Summary
Ce protocole est de récupérer et de préparer des cellules-cibles rares à partir d’un mélange avec des cellules non cibles fond pour la caractérisation génétique moléculaire au niveau unicellulaire. Qualité de l’ADN est égale à cellules individuelles non traitées et permet application unicellulaires (les deux dépistage basé et ciblée d’analyse).
Abstract
Cellules cibles rares peuvent être isolés dans un fond important de cellules non ciblés à l’aide d’anticorps spécifiques pour des protéines de surface des cellules cibles. Une méthode récemment développée utilise un fil médical fonctionnalisé avec des cellules épithéliales anti adhérence molécule (EpCAM) anticorps pour in vivo l’isolement des tumeurs des cellules (CTC)1en circulation. Une cohorte de patients appariés en cancer de la prostate non métastatique ont montré que la technique d’isolation en vivo a entraîné un pourcentage plus élevé de patients positifs pour CTC ainsi que les comptes de la CCT supérieurs par rapport à l’étalon-or actuel dans l’énumération de la CCT. Comme les cellules ne peuvent pas être recouvrés auprès des dispositifs médicaux actuels, un nouveau fil fonctionnalisé (dénommé périphérique) a été fabriqué permettant la capture et le détachement ultérieur des cellules par traitement enzymatique. Les cellules sont autorisés à fixer à l’appareil, visualisé sur un microscope et détaché à l’aide d’un traitement enzymatique. Cellules récupérées sont cytocentrifuged sur glissières recouvertes de membrane et récoltées individuellement par le biais de microdissection laser ou micromanipulation. Unicellulaire échantillons sont ensuite soumis à l’amplification du génome entier de cellule unique permettant plusieurs analyse en aval, y compris les méthodes de dépistage et spécifique à la cible. La procédure d’isolement et de récupération rendements haute qualité ADN des cellules individuelles et n’altère pas l’amplification du génome entier ultérieures (WGA). Amplification de l’ADN d’une seule cellule peut être transmise au dépistage et/ou ciblées d’analyse tels que l’hybridation génomique comparative array (tableau-CGH) ou séquençage. Le dispositif permet ex vivo l’isolement des échantillons de cellules rares artificiel (c.-à-d. 500 cellules cibles dopés dans 5 mL de sang périphérique). Alors que les taux de détachement des cellules sont acceptable (50-90 %), le taux de récupération des cellules individuelles sur glissières s’étend sur une vaste gamme dépend de la lignée cellulaire utilisée (< 10 - > 50 %) et a besoin d’une plus grande attention. Cet appareil n’est pas autorisé pour l’utilisation chez les patients.
Introduction
Récemment, CellCollector DC01, un fil médical fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM pour isoler la CTC de sang périphérique des patients atteints de cancer, a été ajouté à la gamme méthodique de CTC énumération1,2,3 . Dans une étude actuellement en cours dans le cancer de la prostate non métastatique, ce fil fonctionnalisé rapports presque deux fois plus de patients CTC-positifs et CCT supérieure compte chez les patients séropositifs au CCT par rapport à CellSearch, l’étalon-or dans l’énumération3 de la CCT . Grâce à cette performance encourageante, isolement des cellules d’un fil médical fonctionnalisé pour l’analyse de la cellule unique serait souhaitable, mais ni le traitement enzymatique avec des solutions de détachement cellulaire (par exemple , la trypsine) ni microdissection laser permet la récupération des cellules intactes (données non présentées).
Pour permettre le détachement des cellules capturées, une nouvelle génération de fils fonctionnalisés était équipée d’un polymère spécifique. Ce polymère, qui relie l’anticorps de capture le fil, est sensible à un traitement de tampon de sortie permettant le détachement des cellules intactes (CellCollector DC03 dénommé dispositif). Le nouveau dispositif fonctionnalisé, permet d’isoler des cellules cibles de différentes concentrations des cellules de ligne de cellules cancéreuses dopés à l’albumine sérique bovine (BSA) / tampon phosphate salin (PBS) et du sang périphérique, respectivement.
Pour faciliter la détection visuelle des cellules sur l’appareil et après récupération, les cibler les cellules cancéreuses sont étiquetés avec la carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) et une coloration de l’ADN avant le traitement de récupération (i.e. charge et de dépose). Les effets du traitement sur la qualité de l’ADN des cellules simples ont été préalablement évalués après WGA au moyen d’un contrôle de la qualité PCR4,5, CGH-array6,7 et ciblé de séquençage7 n’indiquant aucune différence par rapport aux cellules non traitées micromanipulés partir de suspensions cellulaires7. L’avantage de cette méthode réside dans la combinaison de pré-enrichissement rare de la cellule-cible et la récupération des cellules pour analyse en aval de cellule unique (Figure 1). Le périphérique actuel marqué CE en vivo collection est généralement utilisé pour le dénombrement des PTC, plutôt que pour la caractérisation moléculaire de cellules individuelles2,8. Cependant, une analyse plus complète pour étudier l’hétérogénéité entre les CTC depuis longtemps pour l’analyse au niveau des cellules individuelles (c'est-à-dire ciblées séquençage au niveau unicellulaire). Autres méthodes basées sur les cellules reposent sur isoler immunomagnetic CTC EpCAM séropositifs et manipulation cellule unique basé sur diélectrophorèse pour analyse génétique moléculaire ultérieures9,10. Caractérisation moléculaire des PTC est une condition importante pour leur mise en oeuvre utile en milieu clinique et est tout aussi importante dans la recherche fondamentale de la cascade métastatique. En parallèle de la CTC, circulation tumeur ADN (ADNct) est devenu d’une grande importance car elle permet l’analyse d’ADN du fardeau tumoral avec isolement technique minimale procédures11,12. Les approches de la cellule en fonction pourraient servir comme une contribution complémentaire car elle permet de RNA13,14 et protéine15 analyse de l’expression et également pour la CCT dérivé cell cultures ou xénogreffes16, 17. bien que des obstacles tels que la récupération de cellules faibles et autorisation pour l’utilisation chez les patients doivent encore être surmontés, la méthode de verrouillage et la lâcher prend une prochaine étape importante vers la caractérisation des cellules cibles rares.
Protocol
Toutes les méthodes qui ont été approuvés par le Comité d’éthique de l’Université médicale de Graz (25-240 ex 12/13). Sang périphérique pour expériences de fortification a été échantillonné par des individus en bonne santé.
