Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

Wij rapporteren een kleine haarspeld RNA (shRNA) en de volgende generatie sequencing-gebaseerd protocol voor het identificeren van de regelgevers van de inactivering van het x-chromosoom in een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten aan de methyl CpG bindende eiwit 2) MeCP2) gen op het X-chromosoom inactief.

Abstract

Voorwaartse genetische schermen met behulp van verslaggever genen ingevoegd in de heterochromatin zijn uitgebreid gebruikt om de mechanismen voor controle van de epigenetische in modelorganismen onderzoeken. Technologieën met inbegrip van korte haarspeld RNAs (shRNAs) en geclusterde regelmatig interspaced korte palindromische herhaalt (CRISPR) hebt ingeschakeld op dergelijke schermen in diploïde cellen van zoogdieren. Hier beschrijven we een grootschalige shRNA scherm voor regelgevers van x-chromosoom inactivering (XCI), met behulp van een lymfkliertest cellijn met firefly luciferase en hygromycin resistentiegenen klopte in het C-terminus van de methyl CpG bindend-proteïne 2 (MeCP2) gen op het inactieve x-chromosoom (Xi). Reactivering van de constructie in de verslaggever cellijn verleende overleving voordeel onder hygromycin B selectie, waarmee we een grote shRNA bibliotheek scherm en identificeren van haarspelden dat gereactiveerd de verslaggever door te meten met behulp van hun na selectie verrijking volgende-generatie sequencing. De verrijkte haarspelden werden vervolgens individueel gevalideerd door het testen van hun vermogen om het activeren van de luciferase verslaggever op Xi.

Introduction

Één de meest voorkomende vormen van erfelijke geestelijke stoornis bij vrouwtjes, Rett syndroom, wordt veroorzaakt door heterozygoot mutaties in MeCP2, een x-chromosoom-gen dat codeert voor een eiwit dat essentieel is voor de normale functie van de neuronale1. Een mogelijke aanpak voor de behandeling van deze aandoening zou reactivering van het wild-type MeCP2 -allel op de Xi, zoals herstel van MeCP2 expressie bleek te keren neurologische tekorten in een muismodel van deze ziekte1, 2 , 4. echter strak epigenetische monddood maken van één van de twee X chromosomen in vrouwelijke cellen wordt gehandhaafd gedurende de levensduur van een organisme3,4, en robuuste reactivering van een Xi-gen zou waarschijnlijk vereisen een grote verstoring in meerdere epigenetische regelgevende trajecten.

Om te identificeren factoren nodig zijn voor onderhoud MeCP2 monddood maken, ontwikkelden we eerst een transgeen muismodel uitvoering een MeCP2- luciferase - hygromycin weerstand gene fusion (MeCP2-LUC-HR) op één van de twee X chromosomen (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Hoewel het MeCP2 uitgedrukt uit de fusion-constructie bleek instabiel en resulteerde in een verlies van functie, fenotypische nabootsen MeCP2 schrapping in hemizygous mannen (XMeCP2-LUC-HR/Y), de uitdrukking van de genen van de verslaggever was in een patroon overeen met de uitdrukking van endogene MeCP25gemakkelijk worden opgespoord. Wij vervolgens gegenereerd vereeuwigd fibroblast klonen met de constructie op actieve of inactieve x-chromosoom, en bevestigd dat voormalig uitgedrukt wild type MeCP2 en niet de verslaggever constructie; de inverse Gold voor de laatstgenoemde. Wanneer blootgesteld aan een DNA demethylating agent bekend te trekken gene silencing, 5-azacytidine (5-AZA), de cellen met de verslaggever op de Xi ("verslaggever cellen") activiteit in een bioluminescentie assay, die aangeeft dat onze constructie kan worden gereactiveerd opgedaan en daarom gebruikt voor genetische screening.

