Summary
Vi rapporterer en lille hårnål RNA (shRNA) og næste generation sequencing-baseret protokol til at identificere regulatorer af x-kromosom Inaktiveringen i en murine cellelinie med firefly luciferase og hygromycin resistensgener smeltet til methyl CpG bindende protein 2) MeCP2) gen på det inaktive X kromosom.
Abstract
Fremad genetiske skærme bruger reporter gener indsættes i heterochromatin har været flittigt brugt til at undersøge epigenetiske kontrolmekanismer i modelorganismer. Teknologier, herunder kort hårnål RNA'er (shRNAs) og grupperet regelmæssigt interspaced korte palindromiske gentagelser (CRISPR) har aktiveret sådanne skærme i diploide pattedyrsceller. Beskriver her vi en storstilet shRNA skærm til regulatorer af x-kromosom Inaktiveringen (XCI), ved hjælp af en murine cellelinie med firefly luciferase og hygromycin resistensgener bankede i C-endepunktet for methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2) genet på det inaktive x-kromosom (Xi). Reaktivering af construct i reporter cellelinie tillægges overlevelsesfordel under hygromycin B valg, gør det muligt for os at screene store shRNA bibliotek og identificere Hårnåle, genaktiveret reporter ved at måle deres post udvalg berigelse ved hjælp af næste generation sequencing. De beriget Hårnåle blev derefter individuelt valideret ved at teste deres evne til at aktivere luciferase reporter på Xi.
Introduction
En de mest almindelige former for arvelige mental svækkelse i hunner, Rett syndrom, er forårsaget af heterozygous mutationer i MeCP2, et x-kromosom-gen, der koder et protein, der er nødvendige for normal neuronal funktion1. En potentiel tilgang til behandling af denne lidelse skulle reaktivering af den MeCP2 vildtypeallelen på Xi, som restaurering af MeCP2 udtryk var vist sig at vende neurologiske underskud i en musemodel af denne sygdom1, 2 , 4. men epigenetiske hæmning af en af de to X-kromosomer i celler, kvindelige stramt vedligeholdes i hele levetiden for en organisme3,4, og robust reaktivering af en Xi gen vil sandsynligvis kræve en større forstyrrelser i flere epigenetisk regulering veje.
For at identificere faktorer, der er nødvendige for opretholdelsen af MeCP2 hæmning, vi først udviklet en transgene musemodel bærer en MeCP2- luciferase - hygromycin resistens gen fusion (MeCP2-LUC-HR) på en af de to X-kromosomer (X MeCP2-LUC-HRxMeCP2)5. Selv om MeCP2 udtrykt fra fusion konstruere viste sig for at være ustabil og resulterede i et tab af funktion, fænotype efterligner MeCP2 sletning i hemizygous hanner (XMeCP2-LUC-HR/Y), udtryk for reporter gener var let påviselige i et mønster, der er konsistent med udtrykket af endogene MeCP25. Vi derefter genereret udødeliggjort fibroblast kloner med konstruktion på enten inaktiv eller aktiv x-kromosom, og bekræftede, at tidligere udtrykt vildtype MeCP2 og ikke journalist konstruere; omvendt var tilfældet for sidstnævnte. Når de udsættes for et DNA demethylating agent kendt at ophæve genhæmning, 5-azacytidine (5-AZA), celler med reporter på Xi ("reporter celler") fik aktivitet i en bioluminescens assay, der angiver, at vores konstruere kunne genaktiveres og derfor anvendes til genetisk screening.
