Summary
Wir berichten über eine kleine Hairpin RNA (ShRNA) und die nächste Generation Sequencing-basiertes Protokoll zur Identifizierung von Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung in einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene verschmolzen, das Methyl CpG verbindliches Protein 2) MeCP2) gen auf dem x-Chromosom inaktiv.
Abstract
Nach vorne genetische Bildschirme mit Reporter-Gene in das Heterochromatin eingefügt wurden ausgiebig zur epigenetischen Kontrollmechanismen in Modellorganismen untersuchen. Technologien einschließlich kurze Haarnadel RNAs (ShRNAs) und gruppierten regelmäßig dazwischen kurze palindromische Wiederholungen (CRISPR) haben solche Bildschirme in diploiden Säugetier-Zellen aktiviert. Hier beschreiben wir einen groß angelegte ShRNA-Bildschirm für Regulatoren der X-Chromosom Inaktivierung (XCI), mit einem murinen Zelllinie mit Firefly Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene klopfte am C-Terminus von Methyl CpG verbindliches Protein 2 (MeCP2) gen auf dem inaktiven X-Chromosom (Xi). Reaktivierung des Konstrukts in der Reporter-Zellinie übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B Auswahl ermöglicht uns eine große ShRNA-Bibliothek und Haarnadeln, die die Reporter reaktiviert durch Messen, ihre Post-Auswahl Bereicherung zu identifizieren Sequenzierung der nächsten Generation. Die angereicherten Haarnadeln wurden dann einzeln testen ihre Fähigkeit zur Aktivierung der Luciferase Reporters auf Xi validiert.
Introduction
Eine der häufigsten Formen der erblichen psychischen Beeinträchtigung bei Frauen, Rett-Syndrom, wird verursacht durch heterozygoten Mutationen im MeCP2, ein X-Chromosom-gen, das ein Protein wichtig für normale neuronale Funktion1kodiert. Eine mögliche Ansatz zur Behandlung dieser Erkrankung wäre Reaktivierung der Wildtyp MeCP2 Allel auf Xi, wie Wiederherstellung von MeCP2 Ausdruck zeigte umzukehrenden neurologische Defizite in einem Mausmodell der diese Krankheit1, 2 , 4. jedoch epigenetische silencing von einem der beiden X-Chromosomen in weiblichen Zellen fest bleibt, während der gesamten Lebensdauer eines Organismus3,4, und robuste Reaktivierung eines Gens Xi müsste wahrscheinlich a-Dur Störungen in mehreren epigenetische Regulierung Bahnen.
Ermittlung der Faktoren, die für Wartung von MeCP2 zum Schweigen zu bringen, haben wir zuerst entwickelt einem transgenen Mausmodell tragen eine MeCP2- Luciferase - Hygromycin Widerstand gen Fusion (MeCP2-LUC-HR) auf einem der beiden X-Chromosomen (X MeCP2-LUC-HR/xMeCP2)5. Obwohl die MeCP2 von Fusion Konstrukt ausgedrückt erwies sich als instabil und führte zu einem Verlust der Funktion, phänotypisch imitiert MeCP2 Löschung bei Hemizygous Männern (XMeCP2-LUC-HR/y), die Expression der Gene reporter war in einem Muster entsprechen der Ausdruck der endogenen MeCP25leicht nachweisbar. Wir dann verewigt Fibroblasten Klone mit dem Konstrukt auf entweder inaktiv oder aktiv X-Chromosom erzeugt, und bestätigte, dass der ehemalige Wildtyp MeCP2 und nicht das Reporter-Konstrukt zum Ausdruck gebracht; die Inverse galt für Letzteres. Wenn ein DNA-demethylating Agent bekannt, Gen-silencing, aufzuheben 5-Azacytidine (5-AZA) ausgesetzt gewonnen Zellen mit dem Reporter auf der Xi ("Reporter-Zellen") Aktivität in einem Biolumineszenz-Assay, darauf hinweist, dass unsere Konstrukt reaktiviert werden könnten und daher für genetisches Screening verwendet.
Wir entwickelt als nächstes einen Hochdurchsatz-genetischen Bildschirm für Regulatoren des MeCP2 zum Schweigen zu bringen. Die Reporter-Zell-Linie wurde zuerst mit einem antiretroviralen Bibliothek mit infiziert > 60.000 verschiedene ShRNAs targeting > 25.000 Gene in der Maus Genom5,6, und dann Hygromycin B Auswahl unterzogen. Haarnadel Frequenz verglich in Pre- und Post-Auswahl Proben mit Sequenzierung der nächsten Generation, als Reporter Reaktivierung Wachstum Vorteil unter Hygromycin B Auswahl und Anreicherung der Verantwortlichen Haarnadeln führte. Mit diesem Ansatz, wir 30 Gene verwickelt in MeCP2 zum Schweigen zu bringen und anschließend bestätigte die Ergebnisse von transducing die Reporter Zellen mit einzelnen Haarnadeln und Messung ihrer Luciferase-Aktivität.
