Summary
우리 보고 작은 헤어핀 RNA (shRNA) 반딧불 luciferase murine 셀 라인에서 x 염색체 비활성화의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위한 다음 세대 시퀀싱 기반 프로토콜 및 hygromycin 저항 유전자는 메 틸 CpG 바인딩 단백질 2 (융합 MeCP2) 비활동 성 X 염색체에 유전자입니다.
Abstract
리포터 유전자는 섬으로에 삽입을 사용 하 여 앞으로 유전 스크린 모델 생물에서 후 컨트롤의 메커니즘을 조사를 광범위 하 게 사용 되었습니다. 짧은 머리 핀 RNAs (shRNAs) 및 클러스터 된 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 (CRISPR)를 포함 하 여 기술 2 중 포유류 세포에서 이러한 화면을 활성화 했습니다. 여기 우리 x 염색체 비활성화 (XCI)의 레 귤 레이 터에 대 한 대규모 shRNA 스크린 반딧불 luciferase murine 셀 라인을 사용 하 여 설명과 hygromycin 저항 유전자에서 절 메 틸 CpG 의무적인 단백질의 C-말단에 2 (MeCP2) 유전자 에 비활성 x 염색체 (Xi). 기자 셀 라인 구축의 재 활성화 hygromycin B 선택, 큰 shRNA 라이브러리 및 그들의 포스트 선택 농축을 사용 하 여 측정 하 여 기자를 다시 활성화 하는 헤어핀을 식별를 생존 우위를 수 여 다음-세대 시퀀싱입니다. 풍부한 헤어핀은 개별적으로 xi luciferase 기자를 활성화 하는 능력을 테스트 하 여 확인 됩니다.
Introduction
한 여성, 레트 증후군, 유전 성 정신 장애의 가장 일반적인 형태는 MeCP2, 정상적인 신경 기능1에 필수적인 단백질을 인코딩하는 x 염색체 유전자 heterozygous 돌연변이 의해 발생 합니다. 이 장애를 치료 하는 잠재적인 접근 방식을 것 사이에 야생-타입 MeCP2 대립 유전자의 재 활성화 MeCP2 식의 유신이 질병1, 의 마우스 모델에서 신경학 상 적자를 표시 했다 2 , 그러나 4., 단단히는 유기 체3,4의 수명에 걸쳐 유지 한 개의 암 세포에서 염색체 X의 epigenetic 입을 하 고 사이 유전자의 강력한 재 활성화 가능성이 주요 요구 여러 epigenetic 규제 경로의 교란 한다입니다.
MeCP2 침묵의 유지 보수에 필요한 요소를 식별 하려면 우리가 먼저 개발 유전자 변형 마우스 두 X 염색체 중 하나에 MeCP2-luciferase-hygromycin 저항 유전자 융합 (MeCP2-뤽-시간)을 들고 (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. 비록 MeCP2 퓨전 구문에서 표현 된이 불안정 하 고 손실 함수, hemizygous 남성 (MeCP2 뤽 시간/Y) X에 MeCP2 삭제 phenotypically 흉내 낸 리포터 유전자의 표현에에서 결과 판명 내 생 MeCP25의 식과 일치 패턴에서 쉽게 감지 했다. 우리 다음 비활성 또는 액티브 x 염색체에 구조와 불멸 하 게 섬유 아 세포 클론을 생성 하 고 그 전 표현 야생 타입 MeCP2 하지 기자 구문; 확인 역은 후자에 대 한 사실 이다. DNA 유전자 침묵, 파기를 알려진 에이전트 demethylating 5-azacytidine (5-아 자)에 노출 되 면 셀 ("기자 셀") 사이에 기자와 얻은 활동 우리의 구문을 다시 활성화 수 나타내는 생물 발광 분석 결과에 따라서 유전자 검사에 대 한 사용.
우리는 다음 MeCP2 침묵의 레 귤 레이 터에 대 한 높은 처리량 유전 스크린을 개발 했다. 기자 셀 라인 처음 retroviral 라이브러리를 포함 하는 감염 > 60000 다른 shRNAs 대상 > 마우스 게놈5,6, 걸쳐 25000 유전자 다음 hygromycin B 선택 대상. 헤어핀 주파수 사전에 비교 했다 고 후 선택 샘플 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여, 기자로 재 hygromycin B 선택 성장 이점 수 여 책임 헤어핀의 풍부 귀착되 었 다. 이 방식을 사용 하 여, 우리는 MeCP2 , 침묵에 연루 30 유전자를 확인 하 고 이후 개별 헤어핀 기자 셀 시험 그들의 luciferase 활동을 측정 하 여 결과 확인.
