco in 50 µ l di metanolo e 200 µ l di acetonitrile. Aggiungere 300 µ l di DMFDMA. Vortice del tubo e trasferimento ai campioni di autocampionatori GC fiale che contengono inserti in vetro conico.
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N, derivatizzazione trifluoroacetamide (BSTFA) O-Bis (trimetilsilile)
- Sospendere l'idrolizzato in 200 µ l di acetonitrile. Aggiungere 200 µ l di BSTFA, chiudere ermeticamente il tubo di vetro ed incubare per 4 h a 135 ° C prima di trasferire l'estratto direttamente al GC fiale.
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Analisi GC-MS
- Analizzare i campioni con un cromatografo a gas che è dotato di un iniettore di autocampionatori ed è accoppiato ad uno spettrometro di massa.
- Utilizzare software specifici dello strumento di controllo dello strumento e analizzare i cromatogrammi. Nel menu "Sequenza", fare clic su "Tabella del Log di esempio" per creare l'elenco di esempio e fare clic sul pulsante "Esegui" per iniziare le iniezioni.
Nota: Il cromatografo a gas è dotato di una colonna capillare in silice apolari 30 m x 0,25 mm con una spessore 0.15 μm. Impostare la temperatura di spettrometro di massa quadrupolare a 150 ° C e tenere la linea di trasferimento a 250 ° C per tutte le analisi. Tre programmi di analisi, ogni uno specifico di ogni agente di derivatizzazione, vengono utilizzati. - Derivati ECF: Utilizzo dell'elio come fase mobile con una portata di 1,2 mL/min imposta la temperatura dell'ingresso a 230 ° C e quello della sorgente a 250 ° C. Programmare l'autocampionatore per iniettare 1 µ l di campioni con un rapporto di divisione di 3:1. Eseguire le analisi, aumentando gradualmente la temperatura del forno come indicato di seguito: 130 ° C per 3 min; pendenza di 15 ° C/min fino a 260 ° C; mantenere la temperatura a 260 ° C per 20 min.
- Derivati DMFDMA: Utilizzo dell'elio come fase mobile con un flusso costante di 1,2 mL/min. imposta la temperatura dell'ingresso a 230 ° C e quello della sorgente a 250 ° C. Programmare l'autocampionatore per iniettare 1 µ l di campioni con un rapporto di divisione di 3:1. Eseguire le analisi, aumentando gradualmente la temperatura del forno come segue: 60 ° C per 1 min; pendenza di 20 ° C/min fino a 130 ° C; secondo gradiente di 4 ° C/min fino a 260 ° C; mantenere la temperatura a 260 ° C per 10 min.
- Derivati BSTFA: Utilizzo dell'elio come fase mobile con un flusso costante di 1,2 mL/min. imposta la temperatura dell'ingresso a 275 ° C e quello della sorgente a 300 ° C. Eseguire le analisi (iniezione: 1 µ l), gradualmente aumentando la temperatura del forno come segue: 110 ° C per 1 min; primo gradiente di 2 ° C/min fino a 154 ° C; secondo gradiente di 5 ° C/min fino a 300 ° C; mantenere la temperatura a 300 ° C per 10 min.
- Procedura di rilevazione: Per ogni modalità di derivatizzazione, iniettare un campione (1 µ l) in modalità di scansione con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV e prendere nota del tempo di ritenzione di ciascun amminoacido.
- Utilizzare questi valori per definire le finestre di tempo in tutto il cromatogramma e per i diversi ioni selezionati, che sono caratteristici di ciascun amminoacido ed elencati in tabella 3; questi valori devono essere inclusi per ogni amminoacido. Includere questa informazione nel programma di rilevamento di SIM ed eseguire le analisi in modalità SIM con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV.
- Utilizzare software specifici dello strumento di controllo dello strumento e analizzare i cromatogrammi. Nel menu "Sequenza", fare clic su "Tabella del Log di esempio" per creare l'elenco di esempio e fare clic sul pulsante "Esegui" per iniziare le iniezioni.
- Raccogliere i risultati delle analisi; vale a dire, per ogni amminoacido, è possibile registrare un cluster di intensità che corrispondono al suo isotopomers di massa diversa. Elaborare i dati utilizzando il dedicatedsoftware17 per correggere per l'etichettatura di naturale e calcolare l'arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici (definita come la frazione con etichetta di un amminoacido rispetto al suo importo totale nella proteina campioni).
Nota: L'arricchimento isotopico di una molecola (cioè), espressa in percentuale, viene calcolato dividendo la somma delle intensità corretta della massa isotopomers con etichettatura (m1, m2,... mn) la somma del corretto intensità di tutti i isotopomers massa (m0, m1, m2,... mn):
Cioè = (m1 + m2 +... + mn) / (m0 + m1e m2 +... + mn)
- Analizzare i campioni con un cromatografo a gas che è dotato di un iniettore di autocampionatori ed è accoppiato ad uno spettrometro di massa.
5. quantificazione e arricchimento isotopico di composti volatili
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Estrazione di composti volatili con etichettati
- Aggiungere 10 µ l di standard interni deuterati a 5 mL di surnatante (concentrazione finale di composti deuterati: 100 µ g/L) in una provetta di vetro da 15 mL. Aggiungere 1 mL di diclorometano, strettamente chiudere le provette e agitarle su una piattaforma a dondolo per 20 min. Centrifugare per 5 min 3.000 x g e raccogliere la fase organica inferiore in una provetta di vetro da 15 mL. Ripetere l'estrazione di diclorometano.
- Asciugare l'Estratto organico più di 500 mg di solfato di sodio anidro e raccogliere la fase liquida con una pipetta Pasteur. Concentrare l'Estratto da un fattore di quattro sotto flusso di azoto e trasferirlo in un flaconcino di autocampionatori GC.