Dernæst udviklede vi en høj overførselshastighed genetiske skærm til regulatorer af MeCP2 hæmning. Reporter cellelinie var først inficeret med en retroviral bibliotek indeholdende > 60.000 forskellige shRNAs målretning > 25.000 gener hele musen genom5,6og derefter udsat for hygromycin B udvalg. Hårnål frekvens blev sammenlignet i før og efter udvalg prøver ved hjælp af næste generation sequencing, som reporter reaktivering vækst fordel under hygromycin B udvælgelse og resulterede i berigelse af ansvarlig Hårnåle. Brug denne fremgangsmåde, vi identificeret 30 gener involveret i MeCP2 hæmning, og senere bekræftet af resultaterne af transducing reporter celler med individuelle Hårnåle og måle deres luciferase aktivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle trin, der involverer dyr blev udført ved hjælp af protokoller, der er godkendt af de Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC). Ingen reagenser, der anvendes her, vides at indebære betydelige menneskelige sundhedsrisici undtagen 5-azacytidine (5-AZA).
1. skabe en reporter cellelinie med MeCP2- LUC-HR transgen på Xi
-
Forberede mus senen fibroblaster fra en kvindelig XMeCP2-LUC-HR xMeCP2 mus
- Aflive en 10-12 dages-gamle kvinde XMeCP2-LUC-HRxMeCP2 mus.
- Brug lige dissektion saks, lave en omkredsen snit gennem huden af den proksimale hale del.
- Holde slagtekroppen nær bunden af halen, trække huden væk fra musen til at udsætte fibrocartilaginous del af halen. Fjerne og skær terminal 10 mm af de udsatte væv i 1 mm lange fragmenter ved hjælp af en kirurgisk skalpel.
- Overførsel af fragmenterede væv til en 15 mL konisk rør der indeholder 5 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM) suppleret med 1 U/mL-penicillin, 1 µg/mL streptomycin og 1,5 mg/mL collagenase, pre filtreret gennem 0,45 µm og derefter 0,2 µm mesh filtre. Inkuber i 3-4 timer ved 37 ° C med kontinuerlig rotation.
- Centrifuge prøve ved stuetemperatur på 500 x g i 10 min. resuspenderes i 10 mL af DMEM suppleret med 10% føtal bovint serum, 1 U/mL penicillin, og 1 µg/mL streptomycin (DMEM-10) og plade på en 6-godt vævskultur plade. Passage cellerne en gang og udvide til en 10 cm plade, før du fortsætter til næste trin.
- Udødeliggøre cellerne ved at udføre en transduktion med et udtryk vektor transporterer HPV-16 viral onkogener (E6/E7), som tidligere beskrevet7.
-
Hvis du vælger enkelt celle kloner og kendetegner MeCP2 reporter udtryk
- Høste celler fra en 10 cm plade. Første Aspirér medierne, tilsættes 1 mL 0,05% trypsin-EDTA og inkuberes i 2-5 min ved 37 ° C. Dæmpning med 9 mL af DMEM-10 og indsamle de resuspenderede celler i en 15 mL konisk slange.
- Fortyndes cellerne med DMEM-10 til en endelig koncentration på 1 celle/100 µL. overføres til 96-brønd plader af pipettering 100 µL af suspension i hver brønd.
- Der inkuberes ved 37 ° C, indtil brøndene er sammenflydende, som kan tage op til 2-3 uger. Erstatte medierne med friske DMEM-10 hver 3-5 dage. Når sammenflydende, mobilisere celler med 20 µL af 0,05% trypsin-EDTA pr. brønd og opdele dem i to identiske sæt af 96-brønd plader.
- Bruge et sæt plader til assay for luciferase aktivitet. Bruge en homogen firefly luciferase assay kit, som ikke kræver media fjernelse. Følg den protokol, der følger med sættet.
- Bruge resultaterne fra trin 1.2.4 for at vælge kloner med ingen påviselige luciferase aktivitet fra de resterende sæt af plader. Udvide disse kloner til 24-godt og derefter 6-godt plader.
- Udføre det samme for en klon med den højeste luciferase aktivitet; Dette vil blive brugt som en positiv kontrol til valideringsformål.