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Protocol
동물을 포함 하는 모든 단계는 프레드 허 친 슨 암 연구 센터 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인 하는 프로토콜을 사용 하 여 실행 되었다. 여기 사용 아니 시 약 5-azacytidine (5-아 자)를 제외 하 고 중요 한 인간의 건강 위험 포즈를 알려져 있습니다.
1. 생성 하는 사이에 MeCP2뤽 HR transgene 기자 셀 라인
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MeCP2 뤽 시간 /X X 여성에서 마우스 힘 줄 섬유 아 세포를 준비MeCP2 마우스
- 하루에 10-12를 안락사-MeCP2 뤽 시간/X X 오래 된 여성MeCP2 마우스.
- 바로 해 부가 위를 사용 하 여 인접 꼬리 부분의 피부를 통해 완곡 한 절 개를 확인 합니다.
- 꼬리의 기지 근처에 시체를 들고, 꼬리 fibrocartilaginous 부분을 노출 하는 마우스에서 피부를 당겨. 제거 하 고 잘라 터미널 노출 조직의 10 m m 1 m m 수술 메스를 사용 하 여 긴 조각.
- 전송 조각난된 조직 15 ml 원뿔 튜브 포함 5 mL의 Dulbecco의 수정이 글 중간 (DMEM) 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스, 그리고 콜라 1.5 mg/mL, 보충 사전 0.45 μ m 및 다음 0.2 µ m 메쉬 필터를 통해 필터링. 3-4 시간 연속 회전 37 ° C에서 품 어.
- 원심 분리기 샘플 500 x g 에 실 온에서 10 분에 대 한 10% 태아 둔감 한 혈 청, 1 U/mL 페니실린, 1 µ g/mL 스 (DMEM-10)과 6 잘 조직 문화 접시에 접시와 보충 DMEM의 10 mL에 펠 릿을 Resuspend. 셀을 한 번 통과 하 고 단계로 진행 하기 전에 10 cm 접시에 확장.
- 앞에서 설명한7HPV 16 바이러스 성 oncogenes (E6/E7)를 들고 식 벡터와는 변환을 수행 하 여 세포를 불멸.
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단일 세포 클론 선택 및 MeCP2 기자 식
- 10 cm 접시에서 세포를 수확. 첫째, 미디어 발음, 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10의 9 mL와 quench 고 15 mL 원뿔 튜브에 resuspended 세포를 수집 합니다.
- 셀을 희석 DMEM-1 셀/100의 최종 농도에 10 µ L. 전송 96 잘 접시를 정지 pipetting 100 µ L에 의해 각 우물에.
- 우물은 최대 2-3 주를 걸릴 수 있습니다 합칠 때까지 37 ° C에서 품 어. 3-5 일 마다 신선한 DMEM-10 미디어를 교체 합니다. Confluent, 잘 당 0.05% 트립 신-EDTA의 20 µ L로 세포를 동원 하 고 96 잘 접시의 두 가지 중복 집합으로 그들을 분할.
- 격판덮개의 1 세트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과. 미디어 제거를 요구 하지 않는 균질 반딧불 luciferase 분석 결과 키트를 사용 합니다. 키트에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.
- 1.2.4 단계에서 결과 사용 하 여 격판덮개의 나머지 세트에서 감지 luciferase 활동 없이 클론을 선택. 이러한 24-잘, 다음 6-잘 접시를 확장 합니다.
- 가장 높은 luciferase 활동; 클론 동일을 수행합니다 이 유효성 검사를 위해서 긍정적인 컨트롤로 사용 됩니다.
- 서쪽 오 점을 위해 6 잘 플레이트에 각의 약 수를 수확. 0.05% 트립 신-EDTA의 200 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM-10, 2 mL와 quench 그리고 1.5 ml 원심 분리기 튜브에 세포의 절반을 전송. 서쪽 오 점을 위해 lysing 하기 전에 한 번 PBS와 셀을 세척. 또는, 다른 6 잘 플레이트 세포의 절반을 전송 합니다. 셀 접시의 바닥에 연결, PBS와 린스 그리고 서쪽 오 점을 위해 lyse.
- 수행 하는 서쪽 오 점 안티 MeCP2 항 체는 luciferase 부정적인 세포 표현, luciferase 긍정적인 세포 활성 X 염색체;에서 야생-타입 MeCP2 표현 하지 않는 하는 동안 확인 된 앞에서 설명한 프로토콜8을 따릅니다. 뇌 조직에서 어떤 야생 타입 마우스 lysate를 사용 하 여 긍정적인 통제로.
- 2 x 105 셀/잘 6 잘 플레이트에에서 여러 가지 부정적인 클론 접시 10 µ M 5-아 자 한 번 치료 하 고, 72 h에 대 한 미디어, 변경 하지 않고 품 어 1.2.3 단계에서 설명한 대로 luciferase 활동에 대 한 분석 결과.
- Luciferase 활동 5-아 자 고 여러 10 cm 접시에 그것을 확장을 시작 하는 클론 (사이 클론)이 부정적인 하나를 선택 합니다. 백업으로 액체 질소에 나머지 부정적인 클론을 고정 합니다. 긍정적인 복제품 (클론 Xa) 조직 문화에서 유지 하거나 추가 사용까지 냉동 수 있습니다.
2. 심사 hygromycin B 선택을 사용 하 여 다시 활성화에 대 한 라이브러리
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테스트 복제 감염, 선택, 적용 및 시퀀싱에 대 한 DNA를 수확
- ShRNA 라이브러리에서 헤어핀을 표현 하는 retroviral 구문의 바이러스 집중 얻거나 집중된 바이러스 상쾌한 원하는 라이브러리에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 생산.
- 화면을 계속 하기 전에 적정 라이브러리 (사용 하 여 GFP 마커 사용 가능한 경우). 0.3에서 0.5 사이 감염의 다양성에 대 한 목표.
참고: 거짓 긍정적인 요금을 최소화 하기 위해 적어도 4 개의 독립적인 화면 수행 합니다. 헤어핀의 적절 한 표시를 유지 하 고 임의의 중단9피하십시오 도서관의 100 범위를 화면 당 20 접시를 사용 합니다. 그러나, 그것은 가능성이 낮은 범위 겠지만 긍정적인 선택 화면과 큰 도서관 크기를 감안할 때. - 아침에, 1 x 106 사이 셀 10cm 조직 문화 접시에 접시.
- 오후에 신선한 DMEM 10 바이러스 상쾌한과 polybrene의 5-10 µ g/mL를 포함 하는 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 2.1.2 단계에서 확인 하는 바이러스 성 상쾌한의 금액을 사용 합니다.
- 18-24 h 후 미디어 발음 하 고 각 플레이트에 신선한 DMEM-10의 10 mL를 추가 합니다. 또 다른 48 h에 대 한 문화입니다.
- 아침에 접시 당 0.05% 트립 신-EDTA의 1 mL를 사용 하 여 셀을 동원 하 고 접시 당 DMEM-10의 9 mL와 끄다. 100 µ m 메쉬 필터를 통해 정지를 실행 합니다. 필터링 된 정지를 함께, 수영장 그리고 1 x 106 셀/접시에 10 cm 격판덮개의 2 세트 씨앗.
- 오후에 격판덮개의 1 세트에 미디어를 DMEM 10 15 µ g/mL hygromycin B의 (0 일) 포함 된 바꿉니다. 다른 세트에는 미디어를 신선한 DMEM-10만 바꿉니다.
- 48 시간 후 치료 접시 0.05% 트립 신-EDTA의 1 ml를 사용 하 여 집합에서 셀을 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 9 mL와 끄다. 실 온에서 5 분 동안 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g에서 원심 분리기를 셀을 전송. supernatants 발음 하 고 즉시 알 약에서 DNA를 추출 진행. 또는, 원심 분리 단계 전에 큰 튜브로 셀 풀.
- 페 놀 및 chroroform의 혼합물을 사용 하 여 DNA를 추출 하 고 앞에서 설명한10으로 나트륨 아세테이트와 냉 에탄올과 DNA를 침전. 개별 사전 선택 DNA 샘플을 보유 하 고 추가 사용까지-20 ° C에서 저장 합니다.
- 계속 경작 hygromycin B 선택 4 더 많은 일에 대 한 설정. 2 일 후 신선한 DMEM-10 포함 hygromycin B와 선택 미디어를 보충.
- 7 일에 신선한 DMEM-10만 선택 미디어를 교체 합니다. 복구에 2 ~ 4 일을 허용 하 고 단계 2.1.8에서에서 설명한 대로 셀을 수확. 2.1.9 단계에서 설명한 대로 DNA 추출 진행.
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확인 후 선택 샘플에 농축 헤어핀
- 사용 5' 컨텍스트 (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') 3 ' 반전 루프 뇌관 (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3')에서 사전 및 사후 선택 DNA 샘플 반-헤어핀을 증폭. 모든 추출 된 DNA를 사용 하 여 별도 PCR 반응에 100-200 ng와 DNA의 반응 당.
참고: 이러한 컨텍스트 뇌관 5'과 3' 반전 루프 뇌관 및 해당 합니다 미르-30 컨텍스트 시퀀스 shRNA 삽입의 상류 shRNA 루프에서 순서 각각. 다른 라이브러리는 다른 oligos를 요구할 것 이다. 정화 단계 분리 필요에 따라 다른 제품의 크기를 조정 합니다. - 뇌관 및 genomic DNA를 제거 하 고 100과 200 bp. 사이 PCR 제품을 복구를 사용 하 여 크기 선택 구슬 구슬에 포함 된 프로토콜을 따릅니다.
- 하프-헤어핀을 시퀀싱 하는 시퀀싱 라이브러리를 준비 합니다. 스크린 당 50 백만 이상 읽기를 생성 합니다. 시퀀싱 장비 및 장비에 대 한 적절 한 프로토콜을 따릅니다.
참고: 각 shRNA 라이브러리에서의 1000-fold 표현 및 약 10의 범위 (각 shRNA 100 표현에서 실시) 각 독립적인 감염의 적절 한 표현을 보장 화면 당 50 백만 읽기 제공 합니다. 각 감염 이벤트입니다. - 완벽 한 일치와 시퀀스를 계산 하는 펄 스크립트를 사용 하 여 각 shRNA 열거 합니다. 추가 분석을 위해 미리 선택 수영장에서 적어도 10 읽기를 했다 shRNAs를 선택 했다. Preselection를 후의 비율 계산 하 고 틀린 발견 비율 (FDR) 1000 순열 기준 결정은 풍부를 계산 합니다. 유전자와 shRNAs의 대상 선택 < 5%로 루즈벨트 "조회 수" 추가 테스트를 위해.
- 사용 5' 컨텍스트 (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') 3 ' 반전 루프 뇌관 (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3')에서 사전 및 사후 선택 DNA 샘플 반-헤어핀을 증폭. 모든 추출 된 DNA를 사용 하 여 별도 PCR 반응에 100-200 ng와 DNA의 반응 당.
3. 유효성 확인 된 헤어핀 (이 하 "조회 수")
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화면에서 식별 하는 shRNAs를 포함 하는 포장 하는 lentiviruses
- 시드 8 × 10 10 cm 접시에 접시 당6 293 피트 셀.
- 다음 날, 항생제 무료 DMEM-당 10의 격판덮개; 9 mL 미디어를 바꿉니다 이 분 transfection 전에 마십시오.
- 30 분 간격 동안 두 믹스 transfection에 대 한 준비:
- 믹스 1 준비 (접시/shRNA; 당 최대 규모 shRNAs의 총 수에 따라): 10 µ L의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 2 mg/mL polyethylenimine (페이). Pipetting으로 혼합 하 고 5 분 동안 실 온에서 품 어.
- 믹스 2 (shRNA) 당 준비: 패키지 될 shRNA 벡터의 4 µ g, VSV G 봉투 벡터 (pMD2.G)의 1.5 µ g 그리고 2.5 µ g 포장 벡터 (psPAX2)의 최적의 최소 필수 미디어의 0.5 mL에 혼합.
주: 부정적인 컨트롤로 나중 감염에 사용 하 여 포장에 빈 lentiviral 벡터를 포함 합니다.
- 믹스 2, 각 약 수를 믹스 1의 0.5 mL를 추가 하 고 부드럽게 pipetting으로 혼합. 20 분 동안 실내 온도에 어둠 속에서 품 어.
- 단계 3.1.2 dropwise 패션;에서 각 접시에 혼합물을 적용 부드럽게 혼합 하 판을 소용돌이 친다.
- 다음 날, 신선한 DMEM-10의 5 mL는 미디어를 바꿉니다.
- 48 시간 후에 초기 transfection는 상쾌한을 수집 하 고 0.22 μ m 필터를 통해 그것을 실행. 사전 필터 DMEM-10 복구를 최대화 하기를 젖은.
- 6 잘 플레이트를 잘 감염에 대 한 이상적인 금액으로 필터링 된 상쾌한 약 수.
- 나중에 사용 하기 위해-80 ° C에서 aliquots 고정 또는 즉시 변환 진행.
-
변환 및 luciferase 기자 재 활성화 및 야생-타입 MeCP2 유전자는 xi의 재 조직에 대 한 개별 헤어핀의 테스트.
- 아침에, 1 x 105 사이 6 잘 플레이트에 셀/잘 플레이트.
- 오후에 lentiviral 상쾌한 및 polybrene의 5-10 µ g/mL 신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 대체 하 여 번호판을 감염. 바이러스 성 상쾌한 빈 lentiviral 벡터에서 생산으로 잘 컨트롤을 감염.
- 다음 날, 2 mL DMEM-10 포함 1 mg/mL puromycin의 미디어를 바꿉니다. 4 일에 대 한 문화입니다.
- 신선한 DMEM-10의 2 mL와 함께 미디어를 교체 하 고 48-72 h 복구에 대 한 허용.
- 0.05% 트립 신-EDTA의 150 µ L로 세포를 동원. 37 ° c.에 2-5 분 동안 품 어 DMEM 10의 1.5 mL와 끄다. 실 온에서 10 분간 15 ml 원뿔 튜브와 500 x g 에서 원심 분리기를 셀을 전송.
- 미디어를 제거 하 고 resuspend 100 µ L 세포의 용 해 버퍼 luciferase 분석 결과 키트에 제공 된에 셀. 5 분 동안 실 온에서 품 어. 흰색 96 잘 접시와 키트에 포함 된 프로토콜을 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 분석 결과 lysates 전송. Xa 세포를 사용 하 여 긍정적인 제어 및 부정적인 컨트롤로 빈 lentiviral 벡터와 감염 사이 세포로.
참고: 분석 결과; 전에 형광등에 흰색 번호판을 노출 하지 않도록 이 배경 하는 분석 결과 감도 증가 하십시오. 분석 결과 키트에 제공 된 프로토콜 가능한 어둠 속에서 수행 하는 경우 가장 효과적인 것으로 발견 되었다. - 액티브 x 염색체에는 머리 핀에 MeCP2 식 수준에 영향을 했다 여부를 확인 하려면 tranduced 사이 세포에서 RNA를 분리 하 고 뇌관만 야생 타입 MeCP2 (f:를 증폭 하도록 설계 되었습니다으로 양이 많은 PCR를 사용 하 여 MeCP2 mRNA 수준 측정 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
- 옵션: 셀 puromycin 선택에서 회복 후 0.2 µ M의 최종 농도에 5-아를 추가 하 여 분석 결과의 감도 증가. 미디어를 교체 하지 않고 72 h에 대 한 셀을 문화 그리고 상업 luciferase 분석 결과 키트를 사용 하 여 luciferase 활동에 대 한 다음 분석 결과.
- 입 막 음된 야생-타입 MeCP2의 재 활성화를 측정 합니다. 단계는 프로토콜 3.2.1 개별 헤어핀을 포함 하는 벡터와 xi, 야생 타입 MeCP2 항구 Xa 세포를 감염. -3.2.4. 세포에서 RNA를 분리 하 고 정량 PCR 뇌관만 야생 타입 MeCP2를 증폭 하도록 설계 되었습니다 사용 하는 MeCP2 mRNA 수준 측정 (f: 5 '-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', r: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
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Representative Results
마우스 힘 줄 fibroblasts 수확 했다MeCP2 뤽 시간/X X 이전 설명에서 HPV 16 virus7에서 e 6와 E7 oncogenes의 retroviral 변환에 의해 불후MeCP2 여성 마우스 제한 희석을 사용 하 여 복제 및 테스트 luciferase 활동과 표현 야생-타입 MeCP2 단백질 (그림 1A 및 1B). Luciferase 활동은 기자, Xa에 있었다면 강력 하 고 탐지 사이; 하는 경우에 네이티브 MeCP2 식 전시 상호 패턴. 우리 선택 luciferase 활동 (Xi-8) 없이 복제 및 복제 추가 실험에 대 한 강력한 활동 (Xa-3). Xi-8 세포 5-아 자로 치료 했다 때 luciferase 활동에 복용량 의존 유도 (그림 1C) 관찰 되었다.
Xi-8 및 Xa-3 hygromycin B 세포의 감도 수행 3 및 6 하루 동안 선택 하 여 테스트 했습니다. Xi-8 셀 luciferase 기자의 식 패턴에서 예상 대로 후자 감도 높은 복용량 (그림 2A)를 전시 하더라도 hygromycin B Xa-3 셀 보다 더 민감한를 했다. Xi-8 셀에 Xa-3의 1: 100 혼합 후의 다른 노출된 농도 사이 8 셀 (그림 2B)에 Xa-3 셀의 성공적인 경쟁을 나타내는 hygromycin B, luciferase 활동 시간에 따라 증가 관찰 되었다. 복용량과 기간 hygromycin B 선택의 Xa-3 셀에 Xi-8의 특혜 금지에 따라 추가 실험을 위해 선택 되었다.
4 개의 독립적인 스크린 MeCP2 입을 사용 하 여 Xi-8 셀 라인 오픈 농 미르의 레 귤 레이 터를 식별 하기 위해 수행한-30-기반된 shRNA 라이브러리를 포함 하는 64,159 다른 헤어핀 MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retroviral으로 복제 벡터입니다. 각 화면에 20 10 cm 번호판 풀링된 shRNAs, 도서관의 약 100 범위를 대상으로 감염 되었습니다. Hygromicin B 6 일 때까지 작은 acellular 패치 관찰 했다;에 대 한 실시 했다 셀 추가 24 ~ 48 시간 동안 죽을 계속 했다. 때, 세포 DNA 추출 페 놀-클로 프롬 기술을 사용 하 여 수확 했다. 스크린 당 총 DNA 수율 약 20 µ g/접시, 풀링된 되었고 반 헤어핀을 증폭 하도록 설계 된 뇌관을 사용 하 여 100 PCR 반응 사이 분할 했다. PCR 제품 구슬 정화 그리고 높은 처리량 시퀀싱을 복종 되었다.
사전 및 사후 선택 샘플 비교 되었다 헤어핀 농축 결정 우리가 후 선택 샘플의 높은 수준에서 현재 어떤 머리 핀 사이 다시 활성화 하 고 따라서 hygromycin 저항을 수 여 하는 유전자를 대상으로 예상. 4 개의 스크린의 적어도 2에 농축 헤어핀만 유효성 검사를 위해 고려 되었다. 우리의 스크린의 모든 복제에 가장 풍부한 헤어핀 4 헤어핀 XIST, XCI11에서 중요 한 역할을 대상으로 했다.
스크린의 유효성 검사 부분 Xi-8 셀에 luciferase 리포터의 활성화를 위한 명 중으로 등록 하는 헤어핀을 개별적으로 테스트 하 여 실행 되었다. 화면 실행 되었다 MSCV 기반 retroviral 라이브러리를 사용 하 여, 비록 유효성 검사 실행 되었다 lentiviral 벡터 (shRNA 개별 pGIPZ 클론)을 사용 하 여 아티팩트 유도 하는 레트로 바이러스의 가능한 탐지를 피하기 위해.
후보 유전자 각각의 적어도 2 개의 다른 머리 핀 시퀀스에 의해 표적으로 했다 고 대상 유전자의 최저-실시간 정량 PCR (RT-정량)에 의해 확인 되었다. 6 잘 형식에 최대 1 x 106 셀 시 금 하 고 감소 하는 배경 발광 (그림 2C), 매우 낮은 주파수 재 활성화 이벤트, 우리 1:20,000 범위에 있을 것으로 추정을 감지할 수 있었습니다.
개별 헤어핀을 사용 하 여 추가 분석 기자는 사이에 다시 활성화 귀착되 었 다의 최저 30 유전자의 id에 지도 했다. 30이 유전자에 대 한 발광의 평균 크기는 2.8-fold 기준선 위에 더 7.1-fold 다음 5-아 자 치료에 증폭 되었다. 5-아 자, 야생 타입 MeCP2 는 Xi에서의 재 식 확인 Xa-3 셀과 함께에서 같은 헤어핀 필적 했다. 이것은 실시간 정량 Pcr을 수행 하 여 달성 되었다 뇌관만 MeCP2의 야생 유형 증명서를 증폭 하도록 설계를 사용 하 여.
그림 1입니다. 사이에 MeCP2 뤽 시간 취재 원 유전자 클론의 격리.
불멸 하 게 힘 줄 fibroblasts에 A) 대표 반딧불 luciferase 분석 결과 (1-9)를 복제합니다. 비-유전자 변형 (NT) 및 유전자 변형 heterozygous 여성 (F)에서 기본 섬유 아 세포는 각각 부정과 긍정적인 컨트롤로 사용 되었다. B) 대표 서양 오 점 (A)의 세포에서 MeCP2 단백질 표정 보여주는. Note luciferase 활동 (그림 1A)와 MeCP2 식 상호 식 패턴을 전시. C) 사이 8 세포 5-아 자에에서 반딧불 luciferase 활동의 감 응 작용. Xa-3 셀은 Xa에 취재 원 유전자와 긍정적인 컨트롤 역할을 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. Xi-8 및 Xa-3 셀에 hygromycin 저항 특성
Xi-8 및 Xa-3 셀의 A) 상대 성장 다른 hygromycin B 식이요법으로 치료 (3D = 3 일; 6D = 6 일), 치료 되지 않는 셀에 비해. 10000 3 Xa 및 Xi-8 셀 (1: 100 비율에 혼합) hygromicin B의 총 노출 후 B) luciferase 활동 농축 (25 µ g/mL) 일 수 표시. 사후 노출 luciferase 활동 농축 계산을 사전 노출 수준으로 분할 되었다. C) 반딧불 luciferase 활동 사이 8 셀에 96-6 음 형식, 5-아 자 (10 µ M) 없이 분석. 비-유전자 변형 (NT) fibroblasts 부정적인 제어로 사용 되었다. 5-아 자 각각 96-6 음 형식, 기준선 이상 luciferase 활동 7.2 86 배 증가. (N = 3, * p < 0.001 * * p < 0.0001 스튜던트 t-검정 비교 5-아 자 여 치료 및 Xi-8 셀을 치료.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
우리의 최근 연구6, luciferase murine 셀 라인 생성 그리고 hygromycin 저항 유전자는 사이에 MeCP2 융합의 도서관으로 불리고 > 60000 shRNAs 대상 > 25000 유전자. 우리는 발견 30 유전자 hygromycin B 선택, 누구의 노크 다운 수 여 생존 이점을 MeCP2 x 염색체 입을 통제에서 그들의 역할을 제안. 이러한 결과 개별 헤어핀으로 보고 셀 라인을 시험 하 고 침묵 luciferase 기자의 재 활성화를 평가 하 여 확인 했다.
우리의 스크린의 모든 복제에 최고 4 개의 헤어핀 XIST 대상 찾는 XCI11 XIST 의 중추적인 역할을 주어 우리의 방법에 대 한 강한 내부 유효성 검사를 제공 합니다. XCI에 규제 역할 이전 설명 하지 했다 TGFβ superfamily 이외 다른 확인 된 유전자 모든 후 성적인 규칙, 따라서 우리의 방법12 에 대 한 추가 유효성 검사로 봉사에 관계와 기능 가족에 속한 , 13 , 14. 또한, 우리 또한 감지 다른 화면에서 식별 이전 13 유전자 4 발기인 기반 GFP Xi15에 무작위로 삽입 CMV를 사용 하 여.