Volgende ontwikkelden we een scherm high-throughput genetische voor regelgevers MeCP2 monddood maken. De verslaggever-cellijn werd eerst besmet met een retrovirale bibliotheek met > 60.000 verschillende shRNAs targeting > 25.000 genen in de muis genoom5,6, en vervolgens onderworpen aan hygromycin B selectie. Haarspeld frequentie bedroeg vergeleken in pre en post selectie monsters met behulp van de volgende generatie sequencing, als verslaggever reactivering verleende groei voordeel onder hygromycin B-selectie en resulteerde in de verrijking van verantwoordelijk haarspelden. Met behulp van deze aanpak, we geïdentificeerd 30 genen betrokken bij MeCP2 monddood maken, en vervolgens de bevindingen bevestigd door transducing de verslaggever cellen met individuele haarspelden en het meten van hun luciferase activiteit.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle stappen waarbij dieren werden uitgevoerd met behulp van protocollen die zijn goedgekeurd door het Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC). Geen hier gebruikte reagentia is bekend dat de gezondheid van de mens van de aanzienlijke risico's met uitzondering van 5-azacytidine (5-AZA).

1. het genereren van een verslaggever cellijn met MeCP2- LUC-HR transgenic op de Xi

  1. Voorbereiding van muis pees fibroblasten uit een vrouwelijk XMeCP2-LUC-HR /XMeCP2 muis
    1. Een 10-12-daagse euthanaseren-oude vrouw XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 muis.
    2. Met behulp van rechte dissectie schaar, maken een ze incisie via de huid van het gedeelte van de proximale staart.
    3. Houd de karkas in de buurt van de onderkant van de staart en trek de huid uit de buurt van de muis om het fibrocartilaginous gedeelte van de staart bloot te stellen. Verwijderen en snijd de terminal 10 mm van de blootgestelde weefsel in 1 mm lange fragmenten met een chirurgische scalpel.
    4. Overdracht de gefragmenteerde weefsel een conische 15 ml tube met 5 mL van de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM) aangevuld met 1 U/mL penicilline, 1 µg/mL streptomycine, en 1,5 mg/mL collagenase, vooraf gefilterd door 0,45 µm en dan 0,2 µm mesh filters. Incubeer gedurende 3-4 uur bij 37 ° C met continue rotatie.
    5. Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur op 500 x g gedurende 10 min. resuspendeer de pellet in 10 mL DMEM aangevuld met 10% foetale runderserum, 1 U/mL penicilline, en 1 µg/mL streptomycine (DMEM-10) en plaat op een 6-well weefselkweek plaat. Eenmaal passage van de cellen en uit te breiden naar een 10 cm plaat voordat u verdergaat met de volgende stap.
    6. De cellen door het uitvoeren van een transductie met een expressie vector uitvoering van HPV-16 virale oncogenen (E6/E7), zoals eerder beschreven7vereeuwigen.