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GC-MS quantificazione dei composti volatili
- Dotare il cromatografo a gas con una colonna capillare in silice fusa 30 m x 0,25 mm di spessore 0,25 μm e applicare un flusso di elio costante di 1,0 mL/min attesa l'iniettore e la linea di trasferimento a 250 ° C.
- Iniettare 2 µ l di campione con un rapporto di divisione di 10:1 e separare le molecole volatili estratte utilizzando il seguente profilo di temperatura del forno: tenere la temperatura per 3 min a 40 ° C, aumentare di 4 ° C/min fino a 220 ° C e poi tenere il forno a 220 ° C per 20 min.
- Rilevare i composti utilizzando uno spettrometro di massa con la sua temperatura di origine impostato a 230 ° C e la sua temperatura di spettrometro di massa quadrupolare a 150 ° C. Registrare spettri di massa in modalità selezionata Ion Monitoring (SIM) con ionizzazione di effetto elettrone positivo a 70 eV e con i grappoli di ioni specifici per le sostanze volatili che sono riportati nella tabella 4.
- Utilizzare una taratura esterna di 7 punti per quantificare le concentrazioni di molecole volatili le somme delle intensità del cluster dello ione corrispondente. Preparare soluzioni di riserva di ogni composto (10 g/L) in etanolo al 100%. Quindi, preparare soluzioni standard per ciascuna classe di molecole volatili (esteri etilici, acetati, alcoli e acidi) con soluzioni di riserva. Infine, diluire gli importi differenti di soluzioni standard in una soluzione idroalcolica di 12% contenente 5 g/L in acido tartarico con il pH regolato a 3.3 per preparare soluzioni di taratura.
- In parallelo, correggere per l'etichettatura naturale delle intensità di ogni cluster di ioni e calcolare l'arricchimento isotopico di composti volatili, che è definita come la frazione con etichetta delle molecole ed è espresso come una percentuale utilizzando il software dedicato 17.
6. calcoli per un'analisi integrata del Dataset
-
Raccolta dei dati grezzi
- Utilizzando i fogli di calcolo riportati nelle tabelle 5, 6, 7 e 8, immettere i valori di dati grezzi che corrispondono alla concentrazione di aminoacidi extracellulari, peso a secco delle cellule, contenuto proteico delle cellule, concentrazione di molecole volatili e isotopica arricchimento di aminoacidi proteinogenici e molecole volatili.
Nota: I dati riportati nelle tabelle sono espresse in mM. Tutti i risultati sono anche espressi in mg/L, moltiplicando i valori in mM per il peso molecolare di ogni molecola o in mg N/L moltiplicando la concentrazione millimolar di un aminoacido proteinogenici per la massa atomica dell'azoto (14 ore) e dal numero di azoto ato MS che sono forniti da catabolismo di questa molecola. - Calcolare la percentuale in massa di ciascun amminoacido in proteine dividendo la quantità in mg/L nell'idrolizzato dalla quantità totale di aminoacidi (loro somma in mg/L).
- Calcolare i mezzi, deviazioni standard ed errori standard della media dai dati che sono stati ottenuti negli esperimenti indipendenti.
- Calcolare la concentrazione di proteinogenici (mg/L) per ogni amminoacido moltiplicando la percentuale di questo aminoacido in proteine (mg aa/g proteine) con la frazione proteica della biomassa (g proteine/g DW) e il tenore di peso a secco (produzione di biomassa) nella media (g DW/L).
- Utilizzando i fogli di calcolo riportati nelle tabelle 5, 6, 7 e 8, immettere i valori di dati grezzi che corrispondono alla concentrazione di aminoacidi extracellulari, peso a secco delle cellule, contenuto proteico delle cellule, concentrazione di molecole volatili e isotopica arricchimento di aminoacidi proteinogenici e molecole volatili.
-
15 Esperimenti di tracciante isotopico di N
- Utilizzando i fogli di calcolo sono presentati in tabella 9, calcolare le frazioni marcate e non marcate di azoto che sono presenti negli amminoacidi proteinogenici (espressi in mg N/L) da loro concentrazioni totali (espressi in mg N/L) e loro arricchimenti isotopici. Per ogni amminoacido, la frazione con etichetta corrisponde al prodotto tra la sua concentrazione totale e relativo arricchimento isotopico, e la parte senza etichetta è la differenza tra il totale e gli importi con etichettati.
- Quindi, determinare la frazione di azoto totale in proteine che è contenuto in amminoacidi proteinogenici quantificati in questo studio sommando la quantità totale di Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, la sua, Glu e Arg (in mg N/L) e dividendo il totale un Monte di azoto contenuto in proteine di questa somma.
- Calcolare l'azoto fornito da arginina, glutamina o ammonio che è stato recuperato negli acidi proteinogenici quantificati in questo studio sommando la frazione con etichetta (in mg N/L) di aminoacidi proteinogenici che sono stati quantificati nello studio (Ala, Gly, Val, Asp, Phe, Leu, Ile, Thr, Ser, Pro, Lys, suo, Glu e Arg) durante gli esperimenti in presenza di 15N-etichettato arginina, glutamina, o ammonio e dividendo questa frazione di azoto con l'etichetta per la quantità totale di azoto nel quantificati proteinogenici amino acidi.
- Valutare il contributo di 3 aminoacidi più abbondanti al pool intracellulare dell'azoto utilizzato per la biosintesi de novo combinando i dati dal 13C ed esperimenti di 15N isotopo tracciante (foglio di calcolo nella tabella 7).