- Høste en delprøve af hver brønd i 6-godt pladen til en vestlige skamplet. Mobilisere celler med 200 µL af 0,05% trypsin-EDTA. Der inkuberes i 2-5 min ved 37 ° C. Dæmpning med 2 mL af DMEM-10, og overføre halvdelen af cellerne til 1,5 ml-centrifugerør. Vaske cellerne en gang med PBS før lysing for vestlige skamplet. Alternativt, overføre halvdelen af cellerne til en anden 6-godt plade. Når cellerne tillægger undersiden af pladen, skyl med PBS og lyse for vestlige skamplet.
- Udføre en Western skamplet med anti-MeCP2 antistoffer til at bekræfte, at luciferase-negative celler express, mens de luciferase-positive celler ikke udtryk vildtype MeCP2 fra active X-kromosom; Følg den tidligere beskrevne protokol8. Bruge hjernevæv lysate fra enhver vilde type mus som positiv kontrol.
- Plade flere negative kloner på 2 x 105 celler/brønd i en 6-godt plade. Behandle en gang med 10 µM 5-AZA, inkuberes i 72 h uden at ændre medierne og assay for luciferase aktivitet som beskrevet i trin 1.2.3.
- Vælg en negativ klon (Xi klon), der fik luciferase aktivitet med 5-AZA og begynde at udvide det til flere 10 cm plader. Fryse de resterende negative kloner i flydende kvælstof som en sikkerhedskopi. Den positive klon (Xa klon) kan opretholdes i vævskultur eller frosne indtil videre anvendelse.
2. screening biblioteket for reaktivering ved hjælp af hygromycin B udvalg
-
Inficere test klon, anvende udvalg og høst DNA til sekvensering
- Få viral koncentrater af retroviral konstruktioner udtrykker Hårnåle fra en shRNA bibliotek, eller producere koncentreret viral supernatanten ved hjælp af protokollen, indgår med det ønskede bibliotek.
- Før du fortsætter med skærmen, titreres biblioteket (ved hjælp af en normal god landbrugspraksis markør, hvis den er tilgængelig). Målet for en mangfoldighed af infektion mellem 0,3 og 0,5.
Bemærk: Udføre mindst fire uafhængige skærme for at minimere falske positive priser. Bruge 20 plader pr. skærm til at opnå 100-fold dækning af biblioteket for at opretholde passende repræsentation af Hårnåle og undgå tilfældige udfald9. Givet positiv markeringsskærmbilledet og et stort bibliotek størrelse, er det imidlertid sandsynligt, at en lavere dækning ville være tilstrækkeligt. - Om morgenen, plade 1 x 106 Xi celler på 10 cm vævskultur plader.
- Om eftermiddagen kan inficere pladerne ved at erstatte mediet med friske DMEM-10 indeholder viral supernatanten og 5-10 µg/mL af polybrene. Bruge mængden af viral supernatanten bestemmes i trin 2.1.2.
- Efter 18-24 h, Aspirér medierne og der tilsættes 10 mL af friske DMEM-10 til hver plade. Kultur til en anden 48 h.
- Om morgenen, mobilisere celler ved hjælp af 1 mL 0,05% trypsin-EDTA pr. plade og slukke med 9 mL af DMEM-10 pr. plade. Køre suspension gennem en 100 µm mesh-filter. Samle de filtrerede suspensioner, og frø to sæt af 10 cm plader på 1 x 106 celler/plade.
- Om eftermiddagen, skal du erstatte medier i et sæt af plader med DMEM-10 indeholder 15 µg/mL af hygromycin B (dag 0). I andet sæt, skal du erstatte medierne med friske DMEM-10 kun.
- Efter 48 timer, mobilisere celler fra ubehandlet sæt af plader ved hjælp af 1 ml 0,05% trypsin-EDTA. Der inkuberes i 2-5 min ved 37 ° C. Dæmpning med 9 mL af DMEM-10. Overfør celler til 15 ml konisk rør, og der centrifugeres 500 g ved x i 5 minutter ved stuetemperatur. Opsug analysere og omgående foretage med udvinding DNA fra pellets. Alternativt, pool cellerne i større rør inden centrifugering trin.