  2. Selecteren van eencellige klonen en karakteriseren van MeCP2 verslaggever expressie
    1. Het oogsten van de cellen van een 10 cm plaat. Eerst, gecombineerd de media, voeg 1 mL trypsine-EDTA 0,05% en incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 9 mL van DMEM-10 en het verzamelen van de geresuspendeerde cellen in een conische tube van 15 mL.
    2. Verdun de cellen met de DMEM-10 tot en met een eindconcentratie van 1 cel/100 µL. overbrengen naar 96-wells-platen door pipetting 100 µL van de schorsing in elk putje.
    3. Incubeer bij 37 ° C totdat de putten zijn heuvels, die tot 2-3 weken kan duren. Vervang de media met verse DMEM-10 elke 3-5 dagen. Wanneer confluente, mobiliseren de cellen met 20 µL van 0,05% trypsine-EDTA per putje en gesplitst in twee dubbele sets van 96-wells-platen.
    4. Één set platen gebruikt voor de gehaltebepaling voor luciferase activiteit. Gebruik een homogene firefly luciferase assay kit die geen media verwijderen vereist. Volg het protocol die bij de kit geleverd.
    5. De resultaten van stap 1.2.4 klonen met geen detecteerbare luciferase activiteit selecteren in het resterende aantal platen gebruiken. Vouw deze klonen tot 24-well en vervolgens 6-well platen.
    6. Voer hetzelfde uit voor een kloon met de hoogste luciferase activiteit; Dit zal als positieve controle worden gebruikt voor validatie doeleinden.
    7. Oogst een aliquoot gedeelte van elk putje in de 6-well plaat voor een westelijke vlek. Het mobiliseren van de cellen met 200 µL van 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 2 mL DMEM-10, en de helft van de cellen naar 1,5 ml centrifugebuis. Het wassen van de cellen een keer met PBS voor lysing voor westelijke vlek. U kunt ook overbrengen in de helft van de cellen een ander 6-well plaat. Wanneer de cellen aan de onderkant van de plaat koppelt, spoelen met PBS en lyse voor westelijke vlek.
    8. Uitvoeren van een Western blot met anti-MeCP2 antilichaam om te bevestigen dat luciferase-negatieve cellen uitspreken, terwijl de luciferase-positieve cellen doen niet express wild-type MeCP2 uit het active X-chromosoom; Volg de eerder beschreven protocol8. Hersenweefsel lysate uit een wild type muis gebruiken als positieve controle.
    9. Verschillende negatieve klonen bij 2 x 10,5 cellen/well in een 6-well plaat plaat. Een keer behandelen met 10 µM 5-AZA, Incubeer gedurende 72 uur zonder de media en assay voor luciferase activiteit, zoals beschreven in stap 1.2.3.
    10. Kies een negatieve kloon (Xi kloon) dat luciferase activiteit met 5-AZA opgedaan en beginnen met het uit te breiden naar meerdere 10 cm platen. Het bevriezen van de resterende negatieve klonen in vloeibare stikstof als een back-up. De positieve kloon (Xa kloon) kan worden gehandhaafd in de weefselkweek of bevroren tot verder gebruik.

2. de screening van de bibliotheek voor het opnieuw activeren met behulp van hygromycin B selectie

  1. De test kloon infecteren, selectie toepassen en oogsten van DNA voor het rangschikken
    1. Verkrijgen van virale concentraten van retrovirale constructies uiten haarspelden uit een mediawisselaar shRNA of produceren van geconcentreerde virale bovendrijvende vloeistof via het protocol opgenomen met de gewenste bibliotheek.
    2. Titreer voordat u verdergaat met het scherm, de bibliotheek (met behulp van een GFP-marker, indien beschikbaar). Streven naar een veelheid aan infectie tussen 0,3 en 0,5.
      Opmerking: Voer ten minste vier onafhankelijke schermen om te minimaliseren van valse positieve tarieven. 20 platen per scherm te verkrijgen 100-fold dekking van de bibliotheek te handhaven adequate vertegenwoordiging van haarspelden en vermijden van willekeurige dropouts9gebruiken. Echter, gezien de positieve selectiescherm en de grootte van een grote bibliotheek, het is waarschijnlijk dat een lagere dekking zou volstaan.
    3. Plaat in de ochtend, 1 x 106 Xi cellen op 10 cm weefselkweek platen.
    4. In de namiddag, infecteren de platen door vervanging van de media met verse DMEM-10 met virale supernatant en 5-10 µg/mL polybrene. Gebruik maken van de hoeveelheid virale supernatant in stap 2.1.2 vastgesteld.
    5. Na 18-24 h, de media gecombineerd en voeg 10 mL van de verse DMEM-10 aan elke plaat. Cultuur voor een ander 48u.
    6. In de ochtend, de cellen 1 mL 0,05% trypsine-EDTA per plaat met mobiliseren en doven met 9 DMEM-10 mL per plaat. De schorsing doorlopen een 100 µm mesh filter. De gefilterde schorsingen samen bundelen en zaad van twee sets van 10 cm platen op 1 x 106 cellen/plaat.
    7. In de namiddag, door de media in één set platen te vervangen door DMEM-10 met 15 µg/mL van hygromycin B (dag 0). In de andere reeks, door de media te vervangen door verse DMEM-10 alleen.
    8. Na 48 uur, mobiliseren de cellen van onbehandelde aantal platen met behulp van 1 ml trypsine-EDTA 0,05%. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 9 mL van DMEM-10. Overbrengen in de cellen 15 ml conische buizen en centrifuge op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Het supernatant gecombineerd en meteen doorgaan met de extractie van DNA van de pellets. Anderzijds bundelen de cellen in de grotere buizen voor de stap van centrifugeren.
    9. Pak van DNA met behulp van een mengsel van fenol en chroroform en neerslag van DNA met natrium acetaat en koude ethanol als eerder beschreven10. Zwembad de individuele voorselectie DNA-monsters en bewaren bij-20 ° C tot verder gebruik.
    10. Blijven hygromycin B selectie instellen voor 4 meer dagen te kweken. Aanvullen van de media van de selectie met verse DMEM-10 met hygromycin B na 2 dagen.
    11. Op dag 7, door de media van de selectie te vervangen door verse DMEM-10 alleen. Toestaan van 2 tot 4 dagen voor herstel, en vervolgens het oogsten van de cellen zoals beschreven in stap 2.1.8. Ga verder met DNA-extractie, zoals beschreven in stap 2.1.9.
  2. Identificeren van haarspelden verrijkt in de monsters na selectie
    1. Gebruik 5' context (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') en 3' reverse lus inleidingen (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') aan het versterken van de half-haarspelden van pre- en post selectie DNA-monsters. Gebruik alle geëxtraheerd DNA in aparte PCR reacties met 100-200 ng van DNA per reactie.
      Opmerking: Deze context primer 5' en 3' omgekeerde lus inleidingen komen overeen met de miR-30 kader volgorde stroomopwaarts van het donormateriaal shRNA en de volgorde bij de shRNA lus, respectievelijk. Verschillende bibliotheken zal vereisen verschillende oligos. Zuivering stappen om te isoleren van verschillende product maten zo nodig aanpassen.
    2. Gebruik grootte-selectie kralen primers en genomic DNA verwijderen en herstellen van PCR producten tussen 100 en 200 bp. Volg het protocol opgenomen met de kralen.
    3. Bereiden een sequencing bibliotheek aan het volgnummer van de half-haarspelden. Minstens 50 miljoen leest per scherm genereren. Volg het protocol geschikt voor de sequencing kit en apparatuur.
      Opmerking: 50 miljoen leest per scherm biedt 1000-fold vertegenwoordiging van elke shRNA in de bibliotheek en ongeveer 10-fold dekking van elke onafhankelijke infectie (uitgevoerd bij 100-fold vertegenwoordiging van elke shRNA), die zorgt voor een adequate vertegenwoordiging van elk evenement van de infectie.
    4. Het opsommen van elke shRNA met behulp van een perlmanuscript dat sequenties met perfecte matches telt. Koos voor shRNAs die ten minste 10 leest had in de preselectie pool voor verdere analyse. Bereken de verrijking en ratio's van post naar preselectie telt valse ontdekking tarief (FDR) bepalen op basis van 1000 permutaties. Koos van genen gericht door shRNAs met < 5% FDR als "hits" voor verder onderzoek.

3. het valideren van de geïdentificeerde haarspelden ("hits")