- Dall'importo totale (espressa in mM) di proteinogenici Val, Leu, Ile o Thr, detrarre la parte derivata dall'incorporazione diretta di composti consumati (13C esperimenti) e la parte che è stato sintetizzato de novo utilizzando l'azoto dai 3 principali fonti al fine di valutare la frazione che è stato sintetizzato de novo utilizzando azoto da altri aminoacidi.
- Quindi, calcolare il rapporto tra la quantità di aminoacidi de novo sintetizzato utilizzando azoto fornito da Gln, Arg e NH4+ (somma espressa in mM) per la quantità totale di aminoacidi proteinogenici (in mM) per quantificare il contributo di arginina, glutamina e ammonio al pool di azoto intracellulare.
-
13 Esperimenti di tracciante isotopico di C
- Calcolare le frazioni marcate e non marcate degli aminoacidi proteinogenici dalle concentrazioni espresse in mM e arricchimenti isotopici di aminoacidi proteinogenici che sono stati ottenuti durante gli esperimenti in presenza di 13C-etichetta Leu, Val, Ile o Thr. (Vedi 6.2.1, tabella 10).
- Calcolare le frazioni marcate e non marcate di composti volatili dalle concentrazioni espresse in mM e arricchimenti isotopici di composti volatili che sono stati ottenuti durante gli esperimenti in presenza di 13C-etichetta Leu, Val, Ile o Thr ( Tabella 10).
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Representative Results
Figura 3 presenta un diagramma schematico del flusso di lavoro che è stato implementato per studiare la gestione da lievito delle molteplici sorgenti di azoto che si trovano durante la fermentazione del vino.
Per i diversi punti di campionamento, le caratteristiche di parametri – crescita biologica, modelli di consumo di azoto e il profilo di aminoacidi proteinogenici – Visualizza un'elevata riproducibilità tra fermentazioni (Figura 4). Tale coerenza convalida la pertinenza dell'approccio basato sulla combinazione di dati che è stati generati durante una serie di 14 fermentazioni indipendente.
La figura 5 Mostra una panoramica completa della ridistribuzione di azoto dalle fonti che sono disponibili nel succo d'uva per tutti gli aminoacidi proteinogenici. Questa analisi è supportata principalmente dai risultati che sono stati ottenuti da esperimenti condotti in presenza di composti con etichetta N 15. Combinato con la determinazione dei saldi massa ed isotopici, la misura dell'arricchimento isotopico degli aminoacidi proteinogenici fornito la prima quantificazione del contributo di azoto-originario dell'arginina, glutamina, ammonio e altro fonti per i gruppi amminici di ciascuno di questi composti. La ridistribuzione importante di azoto che viene sottolineato qui riflette il ruolo notevole della sintesi de novo di aminoacidi nel sostenere la crescita del lievito.
Inoltre, questo studio, confrontando la quantità di composti con etichettate in proteine con il loro consumo, permette la frazione di molecole contenenti N consumati che sono direttamente incorporato nelle proteine quando entrano le cellule per essere valutato. Gli aminoacidi proteinogenici sono differenziati secondo il loro livello di incorporazione diretta della biomassa; alcuni di loro sono esclusivamente (Asp, Glu) o più di 80% de novo sintetizzati, mentre solo piccole quantità di altri composti sono generate da sintesi de novo . È interessante notare che, quest'ultimo gruppo comprende lisina ed istidina, che sono gli aminoacidi unici in cui tutte le fonti consumate sono direttamente incorporate.
Figura 5B presenta anche, per alcuni aminoacidi, un confronto tra la quantità di aminoacido consumato che viene recuperato direttamente nella biomassa, calcolata dai dati ottenuti in esperimenti di 15N-etichettatura e misurata sperimentalmente in 13 C-etichettatura esperimenti. Le piccole differenze tra questi valori mostrano l'affidabilità e la robustezza dell'approccio che è stato implementato in questo studio.
Figura 6 Mostra un esempio di quantitativi di partizionamento (rapporti) dei flussi attraverso vie metaboliche che è stato ottenuto mediante l'implementazione del flusso di lavoro riportato in questo documento. Questa mappa è stata disegnata combinando le informazioni da esperimenti di tracciante isotopico utilizzando substrati di 15N - e 13C-etichetta e descrive il partizionamento degli aminoacidi alifatici consumati nella rete metabolica che è coinvolto in valina e biosintesi di leucina in lievito (per calcoli, fare riferimento alla tabella 1 e tabella 2). Misurando la produzione e l'arricchimento isotopico di aminoacidi proteinogenici e di composti volatili, abbiamo valutato la quantità di questi composti che sono stati sintetizzati dalle dorsali di carbonio consumati U-C13- valina e U-C13- leucina, che corrisponde alla frazione con etichetta dei composti. Successivamente, siamo stati in grado di determinare il contributo di CCM alla loro formazione (la frazione senza etichetta dei composti). Bilanci di massa di carbonio impostare utilizzando il flusso di lavoro e la procedura di calcolo che viene proposto qui mostrano che oltre il 96% del consumato valina e leucina sono recuperati nei loro prodotti di conversione, vale a dire, proteinogenici leucina e valina e volatile superiore alcoli. Questa scoperta conferma l'adeguatezza dell'approccio segnalato per studi quantitativi del metabolismo. L'analisi integrata e globale del dataset offre nuove intuizioni nel destino degli amminoacidi consumati. Sorprendentemente, una frazione sostanziale di valina e la leucina sono catabolizzate nonostante un notevole squilibrio tra la disponibilità di questi composti nel mezzo e il loro contenuto nella biomassa. Tuttavia, la frazione di N-composti esogeni direttamente incorporato nelle proteine dipende dalla natura dell'amminoacido. Un altro punto chiave riguarda l'origine metabolica di aminoacidi proteinogenici e molecole volatili. L'analisi del pattern 13C-etichettatura di proteinogenici leucina e valina rivela che lo scheletro del carbonio di questi aminoacidi proviene principalmente da precursori che sono stati sintetizzati attraverso il CCM. In linea con questa osservazione, l'incorporazione bassa di etichettatura in alcool isobutanolo e isoamyl dimostra il coinvolgimento molto limitato del catabolismo della valina e la leucina che erano consumati dal lievito nella formazione di questi alcoli superiori.