- Uddrag DNA ved hjælp af en blanding af phenol og chroroform og udfældes DNA med natrium acetat og kolde ethanol som tidligere beskrevet10. Pool operatørvalg DNA enkeltprøver og opbevares ved-20 ° C indtil videre anvendelse.
- Fortsat dyrkning hygromycin B markeringssæt for 4 dage. Genopbygge udvalg medier med friske DMEM-10 indeholdende hygromycin B efter 2 dage.
- På dag 7, skal du erstatte udvalg medier med friske DMEM-10 kun. Tillader 2-4 dage for nyttiggørelse, og derefter høste cellerne, som beskrevet i trin 2.1.8. Fortsæt med DNA-ekstraktion som beskrevet i trin 2.1.9.
-
At identificere Hårnåle beriget med efter udvælgelsen prøver
- Brug 5' kontekst (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') og 3' reverse loop primere (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') til at forstærke halv-Hårnåle fra før og efter valg DNA-prøver. Bruge alle udpakkede DNA i separate PCR reaktioner med 100-200 ng af DNA, per reaktion.
Bemærk: Disse forbindelse primer 5' og 3' reverse loop primere svarer til miR-30 sammenhæng sekvensen opstrøms af shRNA Indsæt og sekvens på shRNA sløjfen, henholdsvis. Forskellige biblioteker vil kræve forskellige oligos. Justere rensning trin for at isolere anderledes produktstørrelser som nødvendigt. - Brug størrelse-udvalg perlerne til fjerne primere og genomisk DNA, og Genskab PCR produkter mellem 100 og 200 bp. følge protokollen inkluderet med perlerne.
- Forberede en sekventering bibliotek til sekvens halv-Hårnåle. Generere mindst 50 millioner læser per skærm. Følg protokol egnet til sekvensering kit og udstyr.
Bemærk: 50 millioner læser per skærm giver 1000-fold repræsentation af hver shRNA i biblioteket og ca 10-fold dækning af hver uafhængig infektion (aflagt 100-fold repræsentation af hver shRNA), der sikrer tilstrækkelig repræsentation af hver infektion begivenhed. - Optælle hver shRNA ved hjælp af et Perl-script, der tæller sekvenser med perfekte kampe. Valgte shRNAs, der havde mindst 10 læsninger i forhåndsudvælgelse puljen for yderligere analyse. Beregne enrichments, som nøgletal for post til operatørvalg tæller og bestemme falsk opdagelse sats (FDR) på grundlag af 1000 permutationer. Valgte gener målrettet ved shRNAs med < 5% FDR som "hits" for yderligere test.
- Brug 5' kontekst (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') og 3' reverse loop primere (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') til at forstærke halv-Hårnåle fra før og efter valg DNA-prøver. Bruge alle udpakkede DNA i separate PCR reaktioner med 100-200 ng af DNA, per reaktion.
3. validering af de identificerede Hårnåle ("hits")
-
Emballage lentiviruses indeholdende shRNAs identificeret i skærmen
- Frø 8 x 106 293 FT celler pr. plade på 10 cm plader.
- Den følgende dag, erstatte medierne med 9 mL af antibiotika-gratis DMEM-10 pr. plade; gøre denne 30 minutter før Transfektion.
- I løbet af den 30-minutters interval, forberede to blander Transfektion:
- Forberede Mix 1 (pr. plade/shRNA; skala op efter det samlede antal shRNAs): 10 µL af 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) i 0,5 mL af optimal minimum essential medier. Mix af pipettering og inkuberes ved stuetemperatur i 5 min.