  1. Verpakking lentivirussen met shRNAs geïdentificeerd in het scherm
    1. Zaad 8 x 106 293 FT cellen per plaat op 10 cm platen.
    2. De volgende dag, vervangen de media met 9 mL antibioticum-gratis DMEM-10 per plaat; deze 30 minuten vóór de Transfectie te doen.
    3. Tijdens het interval van 30 minuten, twee mixen voor Transfectie te bereiden:
      1. Voorbereiden Meng 1 (per plaat/shRNA; opschalen volgens het totaal aantal shRNAs): 10 µL van 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) in 0,5 mL van optimale minimale essentiële media. Meng door pipetteren en Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
      2. Mix 2 (per shRNA) bereiden: 4 µg van de vector shRNA worden verpakt, 1,5 µg van de vector envelop VSV-G (pMD2.G) en de verpakking vector (psPAX2), 2,5 µg gemengd in 0,5 mL van optimale minimale essentiële media.
        Opmerking: Een lege lentivirale vector in de verpakking te gebruiken in latere infecties als een negatieve controle opnemen.
    4. Voeg 0,5 mL voor mix 1 aan elk aliquot van mix 2, en meng zachtjes door pipetteren. Incubeer in het donker bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
    5. Breng het mengsel op elk bord uit stap 3.1.2 op een dropwise wijze; Swirl de plaat voorzichtig te mengen.
    6. De volgende dag, vervangen de media met 5 mL van de verse DMEM-10.
    7. 48 uur na eerste transfectie, verzamelen het supernatant en voer het uit door een 0,22 µm filter. Vooraf nat het filter met DMEM-10 tot herstel te maximaliseren.
    8. Aliquot het gefilterde supernatant in bedragen ideaal voor het infecteren van een plaat van 6-well goed.
    9. Bevriezen van de aliquots bij-80 ° C voor later gebruik, of gaan onmiddellijk met transductie.
  2. Transductie en testen van individuele haarspelden voor luciferase verslaggever reactivering en reactivering van wild-type MeCP2 gen op de Xi.
    1. Plaat in de ochtend, 1 x 105 Xi cellen per putje op 6 goed platen.
    2. In de namiddag, infecteren de platen door de media te vervangen door 2 mL verse DMEM-10 met lentivirale supernatant en 5-10 µg/mL polybrene. Infecteren een besturingselement goed met virale bovendrijvende vloeistof geproduceerd uit een lege lentivirale vector.
    3. De volgende dag, vervangen de media met 2 mL DMEM-10 bevat 1 mg/mL puromycin. Cultuur voor vier dagen.
    4. De media te vervangen door 2 mL verse DMEM-10 en toestaan van 48-72 uur voor herstel.
    5. Het mobiliseren van de cellen met 150 µL van 0,05% trypsine-EDTA. Incubeer gedurende 2-5 minuten bij 37 ° C. Doven met 1,5 mL van DMEM-10. Overbrengen in de cellen 15 ml conische buizen en centrifuge op 500 x g gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur.
    6. Verwijder het medium en resuspendeer de cellen in 100 µL lysis-buffermengsel waarin de luciferase assay kit. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten. De lysates overbrengen in een witte 96-wells-plaat en assay voor luciferase activiteit met behulp van het protocol die bij de kit geleverd. Xa cellen worden gebruikt als positieve controle en Xi-cellen geïnfecteerd met een lege lentivirale vector als een negatieve controle.
      Opmerking: Vermijd blootstelling van de witte platen te kunstlicht vóór de bepaling; Dit vermindert de achtergrond en verhogen van de gevoeligheid van de test. Het protocol waarin de assay kit bleek te zijn meest effectieve als uitgevoerd in het donker mogelijk.
    7. Om te bepalen of de haarspeld een effect gehad op het niveau van de expressie van MeCP2 op het actieve x-chromosoom, RNA van tranduced Xi cellen isoleren en MeCP2 mRNA meten met behulp van kwantitatieve PCR met inleidingen ter versterken alleen wild type MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. Optioneel: Het verhogen van de gevoeligheid van de test door 5-AZA toe te voegen aan een definitieve concentratie van 0,2 µM, nadat de cellen van puromycin selectie zijn hersteld. Cultuur van de cellen gedurende 72 uur zonder vervanging van de media, en vervolgens assay voor luciferase activiteit met behulp van de commerciële luciferase assay kit.
    9. Reactivering van het zwijgen wild-type MeCP2 meten. Xa-cellen, die het wild type MeCP2 op de Xi, met de vector met individuele haarspelden haven, als volgt het protocol 3.2.1 infecteren. -3.2.4. RNA van cellen isoleren en MeCP2 mRNA meten met behulp van kwantitatieve PCR met inleidingen ter versterken alleen wild type MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Muis pees fibroblasten zijn geoogst uit een eerder beschreven XMeCP2-LUC-HR/XMeCP2 vrouwelijke muis, vereeuwigd door retrovirale transductie van E6 en E7 oncogenen van HPV-16 virus7, gekloond beperkende verdunning wordt toegepast en getest voor Luciferase activiteit en expressie van wild-type MeCP2 eiwit (figuur 1A en 1B). Luciferase activiteit was robuust als de verslaggever op Xa was, en kan niet worden getraceerd als op Xi; de inheemse MeCP2 expressie tentoongesteld een wederzijdse patroon. Wij geselecteerd een kloon met geen luciferase activiteit (Xi-8) en een kloon met robuuste activiteit (Xa-3) voor verdere experimenten. Wanneer Xi-8 cellen werden behandeld met 5-AZA, werd een dosis-afhankelijke inductie luciferase activiteit (Figuur 1 c) waargenomen.