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Protocol
Alle Schritte, bei denen Tiere wurden durchgeführt mit Protokollen vom Fred Hutchinson Cancer Research Center institutionelle Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) genehmigt. Keine Reagenzien hier bekanntermaßen erhebliche menschliche Gesundheitsrisiken außer 5-Azacytidine (5-AZA) darstellen.
1. erzeugen eine Reporter-Zell-Linie mit MeCP2- LUC-HR Transgen auf der Xi
-
Vorbereitung der Maus Sehne Fibroblasten von einer Frau XMeCP2-LUC- HR/xMeCP2 Maus
- Einschläfern täglich 10-12-alt weiblich XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 Maus.
- Mit geraden Dissektion Schere, machen Sie einen umlaufenden Schnitt durch die Haut des proximalen Heck Teil.
- Halten Sie den Kadaver in der Nähe der Schwanzwurzel, ziehen Sie die Haut von der Maus, die Fibrocartilaginous Teil des Hecks verfügbar zu machen. Entfernen und die Klemme 10 mm des exponierten Gewebes in 1 mm langen Fragmente mit einem chirurgischen Skalpell schneiden.
- Übertragung der fragmentierte Gewebe eine 15 ml konische Rohr mit 5 mL der Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 1 U/mL Penicillin, 1 µg/mL Streptomycin und 1,5 mg/mL Kollagenase, vorgefiltert durch 0,45 µm und dann 0,2 µm Netz Filter. 3-4 h bei 37 ° C mit kontinuierliche Rotation inkubieren.
- Zentrifuge die Probe bei Raumtemperatur bei 500 X g für 10 min. Aufschwemmen das Pellet in 10 mL DMEM mit 10 % fötalen Rinderserum, 1 U/mL Penicillin und 1 µg/mL Streptomycin (DMEM-10) und Platte auf einer Gewebekultur 6-Well-Platte ergänzt. Durchgang der Zellen einmal und erweitern, um einen 10 cm Teller, bevor Sie mit dem nächsten Schritt fortfahren.
- Verewigen Sie die Zellen durch eine Transduktion mit einer Expressionsvektor tragen virale Onkogene HPV-16 (E6/E7), wie zuvor beschrieben7durchführen.
-
Auswahl einzelner Zellklonen und Charakterisierung von MeCP2 Reporter Ausdruck
- Ernten Sie die Zellen aus einer 10 cm-Platte. Fügen Sie zuerst die Medien Aspirieren, 1 mL 0,05 % Trypsin-EDTA und 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Ablöschen mit 9 mL DMEM-10 und die resuspendierte Zellen in einem 15 mL konische Röhrchen zu sammeln.
- Verdünnen Sie die Zellen mit DMEM-10, eine Endkonzentration von 1 Zelle/100 µL. Transfer zum 96-Well Platten durch Pipettieren 100 µL der Suspension in jede Vertiefung.
- Inkubieren Sie bei 37 ° C, bis der Brunnen Zusammenfluss, sind die bis zu 2-3 Wochen dauern kann. Ersetzen Sie die Medien mit frischen DMEM-10 alle 3-5 Tage. Wenn konfluierende, die Zellen mit 20 µL 0,05 % Trypsin-EDTA pro Bohrloch zu mobilisieren und in zwei doppelte Sätze von 96-Well Platten aufgeteilt.
- Verwenden Sie eine Reihe von Platten, um für Luciferase-Aktivität zu bestimmen. Verwenden Sie eine homogene Firefly Luciferase Assay Kit, die keine Medien entfernen erforderlich ist. Befolgen Sie das Protokoll mit dem Kit enthalten.
- Verwenden Sie die Ergebnisse aus Schritt 1.2.4 Klone ohne nachweisbare Luciferase-Aktivität aus dem restlichen Satz Platten wählen. Erweitern Sie diese Klone auf 24 wohlen und dann 6-Well-Platten.
- Führen Sie dasselbe für einen Klon mit der höchsten Luciferase-Aktivität; Dies wird als Positivkontrolle für Überprüfungszwecke verwendet werden.
