Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398

Summary

Vi rapporterer en liten hårnål RNA (shRNA) og neste generasjons sekvensering-basert protokoll for å identifisere regulatorer av X-chromosome inaktivering i murine celle linje med firefly luciferase og hygromycin motstand gener del av methyl CpG bindende protein 2 ( MeCP2) Gen på inaktive X-kromosomet.

Abstract

Fremover genetisk skjermer bruker reporter gener inn i heterochromatin har blitt brukt å undersøke mekanismer epigenetic kontroll i modellen organismer. Teknologier inkludert kort hårnål RNAs (shRNAs) og gruppert regelmessig interspaced kort palindromic gjentar (CRISPR) har aktivert slike skjermer i diploide pattedyrceller. Beskriver her vi en storstilt shRNA skjerm for regulatorer av X-chromosome inaktivering (XCI), med et murint celle linje med firefly luciferase og hygromycin motstand gener banket i på C-terminus av methyl CpG bindende protein 2 (MeCP2)-gen på den inaktive X-chromosome (Xi). Reaktivering av Konstruer i reporter cellen linje overdratt overlevelse fordel under hygromycin B valg, slik at vi kan skjermen en stor shRNA bibliotek og identifisere hårnåler som reaktivert reporteren ved å måle deres etter utvalg berikelse bruker neste generasjons sekvensering. De beriket hårnåler ble deretter individuelt validert ved å teste deres evne til å aktivere luciferase reporter på Xi.

Introduction

En mest vanlige former for arvelig mental svekkelse i kvinner, Retts syndrom, er forårsaket av heterozygote mutasjoner i MeCP2, en X-chromosome genet som koder et protein som er viktig for normal neuronal funksjon1. En potensiell tilnærming til behandling av denne lidelsen ville være reaktivering av vill-type MeCP2 allelet på Xi, som restaurering av MeCP2 uttrykk å reversere nevrologiske underskudd i en musemodell av denne sykdommen1, 2 , 4. men epigenetic silencing av en av de to X-kromosomer i kvinnelige celler er tett opprettholdt gjennom hele levetiden til en organisme3,4, og robust reaktivering av en Xi genet ville trolig kreve en større avbrudd i flere epigenetic regulatoriske veier.

For å identifisere faktorene på krevd for vedlikehold av MeCP2 stanse, vi utviklet en transgene musemodell bærer en MeCP2- luciferase - hygromycin motstand genet fusjon (MeCP2-LUC-HR) på en av de to X-kromosomer (X MeCP2-LUC-HRxMeCP2)5. Selv om MeCP2 uttrykt fra fusion konstruksjon viste seg for å være ustabil og resulterte i tap av funksjon, svært etterligne MeCP2 sletting i hemizygous menn (XMeCP2-LUC-HR/Y), uttrykk for reporter gener var lett synlig i et mønster samsvarer med uttrykket av endogene MeCP25. Vi deretter generert udødeliggjort fibroblast kloner med konstruere på enten inaktiv eller aktiv X-chromosome, og bekreftet at tidligere uttrykt wild type MeCP2 og ikke reporter Konstruer; motsatte var sant for sistnevnte. Når de utsettes for en DNA demethylating agent kjent å oppheve genet stanse, 5-azacytidine (5-AZA), celler med reporter på Xi ("reporter celler") fikk aktivitet i en bioluminescens analysen, som indikerer at vår konstruere kan aktiveres og derfor brukes for genetisk screening.

Deretter utviklet vi en høy gjennomstrømming genetisk skjerm for regulatorer av MeCP2 stanse. Reporter celle linjen var først infisert med en retroviral biblioteket inneholder > 60 000 forskjellige shRNAs målretting > 25 000 gener i musen genomet5,6, og deretter utsatt for hygromycin B utvalg. Hårnål frekvensen ble sammenlignet før og etter valget prøver ved neste generasjons sekvensering, som reporter reaktivering overdratt vekst fordel under hygromycin B valg og resulterte i anriking av ansvarlig hårnåler. Bruker denne tilnærmingen, vi identifisert 30 gener innblandet i MeCP2 stanse, og senere bekreftet resultatene av transducing reporter cellene med personlige hårnåler og måle sin luciferase aktivitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle trinn som involverer dyr ble utført ved hjelp av protokoller godkjent av Fred Hutchinson Cancer Research Center institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC). Ingen reagenser her er kjent for å utgjøre betydelige helserisiko unntatt 5-azacytidine (5-AZA).