- Forberede Mix 2 (per shRNA): 4 µg for shRNA vektor at være pakket, 1,5 µg af VSV-G kuvert vektor (pMD2.G) og 2,5 µg af emballage vektor (psPAX2), blandet i 0,5 mL af optimal minimum essential medier.
Bemærk: Omfatte en tom lentiviral vektor i emballage til brug i senere infektioner som en negativ kontrol.
- Tilsættes 0,5 mL mix 1 til hver delprøve af mix 2, og bland forsigtigt af pipettering. Inkuber i mørke ved stuetemperatur i 20 min.
- Påfør blandingen på hver tallerken fra trin 3.1.2 i en dråbevis mode; Swirl plade forsigtigt at blande.
- Den følgende dag, erstatte medierne med 5 mL frisk DMEM-10.
- 48 timer efter første Transfektion, indsamle supernatanten og køre det gennem et 0,22 µm filter. Pre våd filter med DMEM-10 at maksimere opsving.
- Alikvot filtrerede supernatanten beløb ideel til at inficere en 6-godt plade godt.
- Fryse alikvoter ved-80 ° C til senere brug, eller fortsætte straks med transduktion.
-
Transduktion og testning af individuelle Hårnåle for luciferase reporter reaktivering og genaktivering af vildtype MeCP2 gen på Xi.
- Om morgenen, plade 1 x 105 Xi celler/brønd på 6 godt plader.
- Om eftermiddagen kan inficere pladerne ved at erstatte mediet med 2 mL frisk DMEM-10 indeholdende lentiviral supernatanten og 5-10 µg/mL af polybrene. Inficere en kontrol med viral supernatanten fremstillet af en tom lentiviral vektor.
- Den følgende dag, erstatte medierne med 2 mL af DMEM-10 indeholdende 1 mg/mL puromycin. Kultur i fire dage.
- Erstatte medierne med 2 mL frisk DMEM-10 og tillader 48-72 h til nyttiggørelse.
- Mobilisere celler med 150 µL af 0,05% trypsin-EDTA. Der inkuberes i 2-5 min ved 37 ° C. Dæmpning med 1,5 mL af DMEM-10. Overfør celler til 15 ml koniske rør og centrifugeres 500 x g i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern mediet og resuspend celler i 100 µL lysisbuffer findes i luciferase assay kit. Inkuber ved stuetemperatur i 5 minutter. Overførsel af lysates til en hvid 96-brønd plade og assay for luciferase aktivitet ved hjælp af protokollen, der følger med sættet. Bruge Xa celler som positiv kontrol og Xi celler inficeret med en tom lentiviral vektor som en negativ kontrol.
Bemærk: Undgå at udsætte de hvide plader til fluorescerende lys før analysen; Dette vil reducere baggrunden og øge assay følsomhed. Protokollen findes i analysen kit blev fundet for at være mest effektiv, hvis udført i mørke når det er muligt. - For at afgøre, om hårnålen havde en effekt på niveauet udtryk af MeCP2 på den aktive x-kromosom, isolere RNA fra tranduced Xi celler og måle MeCP2 mRNA niveau ved hjælp af kvantitativ PCR med primere designet til at forstærke kun vildtype MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
- Valgfri: Øge følsomheden af analysen ved at tilføje 5-AZA til en endelig koncentration på 0,2 µM efter cellerne har genvundet fra puromycin udvalg. Kultur celler i 72 timer uden at erstatte mediet, og derefter assay for luciferase aktivitet ved hjælp af kommercielle luciferase assay kit.