Gevoeligheid voor Xi-8 en Xa-3 cellen hygromycin B werd getest door het uitvoeren van 3 en 6 dagen durende selecties. Vanaf het expressiepatroon van de luciferase verslaggever anders dan verwacht, waren Xi-8 cellen gevoeliger voor hygromycin B dan Xa-3 cellen, hoewel de laatste tentoongesteld gevoeligheid voor hogere doseringen (figuur 2A). Na een 1:100 mix van Xa-3 naar Xi-8 cellen blootgesteld aan verschillende concentraties van was werd hygromycin B, een verhoging van de tijd-afhankelijke luciferase activiteit waargenomen, met vermelding van succesvolle concurrentie van Xa-3 cellen over Xi-8 cellen (figuur 2B). Dosis en de duur van hygromycin B selectie werden gekozen voor verdere experimenten op basis van preferentiële inhibitie voor Xi-8 over Xa-3 cellen.

Vier onafhankelijke schermen werden uitgevoerd om te identificeren van regelgevers MeCP2 monddood maken met behulp van de cellijn Xi-8 en een Open Biosystems miR-30-gebaseerde shRNA bibliotheek met 64,159 verschillende haarspelden gekloond in een MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retrovirale vector. In elk scherm, waren twintig 10 cm platen besmet met gebundelde shRNAs, gericht op ongeveer 100-fold dekking van de bibliotheek. Hygromicin B werd uitgevoerd voor 6 dagen, tot kleine Acellulair patches werden waargenomen; de cellen blijven sterven voor extra 24 tot 48 uur. Toen herstelde, werden de cellen geoogst voor DNA-extractie met behulp van een techniek van fenol-chloroform. De totale opbrengst van het DNA per scherm was ongeveer 20 µg/plaat, die werd gebundeld en verdeeld tussen 100 PCR reacties gebruikend inleidingen ter helft-haarspelden versterken. De PCR-producten werden vervolgens kraal-gezuiverd en onderworpen aan hoge doorvoer sequencing.

Pre-en post selectie monsters werden vergeleken om te bepalen van de haarspeld verrijking, zoals we hadden verwacht dat alle haarspeld aanwezig op een hoog peil in het monster na selectie gericht genen die gereactiveerd Xi en aldus verleende hygromycin weerstand. Alleen haarspelden verrijkt met ten minste 2 van de vier schermen werden beschouwd als voor validatie. De meest verrijkt haarspelden in alle replicatieonderzoeken van onze scherm werden vier haarspelden targeting XIST, overeenstemming met zijn cruciale rol in XCI11.

Het deel van de validatie van het scherm werd uitgevoerd door de haarspeldbochten die geregistreerd als hits voor activering van de luciferase verslaggever in Xi-8 cellen afzonderlijk te testen. Hoewel het scherm werd uitgevoerd met behulp van een MSCV gebaseerde retrovirale bibliotheek, werd de validatie uitgevoerd met behulp van een lentivirale vector (individuele pGIPZ klonen met shRNA) om mogelijke ontdekking van retrovirus-geïnduceerde artefacten te voorkomen.

Elk van de kandidaat-genen werd gericht door ten minste twee verschillende haarspeld sequenties, en het knockdown van het target-gen werd gecontroleerd door de kwantitatieve PCR real time (RT-qPCR). Door het analyseren van maximaal 1 x 106 cellen in 6-well-indeling en het verminderen van de achtergrond luminescentie (figuur 2C), waren wij kundig voor speurder zeer laagfrequente reactivering gebeurtenissen, die we naar schatting in de 1:20,000 bereik.

Verdere analyse met behulp van individuele haarspelden geleid tot de identificatie van 30 genen waarvan knockdown in de reactivering van de verslaggever op de Xi resulteerde. De gemiddelde omvang van luminescentie voor deze 30 genen 2.8-fold was boven de basislijn, die werd verder versterkt 7.1-fold volgende 5-AZA-behandeling. De dezelfde haarspelden werden getest, in combinatie met 5-AZA, met de Xa-3 cellen te bevestigen opnieuw uitdrukking van wild type MeCP2 vanaf de Xi. Dit werd bereikt door het uitvoeren van de RT-qPCR gebruikend inleidingen die zijn ontworpen om alleen het wild type transcript van MeCP2 versterken.

Figure 1
Figuur 1. Isolatie van klonen met het MeCP2-Luc-HR verslaggever gen op de Xi.
A) representatieve firefly luciferase assay op vereeuwigd pees fibroblasten klonen (1-9). Primaire fibroblasten uit niet-transgene (NT) en transgene heterozygote vrouwtje (F) werden gebruikt als negatieve en positieve controles, respectievelijk. B) vertegenwoordiger Western blot MeCP2 eiwit expressie uit de cellen in (A) tonen. Merk op dat luciferase activiteit (figuur 1A) en MeCP2 expressie wederzijdse uitdrukking patroon vertonen. C) inductie van firefly luciferase activiteit in Xi-8 cellen met 5-AZA. XA-3 cellen, met het gen van de verslaggever op de Xa, dienen als positieve controle. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2. Karakterisatie van de weerstand van de hygromycin in Xi-8 en Xa-3 cellen.
A) de relatieve groei van Xi-8 en Xa-3 cellen behandeld met verschillende hygromycin B regimes (3D = 3 dagen; 6D = 6 dagen), als in vergelijking met onbehandelde cellen. B) luciferase verrijking van de activiteit na het blootstellen van een totaal van 10.000 Xa-3 en Xi-8 cellen (gemengd in 1:100 verhouding) hygromicin B (25 µg/mL) voor aangegeven aantal dagen. Post-exposure luciferase activiteit werd gedeeld door de pre blootstellingsniveau voor de berekening van de verrijking. C) firefly luciferase activiteit in Xi-8 cellen, vehiculumcontrolegroep in 96 - en 6-goed formaat, met en zonder 5-AZA (10 µM). Non-transgene (NT) fibroblasten werden gebruikt als een negatieve controle. 5-AZA toegenomen de luciferase activiteit 7.2 - en 86 keer de basislijn in 96 - en 6-goed formaat, respectievelijk. (N = 3, * p < 0.001, ** p < 0,0001 door Student t-test vergelijken 5-AZA behandeld en onbehandeld Xi-8 cellen.) Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In onze recente studie6, we genereerden een lymfkliertest cellijn met luciferase en hygromycin resistentiegenen gesmolten tot MeCP2 op de Xi, en het transduced met een bibliotheek van > 60.000 shRNAs targeting > 25.000 genen. We vonden 30 genen waarvan knock-down toegekende overleving voordeel onder hygromycin B selectie suggereren hun rol in de controle van het MeCP2 en het x-chromosoom zwijgen. Deze resultaten werden gevalideerd door het transducing van de gerapporteerde cellijn met individuele haarspelden en beoordelen van reactivering van de Stille luciferase verslaggever.

De bevinding dat de bovenste vier haarspelden in alle replicatieonderzoeken van onze scherm XIST gericht verstrekt een sterke interne validatie voor onze methode, gezien de cruciale rol van XIST in XCI11. Afgezien van de superfamilie TGFβ, waarvan de regulerende rol in XCI niet eerder beschreven had, behoorden de andere geïdentificeerde genen alle tot functionele families met banden met de Epigenetische regulatie, dus dienen als een aanvullende validatie voor onze methode12 , 13 , 14. Bovendien, wij ook gedetecteerd 4 uit 13 genen die eerder geïdentificeerd in een ander scherm, met behulp van een CMV promotor gestuurde GFP willekeurig op de Xi15ingevoegd.

Tot vaststelling van de passende dosis en de duur van hygromycin was B selectie cruciaal in het optimaliseren van de screening-voorwaarden. De gevoeligheid van onze cellijn werd sterk afhankelijk van de dichtheid zaaien, en werden negatief beïnvloed door retrovirale infectie. Hogere doses of lengte van selectie geremd ook de groei van cellen met de verslaggever op Xa, overwegende dat mildere selectie verlaagd de gevoeligheid voor verrijking van de haarspeld. Meerdere hygromycin B doseren regimes en verslaggever cel zaaien dichtheden waren dus getest voordat de definitieve screening. Bovendien, hoewel de MSCV retrovirale vector in onze bibliotheek shRNA bood een goede gelegenheid gebruik puromycin selectie te verrijken voor succesvol getransduceerde cellen, puromycin werd niet gebruikt in onze experimenten, als het sequentieel gebruik van puromycin en hygromyin B geleid tot buitensporige toxiciteit, zelfs na de-escalatie van de juiste dosis van beide antibiotica.

Alle de haarspelden vastgesteld in onze studie gereactiveerd ook de Stille luciferase verslaggever, zij het in bescheidener mate. Detectie van deze zeldzame gebeurtenissen werd ingeschakeld door de hoge gevoeligheid van onze scherm, dat we geschat, op basis van testen betonsamenstelling Xi en Xa cellen, een reactivering evenement in 2 x 104 cellen te worden. Dergelijke lage niveaus van reactivering, verhoogd met co toepassing van 5-AZA, getuigen van bovenstaande problemen in strakke Transcriptionele controle van XCI12,,13,16,17, verstoren en impliceren dat de verstoring van meerdere regulerende mechanismen nodig zou zijn om belangrijke reactivering.

Van de nota gereactiveerd alle 30 haarspelden geïdentificeerd in ons scherm ook een CMV-gedreven verslaggever gen gelegen op een verschillende x-chromosoom locus, met vermelding van hun bredere invloed op Xi ambtshalve repressie. Verdere studies zijn nodig om te testen of MeCP2-specifieke "reactivators" bestaan, zoals hun farmacologische of genetische manipulatie kan buitengewoon nuttig bij de behandeling van het Rett syndroom.

Onze screening-systeem biedt diverse voordelen ten opzichte van de eerder beschreven verslaggevers gebruikt voor x-chromosoom reactivering schermen12,17. In plaats van verdreven door de promotor van een CMV, onze verslaggever cassette is klopte in in het C-terminus van MeCP2 en wordt dus gedreven door de inheemse X-gebonden promotor. Dit ontwerp kan helpen identificeren MeCP2 locus-specifieke regelgevers, meer relevant in de context van het Rett syndroom onderzoek, met een voorbehoud dat de bevindingen in vereeuwigd fibroblasten in neuronen, de gewenste site van MeCP2 moeten worden gerecapituleerd reactivering. Het gebruik van een gen hygromycin weerstand kan positieve selectie van reactivering evenementen en krachtig verhoogt de gevoeligheid van het scherm. Bovendien, de cassette met hygromycin weerstand en firefly luciferase genen kan zowel grootschalige screening gebruik te maken van positieve selectie met hygromycin B en individuele haarspelden testen/screenen met behulp van de luciferase verslaggever.

Kortom rapporteren we een robuust en gevoelige genetische screeningmethode voor de identificatie van regulatoren van MeCP2 en x-chromosoom zwijgen in zoogdiercellen. Deze methode kan worden aangepast voor het screenen van de kleine storende RNAs (siRNAs), CRISPR, of kleine moleculen. Deze gehaltebepalingen kunnen nuttig zijn bij het vaststellen van therapeutische benaderingen die afhankelijk zijn van het reactiveren van het functionele allel van een stille gen, zoals in het geval van Rett syndroom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Leko droegen tot dit artikel als een medewerker van het Fred Hutchinson Cancer Research Center.  De standpunten zijn van zijn eigen en niet noodzakelijkerwijs de visie van de National Institutes of Health of de regering van de Verenigde Staten

Acknowledgments

Wij danken Ross Dickins van de Universiteit van Melbourne genadig voorzien van de bibliotheek van de shRNA gebruikt in het scherm. Dit werk werd gefinancierd door de Rett syndroom onderzoek vertrouwen (A.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).

Tags

Genetica kwestie 133 x-chromosoom inactivatie epigenetica MeCP2 Rett syndroom XIST shRNA screening
Gebundelde shRNA scherm voor de heractivering van het MeCP2 op het inactieve X-chromosoom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter