Summary
Dit protocol is te herstellen en zeldzame doelcellen een mengsel met de doelsoort achtergrond cellen voorbereiden moleculaire genetische karakterisering op het niveau van één cel. DNA kwaliteit is gelijk aan niet-behandelde afzonderlijke cellen en zorgt voor eencellige toepassing (beide screening gebaseerd en gerichte analyse).
Abstract
Zeldzame doelcellen kunnen worden geïsoleerd uit een hoge achtergrond van doelsoort cellen met behulp van antilichamen specifiek voor oppervlakte proteïnen van de doelcellen. Een onlangs ontwikkelde methode maakt gebruik van een medische draad matiemaatschappij met anti-epitheliale cel adhesie molecuul (EpCAM) antilichamen voor in vivo isolatie van circulerende tumor cellen (CTCs)1. Een patiënt-matched cohort in niet-gemetastaseerde prostaatkanker bleek dat de isolatie in vivo techniek in een hoger percentage van de patiënten positief voor CTCs evenals hogere CTC graven ten opzichte van de huidige gouden standaard in CTC-opsomming resulteerde. Als cellen niet kunnen worden teruggevorderd van de huidige medische hulpmiddelen, werd een nieuwe functionalized draad (hierna: apparaat) vervaardigd waardoor vastleggen en latere detachement van cellen door enzymatische behandeling. Cellen kunnen hechten aan het apparaat, gevisualiseerd op een microscoop en vrijstaand met behulp van enzymatische behandeling. Herstelde cellen zijn cytocentrifuged in membraan beklede dia's en afzonderlijk geoogst door middel van laser microdissection of micromanipulation. Eencellige monsters worden vervolgens onderworpen aan het hele genoom eencellige versterking waardoor meerdere stroomafwaartse analyse, met inbegrip van screening en doelgroepen gerichte benaderingen. De procedure voor isolatie en herstel levert hoge kwaliteit DNA van afzonderlijke cellen en latere hele genoom versterking (WGA) niet wordt aangetast. Een eencellige versterkte DNA kan worden doorgestuurd naar screening en/of gerichte analyse zoals matrix vergelijkende genoom hybridisatie (matrix-CGH) of volgorde. Het apparaat kan ex vivo isolatie van kunstmatige zeldzame celsteekproeven (d.w.z. 500 doelcellen spiked in 5 mL van perifeer bloed). Overwegende dat detachement tarieven van cellen zijn aanvaardbaar (50-90%), de opbrengst van vrijstaande cellen in dia's omvat een breed scala afhankelijk van de cellijn gebruikt (< 10 - > 50%) en sommige verdere aandacht nodig heeft. Dit apparaat is niet uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten.
Introduction
Onlangs, CellCollector DC01, een medische draad matiemaatschappij met anti-EpCAM antilichamen voor het isoleren van CTCs uit perifeer bloed van kankerpatiënten, werd toegevoegd aan het methodisch spectrum van CTC (opsomming)1,2,3 . In een momenteel lopend onderzoek in niet-gemetastaseerd prostaatkanker, deze functionalized draad verslagen bijna tweemaal zoveel patiënten CTC-positief en hogere CTC telt in CTC-positieve patiënten in vergelijking met CellSearch, de gouden standaard in CTC opsomming3 . Wegens deze bemoedigende prestatie, isolatie van cellen uit een functionalized medische draad voor eencellige analyse zou wenselijk zijn, maar enzymatische behandeling met cel detachement oplossingen (bijvoorbeeld trypsine) noch laser microdissection kunt het herstel van de onbeschadigde cellen (gegevens niet worden weergegeven).
Zodat het detachement van de opgenomen cellen, was een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden uitgerust met een specifieke polymeer. Dit polymeer, die de antilichamen vastleggen met de draad verbindt, is gevoelig voor een release buffer behandeling waardoor detachement van onbeschadigde cellen (CellCollector DC03 apparaat genoemd). De nieuwe functionalized apparaat, u kunt isolatie van doelcellen van verschillende concentraties van cel kankercellen spiked in bovien serumalbumine (BSA) lijn / fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en perifeer bloed, respectievelijk.
Om te vereenvoudigen de visuele detectie van cellen op het apparaat en na herstel, de kankercellen doel worden geëtiketteerd met carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) en een DNA-vlek vóór de herstellende behandeling (dwz. opladen en loskoppelen). De behandeling van de effecten op DNA kwaliteit van afzonderlijke cellen werden eerder geëvalueerd na WGA door middel van een kwaliteitscontrole PCR4,5, matrix-CGH6,7 en gerichte sequencing7 tonen geen verschil in vergelijking met niet-behandelde cellen micromanipulated van cel schorsingen7. Het voordeel van deze methode ligt in de combinatie van zeldzame doelcel pre verrijking en het herstel van cellen p.a. eencellige stroomafwaarts (Figuur 1). Het huidige CE-geëtiketteerd in vivo collectie apparaat wordt meestal gebruikt voor het opsommen van CTCs in plaats van voor eencellige moleculaire karakterisering2,8. Echter, meer uitgebreide analyse te onderzoeken heterogeniteit onder CTCs lang voor analyse op het niveau van de individuele cel (dat wil zeggen gericht rangschikken op het niveau van eencellige). Andere cel-gebaseerde methoden zijn gebaseerd op isolatie van de immunomagnetic van EpCAM-positieve CTCs en eencellige behandeling op basis van diëlektroforese voor latere moleculaire genetische analyse9,10. Moleculaire karakterisering van CTCs is een belangrijke voorwaarde voor hun nuttige toepassing in een klinische setting, en is net zo belangrijk bij het basisonderzoek van de metastatische cascade. Parallel aan CTCs, is de circulerende tumor DNA (ctDNA) van groot belang geworden aangezien het toestaat DNA-analyse van de last van de tumor met minimale technische isolatie procedures11,12. De cellen gebaseerde benaderingen kunnen dienen als een aanvullende bijdrage omdat het zorgt voor RNA13,14 en eiwitten15 expressie analyse en ook voor de CTC afgeleid cel culturen of xenografts16, 17. Hoewel obstakels zoals lage cel herstel en goedkeuring voor het gebruik bij patiënten nog worden overwonnen moeten, de vangst- en release-methode neemt een belangrijke volgende stap karakterisering van zeldzame doelcellen.
Protocol
Alle procedures zijn goedgekeurd door de ethische commissie van de medische universiteit van Graz (25-240 ex 12/13). Perifeer bloed voor stekelige experimenten werd bemonsterd van gezonde individuen.