Remarque : Ce protocole décrit l’isolement des cellules HT-29 (lignée humaine de cellule de cancer du côlon) de PBS ou de mélanges artificiels des cellules HT-29 et le sang périphérique. La même expérience a été réalisée avec deux lignées de cellules supplémentaires (LNCaP et VCaP, données expérimentales dans les résultats de représentant) et peut théoriquement être effectuée avec toutes les cellules exprimant EpCAM.
1. préparation des cellules cibles
- Culture cellulaire et l’étiquetage des cellules
Remarque : Dans le présent protocole, les cellules sont cultivées dans des flacons de culture 75 cm². S’il vous plaît ajuster les quantités de réactifs en conséquence si les autres appareils de culture cellulaire sont utilisés (par exemple les récipients de culture de 25 cm², plaques 6 puits, etc..). Tous les liquides utilisés sont préchauffées à 37 ° C dans un bain d’eau. Indication contraire, toutes les étapes de protocole sont effectuées à température ambiante (RT).- Cellules HT-29 de culture dans un milieu de McCoy 5 a modifié additionné de 2 mM de L-glutamine, 20 mM Hepes, 10 % sérum fœtal (SVF) et 1 % la pénicilline/streptomycine à 37 ° C en atmosphère 5 % CO2 .
- Lorsque les cellules sont 90 % anastomosé, enlever le milieu et rincer les cellules avec 10 mL de PBS 1 x.
- Pour récolter les cellules, ajouter 2 mL de la solution de détachement cellulaire (Table des matières et réactifs) aux cellules et incuber les cellules pendant environ 5 min à 37 ° C.
Remarque : La solution de détachement contient protéolytique et enzymes collagénolytique dans 1 x PBS, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 0,5 mM et 3 mg/L rouge de phénol. Réduire le temps de préchauffage de la solution de détachement cellulaire au minimum, il vous sera inactif après 1 h à 37 ° C. Recouvrir la couche de cellules entières pour obtenir le détachement cellulaire optimal. - Vérifier le détachement des cellules à l’aide d’un microscope inversé.
- Transférer tout détaché de cellules dans un tube de 50 mL remplie au préalable avec 10 mL de milieu de culture cellulaire (même que celui utilisé à l’étape 1.1.1.) et remettre en suspension les cellules de pipetage.
- Placez la suspension de cellules restantes sur un mélangeur à rouleaux horizontaux à ta et passez à l’étape d’étiquetage.
- Vivre la cellule étiquetage des cellules cibles
- Diluer 1 µL de 5 mM CFSE (fourni dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) dans 1 mL de PBS 1 x préchauffée à 37 ° C pour obtenir la solution d’étiquetage 5µm prêt-à-utiliser CFSE.
Remarque : Pour des résultats optimaux de coloration, utiliser des solutions fraîchement préparées. - Préparer une solution de coloration à la DNA, prêt à l’emploi (Table des matières et réactifs) en dans du PBS 1 x et stockez-le à 2-6 ° C, abri de la lumière.
Remarque : Pour des résultats optimaux de coloration, utiliser des solutions fraîchement préparées. - Obtenir les cellules de table de mixage rouleau horizontal (étape 1.1.6.) et pellet que les cellules à 300 g pendant 10 min. Retirez le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 mL de PBS 1 x.
- Rincer les cellules encore une fois avec du PBS 1 x et Resuspendre le culot dans la solution d’étiquetage CFSE 500 µL prêt-à-utiliser.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 15 min et de recueillir les cellules après centrifugation à 300 g pendant 3 min.
- Remettre en suspension les cellules marquées dans 1 mL de milieu de culture cellulaire pré chauffé et laisser les cellules à se régénérer à 37 ° C pendant 30 min.
- Récolter les cellules par centrifugation à 300 g pendant 3 min et remettre en suspension les granules cellulaires dans 1 mL de l’ADN de prêt-à-utiliser la coloration de la solution à 37 ° C pendant 10 min.
- Les cellules de granule, éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 4 mL de PBS 1 x. Évaluer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre et vérifier pour fluorescence étiquetage à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé avec 4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) et l’isothiocyanate de fluorescéine filtres (FITC) (Figure 2 a et 2E).
- Centrifuger les cellules à 300 g pendant 3 min et Resuspendre le culot cellulaire selon la densité des cellules nécessaires à l’expérience respective, tel qu’il figure dans la section suivante et le lieu sur la glace.
- Diluer 1 µL de 5 mM CFSE (fourni dans le diméthylsulfoxyde, DMSO) dans 1 mL de PBS 1 x préchauffée à 37 ° C pour obtenir la solution d’étiquetage 5µm prêt-à-utiliser CFSE.
2. le fil de charge
Remarque : Les cellules peuvent être isolées de la cible cellulaire/périphérique sang spikings à l’échelle de millilitre ou en fournissant le faible nombre de cellules à l’échelle microlitre. Alors que la première approche permet pour imiter les condition de rares cellules dans le sang périphérique, celui-ci peut être préférable de fixer quelques cellules aux fins d’optimisation de protocole/essais.
- Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge
- Préparer un 2 % de BSA bloquant la solution en dissolvant 0.8 g de BSA dans 40 mL de PBS 1 x (utilisation de culture cellulaire). Dissoudre BSA par Vortex initial et subséquente d’incubation à ta sur un mélangeur à rouleaux horizontaux pour 10-20 min.
- Rinçage vides tubes/sodium héparine tubes EDTA avec 2 mL de 2 % de BSA pour enlever les résidus anticoagulant et jetez la solution. Bloquer la surface du tube en incubation à RT avec 5 mL de 2 % de BSA sur un mélangeur à rouleaux horizontaux à 15 tr/min pendant 30 min et jetez la solution.
- Diluer les cellules marquées (section 1.2) pour une densité de 100 000 cellules/mL et 5 mL permet de recharger le fil.
- Ajouter 5 mL de la suspension de cellules marquées (de 500 000 cellules au total) dans le tube. Éviter les bulles lors de l’ajout de la suspension cellulaire.
- Retirer le câble de l’espace de rangement ainsi que le capuchon en caoutchouc tenant le fil et le rincer dans du PBS 1 x (Figure 3).
- Pénétrer le capuchon du tube en caoutchouc du tube EDTA (étape 2.1.4.) à l’aide d’une aiguille de seringue (20G) et insérez le fil de sorte que la partie fonctionnelle est complètement immergée dans la suspension cellulaire lorsque le bouchon est sur le tube et le tube placé sur la table de mixage Rouleau incliné.