1. generere en reporter celle linje med MeCP2- LUC-HR transgene på Xi

  1. Forbereder musen sene fibroblaster fra en kvinnelig XMeCP2-LUC-HR xMeCP2 musen
    1. Euthanize en 10-12 dag-gamle kvinner XMeCP2-LUC-HRxMeCP2 musen.
    2. Bruke rett disseksjon saks, lage en omkrets snitt gjennom huden av den proksimale hale-delen.
    3. Holde carcass nær foten av halen, trekke huden fra musa for å avsløre den fibrocartilaginous delen av halen. Fjerne og skjær terminalen 10 mm av eksponert vev i 1 mm lang fragmenter med kirurgisk skalpell.
    4. Overføre fragmentert vev til en 15 mL konisk rør som inneholder 5 mL av Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM) med 1 U/mL penicillin 1 µg/mL streptomycin og 1.5 mg/mL collagenase, pre filtrert gjennom 0,45 µm og deretter 0,2 µm mesh filtre. Inkuber for 3-4 h på 37 ° C med kontinuerlig rotasjon.
    5. Sentrifuge prøven ved romtemperatur på 500 x g for 10 min. Resuspend pellet i 10 mL av DMEM med 10% fosterets bovin serum, 1 U/mL penicillin, og 1 µg/mL streptomycin (DMEM-10) og plate på en 6-og vev kultur plate. Passasje cellene gang og utvide til en 10 cm plate før du fortsetter til neste trinn.
    6. Forevige cellene ved å utføre en signaltransduksjon med et uttrykk vektor bærer HPV-16 viral oncogenes (E6/E7), som beskrevet tidligere7.
  2. Velge enkeltcelle kloner og karakteriserer MeCP2 reporter uttrykk
    1. Høste celler fra en 10 cm plate. Først Sug opp media, legge til 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA og ruge i 2-5 min på 37 ° C. Slukke med 9 mL av DMEM-10 og samle de resuspended cellene i et 15 mL konisk rør.
    2. Fortynne cellene med DMEM-10 til en siste konsentrasjon av 1 cellen/100 µL. overføring til 96-brønns plater av pipettering 100 µL av suspensjon i hver brønn.
    3. Ruge på 37 ° C til brønnene er confluent, som kan ta opp til 2-3 uker. Erstatt media med fersk DMEM-10 hver 3-5 dager. Når confluent, mobilisere cellene med 20 µL av 0,05% trypsin-EDTA per brønn og dele dem i to identiske sett med 96-brønns plater.
    4. Bruke ett sett av plater til analysen for luciferase aktivitet. Bruke en homogen firefly luciferase analysen kit som ikke krever fjerning av medium. Følg protokollen inkludert med kit.
    5. Bruk resultatene fra trinn 1.2.4 for å velge kloner uten synlig luciferase aktivitet fra gjenværende sett av plater. Utvide disse Klonene til 24-vel og deretter 6-vel plater.
    6. Utføre det samme for en klone med høyeste luciferase aktivitet; Dette vil bli brukt som en positiv for kontrollhensyn.
    7. Høste en aliquot av hver brønn i 6-vel platen i en Western blot. Mobilisere cellene med 200 µL av 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber for 2-5 min på 37 ° C. Slukke med 2 mL DMEM-10, og Overfør halvparten av cellene til 1,5 ml sentrifuge tube. Vask cellene gang med PBS før lysing for Western blot. Eventuelt overføre halvparten av cellene til en annen 6-vel plate. Når cellene feste til bunnen av platen, skyll med PBS og lyse for Western blot.
    8. Utføre en Western blot med anti-MeCP2 mot bekrefte at luciferase-negativ celler uttrykke, mens luciferase-positive cellene ikke uttrykke vill-type MeCP2 fra active X-kromosomet; Følg den tidligere beskrevet protokoll8. Bruk hjernevev lysate fra noen wild type mus som en positiv.
    9. Plate flere negative kloner på 2 x 105 celler/godt i en 6-vel plate. Behandle en gang med 10 µM 5-AZA ruge 72 h uten å endre media og analysen for luciferase aktivitet som beskrevet i trinn 1.2.3.
    10. Velg en negativ klone (Xi klone) som fikk luciferase aktivitet med 5-AZA og begynne å utvide den til flere 10 cm plater. Fryse de resterende negative Klonene i flytende nitrogen som en sikkerhetskopi. Positiv klone (Xa klone) kan vedlikeholdes i vev kultur eller frosset til fremme bruk.

2. screening biblioteket for reaktivering hjelp av hygromycin B

  1. Infisere test klone bruke utvalg og høsting DNA for sekvensering
    1. Få viral konsentrater i retroviral konstruerer uttrykke hårnåler fra et shRNA bibliotek, eller produsere konsentrert viral nedbryting ved hjelp av protokollen med ønsket biblioteket.
    2. Før du fortsetter med skjermen, sjarmere biblioteket (med en GFP markør, hvis tilgjengelig). Mål for et mangfold av infeksjon mellom 0,3 og 0,5.
      Merk: Utføre minst fire uavhengige skjermer for å minimere mengden. Bruke 20 plater per skjermen for å få 100-fold dekning av biblioteket for å opprettholde tilstrekkelig representasjon av hårnåler og unngå tilfeldige dropouts9. Imidlertid er gitt positive utvalgsskjermen og et stort bibliotek størrelse, det sannsynlig at en lavere dekning nok.
    3. I morgen, plate 1 x 106 Xi celler på 10 cm vev kultur plater.
    4. På ettermiddagen, infisere platene ved å erstatte media med fersk DMEM-10 inneholder viral nedbryting og 5-10 µg/mL av polybrene. Bruk mengden viral nedbryting i trinn 2.1.2.
    5. Etter 18-24 h, Sug opp media og legge 10 mL av fersk DMEM-10 til hver plate. Kultur for en annen 48 timer.
    6. I morgen, mobilisere cellene med 1 mL av 0,05% trypsin-EDTA per plate og slukke med 9 mL av DMEM-10 per plate. Kjør suspensjon gjennom en 100 µm maske filter. Bassenget av filtrerte suspensjon sammen, og frø to sett av 10 cm plater 1 x 106 celler/plate.
    7. På ettermiddagen, erstatte media i ett sett av plater med DMEM-10 inneholder 15 µg/mL av hygromycin B (dag 0). I det andre settet, Erstatt media med fersk DMEM-10 bare.
    8. Mobilisere cellene fra ubehandlet sett av plater med 1 ml av 0,05% trypsin-EDTA etter 48 timer. Inkuber for 2-5 min på 37 ° C. Slukke med 9 mL av DMEM-10. Overføre cellene til 15 ml konisk rør og sentrifuger på 500 x g i 5 minutter ved romtemperatur. Sug opp supernatants og fortsette umiddelbart trekke DNA fra pellets. Alternativt basseng cellene i større rør før sentrifugering trinn.
    9. Ekstra DNA bruker en blanding av fenol og chroroform og utløse DNA med natrium acetate og kalde etanol som beskrevet tidligere10. Basseng personlige forvalg DNA-prøvene og lagre på 20 ° C til fremme bruk.
    10. Fortsette dyrking hygromycin B utvalg satt for 4 dager. Fylle markering media med fersk DMEM-10 med hygromycin B etter 2 dager.
    11. På dag 7, erstatter du valg-media med fersk DMEM-10 bare. 2 til 4 dager for gjenoppretting, og deretter høste cellene som beskrevet i trinn 2.1.8. Fortsett med DNA utvinning som beskrevet i trinn 2.1.9.
  2. Identifisere hårnåler beriket i etter valget utvalgene
    1. Bruk 5' kontekst (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3 ") og 3' omvendt loop primere (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3") å forsterke halv-hårnåler fra før og etter utvalg DNA-prøver. Bruk alle utdraget DNA i separate PCR reaksjoner med 100-200 ng DNA per reaksjon.
      Merk: Disse 5' kontekst primer og 3 omvendt loop primere tilsvarer miR-30 sammenheng sekvensen oppstrøms av shRNA sette og rekkefølgen shRNA loop, henholdsvis. Forskjellige biblioteker krever ulike oligos. Justere rensing fremgangsmåten for å isolere ulike størrelser etter behov.
    2. Bruk størrelse-utvalg perler fjerne primere og genomisk DNA, og gjenopprette PCR produkter mellom 100 og 200 bp. følger protokollen med perler.
    3. Forberede en sekvensering biblioteket til sekvens halv-hårnåler. Generere minst 50 millioner leser per skjermen. Følge protokollen som passer til sekvensering kit og utstyr.
      Merk: 50 millioner leser per skjermen gir 1000-fold representasjon av hver shRNA i biblioteket og ca 10 ganger dekning av hver uavhengige infeksjon (utført på 100-fold representasjon av hver shRNA), som sikrer tilstrekkelig representasjon av hver infeksjon hendelse.
    4. Nummerere hver shRNA ved hjelp av et Perl-skript som teller sekvenser med perfekt treff. Valgte shRNAs som hadde minst 10 leser i forhåndsvalg bassenget for videre analyse. Beregne enrichments som prosenter av post til forhåndsvalg teller og bestemme falske funnrate (FDR) basert på 1000 permutasjoner. Valgte gener målrettet av shRNAs med < 5% FDR som "treff" for ytterligere testing.

3. validering av identifiserte hårnåler ("treff")

  1. Emballasje lentiviruses som inneholder shRNAs i skjermen
    1. Frø 8 x 106 293 FT celler per plate på 10 cm plater.
    2. Dagen erstatte media med 9 mL av antibiotika-fri DMEM-10 per plate; gjøre denne 30 minutter før transfection.
    3. Klargjør to mikser transfection under 30 minutters intervall:
      1. Forberede Mix 1 (per plate/shRNA, skalere opp av totalt antall shRNAs): 10 µL av 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) i 0,5 mL optimal minimum viktige medier. Blande av pipettering og ruge ved romtemperatur for 5 min.
      2. Forberede bland 2 (per shRNA): 4 µg av shRNA vektoren kan pakkes, 1,5 µg av VSV-G konvolutt vektoren (pMD2.G) og 2,5 µg av emballasje vektoren (psPAX2), blandet i 0,5 mL optimal minimum viktige medier.
        Merk: Inkluder en tom lentiviral vektor i emballasjen bruke i senere infeksjoner som en negativ kontroll.
    4. Legg til 0,5 mL Mix 1 hver aliquot Mix 2, og bland forsiktig av pipettering. Inkuber i mørket ved romtemperatur for 20 min.
    5. Påfør blandingen på hver plate fra trinn 3.1.2 på en dropwise måte; snurr den forsiktig å blande.
    6. Dagen erstatte media med 5 mL av fersk DMEM-10.
    7. 48 timer etter første transfection, samle nedbryting og kjøre det gjennom filtere 0.22 µm. Pre våt filteret med DMEM-10 for å maksimere utvinningen.
    8. Aliquot filtrert nedbryting i mengder ideelt for infisere en 6-vel plate også.
    9. Fryse dele ved-80 ° C for senere bruk, eller fortsette umiddelbart signaltransduksjon.
  2. Signaltransduksjon og testing av personlige hårnåler luciferase reporter reaktivering og reaktivering av vill-type MeCP2 gene på Xi.
    1. I morgen, plate 1 x 105 Xi celler/godt på 6 bra plater.
    2. På ettermiddagen, infisere platene ved å erstatte media med 2 mL frisk DMEM-10 inneholder lentiviral nedbryting og 5-10 µg/mL av polybrene. Infisere en kontroll med viral nedbryting produsert fra en tom lentiviral vektor.
    3. Dagen erstatte media med 2 mL DMEM-10 inneholder 1 mg/mL puromycin. Kultur i fire dager.
    4. Erstatte media med 2 mL frisk DMEM-10 og la 48-72 h for utvinning.
    5. Mobilisere cellene med 150 µL av 0,05% trypsin-EDTA. Inkuber for 2-5 min på 37 ° C. Slukke med 1,5 mL av DMEM-10. Overføre cellene til 15 ml konisk rør og sentrifuger på 500 x g i 10 minutter ved romtemperatur.
    6. Fjern media og resuspend cellene i 100 µL lyseringsbuffer gitt i luciferase analysen kit. Inkuber ved romtemperatur i 5 minutter. Overføre lysates hvite 96-brønns plate og analysen for luciferase aktivitet ved hjelp av protokollen som følger med settet. Bruke Xa celler som en positiv kontroll og Xi celler infisert med en tom lentiviral vektor som en negativ kontroll.
      Merk: Unngå å utsette de hvite platene fluorescerende lys før analysen; Dette vil redusere bakgrunnen og øke analysen følsomhet. Protokollen i analysen settet ble funnet for å være mest effektive hvis utført i mørket når det er mulig.
    7. For å fastslå om hårnål hadde en effekt på hvilket uttrykk MeCP2 på den aktive X-chromosome, isolere RNA fra tranduced Xi celler og måle MeCP2 mRNA nivå med kvantitative PCR primere utviklet for å forsterke bare wild type MeCP2 (F: 5-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3 ").
    8. Tilleggsutstyr: Øke sensitiviteten av analysen ved å legge til 5-AZA en siste konsentrasjon av 0,2 µM etter cellene har gjenopprettet fra puromycin utvalg. Kultur celler for 72 h uten å erstatte media, og deretter analysen for luciferase aktivitet ved hjelp av kommersielle luciferase analysen kit.
    9. Måle reaktivering av forstummet vill-type MeCP2. Infisere Xa celler, som havn wild type MeCP2 på Xi, med vektoren som inneholder personlige hårnåler, fremgangsmåten protokollen 3.2.1. -3.2.4. Isolere RNA fra celler og måle MeCP2 mRNA nivå med kvantitative PCR primere utviklet for å forsterke bare wild type MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Musen sene fibroblaster ble høstet fra en tidligere beskrevet XMeCP2-LUC-HRxMeCP2 kvinnelige mus, udødeliggjort av retroviral Albin på E6 og E7 oncogenes fra HPV-16 virus7, klonet ved hjelp av begrensende fortynning og testet for luciferase aktivitet og uttrykk av vill-type MeCP2 protein (figur 1A og 1B). Luciferase aktivitet var robust hvis reporteren var på Xa og undetectable på Xi. native MeCP2 uttrykket utstilt en gjensidig mønster. Vi valgte en klone uten luciferase aktivitet (Xi-8) og en klone med robust aktivitet (Xa-3) for videre studier. Når Xi-8 celler ble behandlet med 5-AZA, ble en doseavhengig induksjon i luciferase aktivitet observert (figur 1 c).