적당 한 복용량과 기간 hygromycin 설정 B 선택 심사 조건 최적화에 중요 했다. 우리의 셀 라인의 감도 높은 밀도, 시드 의존 이었고 부정적인 retroviral 감염에 의해 영향을 받았다. 증가 복용량 또는 선택의 길이 또한 온화한 선택 헤어핀 농축에 대 한 감도 낮춘 반면, Xa에 기자와 세포의 성장을 억제. 여러 hygromycin B 투약 식이요법 및 기자 셀 밀도 시드 따라서 최종 심사 하기 전에 시험 되었다. 또한, 우리의 shRNA 라이브러리 MSCV retroviral 벡터 puromycin 선택을 사용 하 여 성공적으로 불리고 셀에 대 한 풍부 기회를 제공, 비록 puromycin 하지으로 사용 되었다 우리의 실험에 puromycin hygromyin B의 순차적 활용 두 항생제의 적절 한 복용량 드 확대 후에 과도 한 독성 귀착되는.
또한 우리의 연구에서 확인 된 모든 헤어핀 이기는 하지만 더 겸손 한 정도로 침묵 luciferase 기자를 다시 활성화. 이러한 간헐적인 이벤트의 활성화 되었습니다 우리가 예상, 우리의 스크린의 높은 감도 의해 테스트 사이 Xa 셀의 혼합에 따라 2 x 104 의 세포에 한 재 활성화 이벤트. 이러한 저급 한 재 활성화, 공동 활용 5-아 자, 증가 방해 XCI12,13,,1617, 꽉 transcriptional 통제에 앞에서 설명한 어려움을 증명 하 고 여러 규제 메커니즘의 중단 상당한 다시 활성화를 달성 하기 위해 필요한 것을 의미.
메모의 화면에서 확인 된 모든 30 헤어핀 또한 CMV 구동 취재 원 유전자 다른 x 염색체 소재 시, 사이 탈 억제에 그들의 광범위 한 영향을 나타내는에 있는 다시 활성화. 더 연구로 그들의 약리학 적인 또는 유전자 조작 레트 증후군 치료에 매우 유용 하 게 증명할 수 있는 MeCP2 특정 "reactivators", 존재 여부를 테스트 필요 합니다.
우리의 심사 시스템 앞에서 설명한 기자 x 염색체 활성화 화면12,17에 대 한 사용을 통해 여러 가지 이점을 제공 합니다. CMV 발기인에 의해 구동 되 고, 대신 우리의 기자 카세트 MeCP2 의 C-말단에에서 절 하 고 따라서 네이티브 X 연결 된 모터에 의해 구동 됩니다. 이 디자인 MeCP2 로커 스 전용 레 귤 레이 터, 더 그 불멸 하 게 섬유 아 세포에서 발견 해야 될 지 신경에 있는 MeCP2의 원하는 사이트 경고와 함께 레트 증후군 연구의 맥락에서 관련 식별할 수 있습니다. 다시 활성화입니다. Hygromycin 저항 유전자를 사용 하 여 다시 활성화 이벤트의 긍정적인 선택을 가능 하 게 하 고 튼튼하게 화면 감도 증가. 또한, hygromycin 저항 및 반딧불 luciferase 유전자를 포함 하는 카세트 둘 다 대규모 hygromycin B, 및 시험/검사 개별 헤어핀 luciferase 기자를 사용 하 여 긍정적인 선택을 사용 하 여 검사 수 있습니다.
요약 하자면, 우리는 MeCP2 x 염색체는 포유류 세포에 있는 침묵의 레 귤 레이 터의 식별에 대 한 강력 하 고 중요 한 유전자 검사 방법을 보고 합니다. 이 방법론은 작은 방해 RNAs (siRNAs), CRISPR, 심사에 대 한 적응 될 수 또는 작은 분자. 이러한 분석은 레트 증후군의 경우와 같은 자동 유전자의 기능 대립 유전자를 재가동에 의존 하는 치료 접근을 설정 하는 데 유용 증명할 수 있습니다.
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Disclosures
닥터의 프레드 허 친 슨 암 연구 센터의 직원으로이 문서에 기여. 표현 그 자신의 고 반드시 건강의 국가 학회 또는 미국 정부의 의견을 대표 하지는 않습니다.
Acknowledgments
우리는 기꺼이 shRNA 라이브러리 화면에서 사용을 제공 하기 위한 멜버른의 대학 로스 Dickins 감사 합니다. 이 작품으로는 레트 증후군 연구 신뢰 (A.B.) 투자 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