Figura 1. Automatizzato sistema robotico per il monitoraggio di alto-rendimento fermentazioni. (A) piattaforma robotica. Fermentatori (a) vengono inseriti in guide di supporto piastre agitazione magnetica (b). Una barriera ottica di sicurezza (c) protegge gli utenti. Un braccio robotico (d) sposta i fermentatori successivamente dalla posizione su uno dei 6 mescolando piatti di una bilancia di precisione (e) sulla sinistra del tavolo di lavoro, per misurare il peso ogni 4 ore. La piattaforma robotica si trova in una camera a temperatura controllata. (B) rappresentazione schematica dell'architettura software. Un'interfaccia grafica consente agli utenti di definire le impostazioni sperimentali. Queste informazioni vengono trasmesse all'applicazione di controllo che controlla il braccio robotico e registra il diverso peso nei diversi data.xlm raw file (1 file/fermentazione). Il software di calcolo poi raccoglie i file xlm e calcola, per ciascun punto di tempo, la quantità di CO2 che viene rilasciato (espresso in g/L), che è proporzionale alla quantità di zuccheri che sono stati consumati in questo momento e il tasso di fermentazione, che corrisponde al tasso di produzione di CO2 , in g CO2/L/h (proporzionale al tasso di consumo di zucchero). I dati vengono memorizzati in un database relazionale e visualizzato utilizzando un'interfaccia grafica dedicata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Analisi GC-MS di aminoacidi proteinogenici: esempio di alanina. (A) cromatogramma ottenuto dopo derivatizzazione di aminoacidi proteinogenici utilizzando DMFDMA. (B) spettri dell'alanina derivatizzata di massa. Due picchi principali che corrispondono ai frammenti con m0/z = 99 e m0/z = 158. (C) reazione di derivatizzazione dell'alanina con DMFDMA. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Flusso di lavoro per l'analisi quantitativa del metabolismo dell'azoto più fonti di lievito. Questo processo include fermentazioni (i) un insieme di 28 (7 fonti di azoto e fermentazioni con o senza composti azotati in duplice copia); (ii) una parte analitica che coinvolge diversi procedimenti di estrazione e derivatizzazione di molecole e analisi HPLC o GM-MS e (iii) elaborazione dei dati grezzi e un'analisi integrata dei DataSet. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Riproducibilità dei parametri biologici da un insieme indipendente di fermentazioni. (A-B) I valori medi e deviazioni standard di peso secco e contenuto proteico che sono state ottenute dalle 14 fermentazioni indipendenti effettuate utilizzando composti senza etichetta. (C-D) Valori medi e deviazioni standard di proteinogenici e consumati gli aminoacidi che sono stati misurati durante 14 indipendente fermentazioni effettuate utilizzando composti senza etichetta. Produzione di CO2 : 5 (verde), 10 (blu), 40 (rosa) e 90 (viola) g/L. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5. Ridistribuzione di azoto dalle tre fonti principali di azoto agli aminoacidi proteinogenici durante la fermentazione. (A) origine metabolica degli aminoacidi proteinogenici: diretto incorporazione della controparte consumato (blu) e sintesi de novo utilizzando azoto fornito da consumato arginina (arancione), glutammina (verde), ammonio (rosa) o altri (gli aminoacidi viola). Espresso come una percentuale dell'importo totale di ciascun amminoacido proteinogenici. (B) confronto tra la quantità di consumo dell'amminoacido (blu) e la parte dell'amminoacido consumato che viene recuperato direttamente in proteine, calcolati dai dati che sono stati ottenuti in esperimenti di tracciante 15N (viola) o sperimentalmente misurata durante la fermentazione con 13C-etichetta molecole (rosa). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 6. Analisi quantitativa del metabolismo di valina e la leucina. Partizionamento di consumato leucina (verde) e valina (blu) attraverso la rete metabolica quando 40 g/L di CO2 sono prodotti. Le barre sono proporzionali alla quantità di ciascun composto e sono espresse in µM, compresa la frazione che è stato sintetizzato dal metabolismo del carbonio centrale (arancione). Valori in caratteri normali: importo in µM; valori in carattere corsivo: percentuale di consumato valina (blu) o di leucina (verde) che è stata catabolizzata attraverso la via. I calcoli sono forniti in tabella 1 e tabella 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Composti | Quantità per litro |
| Glucosio C6H12O6 | 240 g |
| Acido malico C4H6O5 | 6 g |
| Acido citrico C6H8O7 | 6 g |
| Potassio fosfato KH2PO4 | 0,75 g |
| Solfato di potassio K2SO4 | 0,5 g |
| Solfato di magnesio MgSO4, 7 H2O | 0,25 g |
| Cloruro di calcio CaCl2, 2 H2O | 0,155 g |
| Cloruro di sodio NaCl | 0,2 g |
| Myo-inositolo | 20 mg |
| Calcio pantotenato | 1,5 mg |
| Tiamina cloridrato | 0,223 mg |
| Acido nicotinico | 2 mg |
| Piridossina | 0,25 mg |
| Biotina | 0,003 |
| MnSO4· H2O | 4 mg |
| ZnSO4·7H2O | 4 mg |
| CuSO4·5H2O | 1 mg |
| CoCl2·6H2O | 0,4 mg |
| H3BO3 | 1 mg |
| (NH4) 6 Mo7O24 | 1 mg |
| Ergosterolo | 3,75 mg |
| Acido oleico | 1.25 Μ l |
| Tween 80 | 125 Μ l |
| Tirosina | 8,6 mg |
| Triptofano | 84,4 mg |
| Isoleucina | 15,4 mg |
| Aspartato | 20,9 mg |
| Glutammato | 56,7 mg |
| Arginina | 176,2 mg |
| Leucina | 22,8 mg |
| Treonina | 35,7 mg |
| Glicina | 8,6 mg |
| Glutammina | 237,8 mg |
| Alanina | 68,4 mg |
| Valina | 20,9 mg |
| Metionina | 14,8 mg |
| Fenilalanina | 17,9 mg |
| Serina | 37,0 mg |
| Istidina | 15,4 mg |
| Lisina | 8,0 mg |
| Cisteina | 6,2 mg |
| Prolina | 288,3 mg |
| Ammoniaca cloruro NH4Cl | 220 mg |
| Il pH del mezzo è stato regolato a 3.3 con NaOH 10 M. | |
Tabella 1. Composizione del mezzo sintetico utilizzato in questo studio. Questo terreno chimicamente definito imita la composizione del succo d'uva.