Remarque : La triple hélice partie fonctionnelle du fil doit être recouvert de suspension cellulaire tout au long de la charge. - Faire pivoter les tubes sur une table de mixage Rouleau incliné à 5 tr/min pendant 30 min permettre les cellules à attacher au câble.
- Rincez le fil avec du PBS 1 x 5 mL et placez-le dans l’obscurité entre 2 et 6 ° C dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu'à un examen visuel.
NOTE : La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée dans du PBS pour éviter d’endommager les cellules.
- Isoler les cellules cibles de mélanges artificiels avec du sang périphérique (variante charge méthode pour : 2.1. Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge)
- Diluer les cellules marquées (section 1.2) pour obtenir des suspensions cellulaires à haute densité cellulaire (> 1 000 000 cellules/mL), ce qui maintenant le volume de suspension cellulaire ajouté à du sang périphérique bas.
- Ajouter 500 à 500 000 cellules à 5 mL de sang périphérique et les mélanger en retournant le tube.
- Retirer le câble de l’espace de rangement, enlever le capuchon en caoutchouc tenant le fil et le rincer dans du PBS 1 x.
- Pénétrer un nouveau capuchon du tube avec la partie non fonctionnelle de l’appareil à l’aide d’une aiguille de seringue (20G) tel que la partie fonctionnelle est complètement immergée dans le sang enrichi lorsque le bouchon est sur le tube et le tube placé sur la table de mixage Rouleau incliné.
Remarque : La triple hélice partie fonctionnelle du fil doit être recouvert de suspension cellulaire tout au long de la charge. - Incuber le tube sur le mélangeur Rouleau incliné à 5 tr/min pendant 30 min à température ambiante.
- Rincez le fil 3 fois dans du PBS 1 x et stockez-la dans le noir dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu'à un examen visuel.
Remarque : La partie fonctionnelle du fil doit toujours être immergée pour éviter d’endommager les cellules.
- Le fil de suspensions cellulaires de faible volume de charge (variante charge méthode pour : 2.1. Le fil à l’aide d’un grand volume des suspensions de cellules de charge)
- Remettre en suspension les cellules marquées à 1 000 000 cellules/mL dans une solution 1 PBS x.
- Fixer un 150 mm jetable pipette Pasteur en verre horizontalement sur une grille.
- Retirer le câble de l’espace de rangement, mais garder le bouchon jaune tenant le fil.
- Placez le fil dans la pipette de telle sorte que la partie fonctionnalisée est située à l’extrémité de la pipette Pasteur sans toucher le verre.
Remarque : L’extrémité du fil ne devrait pas s’en tenir sur la pointe de pipette Pasteur. Évitez de brancher l’extrémité arrière de la pointe de pipette Pasteur avec le capuchon en caoutchouc tenant le fil. Collés serrés, des suspensions cellulaires ne peut pas être chargées de l’autre côté dans l’embout de la pipette. - Charger 15 µL de la suspension cellulaire dans l’embout de la pipette Pasteur couvrant la partie fonctionnalisée du fil.
- Incuber le fil pendant environ 10 minutes manuellement quart de tour la pipette assemblés fil/Pasteur chaque minute.
- Retirer le câble de l’embout de la pipette Pasteur, rincez-la dans 5 mL de PBS 1 x et placez-le dans l’obscurité entre 2 et 6 ° C dans un tube de 15 mL contenant 1 x PBS jusqu'à un examen visuel.
Remarque : La partie fonctionnelle doit toujours être immergée dans du PBS 1 x pour éviter d’endommager les cellules.
3. comptage de cellules sur le fil
NOTE : Toujours garder la partie fonctionnelle du fil immergé dans la solution de 1 PBS x pour éviter d’endommager les cellules.
- Utiliser un stylo de graisse pour dessiner une zone rectangle sur une lame de verre et ajouter 500 µL de PBS 1 x.
- Plier la partie non fonctionnelle du fil et placez-le sur la lame de verre telles que la partie fonctionnelle est plongée dans du PBS 1 x.
Nota : Placer la surface du rectangle et le volume de solution de 1 PBS x pour couvrir complètement la partie fonctionnelle du fil. Utilisez un ruban adhésif double-face pour monter la partie non fonctionnelle du fil sur la diapositive. - Inspecter visuellement les deux côtés du fil pour énumérer les cellules capturées (Figure 2 b et 2F).
Remarque : La présence de cellules est déterminée à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé de filtres pour DAPI et FITC. Les deux côtés du fil peuvent être inspectées et le nombre de cellules soit évaluée (pour les numéros de cellulaire élevée) ou comptés (uniquement possible si faible nombre de cellules est relié au câble). Cette étape peut être sautée si le dénombrement des cellules n’est pas nécessaire. - Après la numérisation, placez le fil dans le tube de 15 mL contenant la solution de PBS 1 x (voir Note du 2.3.6. et l’article 3.), stocker le fil dans l’obscurité.
Remarque : La plupart de la partie non fonctionnelle du fil peut être coupé (y compris le coude) et enlevé stockage accélération.
4. détachement et la récupération des cellules cibles
NOTE : Détachement des cellules se fera moins de 4 h après l’isolement.
- Dissoudre 4 mg de la composante de mémoire tampon de sortie (Table des matières et réactifs) par mL de solution 1 PBS x et filtrer la solution sur un filtre stérile de 0,2 µm pour obtenir le tampon prêt à l’emploi.
Remarque : Le polymère du fil est composé d’un hydrogel qui est fonctionnalisé avec des anticorps anti-EpCAM permettant la fixation aux cellules cibles présentant EpCAM. Le tampon de sortie contient une enzyme protéolytique de carbone-oxygène capable de cliver l’hydrogel. Le clivage protéolytique entraîne la dégradation du polymère et, par conséquent, détachement des cellules capturées. - Réchauffez le tampon de sortie à 37 ° C pendant 5 min.
- Ajouter 1,6 mL de tampon de sortie pour remplir un tube de réaction de 1,5 mL.
NOTE : Les Tubes conçus pour la réaction de 1,5 mL volumes permettent demande de 1,6 mL, ce qui est nécessaire pour immerger la partie fonctionnelle du fil. - Incuber la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de sortie à 37 ° C (bain d’eau) pendant 20 min. utiliser le capuchon en caoutchouc livré avec le fil plutôt que le capuchon du tube pour fixer le fil dans le tube de 1,5 mL pour éviter toute contamination pendant l’incubation dans le bain d’eau.
- Transférer l’assemblage câble/tuyau à un agitateur à RT et 500 tr/min pendant 15 min.