Opmerking: Dit protocol beschrijft het isolement van HT-29 cellen (menselijke Colón kanker cellijn) vanaf PBS of kunstmatige mengsels van HT-29 cellen en perifeer bloed. Hetzelfde experiment werd uitgevoerd met twee extra cellijnen (LNCaP en VCaP, experimentele gegevens in vertegenwoordiger resultaten) en theoretisch met alle cellen uiten van EpCAM kan worden uitgevoerd.
1. voorbereiding van de doelcellen
- Celkweek en etikettering van cellen
Opmerking: In dit protocol, cellen worden gekweekt in 75 cm² cultuur kolven. Gelieve de bedragen van de reagentia dienovereenkomstig aanpassen als andere cel cultuur apparaten worden gebruikt (bijvoorbeeld 25 cm² cultuur gerechten, 6-Wells-platen, enz.). Alle vloeistoffen die worden gebruikt zijn vooraf opgewarmd tot 37 ° C in een waterbad. Indien niet anders vermeld, zijn alle protocol stappen uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT).- Cultuur HT-29 cellen in McCoy's 5a bewerkt Medium aangevuld met 2 mM L-glutamine, 20 mM Hepes, 10% foetale runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine bij 37 ° C in een atmosfeer van 5% CO2 .
- Wanneer cellen 90% heuvels, verwijder het medium en spoel de cellen met 10 mL 1 x PBS.
- Het verkrijgen van cellen, voeg toe 2 mL van de mobiele-detachement-oplossing (tabel van materialen en reagentia) aan de cellen en Incubeer de cellen gedurende ongeveer 5 minuten bij 37 ° C.
Opmerking: De detachement oplossing bevat Proteolytische en collagenolytic enzymen in 1 x PBS, 0.5 mM ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) en 3 mg/L fenol rood. De vooraf opwarming van de aarde tijd van de mobiele-detachement oplossing tot een minimum beperkt aangezien dit inactief na 1 uur bij 37 ° C. zijn zal Betrekking hebben op de hele cellaag om het verkrijgen van optimale mobiele-detachement. - Controleer het detachement van cellen met behulp van een omgekeerde Microscoop.
- Alle vrijstaande cellen overbrengen in een tube van 50 mL gevuld met 10 mL van de cel-kweekmedium (hetzelfde als gebruikt in stap 1.1.1.) en resuspendeer de cellen door pipetteren.
- Plaats de resterende celsuspensie op een horizontale roller mixer op RT en overgaan tot de etikettering stap.
- Live cel etikettering van doelcellen
- Verdund 1 µL van 5 mM CFSE (meegeleverd in dimethylsulfoxide, DMSO) in 1 mL 1 x PBS opgewarmd vooraf bij 37 ° C te verkrijgen van de 5 µM kant-en-klare CFSE etikettering oplossing.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat van de kleuring gebruiken vers bereide oplossingen. - Een kant-en-klare DNA kleurstofoplossing (tabel van materialen en reagentia) in 1 x PBS voor te bereiden en op te slaan op 2-6 ° C beschermd tegen licht.
Opmerking: Voor een optimaal resultaat van de kleuring gebruiken vers bereide oplossingen. - Krijgen de cellen van horizontale roller mixer (stap 1.1.6.) en de pellet die de cellen bij 300 x g gedurende 10 min. Verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 10 mL 1 x PBS.
- Spoel de cellen opnieuw met 1 x PBS en resuspendeer de pellet cel in 500 µL kant-en-klare CFSE etikettering oplossing.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 15 minuten en het verzamelen van de cellen na centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 minuten.
- Resuspendeer de gelabelde cellen in 1 mL voorverwarmde cel kweekmedium en laat de cellen om te regenereren bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Oogst van de cellen door centrifugeren bij 300 x g gedurende 3 min en resuspendeer de cel pellets in 1 mL kant-en-klare DNA kleurstofoplossing bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Pellet van de cellen, verwijder het supernatant en resuspendeer de cellen in 4 mL 1 x PBS. Beoordelen van de celdichtheid met behulp van een hemocytometer en sortie voor fluorescentie etikettering met behulp van een fluorescentie Microscoop met 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) en fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC) filters (figuur 2A en 2E uitgerust).
- Centrifugeer de cellen bij 300 x g gedurende 3 min en resuspendeer de pellet cel volgens de dichtheden van de cel die nodig zijn voor de respectieve experiment als bepaald in de volgende sectie en de plaats op het ijs.
- Verdund 1 µL van 5 mM CFSE (meegeleverd in dimethylsulfoxide, DMSO) in 1 mL 1 x PBS opgewarmd vooraf bij 37 ° C te verkrijgen van de 5 µM kant-en-klare CFSE etikettering oplossing.
2. het opladen van de draad
Opmerking: De cellen kunnen worden geïsoleerd van target cel/perifere bloed spikings duurzaame milliliter of doordat het lage aantal cellen op de schaal van een microliter. Overwegende dat de voormalige aanpak maakt het mogelijk voor het nabootsen van zeldzame-cel voorwaarde in perifeer bloed, de laatste mogelijk de aangewezen manier om te hechten weinig cellen met het oog op het protocol optimalisatie/testen.
- Opladen van de draad met behulp van een grote hoeveelheid cel schorsingen
- Bereid een 2% BSA oplossing worden geblokkeerd door ontbinding 0.8 g van BSA in 40 mL 1 x PBS (gebruik van de cultuur van de cel). Ontbinden BSA door de aanvankelijke vortexing en latere incubatie bij RT op een horizontale roller mixer voor 10-20 min.
- Spoelen leeg EDTA buizen/Natrium heparine buizen met 2 mL 2% BSA verwijderen anticoagulatie residuen en negeren de oplossing. Blokkeren van het oppervlak van de buis door incubatie bij RT met 5 mL van 2% BSA op een horizontale roller mixer bij 15 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten en gooi de oplossing.
- Verdun gelabelde cellen (sectie 1.2.) met een dichtheid van 100 000 cellen/mL en 5 mL in rekening te brengen van de draad te gebruiken.
- Voeg 5 mL van de gelabelde celsuspensie (500 000 cellen in totaal) aan de buis. Vermijd bubbels bij het toevoegen van de celsuspensie.
- Verwijder de draad van het opbergvak, alsmede de rubberen dop die de draad houden en spoel het in 1 x PBS (Figuur 3).