- Måle reaktivering af den lyddæmpet wild-type MeCP2. Inficere Xa celler, som havnen vildtype MeCP2 på Xi, med den vektor, der indeholder individuelle Hårnåle, protokol trinnene 3.2.1. -3.2.4. Isolere RNA fra celler og måle MeCP2 mRNA niveau ved hjælp af kvantitativ PCR med primere designet til at forstærke kun vildtype MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Musen senen fibroblaster var høstet fra en tidligere beskrevet XMeCP2-LUC-HRxMeCP2 kvindelige mus, udødeliggjort af retroviral transduktion af E6 og E7 onkogener fra HPV-16 virus7, klonet med begrænsende fortynding, og testet for luciferase aktivitet og udtryk for vildtype MeCP2 protein (figur 1A og 1B). Luciferase aktivitet var robust hvis reporter var på Xa og målbart hvis på Xi; den indfødte MeCP2 udtryk udstillet en gensidig mønster. Vi har valgt en klon med ingen luciferase aktivitet (Xi-8) og en klon med robust aktivitet (Xa-3) for yderligere eksperimenter. Når Xi-8 celler blev behandlet med 5-AZA, konstateredes en dosisafhængig induktion i luciferase aktivitet (figur 1 c).
Følsomhed af Xi-8 og Xa-3 celler til hygromycin B blev testet ved at udføre 3-6 dag-lange markeringer. Som forventet fra udtryk mønster af luciferase reporter, blev Xi-8 celler mere følsomme over for hygromycin B end Xa-3 celler, selvom sidstnævnte udstillet følsomhed over for højere doser (figur 2A). Efter en 1: 100 blanding af Xa-3 til Xi-8 celler blev udsat for forskellige koncentrationer af blev hygromycin B, en tidsafhængig stigning i luciferase aktivitet observeret, der angiver vellykket konkurrence af Xa-3 celler over Xi-8 celler (figur 2B). Dosis og varigheden af hygromycin B udvælgelse blev valgt til yderligere forsøg baseret på præferentielle hæmning af Xi-8 over Xa-3 celler.
Fire uafhængige skærme blev udført for at identificere regulatorer af MeCP2 hæmning ved hjælp af Xi-8 cellelinje og en åben Biosystems miR-30-baseret shRNA bibliotek indeholdende 64,159 forskellige Hårnåle klonet i en retroviral MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP vektor. I hvert skærmbillede, blev tyve 10 cm plader smittet med poolet shRNAs, målretning ca 100-fold dækning af biblioteket. Hygromicin B blev foretaget for 6 dage, indtil lille acellulær patches blev observeret; cellerne fortsatte med at dø for yderligere 24 til 48 timer. Når inddrives, blev cellerne høstet for DNA-ekstraktion med en teknik, phenol-chloroform. Det samlede DNA udbytte pr. skærm var ca. 20 µg/plade, som blev samlet og delt mellem 100 PCR reaktioner ved hjælp af primere designet til at forstærke halv-Hårnåle. PCR produkter blev derefter perle-renset og udsat for høj overførselshastighed sekvensering.
Før og efter udvalg prøver blev sammenlignet for at bestemme hårnål berigelse, som vi forventede, at enhver hårnål stede på forhøjede niveauer i eksemplet efter udvalg målrettet gener, der genaktiveres Xi og dermed tillægges hygromycin modstand. Kun Hårnåle beriget med mindst 2 af de fire skærme ansås for validering. De mest beriget Hårnåle i alle replikater af vores skærmen var fire Hårnåle rettet mod XIST, i overensstemmelse med dens afgørende rolle i XCI11.
Validering del af skærmen blev udført af individuelt test de Hårnåle, der er registreret som hits for aktivering af luciferase reporter i Xi-8 celler. Selvom skærmen blev udført ved hjælp af en MSCV-baseret retroviral bibliotek, blev valideringen udført ved hjælp af en lentiviral vektor (individuelle pGIPZ kloner med shRNA) at undgå mulige påvisning af retrovirus-induceret artefakter.
Hver af kandidat gener blev byen ramt af mindst to forskellige hårnål sekvenser, og knockdown af target-genet blev bekræftet af realtid kvantitativ PCR (RT-qPCR). Ved paavisning op til 1 x 106 celler i 6-godt format og faldende baggrund luminescens (figur 2 c), var vi købedygtig opdager meget lavfrekvent reaktivering begivenheder, som vi anslås for at ligge på 1:20,000.