| Tampone di eluizione | Temperatura | |
| Da 0 a 6 min | Citrato di litio, 200 mM, pH 2.8 | 32 ° C |
| Da 6 a 38 min | Citrato di litio, 300 mM, pH 3 | 32 ° C |
| Da 38 a 57 min | Citrato di litio, 500 mM, pH 3.15 | 64,5 ° C |
| Da 57 a 83 min | Citrato di litio, 900 mM, pH 3,5 | 75 ° C |
| Da 83 a 120 min | Citrato di litio, 1650 mM, pH 3.55 | 75 ° C |
| Da 120 a 130 min | Idrossido di litio, 300 mM |
Tabella 2. Condizioni di utilizzo per la separazione degli aminoacidi dalla cromatografia di scambio ionico. Buffer di eluizione con aumento delle concentrazioni di sale vengono utilizzati successivamente in combinazione con un gradiente di temperatura per consentire la separazione degli aminoacidi.
| Gli aminoacidi | Reagente derivatizzante | RT (min) | Cluster di ioni (m/z) |
| Alanina | ECFun | 3,86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glicina | ECFun | 4,19 | 102, 103, 104 |
| ECFun | 4,19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 144, 145, 146 | |
| Valina | ECFun | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucina | ECFun | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucina | ECFun | 5,85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Treonina | ECFun | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFun | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serina | ECFun | 6,53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFun | 6,53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolina | ECFun | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartato | ECFun | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutammato | ECFun | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanina | ECFun | 9,53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lisina | ECFun | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Istidina | ECFun | 12,54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginina | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
| un ECF, cloroformiato di etile; b DMFDMA, (N, N)-dimetilformammide dibutile acetale; c BSTFA, (N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide). | |||
Tabella 3. Parametri analitici utilizzati per la determinazione degli arricchimenti isotopici di aminoacidi utilizzando ioni selezionati (SIM) modalità di monitoraggio. Questa tabella riassume gli agenti chimici utilizzati per la derivatizzazione, il tempo di ritenzione dei composti derivatizzate e il cluster di ioni ottenuti in MS (modalità impatto elettronico) per ogni amminoacido.
| Gli aminoacidi | Reagente derivatizzante | RT (min) | Cluster di ioni (m/z) |
| Alanina | ECFun | 3,86 | 116, 117, 118, 119 |
| DMFDMAb | 6.37 | 99, 100, 101, 102 | |
| DMFDMAb | 6.37 | 158, 159, 160, 161 | |
| Glicina | ECFun | 4,19 | 102, 103, 104 |
| ECFun | 4,19 | 175, 176, 177 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 85, 86, 87 | |
| DMFDMAb | 6,61 | 144, 145, 146 | |
| Valina | ECFun | 4,97 | 144, 145, 146, 147, 148, 149 |
| DMFDMAb | 7,37 | 127, 128, 129, 130, 131, 132 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 7,37 | 186, 187, 188, 189, 190, 191 | |
| Leucina | ECFun | 5,67 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164 |
| Isoleucina | ECFun | 5,85 | 158, 159, 160, 161, 162, 163, 165 |
| Threonin | ECFun | 6,48 | 146, 147, 148, 149, 150 |
| ECFun | 6,48 | 175, 176, 177, 178, 179 | |
| Serina | ECFun | 6,53 | 132, 133, 134, 135 |
| ECFun | 6,53 | 175, 176, 177, 178 | |
| Prolina | ECFun | 6.83 | 142, 143, 144, 145, 146, 147 |
| Aspartato | ECFun | 7.89 | 188, 189, 190, 191, 192 |
| DMFDMAb | 11,77 | 115, 116, 117, 118, 119 | |
| DMFDMAb | 11,77 | 216, 217, 218, 219, 220 | |
| Glutammato | ECFun | 8,81 | 202, 203, 204, 205, 206, 207 |
| DMFDMAb | 12.75 | 111, 112, 113, 114, 115, 116 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 143, 144, 145, 146, 147, 148 | |
| DMFDMAb | 12.75 | 230, 231, 232, 233, 234, 235 | |
| Fenilalanina | ECFun | 9,53 | 192, 193, 194, 195, 196, 197, 198, 199, 200, 201 |
| DMFDMAb | 13,67 | 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152 | |
| Lisina | ECFun | 11.95 | 156, 157, 158, 159, 160, 161, 162 |
| Istidina | ECFun | 12,54 | 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333 |
| Arginina | BSTFAc | 18,8 | 174, 175, 176, 177, 178, 179 |
Tabella 4. Parametri analitici utilizzati per la determinazione degli arricchimenti isotopici e la quantificazione dei composti volatili mediante ioni selezionati (SIM) modalità di monitoraggio. Questa tabella riassume il tempo di ritenzione e il cluster di ioni ottenuti in MS (modalità impatto elettronico) per ogni composto volatile.