- Ein Aliquot von jedem Bohrloch in der 6-Well-Platte für ein Western-Blot zu ernten. Mobilisieren Sie die Zellen mit 200 µL 0,05 % Trypsin-EDTA. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Ablöschen mit 2 mL DMEM-10, und die Hälfte der Zellen auf 1,5 ml Zentrifugenröhrchen übertragen. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS vor Lyse für Western-Blot. Alternativ übertragen Sie die Hälfte der Zellen auf ein anderes 6-Well-Platte. Wenn die Zellen an der Unterseite der Platte befestigen, Spülen mit PBS und lyse für Western-Blot.
- Führen Sie einen Western Blot mit Anti-MeCP2 Antikörper zu bestätigen, dass Luciferase-negativen Zellen express, während die Luciferase-positiven Zellen Wildtyp MeCP2 aus dem aktiven x-Chromosom; nicht ausdrücken, Befolgen Sie die zuvor beschriebenen Protokoll8. Als Positivkontrolle verwenden Sie Hirngewebe lysate aus jedem Wildtyp-Maus.
- Platte mehrere negative Klone mit 2 x 105 Zellen/Brunnen in einem 6-Well-Platte. Einmal mit 10 µM 5-AZA behandeln, inkubieren 72 h ohne Veränderung der Medien und assay für Luciferase Aktivität wie in Schritt 1.2.3 beschrieben.
- Wählen Sie einen negativen Klon (Xi-Klon), die Luciferase-Aktivität mit 5-AZA erworben und beginnen, mehrere 10 cm Platten erweitert. Frieren Sie die verbleibenden negativen Klone in flüssigem Stickstoff als Backup. Der positiven Klon (Xa-Klon) kann in der Gewebekultur beibehalten oder eingefroren bis zur weiteren Verwendung.
(2) screening die Bibliothek für die Reaktivierung mit Hygromycin B Auswahl
-
Den Test-Klon zu infizieren, Auswahl anwenden und Ernte DNA Sequenzierung
- Virale Konzentrate retrovirale Konstrukte, die mit dem Ausdruck Haarnadeln aus einer ShRNA-Bibliothek erhalten, oder produziert konzentrierte virale Überstand über das Protokoll mit der gewünschten Bibliothek enthalten.
- Bevor Sie mit dem Bildschirm, Titrieren der Bibliothek (mit einer GLP-Markierung, falls vorhanden). Ziel für eine Vielzahl von Infektionen zwischen 0,3 und 0,5.
Hinweis: Führen Sie mindestens vier unabhängigen Bildschirmen, um falsche positive Sätze zu minimieren. Verwenden Sie 20 Platten pro Bildschirm 100-fold Abdeckung der Bibliothek zu erhalten angemessene Vertretung der Haarnadeln und vermeiden zufällige ausfallenden9zu erhalten. Angesichts positiver Selektionsbild und eine große Bibliothek-Größe, ist es jedoch wahrscheinlich, dass eine niedrigere Abdeckung ausreichen würde. - Am Morgen Platte 1 x 106 Xi Zellen auf 10 cm Gewebekultur Teller.
- Am Nachmittag infizieren Sie die Platten durch Austauschen der Medien mit frischen DMEM-10 mit viralen überstand und 5-10 µg/mL Polybrene. Verwenden Sie die Menge der viralen Überstand in Schritt 2.1.2 ermittelten.
- Aspirieren Sie nach 18-24 h die Medien und 10 mL frisches DMEM-10 auf jede Platte. Kultur für eine weitere 48 h.
- Am Morgen die Zellen mit 1 mL Trypsin-EDTA 0,05 % pro Platte zu mobilisieren und stillen mit 9 mL DMEM-10 pro Platte. Ein Siebfilter 100 µm durchziehen Sie die Aufhängung. Bündeln Sie die gefilterten Suspensionen zusammen, und Samen Sie zwei Sätze von 10 cm Platten auf 1 x 106 Zellen/Platte.
- Am Nachmittag ersetzen Sie die Medien in einer Reihe von Platten mit DMEM-10-15 µg/mL Hygromycin B (Tag 0) enthält. Ersetzen Sie in der anderen Gruppe die Medien mit frischen DMEM-10 nur.
- Mobilisieren Sie nach 48 Stunden die Zellen aus unbehandelten Platten mit 1 ml Trypsin-EDTA 0,05 %. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Stillen Sie mit 9 mL DMEM-10. Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml konische Röhrchen und Zentrifuge bei 500 X g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Aspirieren Sie die Überstände und gehen Sie sofort bei der Gewinnung von DNA von den Pellets. Alternativ, bündeln Sie die Zellen in größeren Röhren vor dem Zentrifugieren Schritt.