Remarque : Le shaker a une orbite de 1,5 mm. - Placez l’assemblage câble/tuyau dans une centrifugeuse et le tourner à 300 x g pendant 10 min.
- Retirer le fil du tube, fermer le couvercle et centrifuger le tube à nouveau à 300 x g pendant 10 min.
Remarque : Le fil peut être stocké dans du PBS 1 x 2-6 ° c dans le noir pour le comptage des cellules afin d’évaluer l’efficacité de détachement/chèque pour les cellules restantes sur le fil. - Pour réduire le volume de la suspension cellulaire, supprimer tous sauf 100 µL (micromanipulation) ou alternativement 300 µL (cytocentrifugation et microdissection laser ultérieure) du liquide surnageant et immédiatement procéder à un échantillonnage unicellulaires.
5. cellule unique échantillonnage
- Micromanipulation
NOTE : Cellules individuelles s’ajouteront à 2 µL du mélange maître de cellule lysis permettant de WGA. Préparer le mélange maître selon le nombre de cellules traitées, de calculer des volumes supplémentaires de perte en raison de pipetage et lieu cell lyse mélange principal sur la glace.- Préparer la cellule lysis master mix (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) selon le protocole décrit par Czyż et al.18. Mélanger brièvement, 2,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 12,8 µL eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mix Master pour 10 échantillons (volume total 20 µL).
Remarque : Pour plus d’échantillons, augmenter les volumes en conséquence. La composition du mélange principal de lyse cellulaire diffère de celle utilisée dans la procédure alternative utilisant des échantillons de microdissection laser (voir 5.2.). - Utilisez un stylo de graisse pour dessiner une zone maintenant la suspension cellulaire en place. Ajuster la surface et volume si la densité cellulaire est trop élevée (i.e. marquer une zone plus vaste sur la lame de verre, 1 x PBS et une partie aliquote de la suspension de cellules de charge).
- Pipetter, la suspension de toute cellule tachée (obtenue à l’étape 4.8.) sur la lame de verre.
- Transférer la lame de verre à un microscope équipé d’un micromanipulateur. Laisser les cellules à se contenter de 5 min (Figure 2D et 2 H).
- Préparer 0,2 mL PCR tubes chargés avec 2,0 µL du maître de la lyse cellulaire mélangent (Voir l’étape 5.1.1) et placez-le sur la glace.
- Recueillir des cellules individuelles en 1 µL de PBS 1 x en utilisant le micromanipulateur et transférer les cellules dans un tube contenant le mélange maître de lyse cellulaire.
Remarque : Pour le transfert de cellules micromanipulés dans le tampon de lyse cellulaire Placez le capillaire directement dans les 2 µL de solution de lyse et éjecter jusqu'à ce que les bulles sont visibles. - Faites tourner brièvement vers le bas de l’échantillon à 2000 x g pendant 3 s en utilisant un bureau microtubes pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Placer les échantillons sur la glace.
- Passez directement à l’unicellulaire WGA (voir la section 6. et Czyż et al. ( 19).
- Préparer la cellule lysis master mix (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) selon le protocole décrit par Czyż et al.18. Mélanger brièvement, 2,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 12,8 µL eau exempte de RNase/DNase pour obtenir un mix Master pour 10 échantillons (volume total 20 µL).
- Microdissection de laser (méthode de rechange unicellulaire d’échantillonnage à : 5.1. Micromanipulation)
Remarque : La composition du mélange maître utilisée dans cette section diffère de celle utilisée dans la section 5.1 pour micromanipulation. Cellules individuelles s’ajouteront à 4,5 µL du mélange principal (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) de lyse cellulaire pour WGA.- Préparer le mélange maître de lyse cellulaire selon Czyż et al. 19 en mélangeant 5,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), respectivement, 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 34,8 µL de RNase / Eau exempte de DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total 45 µL). Placez le mélange maître sur la glace.
Remarque : Pour plus d’échantillons, augmenter les volumes en conséquence. - UV-régal revêtement membrane diapositives adapté à la microdissection laser. Par conséquent, déposer les lames dans un dispositif de l’éditeur de liens d’ADN et exposer aux UV plus élevée pendant environ 10 min.
- Assembler la lame revêtement membrane dans un cytocentrifuge et cytospin la suspension de toute cellule à 300 x g pendant 5 min.
Remarque : Lorsque vous utilisez un système en liquide, où les cellules sont cytocentrifuged sur le toboggan en solution, retirer le surnageant après cytocentrifugation et appliquer un sèche-spin à 1140 x g pendant 1 min. - Passez directement à la microdissection de laser ou de laisser le cytospins sécher pendant la nuit et congeler les échantillons à-20 ° C pour le stockage à long terme.
- Pipeter 4,5 µL du mélange maître de cellule lysis dans le bouchon d’un tube PCR de 0,2 mL et récolter les cellules individuelles par le biais de microdissection laser.
- Extraire le tube PCR du microscope microdissection laser et fermer le tube. Recueillir tout le liquide au fond du tube par court-spin et placez l’échantillon sur la glace.
- Poursuivez le WGA monocellulaires ou stocker les échantillons isolés à-80 ° C pendant environ 1 mois avant traitement ultérieur.
- Préparer le mélange maître de lyse cellulaire selon Czyż et al. 19 en mélangeant 5,0 µL de tampon de réaction, 1,3 µL d’octylphenoxypolyethoxyethanol (solution à 10 %), 1,3 µL de 4-(1,1,3,3-tétraméthylbutyl) phényl-polyéthylène-glycol (solution à 10 %), respectivement, 2,6 µL d’une solution de protéinase K et 34,8 µL de RNase / Eau exempte de DNase pour obtenir un mélange maître pour 10 échantillons (volume total 45 µL). Placez le mélange maître sur la glace.
6. adaptateur-linker basé du génome entier amplification 18,19
Remarque : Assurez-vous que tous les mélanges maîtres nécessaires (composants du kit WGA, Table des matières et réactifs) sont préparés et stockés sur glace prête à l’emploi. Mélanges maîtres comprennent le mélange de digestion de l’ADN 1 pour micromanipulés (voir 5.1) échantillons (contenant 2,0 µL de tampon de réaction, 2,0 µL de Msej’ai enzymes de restriction et de 16,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase) ou digestion de l’ADN mélanger 2 pour microdissection laser (voir 5.2.) échantillons (contenant 2,5 µL de Msej’enzymes de restriction et 2,5 µL d’eau exempte de RNase/DNase), recuit pré mélange principal (contenant 5,0 µL de tampon de réaction, 5,0 µL de chacune des cartes preannealing PCR et 15,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase), ligature mélange principal (contenant 30,0 µL de recuit des adaptateurs PCR, 10,0 µL de solution de triphosphate d’adénosine et 10,0 µL de solution de ligase T4) et primaire PCR master mix (contenant 30,0 µL d’un tampon PCR, 20,0 µL de solution de mélange désoxyribonucléosides 10 mM, 10,0 µL d’une polymérase mixage et 340,0 µL d’eau exempte de RNase/DNase). Tous les volumes sont donnés pour la préparation de 10 échantillons. Ajuster en conséquence le nombre d’échantillons.
- Pour la lyse cellulaire, placer les échantillons de microdissection laser/micromanipulés dans un thermocycleur et exécuter la lyse de la cellule unique en incubant les cellules à 42 ° C pendant 45 min, 65 ° C pendant 30 min et 80 ° C pendant 10 min.
Remarque : Utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé. La lyse cellulaire est possible O/N pendant 10 à 15 h. Dans ce cas, omettez l’étape d’incubation à 65 ° C. - Courir avant recuit des adaptateurs PCR. Par conséquent, incuber le mélange maître avant recuit dans un thermocycleur à 65 ° C pendant 1 min, suivie par plus de 49 cycles, 1 min chacun, à diminuer progressivement la température de 1 ° C/cycle. Après 50 cycles (à 15 ° C), incuber master mix à 15 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
Remarque : Cette étape est nécessaire pour générer asymétriques adaptateurs appropriés pour la ligature (Voir l’étape 6,6) avec l’ADN de la cellule unique soumis à Mseje Sommaire de restriction. - Après la lyse cellulaire, tournez en bas les échantillons lysés à 2000 g pendant 3 s pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace.
- Pour le fragment d’ADN, ajouter 2 µL du mélange digestion ADN 1 à chaque échantillon micromanipulés lysés ou 0,5 µL de la digestion de l’ADN mélanger 2 à l’échantillon de microdissection laser et exécution sommaire de restriction. Utiliser un thermocycleur avec un couvercle chauffé à 37 ° C pendant 5 min, suivie d’une étape de l’inactivation des enzymes de restriction à 65 ° C pendant 5 min.
Remarque : La Digestion à 37 ° C peut être étendue à 3h. Il s’agit de la seule étape de protocole diffère entre les échantillons obtenus à partir de micromanipulation et obtenu de microdissection laser. - Tournez en bas les échantillons pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace.
- Pour ligaturer DNA restriction digérée et adaptateurs préalablement recuites, ajouter 5,0 µL du maître ligature mélanger à chaque échantillon d’ADN digéré et ligaturer il dans un thermocycleur à 15 ° C pendant 1 h.
Remarque : Cette étape peut être étendue à 12 h ou effectué O/N. - Tournez en bas les échantillons pour recueillir tout le liquide au fond et placez-le sur la glace.
- Pour WGA ajouter 40,0 µL du mélange maître primaire de PCR pour chacun des produits la ligature et exécuter WGA dans un thermocycleur avec un couvercle chauffant comme suit : d’abord, incuber les échantillons à 68 ° C pendant 3 min. Deuxièmement, cycle pour 15 fois à 94 ° C pendant 40 s, 57 ° C pendant 30 s et 68 ° C pendant 1 min 30 s + 1 s/cycle. Puis ajoutez 9 cycles à 94 ° C pendant 40 s, 57 ° C ± 1 ° C/cycle pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min 45 s + 1 s/cycle. Par la suite, cycle pour 23 fois à 94 ° C pendant 40 s, 65 ° C pendant 30 s, 68 ° C pendant 1 min 53 s + 1 s/cycle. Enfin, effectuer une extension finale à 68 ° C pendant 3 min 40 s et refroidir les échantillons à 4 ° C.
- Tournez en bas les échantillons de recueillir tout le liquide au fond et de vérifier la qualité de l’ADN ou de stocker les échantillons à-20 ° C ou à-80 ° C pour le stockage à long terme.
7. contrôle de la qualité des produits WGA
Remarque : Vérifier la qualité des produits WGA basés sur la gamme de l’ADN de Papanicolaou et le nombre de produits d’amplification après avoir exécuté un 4plex QC-PCR 5. Exécuter les aliquotes WGA et des échantillons respectifs de QC-PCR sur un gel d’agarose de 1,0 % pour l’évaluation.
- Préparer les solutions µM 100 de toutes les amorces utilisées pour le contrôle de la qualité 4plex PCR (tableau 1). Ajouter 8 µL de chaque amorce à 136,0 µL d’eau PCR-grade pour générer 200 µL de la piscine de l’apprêt. Vortex la solution pendant 3 s, le tourner vers le bas à 2000 x g pendant 3 s et l’aliquote de 20 µL de conservation à-20 ° C.
- Utilisation des kits PCR standard pour préparer un master de PCR multiplex mélangent contenant 6,0 µL de 2 composants de x PCR (à l’exception des amorces), 4,5 µL d’eau PCR-grade et 0,5 µL de la piscine de l’apprêt.
- Ajouter 1,0 µL des produits WGA, pivoter vers le bas et exécution PCR à 94 ° C pendant 2 min suivi par 35 cycles de dénaturation à 94 ° C pendant 1 min, apprêt recuit à 56 ° C pendant 1 min et extension d’amorce à 72 ° C pendant 1 min 30 s et une étape finale extension à 72 ° C pendant 7 min. refroidir à 4 ° C, pivoter vers le bas et placer les échantillons sur la glace pour gel analyse le même jour ou à-20 ° C pour une analyse ultérieure.
NOTE : Dans le thermocycleur de refroidissement peut être effectuée à 12 ° C, pour augmenter la longévité des éléments Peltier. - Analyser les produits WGA (obtenues par 6.8.) et 4plex respectifs QC-PCR sur un gel d’agarose5.
Representative Results
Les cellules après CFSE et coloration nucléiques peuvent être évaluées en utilisant un microscope d’immunofluorescence équipé de filtres pour DAPI et FITC. Noyaux présentent contre-colorant lumineux dans le chenal DAPI alors que le cytoplasme des cellules montrent un marquage uniforme avec la CFSE avec une intensité inter-cellules hétérogène (Figure 2 a et 2E). Forme similaire et intensités de coloration sont attendus de cellules attachées au fil (Figure 2 b et 2F) ainsi que décrochés du fil et récupérés sur une lame (Figure 2D et 2 H).
La densité cellulaire élevée (par exemple > 1 000 000 cellules/mL) peut entraîner une couverture totale du fil avec des cellules lorsque les câbles de charge. Cependant, réduire la densité des cellules, des changements de vitesse de rotation pendant l’incubation et l’utilisation de lignées cellulaires différentes affectent l’efficacité de l’isolation et doivent être testés séparément. Lorsque les fils ont été incubées avec 5 mL de cellules HT-29 100 000 cellules / mL comme décrit dans la section 2.1., une moyenne de 254 ± 103 cellules (n = 5) ont été capturés sur les fils. Avec la même expérience en utilisant des cellules LNCaP, une moyenne de 440 ± 319 cellules (n = 5) par fil a été obtenue.
Présentant des cellules HT-29 500, 5 000 et 50 000 dans un fond de 5 mL de sang périphérique aux fils (selon le protocole, section 2.2.) a abouti à la capture de 75 ± 18 cellules, 25 ± 9 cellules et 47 ± 57 cellules (n = 3, chaque), respectivement. Si le fil est facturé 15 µl de la suspension de cellules (cellules/mL 1 000 000) selon le protocole à la section 2.3., jusqu'à 1 000 (HT-29) les cellules peuvent s’attacher à un fil.
Cellule des efficacités de détachement varies de 81 % dans les cellules HT-29 (gamme 54,9 % à 93,2 % et n = 5) à 81 % (rang 63.51 92,87 %, n = 6) et 91 % (rang 84,7 % - 95,3 %, n = 6) à LNCaP et VCaP cellules, respectivement. De même, la récupération de cellules individuelles est différente entre les lignées cellulaires : une moyenne de 28 % des cellules individuelles de HT-29 ont été récupérés par cytocentrifugation. Alors que le taux de récupération de LNCaP était inférieur à 10 %, le taux de recouvrement moyen des cellules VCaP était de 55 %.
Environ 75 % des cellules simples soumis à des produits de WGA WGA rendement qualité : il s’agit de 1) frottis de produits WGA allant de 0,1 à > 1 Ko (Figure 4, panneau supérieur) et 2) trois ou quatre bandes dans la qualité 4plex contrôlent PCR (Figure 4, plateau inférieur) . Produits WGA peuvent être utilisés pour 1) tableau-CGH profilage répondant aux critères de qualité de single-cell array-CGH profils 6,7 et NGS 2) ciblés après ré-amplification WGA 7.
Figure 1 : "Workflow" pour isoler et récupérer des cellules cibles pour l’analyse des unicellulaires. (A) les cellules sont cultivées à la confluence de 90 % et (B) récoltés pour obtenir une suspension de cellules individuelles. Après coloration avec CFSE et acides nucléique teinté, (C) le fil fonctionnalisé est incubée en présence de cellules dans un volume de 5 mL à l’aide de tubes de réaction ou dans un faible volume à l’aide d’une pointe de pipette Pasteur. Ce dernier permet application des volumes de suspension cellulaire aussi bas que 15 µL. (D) cellules ont besoin d’être détaché au sein de 4 h après la recharge. Par conséquent, le fil est placé dans un tube à essais 1,5 mL rempli avec du tampon de sortie. Après 15 min d’incubation sur un rocker et centrifugation de 10 min, le fil est enlevé et la suspension cellulaire est centrifugée pour les cellules de granule. (E) récupéré les cellules sont soit transférés à une lame de verre pour monocellulaires micromanipulation (haut) ou cytocentrifuged sur une lame de membrane-enduit et transmises à laser microdissection (en bas). (F) Enfin, monocellules récoltés sont amplifiées au moyen de l’amplification du génome entier (WGA). Produits WGA sont compatibles avec la CGH-array et analyse en aval du NGS ciblée. EpCAM épitope : cercle vert sur la surface de la cellule. Fonctionnalisés fil : appareil, câbles triple hélice gris. Polymère : lignes violettes. Anticorps anti-EpCAM : orange. Activité de la mémoire tampon de sortie : flèche rouge. Marqueur de graisse pour maintenir la suspension cellulaire en place : ellipse bleu foncé. Récupéré la suspension cellulaire : bleu clair. Capillaire de micromanipulation : noir ligne. Grossissement : récupéré cellule récolté par micromanipulation, cytospin sur membrane recouverte diapositive contenant des cellules récupérées (gris ellipse pleine). Grossissement : cellule récupéré étant laser microdissected (gris ligne circulaire : membrane de diapositive de membrane sert d’épine dorsale pour la microdissection laser), objective, faisceau laser (ligne bleue approchant la lame de la membrane par en dessous). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : visualisation des cellules marquées. (A, E) Avant de charger les cellules : les cellules sont marquées avec CFSE et Eosine avec de l’ADN intercalant colorant montrant une intensité de signal de gamme de CFSE (vert). (B,F) Cellules marquées capturés sur le fil. (C,G) Fil après intervention de la cellule-détachement. (D,H) Cellules individuelles du fil et récupéré par cytocentrifugation sur une lame. CFSE : Canal FITC (vert). ADN : canal DAPI (bleu). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : fil et rangement du coffre à. (A) compartiments du fil. (B) détail de la partie fonctionnalisée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : contrôle de la qualité des produits WGA provenant de cellules simples micromanipulés. Panneau supérieur : produits WGA obtenus à partir de cellules individuelles en général résultat ADN frottis allant de 0,2 kb à > 1,0 Ko avec un pic d’intensité à environ 0,5 Ko. Nombre d’échantillons 1, 7 et 13 (indiquées par des astérisques) montrer sous-optimaux ou aucun ADN frottis. Panneau inférieur : WGA produits sont de qualité suffisante si la PCR 4plex des rendements trois ou quatre de quatre produits PCR (100, 200, 300 et 400 bp). Échantillons de 1, 7, 10 et 13 montrent moins de trois bandes et seraient exclus de l’analyse. Voie M contient une échelle bp 100 et les astérisques indiquent les échantillons de qualité insuffisante de produit WGA. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Séquence d’amorce | REMARQUE |
| 5′-gtt cca ata tga ttc ACC cc-3′ | apprêt avant bp 100 |
| 5′-CCC ctg gaa Tam Tam ggt gg-3′ | 100 amorces inverse bp |
| 5′-agg tgg agc gag gct agc-3′ | apprêt avant 200 bp |
| 5′-ttt tgc ggt gga aat gtc ct-3′ | apprêt inverse bp 200 |
| 5′-agg tga gac att ctt gct gg-3′ | apprêt avant bp 300 |
| 5′-tcc act aac cag tca gcg tc-3′ | apprêt inverse bp 300 |
| 5′-aca gtc chat gcc atc Loi gc-3′ | apprêt avant 400 bp |
| 5′-gct tga caa agt ggt cgt tg-3′ | apprêt inverse bp 400 |
Tableau 1 : Séquences d’amorces pour le contrôle de la qualité 4plex PCR
Discussion
Le protocole décrit vise à récupérer des cellules du fil fonctionnalisé (dénommé périphérique) pour l’analyse génomique ex vivo unicellulaires. Nous avons testé trois lignées de cellules EpCAM-positive (HT-29, LNCaP et VCaP), mais en principe, cette méthode peut être appliquée à n’importe quelle ligne de cellules exprimant EpCAM. Cellules cibles EpCAM séropositifs peuvent être présentés à l’appareil comme suspension cellulaire pur (voir 2.1.) ou mélangé dans un surplus de cellules de fond (par exemple. périphérique sang, voir 2.2.). Considérant que surtout ce dernier peut être utilisé pour tester les capacités d’isolement dans des conditions rares cellules, un réglage fin du nombre de cellules attachées au fil peut être fait en utilisant le faible volume décrit l’approche (voir 2.3.). Comme les différences entre les lignées cellulaires sont à prévoir, la densité cellulaire appropriée pour charger le fil, rotation vitesse ainsi que le temps d’incubation doivent être testés empiriquement en évaluant le nombre de cellules attachées à l’aide d’un microscope d’immunofluorescence.
Pour les applications en aval de la génomique au niveau unicellulaire WGA, est nécessaire. La méthode WGA de choix peut-être différer entre les laboratoires et, en principe, notre méthode est ouvert à toutes les méthodes que peut gérer les échantillons obtenus de microdissection laser ou micromanipulation. Dans ce protocole, nous utilisons une méthode basée sur l’ADN enzymatiquement fragmenté en raison d’une meilleure performance par rapport à une chaleur-fragmentation selon WGA7. En option, seule les cellules peuvent être transmises à WGA isotherme permettant20,21de profilage d’ADN ultérieur.
Le protocole décrit vise à récupérer les cellules intactes après qui est attaché à une nouvelle génération de fils fonctionnalisés pour l’analyse génomique de cellule unique. La première génération des fils fonctionnalisés, qui représentent également les dispositifs d’enrichissement homologation uniquement in vivo sur le marché jusqu'à présent, ont été utilisée pour l’énumération des CTC chez les cancéreux métastasé. Les publications précédentes et nos propres données suggèrent la technique d’isolation en vivo pour être plus sensible par rapport à l’étalon-or actuelle technologie2. Ainsi, équiper cette technique d’isolation in vivo avec une fonction de récupération telle que réalisée dans le dispositif permet alliant haute récupération CCT caractérisation au niveau unicellulaire.
Cependant, l’appareil n'est pas autorisé pour l’utilisation chez les patients, par conséquent, les données cliniques ne sont pas disponibles. Ex vivo des applications (c'est-à-dire isoler CTC de sang périphérique après le prélèvement) ne sont pas recommandés car la technologie est adaptée pour les paramètres présents dans le cubital vaine, par exemple faible diamètre de la vaine (augmentation de la probabilité de un contact entre la CCC et l’anticorps de captures en direct) et les temps de rétention longue (30 min, permettant à 2 ou 3 L de sang à passer le fil). Cependant, tel qu’indiqué dans l’article 2.2. cellules cibles peuvent être également isolés dans des échantillons mixtes7.
Une limitation du courant de la méthode est la récupération inefficace des cellules non fixées après détachement des fils. Ceci, cependant, pourrait être amélioré par une étape de fixation cellulaire avant le traitement de détachement.
En résumé, ce protocole est un premier pas vers l’utilisation combinée d’une technique d’isolation en vivo avec récupération de cellules pour caractériser génétiquement les cellules individuelles. Des efforts supplémentaires doivent lever l’optimisation de la récupération de la cellule et la clairance pour son application dans les patients1,2. Cependant, la médecine personnalisée pour les décisions de surveillance et de la thérapie de traitement dépasse énumération des PTC. Ainsi, cette méthode est une première étape vers la caractérisation génomique de la CCT au niveau de la cellule unique.
Les applications vers l’analyse du transcriptome unicellulaires semblent possibles, comme les cellules intactes sont récoltés. Cependant, il reste à évaluer si la procédure de récupération a un impact sur l’intégrité du RNA (p. ex. transmission monocellules récupérés à la lyse directe, suivie de la RT-qPCR22). En cas de succès, caractérisation de cellules uniques (p. ex. , CTC) peut être déplacée au niveau transcriptome, permettant des analyses plus détaillées. À cet égard, RNA-seq en utilisant Smart-seq2 fournit un outil précieux pour l’analyse en aval de RNA des cellules simples l’ADNc préamplifié (obtenu au cours de la préparation de bibliothèque de RNA-seq) peut être soumis aux PCR quantitative. Cela permettra une cible combinée et l’analyse axée sur la projection de monocellules récupéré22,23.
Les fils fonctionnalisés actuelles reposent sur les anticorps anti-EpCAM qui est un marqueur épithélial largement utilisé pour la sélection positive de PTC24. Comme plusieurs CTC pourrait downregulate marqueurs épithéliaux comme cytokératines ou EpCAM25, l’ajout d’anticorps comme HER2/nouveau augmenterait les chances d’isolement de la CCT. Plusieurs anticorps basé enrichissement des stratégies ont été développés et examinés par Ferreira et al. en 2016,26. Un mélange d’anticorps immobilisés sur un fil pourrait être une amélioration future de la technologie menant à l’isolement d’un plus grand nombre et autres sous-types des PTC.
Il est obligatoire pour toutes les étapes impliquant le fils de manutention pour garder la partie fonctionnelle du fil immergée dans une solution pour maintenir son fonctionnement. Nous vous recommandons de placer le fil dans 1 x PBS lors de l’évaluation (microscope ; e.g. 3.1 les étapes. -3.3.) et le stockage. Afin d’éviter une coloration inappropriée, nous recommandons une solution colorante en étapes 1.2.1 fraîchement préparé. et 1.2.2. Cellules faiblement colorées entravent la cellule de comptage sur le fil et peuvent conduire à la sous-estimation des cellules attachées.
Il faut éviter de brancher la pipette Pasteur avec le capuchon en caoutchouc lorsque vous insérez le fil dans la pipette Pasteur pour chargement ultérieur de la suspension cellulaire (étape 2.3.4.). Le capuchon en caoutchouc est utilisé pour maintenir le fil en place afin que la partie fonctionnelle est située à l’intérieur de l’embout de la pipette Pasteur. Si le bouchon est trop fermement attaché à l’arrière de la pipette Pasteur, chargement de la suspension cellulaire n’est pas possible. Dans ce cas, faciliter la PAC telle que l’air qui est déplacé par la suspension de cellules chargées peut laisser la pipette.
Plier le fil est crucial pour son orientation au cours de la cellule de comptage en étapes 3.2. et 3.3. Monter les conducteurs avec le ruban adhésif tel que la fin ne fonctionne pas du fil vient de se coucher sur le côté. Après la numérisation de toute la longueur de la partie fonctionnelle, le fil est enroulé 180° alors que l’autre moitié du fil fonctionnel peut être scanné. Cette étape est importante pour les premières expériences d’évaluer le nombre de cellules sur le fil. Une fois que le nombre de cellules pour une lignée cellulaire et une procédure est évalué, la procédure peut être répétée sans cellule de comptage (e.g. seulement vérifiant la présence de cellules ou de l’omission de cette étape). Pipetage prudent est cruciale pour éviter la perte de cellules en réduisant le volume du liquide surnageant dans étape 4.8. Assurez-vous de pipetage se fait en douceur sans provoquer de turbulences au culot.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette étude a été financée par le fonds autrichien de Science (FWF), projet-no. J’ai 1220-B19 (au PS) dans le cadre du projet ERA-NET en recherche translationnelle de Cancer (TRANSCAN) « Circulating tumeur des cellules comme biomarqueur de la maladie résiduelle dans le Cancer de la Prostate (CCT-SCAN) ». Candidate au doctorat S.C. a été formé dans le cadre de la médecine moléculaire de programme de doctorat de l’Université médicale de Graz. Les auteurs remercient Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz et Johanna Schiller pour leur assistance technique d’experts. Les auteurs remercient Georg Peinhaupt pour la prise en charge de la conception graphique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gilupi Release Buffer | Gilupi | GIL083 | Used to detach cells from the wire |
| McCoy's 5A Medium (1x) suppl. with L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 16600-082 | Culture medium used for HT-29 cells, adapt culture medium to cell line used for the experiments |
| HEPES Buffer Solution (1 M) | PAA | S11-001 | Supplement for McCoy's 5A Medium |
| Foetal Bovine Serum Gold | PAA | A15-151 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Biowest | L0018-100 | Supplement for McCoy's 5a Modified Medium |
| Phosphate Buffered Saline (1x PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010-015 | |
| Accutase | Biowest | L0950-100 | Cell detachment solution (cell culture) |
| Water bath | GFL | Type 1003 | Used for prewarming solutions |
| Incubator | Thermo Fisher Scientific | Used to incubate cells (cell culture) | |
| 50 mL reaction tubes | VWR | 525-0403 | |
| Roller mixer | Stuart Scientific | SRT6D | Used to attach cells to the wire while keeping the cells from sedimenting |
| CellTrace CFSE Cell Proliferation Kit | Thermo Fisher Scientific | C34554 | Used to label living cells (cytoplasmic label) |
| Hoechst 33342 | H3570 | Thermo Fisher Scientific | Used to stain DNA (nucleic counterstain) |
| Centrifuge (equipped for holding 15 mL and 50 mL reaction tubes) | Thermo Fisher Scientific | Heraeus Megafuge 40R | Used for pelleting cells |
| Observer Z1 (Fluorescence/laser microdissection microscope) | Carl Zeiss Microimaging | Inverted (immunofluorescence) microscope capable of laser microdissection; Fluorescence microscopes must be able to detect Hoechst 33342 (DAPI filter) and CFSE (FITC filter) | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A4503-50G | Used for coating glass/plastic surfaces |
| MS1 Minishaker | Sigma-Aldrich | Z404039 | Used for vortexing |
| Vacutainer EDTA (or Na-heparin) tubes | BD | 366450 (or 366480) | Used as reaction tube for ex vivo capture of target cells |
| Detektor CANCER03 DC03 | Gilupi | GIL003 | Functionalized wire capable of isolating and detaching EpCAM-positive cells (also referred to as catch&release, C&R) |
| Syringe needles (G20) | VWR | 613-0554 | Used to puncture rubber caps in order to allow the non-functional part of the C&R to lead through it |
| Neubauer chamber | Roth | T729.1 | Used to count cells |
| Pasteur pipettes 150 mm | Volac | D810 | Used for the low-volume application of cells to the C&R |
| Grease pen | Dako | S2002 | Used on glass slides to hold cell suspension in place |
| Steril syringe filter (0.2 µm) | Corning | 431219 | For filtering freshly prepared Gilupi Release Buffer |
| Delfia PlateShaker | Perkin Elmer | 1296-003 | Used for agitation during cell detachment |
| 1.5 mL tubes | Eppendorf | 30,125,150 | |
| Ampli1 WGA Kit | Silicon Biosystems | To be ordered via Silicon Biosystems | |
| Axiovert M200 equipped with Mikromanipulator MMJ and CellTram vario | Zeiss/Eppendorf | Use micromanipulation at hand | |
| Microcapillaries (25 µm in diameter), CustomTip Type I | Eppendorf | 930001201 | Used for micromanipulating cells |
| 0.2 mL PCR tubes | Biozym | 710920 | |
| Cytocentrifuge and equippment | Hettich | Universal 32 | Use cytocentrifuge at hand |
| Thermo cycler | Bio-Rad | DNA Engine Dyad | Every thermo cycler with heated lid can be used |
| Microcentrifuge | Roth | CX73.1 | Use desk-top centrifuge at hand |
| MembraneSlide 1.0 PET | Zeiss | 415101-4401-050 | Membrane-coated glass slides used for laser microdissection |
| UV Stratalinker 1800 | Stratagene | 400072 | Use DNA cross linker at hand |
| Standard PCR reagents | |||
| 6x DNA Loading | Thermo Fisher Scientific | R0611 | Use gel loading dye at hand |
| DNA ladder | BioLabs | N0551G | Use 100 bp ladder at hand |
| Agarose | Biozym | 840004 | |
| Gel electorphoresis station | Bio-Rad | Use electrophoresis system at hand | |
| Gel Red Nucleic Acid Stain | Biotium | 41003 | Intercalating dye for DNA visualization In agarose gels |
References
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