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Genetics

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Published: March 2, 2018 doi: 10.3791/56398
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 1,4
1Clinical Research Division, Fred Hutchinson Cancer Research Center, 2Hematology Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 3Epigenetics Program, Department of Cell and Developmental Biology, University of Pennsylvania Perelman School of Medicine, 4Departments of Medicine and Biochemistry, University of Washington

Summary

Divulgamos una pequeña horquilla RNA (shRNA) y el siguiente protocolo basado en la secuencia de generación para la identificación de reguladores de la inactivación del cromosoma x en una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina fusionado a la metil CpG Unión proteína 2 ( MeCP2) gen en el cromosoma X inactivo.

Abstract

Avance genéticos pantallas usando genes del reportero insertados en la heterocromatina se han utilizado para investigar los mecanismos de control epigenético en organismos modelo. Tecnologías incluyendo horquilla corta RNAs (shRNAs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) han permitido que tales pantallas en células de mamíferos diploides. Aquí describimos una pantalla shRNA a gran escala de los reguladores de la inactivación del X-cromosoma (XCI), utilizando una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina golpeó en el c-término de la proteína de unión a CpG de metilo 2 (MeCP2) gene en el cromosoma x inactivo (Xi). Reactivación de la construcción en la línea celular de reportero confiere ventaja de supervivencia en selección de higromicina B, lo que nos permite una biblioteca grande de shRNA y identificar reguladores que reactivaron el reportero midiendo su selección posterior enriquecimiento utilizando secuenciación de próxima generación. Las horquillas enriquecidas entonces fueron validadas individualmente por prueba de su capacidad para activar el reportero de luciferasa en Xi.

Introduction

Una las formas más comunes de deficiencia mental hereditaria en las mujeres, el síndrome de Rett, es causada por mutaciones heterozigóticas en MeCP2, un gen del cromosoma x que codifica una proteína esencial para la función neuronal normal1. Un enfoque potencial para el tratamiento de este trastorno sería la reactivación del alelo tipo salvaje de MeCP2 en la Xi, como restauración de expresión MeCP2 fue demostrado revertir déficits neurológicos en un modelo de ratón de esta enfermedad1, 2 , 4. sin embargo, silenciamiento epigenético de uno de los dos cromosomas en las células femeninas de X se mantiene bien durante toda la vida de un organismo3,4, y sólida reactivación de un gen Xi probablemente requeriría una mayor interrupción en múltiples vías de regulación epigenéticas.

Para identificar los factores necesarios para el mantenimiento del silenciamiento de MeCP2 , primero desarrollamos un modelo de ratón transgénico con una fusión de genes de resistencia MeCP2- luciferasa - Higromicina (MeCP2-LUC-HR) en uno de los dos cromosomas X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Aunque el MeCP2 expresada desde la construcción de la fusión demostró para ser inestable y dio lugar a una pérdida de función, fenotípicamente mímico eliminación de MeCP2 en varones hemizygous (X /YMeCP2-LUC-HR), la expresión de los genes del reportero era fácilmente perceptible en un patrón consistente con la expresión endógena de MeCP25. A continuación genera clones del fibroblasto inmortalizado con el constructo en el cromosoma x inactivo o activo y confirmó que el ex expresó tipo MeCP2 y no la construcción de reportero; el inverso era verdad para estos últimos. Cuando se expone a un ADN desmetilantes agente conocido derogar silenciamiento génico, 5-azacitidina (5-AZA), las células con el reportero de la Xi ("células de reportero") ganaron la actividad en un ensayo de bioluminiscencia, que indica que la construcción podría ser reactivado y por lo tanto utilizado para la investigación genética.

A continuación desarrollamos una pantalla genética de alto rendimiento para los reguladores del silenciamiento de MeCP2 . La línea celular de reportero primero fue infectada con una biblioteca retroviral que contiene > 60.000 diferentes shRNAs dirigidos a > 25.000 genes en el genoma de ratón5,6y después sometida a higromicina B selección. Se comparó la frecuencia de horquilla en pre- y post selección muestras utilizando la siguiente secuencia de generación, como reportero de reactivación confiere ventaja del crecimiento en la selección de higromicina B y dio lugar a enriquecimiento de horquillas responsables. Usando este acercamiento, identificado 30 genes implicados en MeCP2 silenciamiento y posteriormente confirmó los resultados de medir su actividad de luciferasa y transducción de las células de reportero con reguladores individuales.

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Protocol

Todos los pasos que involucran animales se llevaron a cabo utilizando protocolos de actuación aprobados por el Fred Hutchinson cáncer Research Center institucional Animal cuidado y el Comité uso (IACUC). No reactivos utilizados aquí conocen a riesgos significativos para la salud humana a excepción de la 5-azacitidina (5-AZA).

1. generar una línea de celular de reportero con MeCP2- LUC-HR transgen en el Xi

  1. Preparación de fibroblastos de ratón tendón de una hembra X /XMeCP2-LUC-HR MeCP2 ratón
    1. Eutanasia a un día de 10-12-vieja hembra X /XMeCP2-LUC-HRratón deMeCP2 .
    2. Usando las tijeras de disección recta, hacer una incisión circunferencial a través de la piel de la porción proximal de la cola.
    3. Sosteniendo el cadáver cerca de la base de la cola, tirar de la piel de ratón para exponer la porción fibrocartilaginous de la cola. Retire y corte el terminal 10 mm del tejido expuesto en 1 mm largos fragmentos utilizando un bisturí quirúrgico.
    4. Transferencia el tejido fragmentado para un 15 mL cónico del tubo que contiene 5 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 1 U/mL penicilina, estreptomicina μg/mL 1 y colagenasa 1,5 mg/mL, previamente filtradas por 0,45 μm y filtros de malla de entonces 0.2 μm. Incubar durante 3-4 h a 37 ° C con rotación continua.
    5. Centrifugar la muestra a temperatura ambiente a 500 x g durante 10 minutos Resuspender el precipitado en 10 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 1 U/mL de penicilina y 1 estreptomicina μg/mL (DMEM-10) y la placa en una placa de cultivo de tejidos bien 6. Las células de paso una vez y ampliar a una placa de 10 cm antes de proceder al siguiente paso.
    6. Inmortalizar las células mediante la realización de una transducción de señales con un vector de expresión llevando oncogenes virales de VPH-16 (E6/E7), como se describe previamente7.
  2. Selección de clones de células individuales y caracterización de la expresión del reportero de MeCP2
    1. Cosechar las células de una placa de 10 cm. En primer lugar, aspirar los medios de comunicación, añadir 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA e incubar 2-5 minutos a 37 ° C. Saciar con 9 mL de DMEM-10 y recoger las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 mL.
    2. Diluir las células con DMEM-10 a una concentración final de 1 celda/100 μl. transferencia para placas de 96 pocillos por Pipetear 100 μl de la suspensión en cada pozo.
    3. Incubar a 37 ° C hasta que los pozos son confluentes, lo que pueden tardar hasta 2-3 semanas. Sustituir los medios de comunicación con DMEM fresco-10 cada 3-5 días. Confluente, movilizar las células con 20 μl de 0.05% tripsina-EDTA por pozo y separar en dos conjuntos duplicados de placas de 96 pocillos.
    4. Utilice un juego de placas para ensayo de actividad de luciferasa. Utilice un kit de ensayo de luciferasa de luciérnaga homogéneo que no requiere el retiro de los medios de comunicación. Seguir el protocolo incluido en el kit.
    5. Utilizar los resultados del paso 1.2.4 para seleccionar clones con ninguna actividad de luciferasa detectable del conjunto restante de las placas. Ampliar estos clones para placas de 24 pocillos y luego 6-bien.
    6. Realizar lo mismo para un clon con la mayor actividad de luciferasa; Esto se utilizará como control positivo para la validación.
    7. Cosecha una alícuota de cada pocillo de la placa de 6 pozos para un Western blot. Movilizar las células con 200 μL de 0.05% tripsina-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 2 mL de DMEM-10 y transferir la mitad de las células al tubo de centrífuga de 1.5ml. Lave las células una vez con PBS antes de lisis para Western blot. Alternativamente, transferir la mitad de las células a otra placa de 6 pozos. Cuando las células se unen a la parte inferior de la placa, enjuague con PBS y lyse para Western blot.
    8. Realizar un Western blot con anticuerpos anti-MeCP2 para confirmar que las células negativas luciferase expresan, mientras que las células positivas de luciferasa no expresan tipo MeCP2 del cromosoma X activo; seguir el protocolo descrito previamente8. Usar tejido cerebral lisado de cualquier ratón de tipo salvaje como un control positivo.
    9. Varios clones negativos en 2 x 105 células/pozo en una placa de 6 pozos de la placa. Tratar una vez con 10 μm 5-AZA, incuban durante 72 h sin cambiar los medios de comunicación y análisis para la actividad de luciferasa como se describe en el paso 1.2.3.
    10. Elija una copia negativa (clon del Xi) que ganó actividad de luciferasa con 5-AZA y comenzar a expandirse a varias placas de 10 cm. Congelar los clones restantes negativos en nitrógeno líquido como una copia de seguridad. El clon positivo (Xa clon) puede ser mantenido en el cultivo de tejidos o congelado hasta su uso posterior.

2. proyección de la biblioteca de la reactivación con higromicina B selección

  1. Infectar el clon de prueba, aplicación de selección y recolección de ADN para secuenciación
    1. Obtener concentrados virales de retrovirales construcciones expresando horquillas de una biblioteca de shRNA o producir concentrado sobrenadante viral usando el protocolo incluido en la biblioteca deseada.
    2. Antes de proceder con la pantalla, valorar la biblioteca (con un marcador GFP, si está disponible). Objetivo para una multiplicidad de infección entre 0.3 y 0.5.
      Nota: Realice al menos cuatro pantallas independientes para minimizar falsas tasas positivas. Utilice 20 placas por pantalla para obtener cobertura de 100-fold de la biblioteca para mantener una adecuada representación de horquillas para el pelo y evitar caídas al azar9. Sin embargo, pantalla de selección positiva y un tamaño de la gran biblioteca, es probable que bastaría con una cobertura menor.
    3. En la mañana, placa de 1 x 106 células de Xi sobre placas de cultivo de tejidos de 10 cm.
    4. En la tarde, infectar a las placas mediante la sustitución de los medios de comunicación con DMEM fresco-10 que contiene 5-10 μg/mL de polibreno y el sobrenadante viral. Use la cantidad de sobrenadante viral determinada en el paso 2.1.2.
    5. Después de 18-24 h, Aspire los medios de comunicación y añadir 10 mL de DMEM-10 fresco a cada plato. Cultura para otra 48 h.
    6. En la mañana, movilizar las células con 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA por placa y saciar con 9 mL de DMEM-10 por placa. Pase la suspensión a través de un filtro de malla de 100 μm. Las suspensiones filtradas de la piscina juntos y dos conjuntos de placas de 10 cm a 1 x 106 células/placa de la semilla.
    7. En la tarde, vuelva a colocar los medios de comunicación en un juego de placas con DMEM-10 que contienen 15 μg/mL de higromicina B (día 0). En el otro juego, reemplace los medios DMEM fresco-10 solamente.
    8. Después de 48 horas, movilizar las células untreated juego de placas con 1 ml de tripsina 0,05%-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 9 mL de DMEM-10. Transferir las células a tubos cónicos de 15 ml y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y proceder de inmediato con la extracción de ADN de los pellets. Por otra parte, la piscina las células en los tubos más grandes antes del paso de centrifugación.
    9. Extracto de ADN utilizando una mezcla de fenol y chroroform y precipitar el ADN con sodio acetato y frío el etanol como se describió anteriormente10. Las muestras de ADN individuales de preselección de la piscina y almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.
    10. Continuar el cultivo selección de la B de Higromicina para 4 días más. Reponer los medios de selección con fresco DMEM-10 con higromicina B después de 2 días.
    11. En el día 7, sustituir los medios de selección con DMEM fresco-10 solamente. Permite 2 a 4 días para la recuperación y luego cosechar las células como se describe en el paso 2.1.8. Proceder a la extracción de ADN como se describe en el paso 2.1.9.
  2. Identificación de horquillas enriquecidos en las muestras post-selección
    1. Contexto del uso 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') y 3' reverse loop primers (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') para amplificar la mitad-reguladores de pre- y post-selección de muestras de ADN. Uso todos extrajeron ADN en reacciones de PCR independientes con 100-200 ng de ADN por reacción.
      Nota: Estos contexto cartilla de 5' y 3' bucle inverso cartillas corresponden a la secuencia de miR-30 contexto aguas arriba de la inserción de shRNA y la secuencia en el bucle de shRNA, respectivamente. Bibliotecas diferentes requieren diferentes oligos. Ajustar medidas de purificación para aislar diferentes tamaños según sea necesario.
    2. Uso selección del tamaño granos para eliminar cebadores, DNA genomic y recuperar productos de la PCR entre 100 y 200 BP siguen el protocolo incluido en las cuentas.
    3. Preparar una biblioteca de la secuencia a la secuencia de las horquillas de media. Generar por lo menos 50 millones Lee por pantalla. Seguir el protocolo apropiado para el kit de secuenciación y equipo.
      Nota: Lee 50 millones por pantalla provee 1000-fold representación de cada shRNAs en la biblioteca y aproximadamente 10 veces la cobertura de cada infección independiente (realizado en 100-fold representación de cada shRNAs), que asegura la representación adecuada de cada evento de infección.
    4. Enumerar cada shRNA usando un script en Perl que cuenta secuencias con los fósforos perfectos. Eligió shRNAs que lee por lo menos 10 en la piscina de preselección para su posterior análisis. Calcular los enriquecimientos como cocientes de post a preselección cuenta y determinar la tarifa falsa del descubrimiento (FDR) sobre la base de 1000 permutaciones. Eligieron los genes blanco de shRNAs con < 5% FDR como "hits" para más pruebas.

3. validación de las horquillas identificadas ("hits")

  1. Lentivirus de empaquetado que contiene shRNAs identificado en la pantalla
    1. Semilla 8 x 106 FT 293 células por placa en placas de 10 cm.
    2. Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 9 mL de DMEM-10 sin antibióticos por placa; hacer esta 30 minutos antes de la transfección.
    3. Durante el intervalo de 30 minutos, preparar dos mezclas de transfección:
      1. Preparar mezcla 1 (por placa/shRNA; aumentar según el número total de shRNAs): 10 μl de 2 mg/mL polietilenimina (PEI) en 0,5 mL de medio esencial mínimo óptimo. Mezclar mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.
      2. Preparar mezcla 2 (por shRNA): 4 μg del vector shRNA a empaquetar, 1,5 μg del vector VSV-G sobres (pMD2.G) y 2.5 μg del vector packaging (psPAX2), mezclan en 0,5 mL de medio esencial mínimo óptimo.
        Nota: Incluye un vector lentivirales vacío en el envase para uso en infecciones más adelante como control negativo.
    4. Añadir 0,5 mL de mezcla 1 a cada alícuota de la mezcla 2 y suavemente mezclar mediante pipeteo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos.
    5. Aplique la mezcla en cada placa de paso 3.1.2 de forma gota a gota; Agitar la placa suavemente para mezclar.
    6. Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 5 mL de DMEM fresco-10.
    7. 48 horas después de la inicial de la transfección, recoger el sobrenadante y pase a través de un filtro de 0,22 μm. Humedezca previamente el filtro con DMEM-10 para maximizar la recuperación.
    8. Alícuota del sobrenadante filtrado en cantidades ideales para infectar una placa de 6 pozos bien.
    9. Congelar las alícuotas a-80 ° C para su uso posterior, o proceder inmediatamente con la transducción de señales.
  2. Transducción de señales y pruebas de horquillas individuales para luciferase reporter reactivación y reactivación del gen MeCP2 de tipo salvaje en el Xi.
    1. En la mañana, placa de 1 x 105 Xi células/pozo en placas bien 6.
    2. En la tarde, infectar a las placas mediante la sustitución de los medios de comunicación con 2 mL de DMEM fresco-10 que contiene 5-10 μg/mL de polibreno y el lentivirales sobrenadante. Infectar un control con sobrenadante viral producido a partir de un vector lentivirales vacíelo.
    3. Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 2 mL de DMEM-10 puromicina conteniendo de 1 mg/mL. Cultura durante cuatro días.
    4. Sustituir los medios de comunicación con 2 mL de DMEM fresco-10 y permiten 48-72 h para la recuperación.
    5. Movilizar las células con 150 μL de 0.05% tripsina-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 1,5 mL de DMEM-10. Transferir las células a tubos cónicos de 15 ml y centrifugar a 500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.
    6. Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 100 μl de tampón de lisis en el kit de ensayo de luciferasa. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transferencia de los lisados blanco placa de 96 pocillos y de análisis para la actividad de luciferasa usando el protocolo incluido en el kit. Utilizar células Xa como Xi células infectadas con un vector lentivirales vacío como control negativo y control positivo.