Tabella 5. Elaborazione dei dati grezzi ottenuti dalla quantificazione dei residui aminoacidi Dataset contiene dati di misurazioni degli aminoacidi iniziale e residua. Questi valori vengono utilizzati per calcolare la quantità di aminoacido consumata (per sottrazione). Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 6. Elaborazione dei dati grezzi acquisiti dalla quantificazione degli aminoacidi proteinogenici. Questo dataset contiene dati sulla composizione in amminoacidi idrolizzati di biomassa (A) e la frazione delle proteine in biomassa (B). Questi valori vengono utilizzati per valutare la percentuale in massa di ciascun amminoacido in proteine (C). Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 7. Gli aminoacidi proteinogenici. Questo foglio di calcolo viene utilizzato per calcolare la concentrazione (in mM) di aminoacidi proteinogenici da dati riepilogati nella tabella 5 e tabella 6. Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 8. Elaborazione dei dati grezzi acquisiti dalla quantificazione degli alcoli superiori. Set di dati include i dati dalle misurazioni delle concentrazioni di composte volatili (A) e converte i dati espressi in unità di mg/L a µM (B). Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 9. Elaborazione dei dati grezzi acquisiti dalla determinazione degli arricchimenti isotopici di aminoacidi proteinogenici utilizzando 15N-etichettati substrati.
Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
Tabella 10. Elaborazione dei dati grezzi acquisiti dalla determinazione degli arricchimenti isotopici di aminoacidi proteinogenici e composti volatili mediante 13C-etichettati substrati.
Medie e deviazioni standard sono calcolate per ulteriori calcoli. Per favore clicca qui per scaricare questa tabella.
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Discussion
Quantificare il partizionamento di composti attraverso reti metaboliche mediante esperimenti di tracciante isotopico è un promettente approccio per capire il funzionamento del metabolismo microbico. Questa metodologia, mentre applicato con successo con uno o due substrati con etichettati, attualmente non può essere implementata per studiare il metabolismo di varie fonti utilizzando multipli con etichettati elementali isotopi (cioè, più di due substrati). Infatti, le tecniche analitiche disponibili consentono la determinazione accurata dei modelli d'etichettatura di aminoacidi proteinogenici e molecole esclusivamente quando si utilizza isotopi di un elemento singolo e possibilmente quando co-etichettatura con due elementi. Di conseguenza, per risolvere queste limitazioni e valutare la gestione di molteplici fonti di nutrienti da parte dei microrganismi, abbiamo scelto di ripetere una serie di culture sotto le stesse condizioni ambientali mentre etichettatura un substrato selezionato con 13C o 15 Isotopi N. Quindi, ulteriore combinazione delle informazioni specifiche che sono fornite da ogni 13C o esperimento di tracciante 15N offre una vista estesa quantitativa del metabolismo di più origini.
Il successo dell'approccio segnalato si basa sull'attuazione di una serie riproducibile di culture in condizioni standard e sulla raccolta di campioni da una popolazione di cellule in uno stato fisiologico definito che è la stessa per tutte le culture (cella crescita, il consumo di substrato, ecc.). Queste condizioni devono essere soddisfatte affinché i dati ottenuti da esperimenti indipendenti possono essere combinati e analizzati insieme. Soddisfare questi vincoli richiede un accurato e frequente monitoraggio dell'attività microbica che è stato effettuato, nel lavoro sperimentale ha segnalato qui, utilizzando un sistema robot-assistita per monitoraggio online delle attività di fermentazione del lievito. Tuttavia, metodi più tradizionali per la coltivazione di microrganismi e monitoraggio, quali la determinazione della crescita delle cellule misurando la densità ottica, possono essere utilizzati per normalizzare la procedura di campionamento.
Un altro prerequisito per il compimento di questa metodologia è quello di avere una visione chiara delle vie metaboliche che sono coinvolti nella rete per essere studiato. Questa conoscenza è essenziale per la scelta del set di substrati con etichettate che sono le più appropriate per affrontare il problema in fase di studio. I composti con etichettati, nonché la natura e la posizione dell'etichettatura (13C, 15N o altri) all'interno di molecole deve essere selezionato opportunamente in modo da ho) recuperare tutte le etichette fornite dai substrati nei composti che sono derivati da loro catabolismo e sono ulteriormente analizzato nella procedura e ii) ottenere dati ridondanti che dimostrano l'accuratezza della metodologia e la validità dei risultati. La procedura qui descritta include anche un numero importante di analisi che potrebbe essere che richiede tempo e costosa in risorse umane e finanziarie. Inoltre, alcuni vincoli analitici possono limitare l'utilizzo di questa metodologia. In primo luogo, gli utenti dovrebbero assicurare che tutti i metodi analitici che sono necessari per la quantificazione dei composti prodotti durante il metabolismo microbico e per la determinazione del loro arricchimento isotopico sono disponibili. In secondo luogo, questo approccio si applica solo per valutare il metabolismo dei substrati per cui tutta la conversione composti sono prodotte in quantità sufficienti per essere quantificati con precisione.