- Mit einer Mischung aus Phenol und Chroroform DNA extrahieren und DNA mit Natrium Acetat und kaltem Ethanol als zuvor beschriebenen10auszufällen. Die individuelle Vorauswahl DNA-Proben zu bündeln und bei-20 ° C bis zur weiteren Verwendung speichern.
- Weiter züchten Hygromycin B Auswahlsatz für 4 Tage. Ergänzen Sie das Auswahl-Media mit frischen DMEM-10 mit Hygromycin B nach 2 Tagen.
- Am 7. Tag ersetzen Sie die Auswahl-Medien mit frischen DMEM-10 nur. Ermöglichen Sie 2 bis 4 Tage für die Wiederherstellung zu, und dann ernten Sie die Zellen, wie in Schritt 2.1.8 beschrieben. Gehen Sie mit DNA-Extraktion, wie in Schritt 2.1.9 beschrieben.
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Identifizierung von Haarnadeln angereichert in den Post-Auswahl-Proben
- Verwendung 5' Kontext (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3 ") und 3' Schleife Primer umkehren (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3"), Hälfte-Haarnadeln von Pre- und Post-Auswahl DNA-Proben zu verstärken. Verwenden Sie alle extrahierten DNA in separaten PCR-Reaktionen mit 100-200 ng DNA pro Reaktion.
Hinweis: Diese Kontext Primer 5' und 3' Kehrschleife Primer entsprechen die MiR 30 Rahmen Sequenz stromaufwärts der ShRNA einfügen und die Reihenfolge bei der ShRNA-Schleife. Verschiedene Bibliotheken benötigen unterschiedliche Oligos. Stellen Sie Reinigungsschritte um verschiedene Produktgrößen Bedarf zu isolieren. - Verwendung Größenauswahl Perlen, Primern und genomischer DNA zu entfernen und wiederherzustellen PCR-Produkte zwischen 100 und 200 BP. folgen das Protokoll mit den Perlen enthalten.
- Bereiten Sie eine Sequenzierung Bibliothek um die Hälfte-Haarnadeln zu sequenzieren. Erzeugen Sie mindestens 50 Millionen Lesevorgänge pro Bildschirm. Befolgen Sie das Protokoll für die Sequenzierung Kit und Ausrüstung geeignet.
Hinweis: 50 Millionen Lesevorgänge pro Bildschirm bietet, 1000-fold Darstellung der einzelnen ShRNA in der Bibliothek und ca. 10-divisibel Berichterstattung über jede unabhängige Infektion (durchgeführt am 100-fold Darstellung der einzelnen ShRNA), sorgt für angemessene Vertretung der jede Infektion Veranstaltung. - Zählen Sie jede ShRNA mit einem Perl-Skript, die Sequenzen mit perfekte Treffer zählt. Wählte ShRNAs, die mindestens 10 mal gelesen in der Vorauswahl Pool zur weiteren Analyse hatte. Berechnen Sie die Bereicherungen, wie Verhältnisse des Post-Vorauswahl zählt und false Discovery Rate (FDR) auf der Grundlage von 1000 Permutationen zu bestimmen. Wählen Sie Gene gezielt durch ShRNAs mit < 5 % FDR als "hits" für weitere Tests.
- Verwendung 5' Kontext (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3 ") und 3' Schleife Primer umkehren (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3"), Hälfte-Haarnadeln von Pre- und Post-Auswahl DNA-Proben zu verstärken. Verwenden Sie alle extrahierten DNA in separaten PCR-Reaktionen mit 100-200 ng DNA pro Reaktion.
3. Überprüfung der identifizierten Haarnadeln ("Hits")
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Verpackung-Lentiviren mit ShRNAs identifiziert auf dem Bildschirm
- 8 x 106 293 FT Samenzellen pro Platte auf 10 cm Platten.
- Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 9 mL antibiotikafreien DMEM-10 pro Platte; Diese 30 Minuten vor Transfektion zu tun.
- Während der 30-Minuten-Intervall bereiten Sie zwei Mischungen zur Transfektion:
- Bereiten Sie Mix 1 (pro Platte/ShRNA; skalieren nach der Gesamtzahl von ShRNAs): 10 µL 2 mg/mL Polyethylenimine (PEI) in 0,5 mL optimale minimale wesentlichen Medien. Mischen von pipettieren und in 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Mix 2 (pro ShRNA) vorbereiten: 4 µg des Vektors zu verpackenden ShRNA, 1,5 µg des VSV-G Umschlag Vektors (pMD2.G) und 2,5 µg des Vektors Verpackung (psPAX2), in 0,5 mL der optimale minimale wesentlichen Medien gemischt.
Hinweis: Enthalten Sie einen leeren Lentivirale Vektor in der Verpackung, bei späteren Infektionen als Negativkontrolle zu verwenden.
- Jedes aliquoten Mix 2 0,5 mL Mischung 1 hinzu, und mischen Sie leicht durch pipettieren. Im Dunkeln bei Raumtemperatur für 20 min inkubieren.
- Tragen Sie das Gemisch auf jede Platte aus Schritt 3.1.2 tropfenweise Weise; Schwenken Sie die Platte vorsichtig mischen.
- Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 5 mL frischem DMEM-10.
- 48 Stunden nach der ersten Transfektion den Überstand zu sammeln und führen Sie es durch einen 0,22 µm-Filter. Vornässen des Filters mit DMEM-10 um Erholung zu maximieren.
- Aliquot der gefilterten Überstand in Mengen ideal für eine 6-Well-Platte gut zu infizieren.
- Frieren Sie die Aliquote bei-80 ° C zur späteren Verwendung ein, oder gehen Sie sofort mit Transduktion.
-
Transduktion und Erprobung von einzelnen Haarnadeln für Luciferase Reporter Reaktivierung und Reaktivierung von Wildtyp MeCP2-gen auf der Xi.
- Am Morgen Platte 1 x 105 Xi Zellen/gut auf 6-well-Platten.
- Am Nachmittag infizieren Sie die Platten durch Austauschen der Medien mit 2 mL frisches DMEM-10, Lentivirale überstand und 5-10 µg/mL des Polybrene enthält. Infizieren Sie ein Steuerelement mit viralen überstand produziert aus ein leerer Lentivirale Vektor.
- Ersetzen Sie am folgenden Tag, die Medien mit 2 mL DMEM-10 enthält 1 mg/mL Puromycin. Kultur für vier Tage.
- Ersetzen Sie die Medien mit 2 mL frisches DMEM-10 und ermöglichen Sie 48-72 h für die Wiederherstellung zu.
- Mobilisieren Sie die Zellen mit 150 µL 0,05 % Trypsin-EDTA. 2-5 min bei 37 ° c inkubieren Stillen Sie mit 1,5 mL DMEM-10. Übertragen Sie die Zellen auf 15 ml konische Röhrchen und Zentrifuge bei 500 X g für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie das Medium und Aufschwemmen der Zellen in 100 µL Lyse Puffer im Luciferase Assay Kit enthalten. 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Übertragen Sie die Lysates zu einem weißen 96-Well-Platte und Assay für Luciferase-Aktivität unter Verwendung des Protokolls mit dem Kit enthalten. Verwenden Sie Xa Zellen als Positivkontrolle und Xi Zellen infiziert mit ein leerer Lentivirale Vektor als Negativkontrolle.
Hinweis: Aussetzen Sie die weißen Platten, fluoreszierendes Licht vor dem Test; Dies reduziert den Hintergrund und Assay Empfindlichkeit erhöhen. Das Protokoll im Assay Kit enthalten erwies sich am wirksamsten, wenn in der Dunkelheit nach Möglichkeit durchgeführt werden. - Um festzustellen, ob die Haarnadel auf die Expression von MeCP2 auf dem aktiven X-Chromosom auswirkten, isolieren Sie RNA aus Tranduced Xi Zellen zu und zu messen Sie MeCP2 mRNA-Ebene mit quantitativer PCR Primer konzipiert, um nur Wildtyp MeCP2 (F: verstärken 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ").
- Optional: Erhöhen Sie die Empfindlichkeit des Tests durch eine Endkonzentration von 0,2 µM 5-AZA hinzufügen, nachdem die Zellen von Puromycin Auswahl erholt haben. Kulturzellen 72 h ohne austauschen der Medien, und dann für Luciferase-Aktivität mit dem kommerziellen Luciferase Assay Kit assay.
- Reaktivierung der schallgedämpften Wildtyp MeCP2 zu messen. Infizieren Sie Xa-Zellen, die dem Wildtyp MeCP2 auf der Xi mit der Vektor mit einzelnen Haarnadeln, Protokoll folgendermaßen 3.2.1 beherbergen. -3.2.4. RNA aus Zellen zu isolieren und zu messen MeCP2 mRNA-Ebene mit quantitativer PCR Primer konzipiert, um nur Wildtyp MeCP2 verstärken (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').