- Doordringen de rubberen buis dop van de EDTA-buis (stap 2.1.4.) met behulp van een naald van de spuit (20G) en steek de draad zodat het functionele deel is volledig ondergedompeld in de celsuspensie wanneer het GLB terug op de buis en de buis op de mixer gekanteld roller geplaatst is.
Opmerking: De triple-helix functionele deel van de draad moet worden bedekt met celsuspensie gedurende het in rekening brengen. - Draai de buizen op een gekantelde roller mixer bij 5 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten om de cellen te hechten aan de draad.
- Spoel de draad met 5 mL 1 x PBS en op te slaan in het donker bij 2-6 ° C in een tube van 15 mL 1 x PBS met tot visueel onderzoek.
Opmerking: Het functionele deel van de draad moet altijd worden ondergedompeld in PBS om te voorkomen dat nadelige gevolgen voor de cellen.
- Isoleren van doelcellen van kunstmatige mengsels met perifeer bloed (alternatieve methode om te opladen: 2.1. Opladen van de draad met behulp van een groot volume van cel suspensies)
- Verdun gelabelde cellen (sectie 1.2.) voor de cel suspensies met hoge celdichtheid (> 1 000 000 cellen/mL), waardoor het laag houden van de omvang van de celsuspensie toegevoegd aan het perifere bloed.
- 500 à 500.000 cellen toevoegen aan 5 mL van perifeer bloed en meng ze door het omkeren van de buis.
- Verwijder de draad van het opbergvak, verwijder de rubber dop die de draad houden en spoel het in 1 x PBS.
- Een nieuwe dop van de tube met de niet-functionele onderdeel van het apparaat met behulp van een spuit-naald (20G) zodanig dat het functionele deel is volledig ondergedompeld in het puntige bloed wanneer het GLB terug op de buis en de buis op de mixer gekanteld roller geplaatst is doordringen.
Opmerking: De triple-helix functionele deel van de draad moet worden bedekt met celsuspensie gedurende het in rekening brengen. - Incubeer de buis op de mixer van de gekantelde roller bij 5 omwentelingen per minuut gedurende 30 minuten op RT.
- Spoel de draad 3 keer in 1 x PBS en sla het op in het donker in een tube van 15 mL 1 x PBS met tot visueel onderzoek.
Opmerking: Het functionele deel van de draad moet altijd worden ondergedompeld om te voorkomen dat nadelige gevolgen voor de cellen.
- Opladen van de draad van laag-volume cel schorsingen (alternatieve methode om te opladen: 2.1. Opladen van de draad met behulp van een groot volume van cel suspensies)
- Resuspendeer de gelabelde cellen bij 1 000 000 cellen/mL in 1 x PBS.
- Fix een 150 mm wegwerp glazen pipet van Pasteur horizontaal op een rek.
- Verwijderen van de draad van het opbergvak, maar houden de gele rubberen dop die de draad houden.
- Plaats de draad in de pipet zodanig zijn dat het functionalized deel ligt in het puntje van de Pipet van Pasteur niet aanraken van het glas.
Opmerking: Het uiteinde van de draad moet niet vasthouden uit het Pasteur pipette uiteinde. Vermijd het achterste uiteinde van het Pasteur pipette uiteinde aansluiten met de rubberen dop die de draad houden. Als strak aangesloten, kunnen niet schorsingen van de cel worden geladen vanaf de andere kant in het uiteinde van de pipet. - Laad 15 µL van de celsuspensie in het uiteinde van de Pipet van Pasteur die betrekking hebben op het functionalized deel van de draad.
- Incubeer de draad voor 10 min. handmatig kwartslag de geassembleerde draad/Pasteur Pipetteer tip elke minuut.
- Verwijderen van de draad van het uiteinde van de pipet Pasteur, spoel het in 5 mL 1 x PBS en sla het in het donker bij 2-6 ° C in een tube van 15 mL 1 x PBS met tot visueel onderzoek.
Opmerking: Het functionele deel moet altijd worden ondergedompeld in 1 x PBS om te voorkomen dat nadelige gevolgen voor de cellen.
3. tellen cellen op de draad
Opmerking: Houd altijd het functionele deel van de draad ondergedompeld in 1 x PBS om te voorkomen dat nadelige gevolgen voor de cellen.
- Gebruik een pen vet aan de oppervlakte van een rechthoek tekenen op een glasplaatje en voeg 500 µL van 1 x PBS.
- Buig het niet-functionele deel van de draad en plaats deze op het glasplaatje zodanig dat het functionele deel is ondergedompeld in 1 x PBS.
Opmerking: Past de oppervlakte van de rechthoek en het volume van 1 x PBS volledig voor het functionele deel van de draad. Gebruik een dubbele kleefband voor montage van het niet-functionele deel van de draad op de dia. - Inspecteer visueel of beide zijden van de draad bij het inventariseren van de opgenomen cellen (figuur 2B en 2F).
Opmerking: De aanwezigheid van cellen wordt bepaald met behulp van een fluorescentie Microscoop uitgerust met filters voor DAPI en FITC. Beide zijden van de draad kunnen worden gecontroleerd en het aantal cellen beoordeeld (voor hoge cel nummers) of geteld (alleen haalbaar als lage aantallen cellen zijn gekoppeld aan de draad). Deze stap kan worden overgeslagen als opsomming van cellen niet nodig is. - Na het scannen, plaatst u de draad terug in de tube van 15 mL met de 1 x PBS (zienoot van 2.3.6. en punt 3.), slaan de draad in donker.
Opmerking: De meeste van de niet-functionele deel van de draad kan knippen (met inbegrip van de bocht) en versoepeling opslag verwijderd.
4. detachement en herstel van doelcellen
Opmerking: Detachement van de cellen geschiedt binnen 4 uur na isolatie.
- Los van de release buffer component (tabel van materialen en reagentia) 4 mg per mL 1 x PBS en filtreer de oplossing door een 0,2 µm steriele filter te verkrijgen van de kant-en-klare buffer.
Opmerking: Het polymeer van de draad is samengesteld uit een hydrogel die is matiemaatschappij met anti-EpCAM antilichamen binden aan EpCAM-presenteren doelcellen waardoor. De release buffer bevat een koolstof-zuurstof Proteolytische enzymen staat het splijten van de hydrogel. Proteolytische decollete resulteert in de afbraak van het polymeer, en dus, detachement van vastgelegde cellen. - Vooraf warm de release buffer bij 37 ° C gedurende 5 minuten.
- Voeg 1.6 mL release buffer te vullen een 1,5 mL reactiebuis.
Nota: Buizen ontworpen voor 1,5 mL reactie volumes toestaan toepassing van 1,6 mL die nodig is voor het inlaten van het functionele deel van de draad. - Incubeer het functionele deel van de draad in de release-buffer bij 37 ° C (waterbad) voor 20 min. de rubberen dop verzonden met de draad in plaats van de dop van de tube gebruiken om te herstellen van de draad in de buis 1,5 mL om te voorkomen dat besmetting tijdens de incubatie in het waterbad.
- De draad/binnenband overbrengen in een shaker op RT en 500 rpm gedurende 15 minuten.
Opmerking: De shaker heeft een baan van 1,5 mm. - Plaats de draad/binnenband in een centrifuge en draai het bij 300 x g gedurende 10 minuten.
- De draad van de tube verwijderen, sluit u het GLB en centrifugeer de buis opnieuw bij 300 x g gedurende 10 minuten.
Opmerking: De draad kan worden opgeslagen in 1 x PBS op 2-6 ° C in het donker voor het tellen van de cel om te beoordelen detachement efficiëntie/check voor cellen nog op de draad. - Ter vermindering van het volume van de celsuspensie, nagenoeg 100 µL (micromanipulation) of alternatief 300 µL (cytocentrifugation en latere laser microdissection) van de bovendrijvende vloeistof verwijderen en onmiddellijk overgaan tot eencellige bemonstering.
5. eencellige bemonstering
- Micromanipulation
Opmerking: Afzonderlijke cellen zal worden toegevoegd aan 2 µL van cellysis master mix waardoor WGA. Master mix volgens het aantal cellen die moeten worden verwerkt, berekenen van extra volumes voor verlies als gevolg van pipetteren en plaats cellysis meester mix op ijs bereiden.- De cellysis master mix (onderdelen van de uitrusting van de WGA, tabel van materialen en reagentia) volgens het protocol beschreven door Czyż et al.18voor te bereiden. Kort, Meng 2.0 µL van reactie buffer, 1.3 µL van octylphenoxypolyethoxyethanol (10%-oplossing), 1.3 µL van 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol (10%-oplossing), 2.6 µL van een proteïnase K-oplossing, en 12,8 µL RNase/DNase-gratis water voor een Master mix voor 10 monsters (totale volume 20 µL).
Opmerking: Voor meer voorbeelden, verhogen de volumes dienovereenkomstig. De samenstelling van de cellysis master mix verschilt van de in de alternatieve procedure met behulp van laser microdissection monsters (zie 5.2.) gebruikt. - Een vet-pen gebruiken om een bedrijf van de celsuspensie in de plaats gebied te tekenen. Oppervlakte en volume aanpassen als de celdichtheid te hoog is (dwz. mark een groter gebied op het glasplaatje, 1 x PBS en een aliquoot gedeelte van de celsuspensie laden).
- Pipetteer de hele gebeitst celsuspensie (verkregen in stap 4.8.) op het glasplaatje.
- Het glasplaatje overbrengen in een microscoop voorzien van een micromanipulator. Laat de cellen regelen voor 5 min (figuur 2D en 2 H).
- Bereiden van 0,2 mL PCR buizen geladen met 2.0 µL van meester lysis van de cel mix (zie stap 5.1.1.) en slaat u deze op het ijs.
- Enkele cellen in 1 µL van 1 x PBS met behulp van de micromanipulator verzamelen en overdragen van de cellen in een buis met cellysis master mix.
Opmerking: Voor de overdracht van micromanipulated cellen in de lysis van de cel buffer het capillair direct in de 2 µL van lysis van de oplossing te plaatsen en uitwerpen totdat bubbels kunnen worden gezien. - Kort spin down het monster bij 2000 x g voor 3 s met behulp van een desktop microfuge te verzamelen van alle vloeistof bij de onderkant van de buis. Leg de monsters op ijs.
- Direct overgaan tot de eencellige WGA (zie sectie 6. en Czyż et al. 19).
- De cellysis master mix (onderdelen van de uitrusting van de WGA, tabel van materialen en reagentia) volgens het protocol beschreven door Czyż et al.18voor te bereiden. Kort, Meng 2.0 µL van reactie buffer, 1.3 µL van octylphenoxypolyethoxyethanol (10%-oplossing), 1.3 µL van 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol (10%-oplossing), 2.6 µL van een proteïnase K-oplossing, en 12,8 µL RNase/DNase-gratis water voor een Master mix voor 10 monsters (totale volume 20 µL).
- Laser microdissection (alternatieve eencellige bemonsteringsmethode aan: 5.1. Micromanipulation)
Opmerking: De samenstelling van de master mix gebruikt in deze sectie verschilt van de in punt 5.1 gebruikt voor micromanipulation. Afzonderlijke cellen zal worden toegevoegd aan 4.5 µL van cellysis master mix (onderdelen van de uitrusting van de WGA, tabel van materialen en reagentia) voor WGA.- De cellysis master mix volgens Czyż et al. bereiden 19 door het mengen van 5.0 µL van reactie buffer, 1.3 µL van octylphenoxypolyethoxyethanol (10%-oplossing), 1.3 µL van 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol (10%-oplossing), resp., 2.6 µL van een proteïnase K-oplossing en 34.8 µL van RNase / DNase-gratis water te verkrijgen van een master mix voor 10 monsters (totale volume 45 µL). Plaats de meester mix op ijs.
Opmerking: Voor meer voorbeelden, verhogen de volumes dienovereenkomstig. - UV-traktatie membraan beklede dia's geschikt voor laser microdissection. Daarom, plaatst u de dia's in een DNA cross linker apparaat en blootstellen aan hoogste UV gedurende ongeveer 10 minuten.
- Monteer de membraan beklede dia in een cytocentrifuge en cytospin de hele celsuspensie bij 300 x g gedurende 5 min.
Opmerking: Wanneer u een in-liquid-systeem, waar de cellen zijn cytocentrifuged op de dia die in oplossing, verwijderen van het supernatans dat na cytocentrifugation en toepassing van een droge-spin bij 1140 x g gedurende 1 minuut. - Direct overgaan tot de laser microdissection of laat de cytospins's nachts drogen en bevriezen van de monsters bij-20 ° C voor lange termijn opslag.
- Pipetteer 4.5 µL van cellysis master mix in de dop van een tube van 0,2 mL PCR en oogsten van afzonderlijke cellen door middel van laser microdissection.
- De PCR-buis ophalen met de laser microdissection Microscoop en sluit de tube. Verzamel alle vloeistof bij de onderkant van de buis door korte-spin en leg het monster op het ijs.
- Doorgaan met eencellige WGA of op te slaan van de geïsoleerde monsters bij-80 ° C voor maximaal 1 maand voor verdere verwerking.
- De cellysis master mix volgens Czyż et al. bereiden 19 door het mengen van 5.0 µL van reactie buffer, 1.3 µL van octylphenoxypolyethoxyethanol (10%-oplossing), 1.3 µL van 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl) fenyl-polyethyleenglycol (10%-oplossing), resp., 2.6 µL van een proteïnase K-oplossing en 34.8 µL van RNase / DNase-gratis water te verkrijgen van een master mix voor 10 monsters (totale volume 45 µL). Plaats de meester mix op ijs.
6. adapter-linker gebaseerd hele genoom amplificatie 18,19
Opmerking: Zorg ervoor dat alle nodige master mixen (onderdelen van de uitrusting van de WGA, tabel van materialen en reagentia) worden voorbereid en opgeslagen op het ijs klaar voor gebruik. Master mixen omvat de DNA spijsvertering mix 1 voor micromanipulated (zie 5.1.) monsters (met 2.0 µL van reactie buffer, 2.0 µL van Mseik restrictie-enzym en 16,0 µL van RNase/DNase-gratis water) of DNA spijsvertering Meng 2 voor laser microdissection (zie 5.2.) monsters (met 2,5 µL van Mseik restrictie-enzym en 2.5 µL van RNase/DNase-gratis water), vooraf onthardende master mix (met 5.0 µL van reactie buffer, 5.0 µL van elk van de preannealing PCR-adapters en 15,0 µL van RNase/DNase-gratis water), afbinding Master mix (met 30.0 µL van vooraf ontharde PCR adapters, 10.0 µL adenosinetrifosfaat oplossing en 10.0 µL T4 ligase oplossing) en primaire PCR master mix (met 30.0 µL van een PCR-buffer, 20,0 µL van 10 mM deoxynucleotide mix oplossing, 10.0 µL van een polymerase mix en 340.0 µL van RNase/DNase-gratis water). Alle volumes worden gegeven voor de voorbereiding van 10 monsters. Dienovereenkomstig aan te passen aan het aantal monsters.
- Voor lysis van de cel, plaatst u de micromanipulated/laser microdissection monsters in een thermische cycler en uitvoeren eencellige lysis van de cel bij 42 ° C voor 45 min, 65 ° C gedurende 30 minuten en 80 ° C gedurende 10 minuten aan het broeden.
Opmerking: Gebruik een thermische cycler met een verwarmde deksel. Lysis van de cel kan O/N gebeuren gedurende 10 tot 15 uur. In dat geval het weglaten van de incubatie stap bij 65 ° C. - Vooraf onthardende van de PCR-adapters worden uitgevoerd. Daarom, Incubeer de vooraf onthardende master mix in een thermische cycler bij 65 ° C gedurende 1 min gevolgd door verdere 49 cycli, 1 minuten elk, met de temperatuur geleidelijk te verlagen met 1 ° C/cyclus. Na 50 cycli (bij 15 ° C), de master mix bij 15 ° C te incuberen tot verder gebruik.
Opmerking: Deze stap is noodzakelijk voor het genereren van asymmetrische adapters geschikt voor afbinding (zie stap 6.6.) met eencellige DNA onderworpen aan Mseik beperking digest. - Na de lysis van de cel, spin down de lysed monsters bij 2000 x g gedurende 3 s tot alle vloeistof op de bodem verzamelen en plaats deze op het ijs.
- Om het fragment van DNA, 2 µL van de DNA spijsvertering mix 1 toevoegen aan elke steekproef lysed micromanipulated of 0,5 µL van de spijsvertering van DNA mix van 2 tot en met de laser microdissection monster en uitvoeren van beperking digest. Gebruik een thermische cycler met een verwarmde deksel bij 37 ° C gedurende 5 minuten, gevolgd door een restrictie-enzym inactivatie stap bij 65 ° C gedurende 5 min.
Opmerking: Spijsvertering bij 37 ° C kan worden verlengd tot 3h. Dit is het enige protocol stap verschillen tussen monsters afkomstig van micromanipulation en monsters laser microdissection verkregen. - Spin down de monsters te verzamelen van alle vloeistof op de bodem en plaats deze op het ijs.
- Voor ligating beperking verteerd DNA en vooraf ontharde adapters, voeg 5.0 µL van de afbinding meester Meng aan elk verteerd DNA-monster en het afbinden in een thermische cycler bij 15 ° C gedurende 1 uur.
Opmerking: Deze stap kan worden verlengd tot 12 h of uitgevoerd O/N. - Spin down de monsters te verzamelen van alle vloeistof op de bodem en plaats deze op het ijs.
- Voor WGA 40.0 µL van primaire PCR master mix toevoegen aan elk van de afbinding producten en WGA voert in een thermische cycler met een verwarmde deksel als volgt: eerste, Incubeer de monsters bij 68 ° C gedurende 3 minuten. Ten tweede cyclus voor 15 keer bij 94 ° C gedurende 40 s, 57 ° C gedurende 30 s en 68 ° C gedurende 1 min 30 s + 1 s/cyclus. Voeg vervolgens 9 cycli bij 94 ° C gedurende 40 s, 57 ° C + 1 ° C/cyclus voor 30 s, 68 ° C gedurende 1 min 45 s + 1 s/cyclus. Daarna cyclus voor 23 keer bij 94 ° C gedurende 40 s, 65 ° C gedurende 30 s, 68 ° C gedurende 1 min 53 s + 1 s/cyclus. Tot slot voeren een definitieve verlenging bij 68 ° C voor 3 min 40 s en chill de monsters tot 4 ° C.
- Spin down de monsters te verzamelen van alle vloeistof op de bodem en controleren de kwaliteit van DNA of opslaan van de monsters bij-20 ° C of -80 ° C voor langdurige opslag.
7. kwaliteitscontrole van WGA producten
Opmerking: Controleer de kwaliteit van de WGA-producten op basis van het bereik van de DNA-uitstrijkjes en het aantal versterking producten na het uitvoeren van een 4plex QC-PCR 5. WGA aliquots en respectieve QC-PCR monsters uitvoeren op een 1,0% agarose gel voor evaluatie.