Yderligere analyse ved hjælp af individuelle Hårnåle førte til identifikation af 30 gener hvis knockdown resulterede i reaktivering af reporter på Xi. Den mediane dumpingmargenens luminescence for disse 30 gener var 2.8-fold over baseline, som blev yderligere forstærket 7.1-fold følgende 5-AZA behandling. De samme Hårnåle blev efterprøvet i forbindelse med 5-AZA, med Xa-3 celler til at bekræfte igen udtryk for vildtype MeCP2 fra Xi. Dette blev opnået ved at udføre RT-qPCR ved hjælp af primere designet til at forstærke kun vildtype afskriften af MeCP2.
Figur 1. Isolation af kloner med MeCP2-Luc-HR reporter gen på Xi.
A) repræsentative firefly luciferase assay på udødeliggjort senen fibroblaster kloner (1-9). Primære fibroblaster fra ikke-transgene (NT) og transgene heterozygous kvinde (F) blev brugt som negativ og positiv kontrol, henholdsvis. B) repræsentant Western skamplet viser MeCP2 protein udtryk fra cellerne i (A). Bemærk at luciferase aktivitet (figur 1A) og MeCP2 udtryk udviser gensidig udtryk mønster. C) induktion af firefly luciferase aktivitet i Xi-8 celler med 5-AZA. XA-3 celler, med reporter gen på Xa, tjene som positiv kontrol. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Karakterisering af hygromycin resistens i Xi-8 og Xa-3 celler.
A) relative vækst af Xi-8 og Xa-3 celler behandles med forskellige hygromycin B regimer (3D = 3 dage; 6D = 6 dage), som i forhold til ubehandlede celler. B) luciferase aktivitet berigelse efter udsætter ialt 10.000 Xa-3 og Xi-8 celler (blandes i forholdet 1: 100) til hygromicin B (25 µg/mL) for angivet antal dage. Efter eksponering luciferase aktivitet var divideret med pre-eksponering niveau til at beregne berigelse. C) firefly luciferase aktivitet i Xi-8 celler, analyseres i 96 - og 6-godt format, med og uden 5-AZA (10 µM). Ikke-transgene (NT) fibroblaster blev brugt som en negativ kontrol. 5-AZA øget luciferase aktiviteten 7.2 og 86 gange over grundlinjen i 96 - og 6-godt format, henholdsvis. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 af Student's t-test sammenligning 5-AZA behandlet og ubehandlet Xi-8 celler.) Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I vores seneste undersøgelse6, vi genereret en murine cellelinie med luciferase og hygromycin resistensgener sammenvokset til MeCP2 på Xi, og transduced det med et bibliotek med > 60.000 shRNAs målretning > 25.000 gener. Vi fandt 30 gener hvis knock-down konfererede overlevelsesfordel under valg af hygromycin B tyder på deres rolle i kontrol af MeCP2 og x-kromosom hæmning. Disse resultater er blevet godkendt af transducing den rapporterede cellelinie med individuelle Hårnåle og vurdere reaktivering af tavse luciferase reporter.
Den konstatering, at de top fire Hårnåle i alle replikater af vores skærm målrettet XIST fastsat en stærk intern validering for vores metode, på grund af XIST afgørende rolle i XCI11. Bortset fra TGFβ superfamilien, hvis regulerende rolle i XCI ikke havde været tidligere beskrevet, tilhørte de andre alle identificerede gener funktionelle familier med bånd til epigenetisk regulering, dermed tjener som en supplerende validering for vores metode12 , 13 , 14. Desuden er vi også fundet 4 ud af 13 gener tidligere identificeret i en anden skærm, ved hjælp af en CMV promotor-drevet normal god landbrugspraksis tilfældigt indsat på Xi15.