In questa carta, abbiamo applicato questo flusso di lavoro per esplorare la gestione di molteplici fonti di azoto dal lievito durante la fermentazione del vino. Questa relazione ha offerto nuove intuizioni sul metabolismo dei lieviti, tra cui notevole catabolismo degli aminoacidi più consumate, combinato con la loro incorporazione diretta basso in proteine e l'importante contributo di CCM di fornire precursori che vengono ulteriormente utilizzati per sia la sintesi de novo di aminoacidi proteinogenici e la formazione di molecole volatili.
Più in generale, l'approccio che viene qui descritto può essere utilizzato per quantificare il partizionamento di substrati multipli attraverso la rete metabolica di qualsiasi microrganismo. Permetterà ai ricercatori di delucidare il destino di tutti i composti consumati dopo l'ingresso delle cellule e per affrontare l'identificazione dell'origine metabolica dei precursori e dei prodotti. Queste informazioni possono essere utili per confrontare l'attività metabolica dei ceppi che hanno diversi background genetici o crescere in condizioni diverse e, di conseguenza, per la progettazione di strategie razionali per migliorare i processi di fermentazione.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Grazie a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin e Jean-Marie Sabalyrolles per aver contribuito alla concezione del sistema robot-assistita fermentazione e Martine Pradal, Nicolas Bouvier e Pascale Brial per il loro supporto tecnico. Finanziamento per questo progetto è stato fornito dal Ministère de l'Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Glucose | PanReac | 141341.0416 | |
| D-Fructose | PanReac | 142728.0416 | |
| DL-Malic acid | Sigma Aldrich | M0875 | |
| Citric acid monohydrate | Sigma Aldrich | C7129 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | P5379 | |
| Potassium sulfate | Sigma Aldrich | P0772 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | 230391 | |
| Calcium chloride dihydrate | Sigma Aldrich | C7902 | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S9625 | |
| Ammonium chloride | Sigma Aldrich | A4514 | |
| Sodium hydroxide | Sigma Aldrich | 71690 | |
| Manganese sulfate monohydrate | Sigma Aldrich | M7634 | |
| Zinc sulfate heptahydrate | Sigma Aldrich | Z4750 | |
| Copper (II) sulfate pentahydrate | Sigma Aldrich | C7631 | |
| Potassium iodine | Sigma Aldrich | P4286 | |
| Cobalt (II) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | C3169 | |
| Boric acid | Sigma Aldrich | B7660 | |
| Ammonium heptamolybdate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Myo-inositol | Sigma Aldrich | I5125 | |
| D-Pantothenic acid hemicalcium salt | Sigma Aldrich | 21210 | |
| Thiamine, hydrochloride | Sigma Aldrich | T4625 | |
| Nicotinic acid | Sigma Aldrich | N4126 | |
| Pyridoxine | Sigma Aldrich | P5669 | |
| Biotine | Sigma Aldrich | B4501 | |
| Ergostérol | Sigma Aldrich | E6510 | |
| Tween 80 | Sigma Aldrich | P1754 | |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 101074F | |
| Iron (III) chloride hexahydrate | Sigma Aldrich | 236489 | |
| L-Aspartic acid | Sigma Aldrich | A9256 | |
| L-Glutamic acid | Sigma Aldrich | G1251 | |
| L-Alanine | Sigma Aldrich | A7627 | |
| L-Arginine | Sigma Aldrich | A5006 | |
| L-Cysteine | Sigma Aldrich | C7352 | |
| L-Glutamine | Sigma Aldrich | G3126 | |
| Glycine | Sigma Aldrich | G7126 | |
| L-Histidine | Sigma Aldrich | H8000 | |
| L-Isoleucine | Sigma Aldrich | I2752 | |
| L-Leucine | Sigma Aldrich | L8000 | |
| L-Lysine | Sigma Aldrich | L5501 | |
| L-Methionine | Sigma Aldrich | M9625 | |
| L-Phenylalanine | Sigma Aldrich | P2126 | |
| L-Proline | Sigma Aldrich | P0380 | |
| L-Serine | Sigma Aldrich | S4500 | |
| L-Threonine | Sigma Aldrich | T8625 | |
| L-Tryptophane | Sigma Aldrich | T0254 | |
| L-Tyrosine | Sigma Aldrich | T3754 | |
| L-Valine | Sigma Aldrich | V0500 | |
| 13C5-L-Valine | Eurisotop | CLM-2249-H-0.25 | |
| 13C6-L-Leucine | Eurisotop | CLM-2262-H-0.25 | |
| 15N-Ammonium chloride | Eurisotop | NLM-467-1 | |
| ALPHA-15N-L-Glutamine | Eurisotop | NLM-1016-1 | |
| U-15N4-L-Arginine | Eurisotop | NLM-396-PK | |
| Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 270989 | |
| Ethyl propanoate | Sigma Aldrich | 112305 | |
| Ethyl 2-methylpropanoate | Sigma Aldrich | 246085 | |
| Ethyl butanoate | Sigma Aldrich | E15701 | |
| Ethyl 2-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 306886 | |
| Ethyl 3-methylbutanoate | Sigma Aldrich | 8.08541.0250 | |
| Ethyl hexanoate | Sigma Aldrich | 148962 | |
| Ethyl octanoate | Sigma Aldrich | W244910 | |
| Ethyl decanoate | Sigma Aldrich | W243205 | |
| Ethyl dodecanoate | Sigma Aldrich | W244112 | |
| Ethyl lactate | Sigma Aldrich | W244015 | |