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Representative Results
Maus Sehne Fibroblasten geerntet wurden aus einer zuvor beschriebenen XMeCP2-LUC-HR/xMeCP2 weibliche Maus, verewigt von retrovirale Transduktion von E6 und E7 Onkogene von HPV-16 virus7, geklont mit einschränkenden Verdünnung und getestet für Luciferase Aktivität und Expression von Wildtyp MeCP2 Protein (Abb. 1A und 1 b). Luciferase Aktivität war robust, wenn der Reporter auf Xa war und nicht nachweisbar wenn auf Xi; der native MeCP2 Ausdruck ausgestellt eine reziproke Muster. Wir haben ein Klon ohne Luciferase-Aktivität (Xi-8) und ein Klon mit robusten Aktivität (Xa-3) für weitere Experimente. Wenn Xi-8 Zellen mit 5-AZA behandelt wurden, beobachtet eine dosisabhängige Induktion Luciferase-Aktivität (Abbildung 1).
Empfindlichkeit des Xi-8 und Xa-3 Zellen Hygromycin B wurde getestet, indem Sie 3 und 6 Tage lang Selektionen durchführen. Wie aus dem Muster des Ausdrucks der Luciferase Reporter erwartet, waren Xi-8 Zellen empfindlicher auf Hygromycin B als Xa-3 Zellen, obwohl Letzteres Empfindlichkeit gegenüber höheren Dosen (Abbildung 2A) ausgestellt. Nach eine 1: 100 Mischung aus Xa-3 Xi-8 Zellen ausgesetzt unterschiedliche Konzentrationen von war wurde Hygromycin B, eine zeitabhängige Zunahme der Luciferase-Aktivität beobachtet, zeigt erfolgreiche Konkurrenz Xa-3 Zellen über Xi-8 Zellen (Abbildung 2 b). Dosis und Dauer der Hygromycin B Auswahl wurden für weitere Experimente basierend auf bevorzugte Hemmung der Xi-8 über Xa-3 Zellen ausgewählt.
Vier unabhängige Bildschirme wurden durchgeführt, um die Regulatoren des MeCP2 zum Schweigen zu bringen, mit der Xi-8-Zell-Linie und eine offene Biosystems MiR identifizieren-30-basierte ShRNA Bibliothek mit 64.159 verschiedene Haarnadeln in ein MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retrovirale kloniert Vektor. In jedem Bildschirm infiziert waren zwanzig 10 cm Platten mit gepoolten ShRNAs, Ausrichtung auf ca. 100-fold Abdeckung der Bibliothek. Hygromicin B wurde für 6 Tage, bis kleine azelluläre Flecken beobachtet wurden durchgeführt; die Zellen weiterhin für weitere 24 bis 48 Stunden sterben. Als erholte, wurden die Zellen für die DNA-Extraktion durch eine Phenol-Chloroform-Technik geerntet. Die Gesamtausbeute DNA pro Bildschirm war rund 20 µg/Platte, die gebündelt und geteilt zwischen 100 PCR-Reaktionen mit Primer konzipiert, um halb-Haarnadeln zu verstärken. Die PCR-Produkte wurden dann Perle gereinigt und Hochdurchsatz-Sequenzierung.
Pre- und Post-Auswahl Proben wurden verglichen, um festzustellen, Haarnadel Bereicherung, wie wir erwartet, dass jede Haarnadel vorhanden auf einem erhöhten Niveau in der Post-Auswahl Probe gezielt Gene, die Xi reaktiviert und somit übertragenen Hygromycin-Resistenz. Nur Haarnadeln in mindestens 2 der vier Bildschirme bereichert galten für die Validierung. Die meisten angereicherten Haarnadeln in alle Wiederholungen unserer Leinwand wurden vier Haarnadeln targeting XIST, seine entscheidende Rolle in XCI11entsprechen.
Die Validierung Teil des Bildschirms erfolgte durch einzeln testen die Haarnadeln, die als Hits für die Aktivierung der Luciferase Reporter in Xi-8 Zellen registriert. Obwohl der Bildschirm mit einer MSCV-basierte retrovirale Bibliothek durchgeführt wurde, die Validierung erfolgte nach einer Lentivirale Vektor (individuelle pGIPZ Klone mit ShRNA) möglich Erkennung des Retrovirus-induzierte Artefakte zu vermeiden.
Jeder der Kandidatengene richtete sich von mindestens zwei verschiedenen Haarnadel-Sequenzen, und der Zuschlag des Zielgens wurde durch Real-Time quantitative PCR (RT-qPCR) überprüft. Durch die Prüfung bis zu 1 x 106 Zellen im 6-Well-Format und abnehmende Hintergrund Lumineszenz (Abbildung 2), konnten wir sehr niederfrequente Reaktivierung Ereignisse zu erkennen, die wir voraussichtlich im Bereich von 1: 20.000.
Weitere Analysen mit einzelnen Haarnadeln führte zur Identifikation 30 Gene, deren Zuschlag Reaktivierung des Reporters auf die Xi geführt. Die mittlere Größe der Lumineszenz für diese 30 Gene war 2,8-fache oberhalb der Grundlinie wurde die verstärkt auf die 7.1-fold folgenden 5-AZA-Behandlung. Die gleichen Haarnadeln wurden in Verbindung mit 5-AZA, mit den Xa-3 Zellen wieder Ausdruck der Wildtyp MeCP2 aus dem Xi bestätigen erneut getestet. Dies wurde erreicht durch die Durchführung der RT-qPCR mit Primer konzipiert, um nur das Wildtyp-Transkript des MeCP2 zu verstärken.
Abbildung 1. Isolierung der Klone mit dem MeCP2-Luc-HR-Reporter-gen auf der Xi.
(A) repräsentative Firefly Luciferase Assay auf verewigt Sehne Fibroblasten klont (1-9). Primäre Fibroblasten aus nicht-transgenen (NT) und transgenen heterozygot weiblich (F) dienten als negative und positive Kontrollen. (B) Vertreter Western Blot zeigt MeCP2 Protein-Expression aus den Zellen in (A). Beachten Sie, dass Luciferase-Aktivität (Abbildung 1A) und MeCP2 Ausdruck gegenseitigen Expressionsmuster aufweisen. (C) Induktion von Firefly Luciferase Aktivität in Xi-8 Zellen mit 5-AZA. XA-3 Zellen, mit dem Reportergen auf die Xa dienen als Positivkontrolle. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2. Charakterisierung der Hygromycin-Resistenz in Xi-8 und Xa-3 Zellen.
(A) relative Wachstum von Xi-8 und Xa-3 Zellen mit verschiedenen Hygromycin B Regimen behandelt (3D = 3 Tage; 6 = 6 Tage), im Vergleich zu unbehandelten Zellen. (B) Luciferase Aktivität Bereicherung nach Freilegung insgesamt 10.000 Xa-3 und Xi-8 Zellen (gemischt im Verhältnis 1: 100), Hygromicin B (25 µg/mL) für die angegebene Anzahl von Tagen. Nach Exposition Luciferase Aktivität teilte die Vorbelichtung Ebene Bereicherung zu berechnen. (C) Firefly Luciferase Aktivität in Xi-8 Zellen, in 96 und 6-Well-Format, mit und ohne 5-AZA (10 µM) untersucht. Nicht-transgenen (NT) Fibroblasten dienten als Negativkontrolle. 5-AZA erhöht bzw. die Luciferase Aktivität 7.2 und 86 - fache über der Grundlinie in 96 und 6-Well-Format. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 von der Student t-Test Vergleich 5-AZA behandelt und unbehandelt Xi-8 Zellen.) Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
In unserer letzten Studie6, erzielten wir eine murinen Zelllinie mit Luciferase und Hygromycin-Resistenz-Gene mit MeCP2 auf der Xi verschmolzen und mit einer Bibliothek von ausgestrahlt > 60.000 ShRNAs targeting > 25.000 Gene. Wir fanden 30 Gene deren Knock-down übertragenen Überlebensvorteil unter Hygromycin B-Auswahl, was ihre Rolle in der Steuerung von MeCP2 und X-Chromosom zum Schweigen zu bringen. Diese Ergebnisse wurden durch transducing die gemeldeten Zell-Linie mit einzelnen Haarnadeln und die Reaktivierung der Stille Luciferase Reporter Bewertung validiert.
Die Feststellung, dass die oberen vier Haarnadeln in alle Replikate von unserem Bildschirm XIST gezielt zur Verfügung gestellt einer starke interne Validierung für unsere Methode, die Schlüsselrolle der XIST XCI11gegeben. Neben der TGFβ-Superfamilie, deren Regulierungsfunktion XCI zuvor nicht beschrieben hatte, gehörte der anderen identifizierten Gene, die alle funktionalen Familien mit Verbindungen zur epigenetischen Regulation, dient als eine weitere Bestätigung für unsere Methode12 , 13 , 14. Darüber hinaus wir auch 4 von 13 Genen, die zuvor in einem anderen Bildschirm identifiziert mit detektiert eine CMV Projektträger-gesteuerte GFP nach dem Zufallsprinzip auf die Xi15eingefügt.