Oprettelse af passende dosis og varigheden af hygromycin var B udvælgelse afgørende i at optimere screeningen betingelser. Følsomheden af vores cellelinie var stærkt afhængig af såning tæthed, og blev negativt påvirket af retroviral infektion. Øget doser eller længde af udvalg også hæmmet vækst af celler med reporter på Xa, hvorimod mildere udvalg nedsat følsomhed for hårnål berigelse. Flere hygromycin B dosering regimer og reporter celle såning tætheder blev således testet inden den endelige screening. Desuden, selv om MSCV retroviral vektor i vores shRNA bibliotek gav mulighed for at bruge puromycin udvalg og berige for med held transduced celler, puromycin ikke blev anvendt i vores eksperimenter, som den sekventielle brug af puromycin og hygromyin B resulterede i overdreven toksicitet, selv efter passende dosis nedtrapning af både antibiotika.
Alle Hårnåle identificeret i vores undersøgelse også genaktiveret tavse luciferase reporter, omend i en mere beskeden grad. Påvisning af disse sjældne hændelser blev aktiveret af høj følsomhed på vores skærm, som vi anslog, baseret på test Tilslagsstoffer Xi og Xa celler, skal en reaktivering begivenhed i 2 x 104 celler. Sådanne lave niveauer af reaktivering, steg med fælles anvendelse af 5-AZA, vidner om tidligere beskrevet vanskeligheder i forstyrre stramme transcriptional kontrol XCI12,13,16,17, og indebære, at afbrydelse af flere reguleringsmekanismer ville være nødvendige for at opnå betydelige reaktivering.
Bemærk genaktiveret alle 30 Hårnåle identificeret i vores skærm også en CMV-drevet reporter gen placeret på en anden x-kromosom locus, der angiver deres bredere indvirkning på Xi nedtrapning undertrykkelse. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at teste, om MeCP2-specifikke "reactivators" eksisterer, som deres farmakologiske eller genetisk manipulation kan vise sig særdeles nyttige i behandling af Rett syndrom.
Vores screening system tilbyder flere fordele i forhold til de tidligere beskrevne reportere bruges til x-kromosomet reaktivering skærme12,17. I stedet for at være drevet af en CMV promotor, vores reporter kassette er slået i C-endepunktet for MeCP2 og er således drevet af den oprindelige X-linked promotor. Dette design kan hjælpe med at identificere MeCP2 locus-specifikke regulatorer, mere relevant i forbindelse med Rett syndrom forskning, med en advarsel, at resultaterne i udødeliggjort fibroblaster bør være sammenfattet i neuroner, det ønskede websted i MeCP2 reaktivering. Brugen af et hygromycin resistens gen giver positiv markering af reaktivering begivenheder og øger håndfast skærmen følsomhed. Derudover giver kassetten indeholdende hygromycin modstand og firefly luciferase gener både omfattende screening ved hjælp af positiv markering med hygromycin B og testning/screening individuelle Hårnåle bruger luciferase reporter.
Sammenfattende rapport vi en robust og følsom genetisk screeningsmetode til identifikation af regulatorer af MeCP2 og x-kromosom silencing i pattedyrsceller. Denne metode kunne tilpasses til screening små interfererende RNA'er (siRNAs), CRISPR, eller små molekyler. Disse analyser kunne være nyttige ved oprettelse af terapeutiske tilgange, der stoler på Genaktiver den funktionelle allel af en tavs gen, som i forbindelse med Rett syndrom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Leko bidraget til denne artikel som ansat i Fred Hutchinson Cancer Research Center. Synspunkterne er hans egne og repræsenterer ikke nødvendigvis synspunkter af National Institutes of Health eller de Forenede Staters regering
Acknowledgments
Vi takker Ross Dickins af University of Melbourne allernådigst giver shRNA biblioteket anvendes i skærmen. Dette arbejde blev finansieret af Rett syndrom forskning Trust (A.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