| Diethyl succinate | Sigma Aldrich | W237701 | |
| 2-methylpropyl acetate | Sigma Aldrich | W217514 | |
| 2-methylbutyl acetate | Sigma Aldrich | W364401 | |
| 3-methyl butyl acetate | Sigma Aldrich | 287725 | |
| 2-phenylethyl acetate | Sigma Aldrich | 290580 | |
| 2-methylpropanol | Sigma Aldrich | 294829 | |
| 2-methylbutanol | Sigma Aldrich | 133051 | |
| 3-methylbutanol | Sigma Aldrich | 309435 | |
| Hexanol | Sigma Aldrich | 128570 | |
| 2-phenylethanol | Sigma Aldrich | 77861 | |
| Propanoic acid | Sigma Aldrich | 94425 | |
| Butanoic acid | Sigma Aldrich | 19215 | |
| 2-methylpropanoic acid | Sigma Aldrich | 58360 | |
| 2-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | 193070 | |
| 3-methylbutanoic acid | Sigma Aldrich | W310212 | |
| Hexanoic acid | Sigma Aldrich | 153745 | |
| Octanoic acid | Sigma Aldrich | W279900 | |
| Decanoic acid | Sigma Aldrich | W236403 | |
| Dodecanoic acid | Sigma Aldrich | L556 | |
| Fermentor 1L | Legallais | AT1357 | Fermenter handmade for fermentation |
| Disposable vacuum filtration system | Dominique Deutscher | 029311 | |
| Fermenters (250 ml) | Legallais | AT1352 | Fermenter handmade for fermentation |
| Sterile tubes | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Fermentation locks | Legallais | AT1356 | Fermetation locks handmade for fermentation |
| BactoYeast Extract | Becton, Dickinson and Company | 212750 | |
| BactoPeptone | Becton, Dickinson and Company | 211677 | |
| Incubator shaker | Infors HT | ||
| Particle Counter | Beckman Coulter | 6605697 | Multisizer 3 Coulter Counter |
| Centrifuge | Jouan | GR412 | |
| Plate Butler Robotic system | Lab Services BV | PF0X-MA | Automatic instrument |
| Plate Butler Software | Lab Services BV | Robot monitor software | |
| RobView | In-house developed calculation software | ||
| My SQL | International source database | ||
| Cimarec i Telesystem Multipoint Stirrers | Thermo Fisher Scientific | 50088009 | String Drive 60 |
| BenchBlotter platform rocker | Dutscher | 60903 | |
| Ammonia enzymatic kit | R-Biopharm AG | 5390 | |
| Spectrophotometer cuvettes | VWR | 634-0678 | |
| Spectrophotometer UviLine 9400 | Secomam | ||
| Amino acids standards physiological - acidics and neutrals | Sigma Aldrich | A6407 | |
| Amino acids standards physiological - basics | Sigma Aldrich | A6282 | |
| Citrate lithium buffers - Ultra ninhydrin reagent | Biochrom | BC80-6000-06 | |
| Sulfosalycilic acid | Sigma Aldrich | S2130 | |
| Norleucine | Sigma Aldrich | N1398 | |
| Biochrom 30 AAA | Biochrom | ||
| EZChrom Elite | Biochrom | Instrument control and Data analysis software | |
| Ultropac 8 resin Lithium | Biochrom | BC80-6002-47 | Lithium High Resolution Physiological Column |
| Filter Millex GV | Merck Millipore | SLGVX13NL | Millex GV 13mm (pore size 0.22 µm) |
| Membrane filter PALL | VWR | 514-4157 | Supor-450 47mm 0.45µm |
| Vacuum pump Millivac Mini | Millipore | XF5423050 | |
| Aluminium smooth weigh dish 70mm | VWR | 611-1380 | |
| Precision balance | Mettler | Specifications AE163 | |
| Dimethyl sulfoxid dried | Merck | 1029310161 | (max. 0.025% H2O) SeccoSolv |
| Combustion oven | Legallais | ||
| Pierce BCA protein assay kit | Interchim | UP40840A | |
| Formic acid | Fluka | 94318 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma Aldrich | H1009 | |
| Hydrochloric Acid Fuming 37% Emsure | Merck | 1003171000 | Grade ACS,ISO,Reag. Ph Eur |
| Lithium acetate buffer | Biochrom | 80-2038-10 | |
| Commercial solution of hydrolyzed amino acids | Sigma Aldrich | AAS18 | |
| L-Methionine sulfone | Sigma Aldrich | M0876 | |
| L-Cysteic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 30170 | |
| Pyrex glass culture tubes | Sigma Aldrich | Z653586 | |
| Pyridine | Acros Organics | 131780500 | 99% Extrapure |
| Ethyl chloroformate | Sigma Aldrich | 23131 | |
| Dichloromethane | Sigma Aldrich | 32222 | |
| Vials | Sigma Aldrich | 854165 | |
| Microinserts for 1.5ml vials | Sigma Aldrich | SU860066 | |
| GC/MS | Agilent Technologies | 5890 GC/5973 MS | |
| Chemstation | Agilent Technologies | Instrument control and data analysis software | |
| Methanol | Sigma Aldrich | 34860 | Chromasolv, for HPLC |
| Acetonitrile | Sigma Aldrich | 34998 | ChromasolvPlus, for HPLC |
| N,N-Dimethylformamide dimethyl acetal | Sigma Aldrich | 394963 | |
| BSTFA | Sigma Aldrich | 33024 | |
| DB-17MS column | Agilent Technologies | 122-4731 | 30m*0.25mm*0.15µm |
| Sodium sulfate, anhydrous | Sigma Aldrich | 238597 | |
| Technical nitrogen | Air products | 14629 | |
| Zebron ZB-WAX column | Phenomenex | 7HG-G007-11 | 30m*0.25mm*0.25µm |
| Helium BIP | Air products | 26699 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 612-1702 |
References
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