- Bereiden van 100 µM stamoplossingen van alle inleidingen gebruikt voor de controle van de kwaliteit van de 4plex PCR (tabel 1). 8 µL van elke primer aan 136.0 µL van het PCR-grade water voor het genereren van 200 µL van primer zwembad toevoegen. Vortex de oplossing voor 3 s, draai het naar beneden bij 2000 x g gedurende 3 s en aliquot 20 µL voor opslag bij-20 ° C.
- Gebruik standaard PCR uitrustingen te bereiden een multiplex PCR meester meng met 6.0 µL van 2 x PCR onderdelen (met uitzondering van inleidingen), 4.5 µL van het PCR-grade water en 0,5 µL van het zwembad van de primer.
- Voeg 1,0 µL van de WGA-producten, draai het naar beneden en stormloop PCR bij 94 ° C gedurende 2 minuten gevolgd door 35 cycli van denaturatie bij 94 ° C voor 1 min, primer gloeien op 56 ° C gedurende 1 minuut en primer uitbreiding bij 72 ° C gedurende 1 min 30 s en een definitieve verlenging stap bij 72 ° C gedurende 7 minuten koelen tot 4 ° C, draai het neer en plaats de monsters op ijs gel p.a. dezelfde dag of bij-20 ° C voor een latere anayse.
Opmerking: Koelen in de thermische cycler kan worden uitgevoerd bij 12 ° C tot het verhogen van levensduur van Peltier elementen. - WGA (verkregen uit 6.8.) en respectieve 4plex QC-PCR producten op een agarose gel5analyseren.
Representative Results
Cellen na CFSE en stikstofbase kleuring kunnen worden geëvalueerd met behulp van een Microscoop van de immunofluorescentie uitgerust met filters voor DAPI en FITC. Kernen presenteren met een heldere counterstain in de DAPI kanaal terwijl het cytoplasma van de cellen Toon uniforme etikettering met CFSE met heterogene Inter cel intensiteit (figuur 2A en 2E). Soortgelijke vorm en kleuring intensiteiten zijn van cellen die zijn gekoppeld aan de draad (figuur 2B en 2F) verwacht evenals losgekoppeld van de draad en hersteld op een dia (figuur 2D en 2 H).
Hoge cel dichtheden (b.v. > 1 000 000 cellen/mL) kan leiden tot totale dekking van de draad met cellen tijdens het opladen van de draden. Echter lager cel dichtheden, veranderingen in de rotatiesnelheid tijdens de incubatie en het gebruik van verschillende cellijnen invloed op de efficiëntie van isolatie en moeten afzonderlijk worden getest. Wanneer de draden werden geïncubeerd met 5 mL van de HT-29 cellen bij 100 000 cellen / mL als beschreven in punt 2.1., een gemiddelde van 254 ± 103 cellen (n = 5) werden vastgelegd op de draden. Experimenteren met de zelfde LNCaP cuvetten, een gemiddelde van 440 ± 319 cellen (n = 5) per draad was verkregen.
Presentatie van de cellen in de 500, 5 000 en 50 000 de HT-29 op een achtergrond van 5 mL van perifeer bloed aan draden (volgens protocol punt 2.2.) resulteerde in de verovering van 75 ± 18 cellen, 25 ± 9 cellen en 47 ± 57 cellen (n = 3, elk), respectievelijk. Als de draad is belast met 15 µL celsuspensie (1 000 000 cellen/mL) volgens het protocol in punt 2.3., maximaal 1 000 personen (HT-29) cellen kunnen hechten aan een draad.
Cel detachement efficiëntie varieerden van 81% in HT-29 cellen (variëren 54,9% - 93,2%, en n = 5) naar 81% (variëren van 63.51-92.87%, n = 6) en 91% (assortiment 84,7% - 95,3%, n = 6) in LNCaP en VCaP cellen, respectievelijk. Ook het herstel van vrijstaande cellen verschilt tussen cellijnen: een gemiddelde van 28% van de vrijstaande HT-29 cellen werden teruggevonden door cytocentrifugation. Overwegende dat de opbrengst voor LNCaP lager dan 10% was, was de gemiddelde terugvinding voor VCaP cellen 55%.
Ongeveer 75% van de afzonderlijke cellen onderworpen aan producten van de WGA van hoge kwaliteit van de opbrengst van WGA: dit is 1) uitstrijkje van WGA producten variërend van 0.1 tot > 1 kb (Figuur 4, bovenste paneel) en 2) drie of vier bands in de 4plex-kwaliteit controle PCR (Figuur 4, onderste paneel) . WGA producten gebruikt kunnen worden voor 1) matrix-CGH profilering voldoen aan de kwaliteitscriteria voor 6,7 van de profielen van de eencellige matrix-CGH en 2) gerichte NGS na opnieuw versterking WGA 7.
Figuur 1: Workflow bij het opsporen en herstellen van doelcellen eencellige p.a.. (A) cellen worden gekweekt tot 90% confluentie en (B) geoogst om te verkrijgen van een eencellige schorsing. Na kleuring met CFSE en een stikstofbase vlek, (C) de functionalized draad is geïncubeerd in aanwezigheid van de cellen in een volume van 5 mL met behulp van reactie buizen of in een laag volume met behulp van een Pasteur pipette uiteinde. Deze laatste voorziet in toepassing van cel schorsing volumes zo laag als 15 µL. (D) cellen moeten worden losgemaakt binnen 4 uur na het opladen. Dus de draad in een 1,5 mL reactiebuis gevuld met release buffer geplaatst. Na 15 minuten incubatie op een rocker en 10 min centrifugeren, de draad wordt verwijderd en de celsuspensie gecentrifugeerd om de pellet van de cellen. (E) hersteld cellen zijn ofwel overgebracht naar een glasplaatje voor eencellige micromanipulation (boven) of cytocentrifuged op een membraan beklede dia en doorgestuurd om laser microdissection (onder). (F) ten slotte geoogste afzonderlijke cellen worden versterkt door middel van versterking van de hele genoom (WGA). WGA producten zijn compatibel met matrix-CGH en gerichte NGS downstream analyse. EpCAM epitoop: groene cirkel op het celoppervlak. Matiemaatschappij draad: apparaat, grijze triple-helix draden. Polymer: paarse lijnen. Anti-EpCAM antilichamen: oranje. Vrijgeven van buffer activiteit: rode pijl. Vet marker aan celsuspensie op zijn plaats houden: donker blauwe ellips. Celsuspensie hersteld: lichtblauw. Capillaire voor micromanipulation: zwarte lijn. Vergroting: herstelde cel geoogst door micromanipulation, cytospin op het membraan bedekte Schuif met herstelde cellen (grijs opgevulde ovaal). Vergroting: herstelde cel wordt laser microdissected (grijs cirkelvormige lijn: membraan van membraan dia serveren als backbone voor laser microdissection), objectieve met laserstraal (blauwe lijn naderen de membraan dia uit de onderstaande lijst). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: visualiseren van gelabelde cellen. (A, E) Cellen voordat het opladen: cellen zijn voorzien van CFSE en counterstained met een DNA intercalating kleurstof toont de signaalsterkte van een bereik van CFSE (groen). (B,F) Gelabelde cellen gevangen op de draad. (C,G) Draad na mobiele-detachement procedure. (D,H) Cellen los van draad en door de cytocentrifugation op een dia hersteld. CFSE: FITC kanaal (groen). DNA vlek: DAPI kanaal (blauw). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: draad en opslag compartiment. (A) compartimenten van de draad. (B) Detail van het functionalized deel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: kwaliteitscontrole van WGA producten verkregen uit één micromanipulated cellen. BOVENPANEEL: WGA producten verkregen uit afzonderlijke cellen meestal resultaat in DNA uitstrijkjes variërend van 0.2 kb tot > 1.0 kb met een intensiteit van de piek bij ongeveer 0,5 kb. Monsters nummer 1, 7 en 13 (aangegeven met een sterretje) Toon suboptimaal of geen DNA uitstrijkjes. Onderste paneel: WGA producten van voldoende kwaliteit zijn als de 4plex PCR resulteert in drie of vier van vier PCR producten (op 100, 200, 300 en 400 bp). Monsters 1, 7, 10 en 13 Toon minder dan drie bands en zouden worden uitgesloten van verdere analyse. Lane M bevat een 100 bp ladder en sterretjes geven de monsters van onvoldoende kwaliteit van de producten van de WGA. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Primer volgorde | OPMERKING |
| 5 '-gtt cca ata tga ttc cac cc-3 ' | 100 bp voorwaartse primer |
| 5 '-ctc ctg gaa gat ggt gat gg-3 ' | 100 bp omgekeerde primer |
| 5 '-agg tgg agc gag gct agc-3 ' | 200 bp voorwaartse primer |
| 5 '-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3 ' | 200 bp omgekeerde primer |
| 5 '-agg tga gac att ctt gct gg-3 ' | 300 bp voorwaartse primer |
| 5 '-tcc wet aac cag tca gcg tc-3 ' | 300 bp omgekeerde primer |
| 5 '-aca gtc kat gcc atc handelen gc-3 ' | 400 bp voorwaartse primer |
| 5 '-gct tga caa agt ggt cgt GS-3 ' | 400 bp omgekeerde primer |
Tabel 1: Primer sequenties voor de controle van de kwaliteit van de 4plex PCR
Discussion
Het beschreven protocol is gericht op het ophalen van cellen uit een functionalized draad (hierna: apparaat) p.a. ex vivo eencellige genomic. We testten drie cellijnen van de EpCAM-positieve (HT-29, LNCaP en VCaP), maar in principe, deze methode kan worden toegepast op elke regel van de cel uiting van EpCAM. EpCAM-positieve doelcellen kunnen worden voorgelegd aan het apparaat als pure celsuspensie (zie 2.1.) of gemengd in een overschot van achtergrond cellen (bv. perifere bloed, zie punt 2.2.). Overwegende dat vooral de laatste kunnen worden gebruikt voor het testen van isolatie capaciteiten onder zeldzame cel voorwaarden, fine tuning van het aantal cellen die zijn gekoppeld aan de draad kan gebeuren met behulp van de beschreven kleinschalige aanpak (zie 2.3.). Zoals verschillen tussen cellijnen zijn te verwachten, snelheid geschikt cel dichtheden voor het opladen van de draad, rotatie evenals incubatietijd moeten empirisch getest worden door het aantal gekoppelde cellen met behulp van een Microscoop immunofluorescentie te evalueren.
Voor genomic downstream toepassingen op het niveau van de eencellige WGA, is vereist. De WGA-methode van keuze kan verschillen tussen labs en onze methode is in principe open voor alle methoden dan monsters van micromanipulation of laser microdissection kan verwerken. In dit protocol gebruiken we een methode op basis van enzymatisch gefragmenteerde DNA als gevolg van een betere prestaties ten opzichte van een warmte-fragmentatie gebaseerd WGA7. Optionele, interne cellen kunnen worden doorgestuurd naar isothermische WGA waardoor latere DNA profielen van20,21.
Het beschreven protocol beoogt intact cellen te kunnen herstellen na zijn vastgemaakt aan een nieuwe generatie van matiemaatschappij draden voor genomic eencellige analyse. De eerste generatie van matiemaatschappij draden, die ook de afdrukapparaten alleen CE-gekeurd in vivo verrijking op de markt tot nu toe, werden gebruikt voor het opsommen van CTCs in patiënten met kanker uitgezaaid. Eerdere publicaties en onze eigen gegevens suggereren de in vivo isolatie techniek om gevoeliger zijn in vergelijking met de huidige goudstandaard technologie2. Dus, om deze in vivo isolatie techniek met een herstelfunctie uit te rusten, zoals gerealiseerd in het apparaat kunt combineren hoge CTC herstel met de karakterisering van het niveau van de eencellige.
Echter, het apparaat niet is uitgeschakeld voor het gebruik bij patiënten, dus geen klinische gegevens beschikbaar zijn. Ex vivo toepassingen (dwz isoleren CTCs uit perifeer bloed na bemonstering) zijn niet aanbevolen omdat de technologie aangepast aan de instellingen aanwezig zijn in de kubusvormige ijdel, bijvoorbeeld lage diameter is van de ijdele (verhogen de kans op direct contact tussen CTCs en antilichamen) en lange retentietijd (30 min, waardoor 2-3 L van bloed geschiedde de draad). Echter, als omschreven in punt 2.2. doelcellen kunnen ook worden geïsoleerd van gemengde monsters7.
Een huidige beperking van de methode is het inefficiënte herstel van losse cellen na detachement van de draden. Dit, echter kan worden verbeterd door een cel fixatie stap voorafgaand aan de behandeling van het detachement.
Kortom is dit protocol een eerste stap naar het gecombineerd gebruik van een in vivo isolatie techniek met terugwinning van de cel voor genetisch karakteriseren van afzonderlijke cellen. Verdere inspanningen moeten aanpakken van de optimalisering van de cel herstel en goedkeuring voor de toepassing ervan in patiënten1,2. Gepersonaliseerde geneeskunde voor monitoring en therapie behandelingsbeslissingen is echter buiten opsomming van CTCs. Deze methode is dus een eerste stap in de richting genomische karakterisering van de CTC op het niveau van één cel.
Toepassingen naar eencellige transcriptome analyse lijken haalbaar als intact cellen worden geoogst. Het blijft echter om te worden beoordeeld of de herstellende procedure heeft een impact op RNA integriteit (bijvoorbeeld doorsturen herstelde afzonderlijke cellen aan directe lysis gevolgd door RT-qPCR22). Als dat lukt, kan karakterisering van afzonderlijke cellen (bijvoorbeeld CTCs) worden verschoven naar het transcriptoom niveau, waardoor meer gedetailleerde analyses. In dit verband, RNA-seq met behulp van Smart-seq2 biedt een waardevol instrument voor RNA downstream analyse van enige cellen preamplified cDNA (verkregen tijdens RNA-seq bibliotheek voorbereiding) kan worden onderworpen aan kwantitatieve PCR. Hierdoor kan een gecombineerde doel en screening gebaseerde analyse van enkele van de teruggekregen cellen22,23.
De huidige functionalized draden zijn gebaseerd op de antilichamen van de anti-EpCAM die is een veel gebruikte epitheliale marker voor positieve selectie van CTCs24. Als verschillende CTCs downregulate epitheliale markeringen zoals Cytokeratines of EpCAM25 kunnen, zou toevoegen van antistoffen zoals HER2/nieuwe de kans verhogen van CTC isolatie. Verschillende antilichaam gebaseerd verrijking strategieën hebben ontwikkeld en herzien door Ferreira et al. in 201626. Een mengsel van antilichamen geïmmobiliseerd op een draad zou een toekomstige verbetering van de technologie die leidt tot de isolatie van een hoger nummer en extra subtypes CTCs.
Het is verplicht voor alle maatregelen waarbij draad omgaan om te houden van het functionele deel van de draad ondergedompeld in oplossing teneinde de functionaliteit. Het is raadzaam om de draad in 1 x PBS tijdens de beoordeling (Microscoop; bv. 3.1 stappen. -3.3.) en opslag. Om te voorkomen dat ongepaste kleuring, is het raadzaam de kleurstofoplossing in stappen 1.2.1 gebruik vers worden bereid. en 1.2.2. Zwak gekleurde cellen belemmeren cel tellen op de draad en kunnen leiden tot de onderschatting van de gekoppelde cellen.
Het is noodzakelijk om te voorkomen dat het inpluggen van de Pipet van Pasteur met de rubberen dop bij invoegen van de draad in de Pipet van Pasteur voor latere laden van de celsuspensie (stap 2.3.4.). De rubberen dop wordt gebruikt om de draad op zijn plaats te houden, zodat het functionele deel binnen het uiteinde van de Pipet van Pasteur ligt. Als het GLB te stevig wordt vastgemaakt aan de achterkant van de Pipet van Pasteur, is laden van de celsuspensie niet mogelijk. In dit geval het GLB te verlichten zodanig zijn dat de lucht die wordt verplaatst door de geladen celsuspensie de pipet laten kunt.
Buigen van de draad is van cruciaal belang voor zijn oriëntatie tijdens de cel tellen in stappen 3.2. en 3.3. Koppel de draden met behulp van het plakband, zodat de niet-functionele uiteinde van de draad komt te liggen aan de ene kant. Na het scannen van de hele lengte van het functionele deel, is de draad 180° gerold zodat de andere helft van de functionele draad kan worden gescand. Deze stap is belangrijk voor de eerste experimenten ter beoordeling van het aantal cellen op de draad. Zodra het aantal cellen voor een bepaalde cellijn en de procedure wordt geëvalueerd, de procedure kan worden herhaald zonder het tellen van de cel (bv. alleen controleren op de aanwezigheid van cellen of weglaten van deze stap). Zorgvuldige pipetteren is cruciaal voor het verlies van de cel kunt voorkomen vermindering van het volume van het supernatans dat in stap 4.8. Zorg ervoor dat soepel zonder turbulenties op de pellet pipetteren gebeurt.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie is gefinancierd door de Oostenrijkse wetenschap Fonds (FWF), project-no. Ik 1220-B19 (naar P.S.) als onderdeel van de ERANET-project in translationeel kanker onderzoek (TRANSCAN) "Circulerend tumorcellen als biomerker voor Minimal Residual Disease in prostaatkanker (CTC-SCAN)". Promovendus S.C. werd opgeleid in het kader van de PhD programma Molecular Medicine van de medische universiteit van Graz. De auteurs erkennen dankbaar Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz en Johanna Schiller voor hun deskundige technische bijstand. De auteurs bedanken Georg Peinhaupt voor grafisch ontwerp steun.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
- Saucedo-Zeni, N., et al. A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire. Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).
- Gorges, T. M., et al. Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells. Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).
- Kuske, A., et al. Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients. Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).
- van Beers, E. H., et al. A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples. Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).
- El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA. Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).
- Möhlendick, B., et al. A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH. PLoS ONE. 8 (6), e67031 (2013).
- Chen, S., et al. Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire. Sci Rep-UK. 7, 43424 (2017).
- Zhang, H., et al. Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck. Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).
- Carter, L., et al. Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer. Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).
- Luca, F. D., et al. Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer. Oncotarget. , (2016).
- Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection. Cell. 168 (4), 571-574 (2017).
- Page, K., et al. Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer. Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).
- Kalinich, M., et al. An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).
- Gorges, T. M., et al. Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells. Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).
- Sinkala, E., et al. Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting. Nat Commun. 8, 14622 (2017).
- Morrow, C. J., et al. Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study. Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).
- Williamson, S. C., et al. Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer. Nat Commun. 7, 13322 (2016).
- Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM. Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).
- Czyż, Z. T., Klein, C. A. Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells. Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).
- Kroneis, T., et al. Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR. J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).
- Kroneis, T., et al. Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification. Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).
- Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification. Sci Rep-UK. 7, 45219 (2017).
- Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2. Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).
- El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. Potential and Challenges of Liquid Biopsies. Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).
- Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).
- Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. Circulating tumor cell technologies. Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).