      Nota: Evite exponer las placas blanco para luz fluorescente antes del ensayo; Esto reducirá el fondo y aumentar la sensibilidad del ensayo. El protocolo que proporciona en el kit de ensayo fue encontrado para ser más eficaz si se realiza en la oscuridad siempre que sea posible.
    7. Para determinar si la horquilla tenía un efecto en el nivel de expresión de MeCP2 en el cromosoma x activo, aislar ARN de células de tranduced Xi y medir nivel MeCP2 mRNA mediante PCR cuantitativa con cebadores diseñados para amplificar sólo tipo MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
    8. Opcional: Aumentar la sensibilidad del ensayo agregando 5-AZA a una concentración final de 0.2 μm, después de que las células se han recuperado de la selección de puromicina. Cultura las células 72 h sin reemplazar los medios de comunicación y luego del análisis para la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de luciferasa comercial.
    9. Medida de reactivación de la MeCP2 silenciado de tipo salvaje. Infectar células Xa, que albergan el tipo salvaje MeCP2 en la Xi, con el vector que contiene reguladores individuales, siguiendo los pasos de protocolo 3.2.1. -3.2.4. Aislar ARN de las células y medir nivel MeCP2 mRNA mediante PCR cuantitativa con cebadores diseñados para amplificar sólo tipo MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').

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Representative Results

Fibroblastos de ratón del tendón se cosecharon de descrita X /XMeCP2-LUC-HRratón hembra deMeCP2 , inmortalizado por transducción retroviral de oncogenes E6 y E7 de HPV-16 virus7, clonado usando dilución limitante y probados para actividad de luciferasa y expresión del salvaje-tipo proteína MeCP2 (figura 1A y 1B). Actividad de luciferasa fue robusto si el reportero estaba en Xa e imperceptibles si en Xi; la expresión nativa de MeCP2 exhibieron un patrón recíproco. Seleccionamos un clon sin actividad de luciferasa (Xi-8) y una copia con robusta actividad (Xa-3) para más experimentos. Cuando las células Xi-8 fueron tratadas con 5-AZA, una inducción dosis dependiente en actividad de luciferasa se observó (figura 1).

Sensibilidad de las células Xi-8 y 3 Xa a higromicina B fue probado realizando selecciones de 3 y 6 días. Como se esperaba desde el patrón de expresión del reportero de luciferasa, Xi-8 células eran más sensibles a higromicina B que Xa-3 células, aunque este último exhibió sensibilidad a dosis más altas (figura 2A). Después de una mezcla de 1: 100 de Xa-3 Xi-8 células expuestas a diferentes concentraciones de higromicina B, un aumento de tiempo-dependiente en actividad de luciferasa observó, indicando la exitosa competencia de Xa-3 células en Xi-8 células (figura 2B). Dosis y la duración de higromicina B selección fueron elegidos para otros experimentos basados en la inhibición preferencial de la Xi-8 sobre células Xa-3.