Følsomheten til Xi-8 og Xa-3 celler til hygromycin B ble testet ved å utføre 3 og 6 dager lange valg. Som forventet fra uttrykksmønster av reporteren luciferase, var Xi-8 celler mer følsomme for hygromycin B enn Xa-3 celler, selv om sistnevnte utstilt følsomhet for høyere doser (figur 2A). Etter en 1: 100 blanding av Xa-3 til Xi-8 celler var utsatt for ulike konsentrasjoner av ble hygromycin B, en tidsavhengige økning i luciferase aktivitet observert, indikerer vellykket konkurranse av Xa-3 celler over Xi-8 celler (figur 2B). Dose og varigheten av hygromycin B utvalg ble valgt for videre studier basert på fortrinnsrett hemming av Xi-8 over Xa-3 celler.

Fire uavhengige skjermer ble utført for å identifisere regulatorer av MeCP2 stanse Xi-8 celle linjen og en åpen Biosystems miR-30-basert shRNA biblioteket som inneholder 64,159 forskjellige hårnåler klonet i en MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retroviral vektor. I hvert skjermbilde, var 20 10 cm plater infisert med grupperte shRNAs, målretting omtrent 100 ganger dekning av biblioteket. Hygromicin B ble gjennomført for 6 dager, til små acellular flekker ble observert; cellene fortsatte å dø for ekstra 24 til 48 timer. Når cellene ble høstet for DNA utvinning bruker en fenol-kloroform teknikk. Den totale DNA avkastningen per skjermen var rundt 20 µg/plate, som var samlet og delt mellom 100 PCR reaksjoner med primere utviklet for å forsterke halv-hårnåler. PCR produktene var så perle-renset og utsatt for høy gjennomstrømning sekvensering.

Før og etter valget var forhold for å bestemme hårnål berikelse, som vi forventet at noen hårnål tilstede på forhøyede nivåer i etter valget utvalget målrettet gener som reaktivert Xi og således gitt hygromycin motstand. Bare hårnåler beriket i minst 2 av de fire skjermene ble ansett for validering. De mest beriket hårnåler i alle gjentak av vår skjermen var fire hårnåler målretting XIST, samsvar med sin avgjørende rolle i XCI11.

Validering-delen av skjermen ble utført ved å individuelt teste hårnåler som registrert som treff for aktivering av luciferase reporteren i Xi-8 celler. Selv om skjermen ble gjennomført med et MSCV-baserte retroviral bibliotek, ble valideringen gjennomført med en lentiviral vektor (personlige pGIPZ kloner med shRNA) å unngå mulig av retrovirus-indusert gjenstander.

Hver kandidat gener ble rettet av minst to forskjellige hårnål sekvenser og knockdown av målet genet ble bekreftet av sanntid kvantitative PCR (RT-qPCR). Ved assaying opptil 1 x 106 celler i 6-vel format og redusere bakgrunnen luminescence (figur 2C), var vi kjøpedyktig merker meget lavfrekvente reaktivering hendelser, som vi anslått til å være 1:20,000.

Videre analyse ved hjelp av individuelle hårnåler førte til identifisering av 30 gener som knockdown resulterte i reaktivering av reporteren på Xi. Median omfanget av luminescence for disse 30 genene ble 2.8-fold over grunnlinjen, som ble ytterligere forsterket 7.1-fold følgende 5-AZA behandling. De samme hårnåler var testes, sammen med 5-AZA, med Xa-3 celler å bekrefte re uttrykk for wild type MeCP2 fra Xi. Dette ble oppnådd ved å utføre RT-qPCR bruker primere utviklet for å forsterke bare vill type transkripsjon av MeCP2.

Figure 1
Figur 1. Isolering av kloner med MeCP2-Luc-HR reporter genet på Xi.
A) representant firefly luciferase analysen på udødeliggjort sene fibroblaster kloner (1-9). Primære fibroblaster fra ikke-transgene (NT) og transgene heterozygote kvinnelige (F) ble brukt som negative og positive kontroller, henholdsvis. B) representant Western blot viser MeCP2 protein uttrykk fra cellene i (A). Merk at luciferase aktivitet (figur 1A) og MeCP2 uttrykk utstillingen gjensidige uttrykksmønster. C) induksjon av firefly luciferase aktivitet i Xi-8 celler med 5-AZA. XA-3 celler, med reporter genet på Xa, tjene som en positiv. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Karakterisering av hygromycin motstand i Xi-8 og Xa-3 celler.
A) relative veksten av Xi-8 og Xa-3 celler behandlet med forskjellige hygromycin B regimer (3D = 3 dager; 6D = 6 dager), som sammenlignet med ubehandlet celler. B) luciferase aktivitet berikelse etter utsette totalt 10.000 Xa-3 og Xi-8 celler (blandet i 1: 100 forholdet) til hygromicin B (25 µg/mL) for angitt antall dager. Etter eksponering luciferase aktivitet ble delt av pre-eksponering nivået til å beregne berikelse. C) firefly luciferase aktivitet i Xi-8 celler, assayed i 96 - og 6-godt format, med og uten 5-AZA (10 µM). Non-transgene (NT) fibroblaster ble brukt som en negativ kontroll. 5-AZA økte luciferase aktiviteten 7.2 - og 86 ganger over grunnlinjen i 96 - og 6-godt format, henholdsvis. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 av Student t-test sammenligner 5-AZA behandlet og ubehandlet Xi-8 celler.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I vår siste studie6, vi generert en murine celle linje med luciferase og hygromycin motstand gener del MeCP2 på Xi, og transduced det med et bibliotek med > 60.000 shRNAs målretting > 25 000 gener. Vi fant 30 gener som sammenleggbare tillagt overlevelse fordel under hygromycin B valg, tyder sin rolle i kontrollen av MeCP2 og X-chromosome stanse. Disse resultatene ble godkjent av transducing rapportert celle linje med personlige hårnåler og vurdere reaktivering av stille luciferase reporter.

Å finne at de øverste fire hårnåler i alle gjentak av skjermen vår målrettet XIST gitt en sterk intern validering for vår metode, gitt pivotal rollen XIST i XCI11. Bortsett fra TGFβ gruppe, hvis regulerende rolle i XCI ikke hadde vært beskrevet tidligere, tilhørte de andre identifiserte genene alle funksjonelle familier med bånd til epigenetic regulering, dermed tjene som en ekstra validering for våre metoden12 , 13 , 14. videre vi også oppdaget 4 av 13 gener tidligere identifisert i en annen skjerm, bruker en CMV promoter-drevet GFP tilfeldig inn på Xi15.