Zur Gründung der geeignete Dosis und Dauer der Hygromycin war B Auswahl entscheidend bei der Optimierung der Screening-Bedingungen. Die Empfindlichkeit der Zell-Linie war stark abhängig von Dichte Aussaat und durch retroviral Infektion beeinträchtigt. Erhöhten Dosen oder Länge der Auswahl auch das Wachstum von Zellen mit dem Reporter auf Xa, gehemmt, während milder Auswahl die Empfindlichkeit für die Haarnadel Anreicherung gesenkt. So wurden mehrere Hygromycin B Dosierung Therapien und Reporter Zelle Dichte Aussaat vor dem final Screening getestet. Außerdem, obwohl MSCV retroviralen Vektors in unserer Bibliothek ShRNA Gelegenheit bot, Puromycin Auswahl verwenden und für erfolgreich ausgestrahlt Zellen zu bereichern, Puromycin nicht in unseren Experimenten, die fortlaufende Nutzung der Puromycin und Hygromyin B diente als übermäßige Toxizität führte auch nach geeigneten Dosis Deeskalation der beiden Antibiotika.
Alle in unserer Studie identifizierten Haarnadeln reaktiviert auch Stille Luciferase Reporter, wenn auch in eher bescheidenen Maße. Erkennung dieser seltenen Ereignisse wurde ermöglicht durch die hohe Empfindlichkeit von unserem Bildschirm, das wir geschätzt, basierend auf Tests Beimischungen von Xi und Xa-Zellen, eine Reaktivierung Ereignis in 2 x 104 Zellen. Solche niedrigen Niveau der Reaktivierung, erhöht mit Co Anwendung der 5-AZA, zeugen von zuvor beschriebenen Schwierigkeiten bei der transkriptionellen Kontrolle XCI12,13,16,17, stören und bedeuten Sie, dass die Unterbrechung der mehrere Regulationsmechanismen notwendig wäre, um erhebliche Reaktivierung zu erreichen.
Der Hinweis reaktiviert alle 30 Haarnadeln in unserem Bildschirm identifiziert auch eine CMV-driven Reporter-gen befindet sich auf einer unterschiedlichen X-Chromosom Locus, unter Angabe ihrer breiteren Auswirkungen auf Xi de-Unterdrückung. Weitere Studien sind notwendig, zu prüfen, ob MeCP2-spezifischen "Reaktivatoren" vorhanden sind, wie ihre pharmakologische oder genetische Manipulation außerordentlich nützlich könnte bei der Behandlung des Rett-Syndroms.
Unsere Screening-System bietet mehrere Vorteile gegenüber den zuvor beschriebenen Reporter für X-Chromosom Reaktivierung Bildschirme12,17verwendet. Anstelle von CMV Förderer getrieben, unsere Reporter-Kassette ist am C-Terminus des MeCP2 klopfte und treibt damit die native X-chromosomal-Promotor. Dieses Design kann dazu beitragen, MeCP2 Locus-spezifische Regulierungsbehörden, mehr relevant im Zusammenhang mit Rett Syndrom Forschung, mit einer Einschränkung, dass die Ergebnisse in verewigt Fibroblasten in Neuronen, die gewünschte Seite von MeCP2 rekapitulierte sollte Reaktivierung. Die Verwendung von einem Hygromycin-Resistenz-Gen ermöglicht positiven Selektion der Reaktivierung Ereignisse und robust erhöht die Bildschirm-Empfindlichkeit. Darüber hinaus ermöglicht die Kassette mit Hygromycin-Resistenz und Firefly Luciferase Gene sowohl große screening mit positiver Selektion mit Hygromycin B und Prüfung/Vorführung einzelner Haarnadeln mit der Luciferase Reporter.
Zusammenfassend lässt sich sagen berichten wir über eine robust und empfindlich genetischen Screening-Methode zur Identifizierung von Regulatoren des MeCP2 und X-Chromosom in Säugetierzellen zum Schweigen zu bringen. Diese Methodik für das screening von kleinen interferierenden RNAs (SiRNAs), CRISPR, angepasst werden kann oder kleinen Molekülen. Solche Tests als nützlich erweisen könnten therapeutische Ansätze, die auf Reaktivierung der funktionalen Allel eines stillen Gens, wie z. B. im Falle von Rett-Syndrom zu etablieren.
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Disclosures
Dr. Leko trug zu diesem Artikel als Angestellter des Fred Hutchinson Cancer Research Center. Die geäußerten Ansichten sind seine eigenen und repräsentieren nicht notwendigerweise die Ansichten von den National Institutes of Health oder Regierung der Vereinigten Staaten
Acknowledgments
Wir bedanken uns bei Ross Dickins von der University of Melbourne für die Bereitstellung von gnädig der ShRNA-Bibliothek auf dem Bildschirm verwendet. Diese Arbeit wurde durch die Rett Syndrome Research Trust (A.B) finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
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