Se realizaron cuatro pantallas independientes para identificar reguladores de MeCP2 silenciar utilizando la línea celular de Xi-8 y un miR de Open Biosystems-30-basado shRNA biblioteca 64.159 horquillas diferentes clonado en un retroviral MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP Vector. En cada pantalla, veinte placas de 10 cm fueron infectadas con shRNAs combinado, a aproximadamente 100-fold cobertura de la biblioteca. B Hygromicin se llevó a cabo durante 6 días, hasta que se observaron pequeños parches acelulares; las células continúan morir por 24 a 48 horas adicionales. Cuando se recuperó, las células se cosecharon para extracción de ADN usando una técnica de fenol-cloroformo. El rendimiento de ADN total por pantalla fue alrededor de 20 μg/placa, que se agruparon y dividido entre 100 reacciones de PCR utilizando primers diseñados para amplificar la mitad-horquillas para el pelo. Los productos PCR fueron purificados de grano y sometidos a secuenciación de alto rendimiento.

Pre- y post-selección de las muestras se compararon para determinar el enriquecimiento de la horquilla, como esperábamos que cualquier horquilla presente en niveles elevados en la muestra de la selección contra genes que reactivaron Xi y así confiere resistencia a Higromicina. Se consideraron sólo horquillas enriquecidos en al menos 2 de las cuatro pantallas para validación. Las horquillas más enriquecidas en todas las repeticiones de nuestra pantalla fueron cuatro horquillas para el pelo a XIST, consistente con su papel crucial en la XCI11.

La parte de la pantalla de validación se llevó a cabo analizando individualmente las horquillas que registrado como golpes para la activación del reportero de luciferasa en las células de Xi-8. Aunque la pantalla se llevó a cabo utilizando una biblioteca retroviral MSCV-basado, la validación se llevó a cabo usando un vector lentivirales (clones de pGIPZ individuales con shRNAs) para evitar la posible detección de artefactos inducidos por retrovirus.

Cada uno de los genes del candidato fue atacado por al menos dos secuencias diferentes de la horquilla y la caída de la gene de la blanco se verificó mediante PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR). Por hasta 1 x 106 células en formato 6-pozo de ensayo y la disminución de la luminiscencia del fondo (figura 2), hemos sido capaces de detectar eventos de reactivación de muy baja frecuencia, que estima que en el rango de 1: 20,000.

Posterior análisis mediante horquillas individuales condujeron a la identificación de 30 genes cuya caída dio lugar a la reactivación de la ponente en el Xi. La magnitud media de luminiscencia para estos 30 genes fue 2.8-fold por encima de la línea de base, que se amplificó aún más a 7.1-fold después del tratamiento 5-AZA. Las horquillas mismo fueron analizadas de nuevo, junto con 5-AZA, con las células de Xa-3 para confirmar la expresión de tipo MeCP2 de la Xi. Esto se logró mediante la realización de RT-qPCR utilizando cebadores diseñados para amplificar sólo la transcripción del tipo salvaje de MeCP2.

Figure 1
Figura 1. Aislamiento de clones con el gen reportero de MeCP2-Luc-HR en el Xi.
A) ensayo de luciferasa de luciérnaga representante en fibroblastos inmortalizados tendones clones (1-9). Fibroblastos primarios de no transgénico (NT) y mujer transgénica heterocigota (F) se usaron como controles positivos y negativos, respectivamente. B) representante de Western blot mostrando la expresión de la proteína MeCP2 de las células en (A). Tenga en cuenta que actividad de luciferasa (figura 1A) y la expresión MeCP2 muestran patrón de expresión recíproca. C) la inducción de la actividad de luciferasa de luciérnaga en Xi-8 células con 5-AZA. XA-3 células, con el gen reportero en Xa, sirva como control positivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. Caracterización de la resistencia Higromicina en Xi-8 y Xa-3 células.
A) relativa de crecimiento de las células Xi-8 y Xa-3 tratados con regímenes diferentes higromicina B (3D = 3 días; 6 = 6 días), en comparación con las células no tratadas. B) enriquecimiento de actividad de luciferasa después de exponer un total de 10.000 Xa-3 y Xi-8 células (mezclado en proporción 1: 100) hygromicin B (25 μg/mL) número de días indicado. Actividad posterior a la exposición luciferasa fue dividido por el nivel de antes de la exposición para el cálculo de enriquecimiento. C) firefly luciferase actividad en Xi-8 células, analizada en formato de 96 y 6 bien, con o sin 5-AZA (10 μm). Fibroblastos (NT) no-transgénicos se utilizaron como control negativo. 5-AZA aumentó la actividad de luciferasa 7.2 y 86 veces sobre la línea de base en formato de 96 y 6 pozos, respectivamente. (N = 3, * p < 0.001, ** p < 0.0001 por t-test comparando 5-AZA estudiante tratados y no tratados las células Xi-8.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En nuestro estudio reciente6, hemos generado una línea celular murina con luciferasa y genes de resistencia a Higromicina fusionado a MeCP2 en el Xi y transduced con una biblioteca de > 60.000 shRNAs dirigidos a > 25.000 genes. Se encontraron 30 genes cuya ventaja en la supervivencia conferida precipitación en higromicina B selección, sugiriendo su papel en el control de MeCP2 y silenciamiento del cromosoma x. Estos resultados fueron validados por transducción de la línea celular reportado con horquillas individuales y evaluar reactivación del reportero de luciferasa silencioso.

El hallazgo que las cuatro horquillas superior en todas las repeticiones de nuestra pantalla blanco XIST proporciona una validación interna fuerte para nuestro método, dado el papel fundamental de XIST en XCI11. Aparte de la superfamilia TGFβ, cuya función reguladora en la XCI no se había descrito previamente, los otros genes identificados todos pertenecieron a familias funcionales con lazos de regulación epigenética, sirviendo así como una validación adicional para nuestro método12 , 13 , 14. Además, también detectamos 4 de 13 genes previamente identificados en una pantalla diferente, usando un CMV promotor basada en GFP insertado al azar en el Xi15.

Establecer la dosis adecuada y la duración de higromicina B selección fue crucial en la optimización de las condiciones de proyección. La sensibilidad de nuestra línea celular fue altamente dependiente de la densidad de siembra y fue afectada por la infección retroviral. Dosis mayor o longitud de selección también inhibió el crecimiento de las células con el reportero de Xa, mientras que selección más leve baja la sensibilidad para el enriquecimiento de la horquilla. Múltiples regímenes de dosificación de higromicina B y célula de reportero, densidades de siembra fueron probados por lo tanto antes de la proyección final. Por otra parte, aunque el vector retroviral MSCV en nuestra biblioteca de shRNAs proporcionó una oportunidad para utilizar selección de puromicina y enriquecer de células transduced con éxito, puromicina no fue utilizada en nuestros experimentos, como el uso secuencial de puromicina y hygromyin B resultó en toxicidad excesiva, incluso después de escalada la dosis apropiada de ambos antibióticos.

Todas las horquillas identificadas en nuestro estudio también reactivan el reportero de luciferasa silenciosa, aunque en un grado más modesto. Detección de estos eventos infrecuentes fue habilitada por la alta sensibilidad de pantalla, que estima, basado en pruebas adiciones de células Xi y Xa, un evento de reactivación en 2 x 104 células. Estos bajos niveles de reactivación, aumentado con la aplicación de la 5-AZA, testimonian dificultades previamente descritas en interrumpir estricto control transcripcional del XCI12,13,16,17, y implica que la alteración de múltiples mecanismos sería necesarios para lograr reactivación significativa.

De la nota, todos 30 horquillas identificados en nuestra pantalla también reactivan un gen reportero impulsado por CMV en un locus del cromosoma x diferente, indicando su impacto más amplio sobre la represión de la Xi. Se necesitan estudios adicionales para comprobar si existen "Reactivadores de MeCP2 específicos", como su manipulación farmacológica o genética puede resultar extraordinariamente útil en el tratamiento del síndrome de Rett.

Nuestro sistema ofrece varias ventajas sobre los reporteros anteriormente descritos utilizados para cromosoma x reactivación pantallas12,17. En vez de ser impulsado por un promotor del CMV, nuestro cassette de reportero se cae en el c-término de MeCP2 y así es conducido por el promotor nativo X-ligado. Este diseño puede ayudar a identificar los reguladores específicas de locus MeCP2 más relevantes en el contexto de la investigación del síndrome de Rett, con una salvedad que los resultados en fibroblastos inmortalizados deben recapitulados en las neuronas, el sitio deseado de MeCP2 reactivación. El uso de un gen de resistencia a Higromicina permite selección positiva de los eventos de reactivación y robusto aumenta la sensibilidad de la pantalla. Por otra parte, el cassette que contiene resistencia a Higromicina y genes de luciferasa de luciérnaga permite tanto a gran escala de detección mediante selección positiva con higromicina B y prueba/proyección individuales horquillas para el pelo con el reportero de luciferasa.

En Resumen, se presenta un método de cribado genético robusta y sensible para la identificación de reguladores de MeCP2 y silenciamiento en células de mamífero X-cromosoma. Esta metodología podría ser adaptada para la detección de RNAs de interferencias pequeños (siRNAs), CRISPR, o pequeñas moléculas. Estos ensayos podrían resultar útiles en el establecimiento de enfoques terapéuticos que se basan en reactivar el alelo funcional de un gen silencioso, como en el caso de síndrome de Rett.

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Disclosures

Dr. Leko contribuyó a este artículo como un empleado del Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Las opiniones expresadas son sus propia y no necesariamente representan las opiniones de los institutos nacionales de salud o el gobierno de Estados Unidos

Acknowledgments

Agradecemos a Ross Dickins de la Universidad de Melbourne para proporcionar amablemente la biblioteca shRNA utilizada en la pantalla. Este trabajo fue financiado por Rett síndrome Research Trust (A.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
293FT Cell Line Invitrogen R700-07
5-Azacytidine Sigma A2385-100MG
Agencourt AMPure XP Beckman-Coulter A63881
Anti-MECP2 antibody Millipore 07-013
Collagenase Sigma C2674-1G
Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates Fisher Scientific 07-200-336
Dulbecco's Modified Eagle Medium Gibco 11965-092
Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) Open Biosystems EAV4679
Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library Open Biosystems RMM3796
Fetal Bovine Serum Fisherbrand 03-600-511
HiSeq 2500 Illumina SY–401–2501 Or equivalent
Hygromycin B Calbiochem 400051-1MU
Lipofectamine 2000 Invitrogen 11668-019
Bright-Glo Luciferase Assay System Promega E2610 Homogenous Assay for Screening Colonies
Luciferase Assay System Promega E4530 Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins
Luminometer TopCount NXT Perkin Elmer N/A Or similar luminometer
MiSeq Reagent Kit v2 Illumina MS-102-2001 Use kit compatible with your equipment
Opti-MEM Gibco 31985-070
Penicillin-Streptomycin Gibco 15140-122
pMD2.G Addgene #12259 VSV-G envelope vector
Polybrene Sigma TR-1003-G
Polyethylenimine Polysciences 23966-1
psPAX2 Addgene #12260 Packaging vector
Puromycin Gibco A11138-02
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054

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References

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Número 133 la inactivación del X-cromosoma genética epigenética MeCP2 Rett síndrome XIST shRNA proyección
ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo
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Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. … More

Leko, V., Sripathy, S., Adrianse, R. L., Loe, T., Park, A., Lao, U., Foss, E. J., Bartolomei, M. S., Bedalov, A. Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome. J. Vis. Exp. (133), e56398, doi:10.3791/56398 (2018).

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