Etablering passende dose og varigheten av hygromycin var B utvalg avgjørende for å optimalisere screening betingelsene. Følsomheten til vår celle linje var svært avhengig seeding tetthet, og var negativt påvirket av retroviral infeksjon. Økt doser eller lengden på utvalg også hemmet veksten av celler med reporter på Xa, mens mildere utvalg senket følsomheten for hårnål berikelse. Flere hygromycin B dosering regimer og reporter celle seeding tettheter ble dermed testet før siste screening. Videre, selv om MSCV retroviral vektoren i biblioteket vårt shRNA ga en mulighet til å bruke puromycin utvalg og berike for vellykket transduced celler, puromycin ble ikke brukt i våre eksperimenter, som sekvensiell bruk av puromycin og hygromyin B resulterte i overdreven toksisitet, selv etter passende dose nedtrappingen av både antibiotika.

Alle hårnåler identifisert i vår studie også reaktivert stille luciferase reporteren, men i mer beskjedne grad. Påvisning av disse sjeldne hendelser ble aktivert ved høy følsomhet av vår skjermen, som vi beregnet, basert på testing tilsetningsstoffer Xi og Xa celler, å være en ny aktivering hendelse i 2 x 104 celler. Slike lave nivåer av reaktivering, økt med co-anvendelse av 5-AZA, bevitne beskrevet tidligere vanskeligheter i å forstyrre tett transcriptional kontroll over XCI12,13,16,17, og antyde at avbrudd i flere regulatoriske mekanismer vil være nødvendig å oppnå betydelige reaktivering.

Av notatet reaktivert alle 30 hårnåler identifisert i vår skjerm også en CMV-drevet reporter genet ligger på et annet X-chromosome locus, som indikerer deres bredere innvirkning på Xi de undertrykkelse. Videre studier er nødvendig å teste om MeCP2-spesifikke "reactivators" finnes, som deres pharmacologic eller genetisk manipulasjon kan være svært nyttig i behandling av Retts syndrom.

Screening systemet tilbyr flere fordeler sammenlignet med tidligere beskrevet journalistene brukes for X-chromosome reaktivering skjermer12,17. I stedet for å være drevet av en CMV promoter, vår reporter kassetten er slått på på C-terminus av MeCP2 og er dermed drevet av opprinnelige X-tilknyttede selskapet. Denne utformingen kan bidra til å identifisere MeCP2 locus-spesifikke regulatorer, mer relevante i forbindelse med Retts syndrom forskning, med en påminnelse at funnene i udødeliggjort fibroblaster bør være recapitulated i neurons, ønsket område av MeCP2 reaktivering. Bruk av en hygromycin motstand genet kan positivt utvalg av reaktivering hendelser og øker robust skjermen følsomheten. Videre kan kassetten som inneholder hygromycin motstand og firefly luciferase gener både store screening med positiv utvalg med hygromycin B og testing/screening personlige hårnåler med luciferase reporter.

I sammendraget rapportere vi en robust og sensitive genetisk screening metode for identifikasjon av regulatorer av MeCP2 og X-chromosome stanse i pattedyrceller. Denne metoden kan tilpasses for screening lite forstyrrende RNAs (siRNAs), CRISPR, eller små molekyler. Slike analyser kan være nyttig i å etablere terapeutiske metoder som bruker reaktivere det funksjonelle allelet med et stille som når det gjelder Retts syndrom.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dr. Leko bidratt til denne artikkelen som en ansatt i Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Synspunktene er hans egne og representerer ikke nødvendigvis synspunktene til National Institutes of Health eller myndighetene i USA

Acknowledgments

Vi takker Ross Dickins av University of Melbourne for allernådigst skaffer shRNA biblioteket i skjermen. Dette arbeidet ble finansiert av Retts syndrom Research Trust (A.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
  2. Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
  3. Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
  4. Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
  5. Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
  6. Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
  7. Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
  8. Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
  9. Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
  10. Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
  11. Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
  12. Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
  13. Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
  14. McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
  15. Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
  16. Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
  17. Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).

Tags

Genetikk problemet 133 X-chromosome inaktivering epigenetics MeCP2 Retts syndrom XIST shRNA screening
Grupperte shRNA skjermen for aktivering av MeCP2 på inaktive X-kromosomet
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter