Summary
Biz bir küçük saç tokası RNA (shRNA) ve düzenleyiciler, x kromozomu inactivation ateş böceği luciferase ile bir fare hücre satırı tanımlamak için sonraki nesil sıralama tabanlı iletişim kuralı raporu ve hygromycin direnç genleri metil için erimiş CpG bağlayıcı protein 2) MeCP2) etkin olmayan X kromozomu üzerindeki gen.
Abstract
Heterochromatin eklenen reporter genler kullanarak ileri genetik ekranlar kapsamlı model organizmalar epigenetik kontrol mekanizmaları araştırmak için kullanılmaktadır. Kısa saç tokası RNA'ların (shRNAs) ve kümelenmiş düzenli olarak interspaced kısa palindromik yineler (CRISPR) gibi teknolojiler böyle ekranlar diploit memeli hücrelerinde etkinleştirdiniz. Burada bir fare hücre satırı ile ateş böceği luciferase kullanarak x kromozomu inactivation (XCI), düzenleyiciler için bir büyük ölçekli shRNA ekran açıklamak ve hygromycin direnç genleri içinde metil CpG bağlayıcı protein C-terminus adlı 2 (MeCP2) gen çaldı etkin olmayan x kromozomu üzerinde (XI). Muhabiri hücre kültürünü inşa reaktivasyonu sağkalım avantajı hygromycin B seçimi, büyük shRNA kitaplık ekranı ve onların sonrası seçim zenginleştirme kullanarak ölçerek muhabir yeniden saç tokaları tanımlamak olanaklı kılar altında doğan yeni nesil sıralama. Zenginleştirilmiş saç tokaları sonra tek tek XI luciferase kahramanlarına etkinleştirmek için yeteneklerini sınayarak geçerliliği.
Introduction
Bir kadın, Rett sendromu, kalıtsal akıl bozukluğu en yaygın formları be neden yanında MeCP2, normal nöronal fonksiyon1için önemli bir protein kodlar bir x kromozomu gen heterozigoz mutasyonlar. Bu hastalık1, , bir fare modeli nörolojik açıkları tersine çevirmek için restorasyon MeCP2 ifadesinin gösterildiği bu hastalığın tedavisi için potansiyel bir yaklaşım vahşi tipi MeCP2 alleli Xi üzerinde reaktivasyonu olacaktır 2 , 4. ancak, bir iki X kromozomları dişi hücrelerdeki epigenetik susturmak sıkı bir organizma3,4ömrü muhafaza ve sağlam bir Xi gen reaktivasyonu büyük olasılıkla büyük bir gerektirir birden çok epigenetik yasal yolları bozulma.
Biz faktörler MeCP2 damping bakım için gerekli belirlemek için önce MeCP2- luciferase - hygromycin direnç gen füzyon (MeCP2-LUC-HR) birinde iki X kromozomu taşıyan bir transgenik fare modeli geliştirildi (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Her ne kadar füzyon yapı ifade MeCP2 kararsız ve işlevi, phenotypically taklit eden MeCP2 silme (XMeCP2-LUC-HR/y) hemizygous erkeklerde, muhabir gen ifade kaybına neden olduğu ortaya çıktı kolayca algılanabilir bir desen endojen MeCP25ifadesi ile tutarlı oldu. Daha sonra ölümsüzleştirdi fibroblast klonlar etkin olmayan veya active x kromozomu üzerinde yapı ile oluşturulan ve o eski vahşi türü MeCP2 ve değil muhabiri yapı ifade doğruladı; tersini ikincisi için doğruydu. Gen susturmak, iptal etmek için bilinen Ajan demethylating bir DNA için 5-azacytidine (5-AZA), maruz kaldığında Xi ("muhabiri hücre") muhabiri hücre bizim yapı yeniden gösteren bir bioluminescence tahlil etkinliği kazandı ve bu nedenle genetik tarama için kullanılan.
Biz sonraki yüksek üretilen iş genetik bir ekran MeCP2 damping düzenleyiciler için geliştirilmiştir. Muhabiri hücre kültürünü ilk içeren bir retroviral kütüphane ile enfekte > 60.000 farklı shRNAs hedefleme > fare genom5,6, boyunca 25.000 genler ve sonra hygromycin B seçime tabi. Saç tokası frekans içinde ön karşılaştırıldı ve sonraki nesil sıralama kullanarak sonrası seçim örnekleri, muhabir olarak yeniden etkinleştirme büyüme avantajı hygromycin B seçimi altında doğan ve sorumlu saç tokaları zenginleştirme sonuçlandı. Bu yaklaşımı kullanarak, biz 30 genler susturmak MeCP2 içinde karıştığı tespit ve sonra bulgular muhabiri hücre bireysel saç tokaları ile transducing ve luciferase faaliyetlerini ölçme doğruladı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvanları içeren tüm adımları Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmış protokolleri kullanılarak yapılmıştır. Burada kullanılan hiçbir reaktifler 5-azacytidine (5-AZA) dışında önemli insan sağlığı risk teşkil olduğu bilinmektedir.
1. bir muhabiri hücre satırıyla MeCP2- LUC-HR transgene Xi üzerinde oluşturma
-
Gelen kadınMeCP2-LUC-HR /X X fare tendon fibroblastlar hazırlanıyorMeCP2 fare
- 10-12 gün ötenazi-MeCP2-LUC-HR/X X eski erkekMeCP2 fare.
- Düz diseksiyon makası kullanarak, proksimal kuyruk kısmı deri yoluyla çevresel bir kesi yapmak.
- Karkas kuyruk yakın tutarak, Cilt uzak kuyruk fibrocartilaginous bölümünü ortaya çıkarmak için fareyi çekin. Kaldırmak ve terminal 10 mm maruz doku 1 mm uzun parçaları cerrahi neşter kullanarak kesti.
- Parçalanmış doku 15 ml konik tüp içeren 5 mL, Dulbecco'nın modifiye kartal orta (1 U/mL penisilin, 1 µg/mL streptomisin ve 1.5 mg/mL collagenase, ile desteklenmiş DMEM) transfer 0,45 µm ve sonra 0.2 µm kafes filtreler önceden filtre. Sürekli rotasyon ile 37 ° C'de 3-4 h için kuluçkaya.
- Santrifüj örnek 500 x g de oda sıcaklığında 10 dakika süreyle 10 ml % 10 fetal sığır serum, 1 U/mL penisilin ve 1 µg/mL streptomisin (DMEM-10) ve bir 6-iyi doku kültürü plaka üzerinde plaka ile takıma DMEM Pelet Resuspend. Hücreleri bir kez geçiş ve bir sonraki adıma devam etmeden önce bir 10 cm tabak için genişletin.
- Hücreleri HPV-16 viral oncogenes (E6/E7),7daha önce açıklandığı gibi taşıyan bir ifade vektör ile bir iletim gerçekleştirerek ölümsüzleştirmek.
-
Tek hücre klonlar seçerek ve MeCP2 muhabir ifade karakterize
- Bir 10 cm tabak hücrelerden hasat. İlk olarak, medya Aspire edin, % 0.05 tripsin-EDTA 1 mL ekleyin ve 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 9 mL ile gidermek ve 15 mL konik tüp resuspended hücreleri toplamak.
- Hücreleri seyreltik DMEM-10 son konsantrasyonu 1 cep/100 µL. Transfer ile 96-şey plakaları için süspansiyon pipetting 100 µL tarafından her kuyuya.
- Kuyuları birleşmesi, hangi-ebilmek almak ilâ 2-3 hafta kadar 37 ° C'de kuluçkaya. Ortamı her 3-5 günde taze DMEM-10 ile değiştirin. Konfluent ne zaman, % 0.05 tripsin-EDTA iyi başına 20 µL hücrelerle seferber ve onları iki yinelenen setleri 96-şey bölünmüş.
- Luciferase etkinlik için tahlil için bir tabak kümesi kullanır. Medya kaldırma gerektirmeyen bir homojen ateş böceği luciferase tahlil Paketi'ni kullanabilirsiniz. Kit ile birlikte protokol izleyin.
- Adım 1.2.4 sonuçlarından klonlar hiçbir tespit luciferase etkinlik ile plakaların kalan kümesinden seçmek için kullanın. Bu klonlar 24-şey ve sonra 6-iyi plakaları için genişletin.
- Aynı yüksek luciferase aktivite ile bir klon için gerçekleştirmek; Bu olumlu bir denetim olarak doğrulama amacıyla kullanılacaktır.
- Bir aliquot her şey bir Western blot 6-şey plaka hasat. 200 µL % 0.05 tripsin-EDTA hücrelerle seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 ile 2 mL gidermek ve hücreleri yarısı 1,5 ml santrifüj tüpü için transfer. Bir kez PBS içeren hücreler için Western blot lysing önce yıkayın. Alternatif olarak, hücrelerin yarısı başka bir 6-şey plakasına aktarın. Hücreleri plaka altına iliştirdiğinizde, PBS ile durulayın ve Western blot için koşullar.
- Gerçekleştirmek bir Western blot luciferase pozitif hücreler vahşi tipi MeCP2 active X kromozomu; dan ifade yok iken luciferase negatif hücreleri, hızlı olduğunu onaylamak için anti-MeCP2 antikor ile yukarıda açıklanan protokol8izleyin. Beyin dokusu herhangi bir vahşi türü fare lysate olumlu bir denetimi kullanın.
- 2 x 105 hücreleri/iyi bir 6-şey tabak içinde birkaç negatif klonlar plaka. Bir kez 10 µM 5-AZA ile tedavi, medya değiştirmeden 72 h için kuluçkaya ve 1.2.3. adımda açıklandığı gibi luciferase etkinlik için tahlil.
- 5-AZA ile luciferase etkinliğini kazandı ve birden çok 10 cm tabak için genişleyen başlayan negatif bir klon (Xi klon) seçin. Kalan negatif klonlar yedek olarak sıvı azot dondur. Pozitif klon (Xa klon) doku kültürü tutulmaz veya daha fazla kullanılmasını kadar donmuş.
2. eleme kitaplık için hygromycin B seçimini kullanarak yeniden etkinleştirme
-
Test klon bulaşmasını, seçim uygulama ve DNA sıralama için hasat
- Retroviral yapıları tokalar shRNA kitaplıktan ifade, viral konsantreleri elde etmek veya konsantre viral süpernatant ile istenen kütüphane dahil iletişim kuralını kullanarak üretmek.
- Belgili tanımlık perde ile devam etmeden önce (varsa GFP işaretleyici kullanarak) Kütüphane titre. Amaç enfeksiyon arasında 0,3 ve 0,5 çeşitliliği için.
Not: yanlış pozitif oranları en aza indirmek için en az dört bağımsız ekranı gerçekleştirin. Saç tokaları yeterli gösterimi korumak ve rasgele terkinin9önlemek için kitaplık 100-fold kapsama almak için ekran başına 20 tabak kullanın. Ancak, pozitif seçim ekranı ve bir büyük kütüphane boyutu göz önüne alındığında, bu bir alt kapsam yeterli olacaktır muhtemeldir. - Sabah, 1 x 106 XI hücreleri 10 cm doku kültürü plakalar üzerine plaka.
- Öğleden sonra taze DMEM-viral süpernatant ve 5-10 µg/mL polybrene içeren 10 ile medya değiştirerek plakaları bulaştırmak. 2.1.2. adımda belirlenen viral süpernatant miktarda kullanın.
- 18-24 h sonra medya Aspire edin ve 10 mL taze DMEM-10 her plaka için ekleyin. Kültür başka bir 48 saat için.
- Sabah, 1 mL % 0.05 tripsin-EDTA plaka başına kullanarak hücreleri seferber ve plaka başına 9 mL DMEM-10 ile gidermek. Süspansiyon 100 µm gözenekli filtre çalıştırmak. Filtre uygulanmış süspansiyonlar birlikte havuz ve 1 x 106 hücreler/plaka iki setleri 10 cm temel olarak belirler.
- Öğleden sonra DMEM-10 ile 15 µg/mL hygromycin B (0 gün) içeren bir küme plakaların ortamı değiştirin. Diğer küme taze DMEM-10 ile sadece ortamı değiştirin.
- 48 saat sonra 1 ml % 0.05 tripsin-EDTA kullanarak plakaları tedavi edilmezse kümesi hücrelerden seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 9 mL ile gidermek. Hücreleri 15 ml konik boru ve santrifüj 500 x g de oda sıcaklığında 5 dakika aktarın. Supernatants Aspire edin ve hemen DNA çökeltilerini ayıklanması ile devam edin. Alternatif olarak, hücre Santrifüjü adım önce büyük tüpler içine havuz.
- Fenol ve chroroform karışımı kullanarak DNA ayıklamak ve yukarıda açıklanan10olarak sodyum asetat ve soğuk etanol ile DNA çökelti. Bireysel ön seçim DNA örnekleri havuz ve -20 ° C'de daha fazla kullanılmasını kadar saklayın.
- Hygromycin B seçimi 4 gün daha ayarla kültür devam edin. Taze DMEM-10 içeren hygromycin B seçimi ortamla 2 gün sonra doldurmak.
- Gün 7, taze DMEM-10 ile sadece seçim ortamı değiştirin. 2-4 gün kurtarma için izin ve sonra hücreleri 2.1.8 adımda anlatıldığı gibi hasat. DNA ekstraksiyon ile 2.1.9. adımda anlatıldığı gibi devam edin.
-
Sonrası seçim örneklerinde zenginleştirilmiş saç tokaları tanımlama
- Kullanım 5' bağlam (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') ve 3' döngü astar ters (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') yarı-tokalar öncesi ve sonrası seçim DNA örneklerinden yükseltmek için. Tüm ayıklanan DNA ayrı PCR reaksiyonları 100-200 ng ile DNA'ın tepki başına kullanın.
Not: Bu 5' bağlam astar ve 3' geriye doğru döngü astar miR-30 bağlam dizisi shRNA ucun upstream ve shRNA döngü, sıra sırasıyla karşılık gelir. Farklı Kitaplıklar farklı oligos gerektirir. Arıtma adımları farklı ürün boyutları gerektiği gibi izole etmek için ayarlayın. - Astar ve genomik DNA kaldırmak ve PCR ürünleri arasında 100 ve 200 bp. kurtarmak için kullanım Boyut seçim boncuk boncuk ile dahil Protokolü izleyin.
- Yarı-saç tokaları sıralamak için sıralama kitaplığı hazırlayın. Ekran başına en az 50 milyon okuma oluşturmak. Sıralama kiti ve tesisler için uygun iletişim kuralı izleyin.
Not: ekran başına 50 milyon okuma sağlar 1000-fold her shRNA kütüphanede gösterimi ve yeterli gösterimini sağlayan yaklaşık 10 kat kapsama (her shRNA 100-fold gösterimi yürütülen) her bağımsız enfeksiyon Her enfeksiyon olay. - Mükemmel maçlar sıralarıyla sayar bir Perl komut dosyası kullanarak her shRNA numaralandırır. Daha fazla çözümleme için disindan havuzunda en az 10 okuma vardı shRNAs açmadı. Oranları için ön sonrası sayar ve yanlış bulma oranı (FDR) 1000 permütasyon temelinde belirlemek gibi enrichments hesaplama. ShRNAs ile tarafından hedef genlerin açmadı < %5 olarak FDR "hits" daha fazla test için.
- Kullanım 5' bağlam (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') ve 3' döngü astar ters (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') yarı-tokalar öncesi ve sonrası seçim DNA örneklerinden yükseltmek için. Tüm ayıklanan DNA ayrı PCR reaksiyonları 100-200 ng ile DNA'ın tepki başına kullanın.
3. tanımlanan tokalar ("sayısı") doğrulanıyor
-
Belgili tanımlık perde içinde tanımlanan shRNAs içeren ambalaj lentiviruses
- 10 cm tabak tabak başına tohum 8 x 106 293 FT hücre.
- Ertesi gün, antibiyotik-Alerjik DMEM-10 plaka başına 9 mL ile ortamı değiştirin; transfection önce bu 30 dakika var.
- 30 dakika aralığında iki karışımları transfection için hazırlayın:
- Mix 1 hazırlamak (plaka/shRNA; shRNAs toplam sayısına göre ölçek): en iyi en az temel medya 0.5 ml 2 mg/mL polyethylenimine (PEI) 10 µL. Pipetting tarafından mix ve 5 min için oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Mix 2 (shRNA) hazırlamak: paketlenmiş shRNA vektör 4 µg, 1,5 µg VSV-G zarf vektör (pMD2.G) ve ambalaj vektörünün (psPAX2), 2,5 µg karışık en iyi en az temel medya 0.5 mL.
Not: Ambalaj sonraki enfeksiyonları bir negatif kontrol kullanmak için boş bir lentiviral vektör dahil.
- Mix 1 0.5 mL mix 2 her aliquot için ekleyin ve karışımı yavaşça pipetting tarafından. 20 dakika oda sıcaklığında karanlıkta kuluçkaya.
- Adım 3.1.2 dropwise bir moda her plaka üzerine karışımı uygulamak; karışımı yavaşça için plaka girdap.
- Ertesi gün, taze DMEM-10 5 mL ile ortamı değiştirin.
- 48 saat sonra ilk transfection, süpernatant toplamak ve 0,22 µm filtre üzerinden çalıştırmak. Kurtarma maksimize etmek için DMEM-10 filtresiyle önceden ıslak.
- Aliquot filtre uygulanmış süpernatant içine tutarları 6-şey plaka de hastalık için ideal.
- Aliquots daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de dondurmak veya hemen iletim ile devam.
-
İletim ve luciferase muhabir etkinleştirme ve vahşi-türü MeCP2 geni Xi üzerinde reaktivasyonu için bireysel saç tokaları test.
- Sabah, 1 x 105 XI hücreler/iyi 6 iyi plakalar üzerine plaka.
- Öğleden sonra tabakları ile 2 mL taze DMEM-10 lentiviral süpernatant ve 5-10 µg/mL polybrene içeren medyayı değiştirerek bulaştırmak. Bir denetimi bir boş lentiviral vector öğesinden üretilen de viral süpernatant bulaştırmak.
- Ertesi gün, DMEM-10 içeren 1 mg/mL puromisindir 2 mL ile ortamı değiştirin. Kültür dört gündür.
- Taze DMEM-10 ile 2 mL ortamı değiştirin ve 48-72 h kurtarma için izin verir.
- 150 µL % 0.05 tripsin-EDTA hücrelerle seferber. 2-5 dk 37 ° C'de için kuluçkaya DMEM-10 ile 1,5 mL gidermek. Hücreleri 15 ml konik boru ve santrifüj 500 x g de oda sıcaklığında 10 dakika aktarın.
- Medyayı çıkarın ve luciferase tahlil Seti'nde sağlanan 100 µL lizis arabellek hücrelerde resuspend. Oda sıcaklığında 5 dakikalığına kuluçkaya. Lysates bir beyaz 96-şey plaka ve kit ile birlikte iletişim kuralını kullanarak luciferase etkinlik için tahlil aktarın. XA hücreleri olumlu bir kontrol ve bir negatif kontrol olarak boş bir lentiviral vektörü ile enfekte XI hücreler kullanın.
Not: önce tahlil Floresan ışık beyaz tabaklar kullanılmasını önlemek; Bu arka plan azaltmak ve tahlil duyarlılığı artırmak. Tahlil Seti'nde sağlanan iletişim kuralı karanlıkta mümkün olduğunda gerçekleştirilen en etkili olabilir bulundu. - Saç tokası active x kromozomu üzerinde bir etkisi MeCP2 ifade düzeyinde olduğu olup olmadığını belirlemek için RNA tranduced XI hücrelerden yalıtmak ve kantitatif PCR ile sadece vahşi türü MeCP2 (F: yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak MeCP2 mRNA düzeyini ölçmek 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').
- İsteğe bağlı: Hücreleri puromisindir seçimden iyileşti sonra 0.2 µM son bir konsantrasyon için 5-AZA ekleyerek tahlil duyarlılığını artırmak. 72 h için hücreleri ezelî eski yerine koymak medya kültür ve ticari luciferase tahlil seti kullanarak luciferase etkinlik için tahlil.
- Sessiz vahşi tipi MeCP2 reaktivasyonu ölçün. Xi, vahşi türüne MeCP2 bireysel tokalar, Protokolü 3.2.1 adımları içeren vektör ile liman Xa hücreleri enfekte. -3.2.4. RNA hücrelerden yalıtmak ve kantitatif PCR ile sadece vahşi türü MeCP2 yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak MeCP2 mRNA düzeyini ölçmek (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fare tendon fibroblastlar hasat--dan bir daha önce açıklananMeCP2-LUC-HR/X XMeCP2 dişi fare, E6 ve E7 oncogenes HPV-16 virus7, üzerinden retroviral iletim tarafından ölümsüzleştirilmiş sınırlayıcı dilüsyonu kullanılarak kopyalanmış ve test luciferase etkinliği ve ifade vahşi tipi MeCP2 protein (şekil 1A ve 1B). Luciferase aktivite sağlam muhabir Xa üzerinde olsaydı ve Xi Eğer üzerinde tespit edilemez; Yerel MeCP2 ifade karşılıklı bir desen sergiledi. Biz bir klon hiçbir luciferase etkinlik (XI-8) ile ve bir klon sağlam aktivitesi (Xa-3) daha fazla deneyler için seçildi. XI-8 hücreleri 5-AZA ile tedavi edildi zaman, bir doz bağımlı indüksiyon luciferase faaliyet (şekil 1 c) gözlenmiştir.
Hygromycin B XI-8 ve Xa-3 hücrelere duyarlılığını 3 ve 6 gün boyu seçimleri yaparak test edildi. İkinci yüksek dozda (şekil 2A) duyarlılık sergilenmektedir olsa bile luciferase muhabir ifade modeli gelen beklendiği gibi XI-8 hücreleri daha Xa-3 hücre, hygromycin B daha hassas olduğunu. Xa-3 1: 100 karışımı XI-8 hücrelere maruz farklı konsantrasyonları sonra başarılı rekabet Xa-3 hücre XI-8 hücrenin üzerine (2B rakam) gösteren hygromycin B, luciferase aktivite bir saat-bağımlı artış gözlendi. Dozu ve süresi hygromycin B seçimi, daha fazla XI-8 tercihli inhibisyonu Xa-3 hücreleri üzerinde temel deneyler için seçilmiştir.
Dört bağımsız ekranı XI-8 hücre satır ve bir açık Biyosistem miR kullanarak MeCP2 damping düzenleyiciler tanımlamak için gerçekleştirilen-30-tabanlı shRNA Kütüphane 64,159 farklı saç tokaları içeren klonlanmış bir MSCV-shRNA-pgk-Puro-ires-GFP retroviral vektör. Her ekranda, yaklaşık 100-fold kapsama Kütüphane hedefleme havuza alınan shRNAs ile yirmi 10 cm tabak bulaşmış. Hygromicin B 6 gün için küçük acellular yamalar gözlendi kadar yapılmıştır; hücreleri ek 24-48 saat için ölmeye devam etti. Ne zaman yeniden elde etmek, hücreleri fenol kloroform tekniği kullanarak DNA ekstraksiyon için hasat edildi. Ekran başına toplam DNA verim yaklaşık 20 µg/plaka, havuza alınmış ve yarı-saç tokaları yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak 100 PCR reaksiyonları arasında bölünmüş oldu. PCR ürünlerinin sonra boncuk saflaştırılmış ve yüksek işlem hacmi sıralama için tabi.
Biz herhangi bir saç tokası mevcut sonrası seçimi örnek yüksek düzeyde XI yeniden ve böylece hygromycin direnç haiz genlerin hedef beklendiği gibi öncesi ve sonrası seçim örnekleri saç tokası zenginleştirme, belirlemek için karşılaştırıldı. Yalnızca en az dört perde 2'zenginleştirilmiş saç tokaları doğrulama için kabul edildi. Bizim ekranın tüm çoğaltır en zenginleştirilmiş tokalar XIST, XCI11çok önemli rolü ile tutarlı hedefleme dört tokalar vardı.
Ekranın Doğrulama bölümünde tek tek sayısı luciferase muhabir XI-8 hücrelerde geçirmek için kayıtlı saç tokaları sınayarak gerçekleştirilmiştir. Ekranın bir MSCV tabanlı retroviral Kütüphanesi kullanılarak yapılmıştır rağmen doğrulama retrovirüsü kaynaklı eserler mümkün yakalanmamak için lentiviral vektör (shRNA ile bireysel pGIPZ klonları) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.
Her aday genlerin en az iki farklı saç tokası dizileri tarafından hedef aldı ve hedef gen nakavt gerçek-zamanlı kantitatif PCR (RT-qPCR) tarafından doğrulandı. 1 x 106 hücre 6-iyi biçimde raporlaması ve arka plan ışıldama (şekil 2C) azalan, 1:20,000 aralığında olacağı tahmin çok düşük frekanslı yeniden etkinleştirme olayları algılamak başardık.
Daha fazla çözümleme bireysel saç tokaları kullanarak 30 genler Xi kahramanlarına reaktivasyonu kimin nakavt sonuçlandı tanımlaması yol açtı. Işıma 30 Bu genler için ortalama büyüklüğü 2.8-fold temel üzerinde hangi daha fazla 7.1-fold aşağıdaki 5-AZA tedaviye AMPLİFİKATÖRLÜ. Aynı saç tokaları, 5-AZA, vahşi türü MeCP2 Xi üzerinden yeniden ifade onaylamak için Xa-3 hücrelerle birlikte yeniden test. Bu RT-qPCR gerçekleştirerek başarıldı MeCP2 vahşi türü transkript yükseltmek için tasarlanmış primerler kullanılarak.
Şekil 1. Yalıtım klon MeCP2-Luc-HR muhabir gen üzerinde Xi ile.
A) temsilcisi ateş böceği luciferase tahlil ölümsüzleştirdi tendon fibroblastlar (1-9) klonlar. Transgenik olmayan (NT) ve transgenik heterozigoz erkek (F) birincil fibroblastlar sırasıyla negatif ve pozitif denetimleri kullanılmıştır. B) temsilcisi Western blot ifadeden (A) hücrelerinde protein MeCP2 gösterilen. Karşılıklı ifade deseninin sergi luciferase etkinliği (şekil 1A) ve MeCP2 ifade unutmayın. C) indüksiyon ateş böceği luciferase faaliyet 5-AZA hücrelerle XI-8. XA-3 hücrelerle muhabir gen Xa üzerinde olumlu bir denetim olarak hizmet vermektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. XI-8 ve Xa-3 hücreleri hygromycin direniş karakterizasyonu.
A) XI-8 ve Xa-3 hücre göreli büyüme farklı hygromycin B rejimleri ile tedavi (3D 3 gün; = 6D = 6 gün), işlenmemiş hücrelere kıyasla. B) luciferase aktivite zenginleştirme (1: 100 oran içinde karışık) 10.000 Xa-3 ve XI-8 hücrelere hygromicin B Toplam açığa sonra (25 µg/mL) için belirtilen gün sayısı. Sonrası pozlama luciferase aktivite zenginleştirme hesaplamak için ön pozlama seviyesi tarafından bölünmüştü. C) ateş böceği luciferase etkinliği 96 - ve 6-da biçiminde ve 5-AZA (10 µM) olmadan denetlesinler XI-8 hücrelerdeki. Sigara transgenik (NT) fibroblastlar içerebilen bir negatif kontrol kullanılmıştır. 5-AZA luciferase etkinlik 7.2 ve 86 kat 96 - ve 6-da biçimi, temelde üzerinde sırasıyla artmış. (N = 3, * p < 0,001, ** p < 0,0001 Öğrenci t-Testi karşılaştırma 5-AZA tarafından tedavi ve tedavi edilmezse XI-8 hücre.) Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bizim son6çalışma, biz bir fare hücre kültürünü luciferase ile oluşturulan ve hygromycin direnç genleri MeCP2 Xi üzerinde erimiş ve bir kütüphane ile transduced > shRNAs 60.000 hedefleme > 25.000 gen. 30 genler olan knock-down haiz sağkalım avantajı hygromycin B seçimi altında MeCP2 ve x kromozomu susturmak kontrol içindeki rollerine düşündüren bulduk. Bu sonuçlar bireysel saç tokaları ile bildirilen hücre kültürünü transducing ve sessiz luciferase muhabir reaktivasyonu değerlendirmek geçerliliği.
Bizim ekranın tüm çoğaltır içinde en iyi dört tokalar XIST hedef bulma XIST önemli rol XCI11verilen bizim yöntemi için güçlü bir iç doğrulaması sağlanan. XCI düzenleyici rolünü daha önce tarif edilmiştir değil, TGFβ süper bir yana, diğer tanımlanmış genlerin tüm epigenetik yönetmelik, böylece bizim yöntem12 için ek bir doğrulama olarak hizmet bağları ile fonksiyonel ailelerine ait , 13 , 14. Ayrıca, aynı zamanda 4 dışarı-in 13 genlerin farklı bir ekran, daha önce tanımlanmış rastgele XI15tarihinde eklenen GFP organizatörü odaklı bir CMV kullanarak tespit ettik.
Kurulması uygun dozu ve süresi hygromycin B seçimi tarama koşulları optimize çok önemli. Bizim hücre kültürünü duyarlılığını yoğunluğu tohum üzerinde son derece bağımlı ve retroviral enfeksiyon tarafından olumsuz etkilendi. Daha hafif seçimi duyarlı bir saç tokası zenginleştirme indirdi, ancak artan dozlarda veya seçim uzunluğunu da Xa üzerinde gazeteciyle hücrelerinin büyümesini inhibe. Böylece birden çok hygromycin B dozaj rejimleri ve yoğunlukları tohum muhabiri hücre önce son tarama test edildi. ShRNA Kütüphane MSCV retroviral vektörde bir fırsat puromisindir seçimini kullanın ve başarılı bir şekilde transduced hücreler için zenginleştirmek için sağlanan rağmen Ayrıca, puromisindir bizim deneyler, puromisindir ve hygromyin B sıralı kullanımı kullanılmadı aşırı toksisite bile uygun doz de-yükseltme her iki antibiyotik sonra sonuçlandı.
Bizim çalışmada tanımlanan tüm saç tokaları sessiz luciferase muhabir, daha mütevazı bir ölçüde de olsa da yeniden. Bu nadir olayların algılama biz tahmini, bizim ekran yüksek hassasiyet tarafından katkıları hücrelerinin, Xi ve Xa testlere dayanmaktadır 2 x 104 hücreleri bir reaktivasyonu olacak etkinleştirildi. 5-AZA, iş uygulaması ile artan reaktivasyonu, böyle düşük seviyelerde XCI12,13,16,17, sıkı transkripsiyon kontrolü engellemeden, yukarıda açıklanan sorunlara kanıtlamak ve birden çok düzenleyici mekanizmaları çalışmasının önemli yeniden etkinleştirme ulaşmak için gereken ima.
Belirtmek gerekirse bizim ekran içinde tanımlanan tüm 30 saç tokaları da Xi de-baskı daha geniş etkileri gösteren farklı bir x kromozomu odağı bulunan bir CMV tahrik muhabir gen yeniden. Daha fazla çalışmaları kendi farmakolojik veya genetik manipülasyon olağanüstü Rett sendromu tedavisinde yararlı olabilir gibi MeCP2 özel "reactivators" olarak kayıtlı olup olmadığını test etmek için ihtiyaç vardır.
Bizim tarama sistemi x kromozomu yeniden etkinleştirme ekranlar12,17için kullanılan önceden açıklanan gazetecilere birkaç avantaj sunar. CMV düzenleyici tarafından tahrik ediliyor, yerine bizim muhabir kaset MeCP2 C-terminus adlı çaldı ve böylece yerel X'e düzenleyici tarafından tahrik edilmektedir. Bu tasarım MeCP2 locus özel düzenleyiciler, Rett Sendromu araştırma, ölümsüzleştirdi fibroblastlar bulguları MeCP2 istediğiniz sitenin nöronlarda, recapitulated bir ihtar ile bağlamında daha alakalı tanımlamaya yardımcı olabilir yeniden etkinleştirme. Hygromycin direnç gen kullanımı yeniden etkinleştirme olayların olumlu seçimi sağlar ve sağlam ekran hassasiyeti artar. Ayrıca, hygromycin direnç ve ateş böceği luciferase genler içeren kaset hygromycin B ve luciferase muhabir kullanarak test/tarama bireysel saç tokaları ile pozitif seçimini kullanarak eleme büyük ölçekli her ikisi de sağlar.
Özet olarak, biz güçlü ve hassas genetik tarama yöntemi düzenleyiciler MeCP2 ve memeli hücrelerinde susturmak x kromozomu tanımlanması için rapor. Bu metodoloji küçük müdahale RNA'lar (çift), CRISPR, eleme için adapte olabilir veya küçük moleküller. Bu tür deneyleri sessiz bir gen işlevsel alleli gibi Rett Sendromu söz konusu olduğunda yeniden etkinleştirme üzerinde itimat tedavi yaklaşımları kurulması yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dr. Leko Fred Hutchinson Kanser Araştırma Merkezi bir çalışan olarak bu makalesine katkıda bulunmuştur. Görüşler kendi ve mutlaka Ulusal Sağlık Enstitüleri ya da Amerika Birleşik Devletleri hükümetinin görüşlerini yansıtmaz
Acknowledgments
Ross Dickins Melbourne Üniversitesi nezaketle belgili tanımlık perde içinde kullanılan shRNA Kütüphane sağlamak için teşekkür ederiz. Bu eser Rett Sendromu araştırma güven (A.B. tarafından) finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 293FT Cell Line | Invitrogen | R700-07 | |
| 5-Azacytidine | Sigma | A2385-100MG | |
| Agencourt AMPure XP | Beckman-Coulter | A63881 | |
| Anti-MECP2 antibody | Millipore | 07-013 | |
| Collagenase | Sigma | C2674-1G | |
| Corning 96-Well Solid White Polystyrene Microplates | Fisher Scientific | 07-200-336 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Gibco | 11965-092 | |
| Expression Arrest microRNA-adapted Retroviral Vector (pMSCV) | Open Biosystems | EAV4679 | |
| Expression Arrest pSM2 Retroviral shRNAmir library | Open Biosystems | RMM3796 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisherbrand | 03-600-511 | |
| HiSeq 2500 | Illumina | SY–401–2501 | Or equivalent |
| Hygromycin B | Calbiochem | 400051-1MU | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Bright-Glo Luciferase Assay System | Promega | E2610 | Homogenous Assay for Screening Colonies |
| Luciferase Assay System | Promega | E4530 | Non-Homogenous Assay for Testing Individual Hairpins |
| Luminometer TopCount NXT | Perkin Elmer | N/A | Or similar luminometer |
| MiSeq Reagent Kit v2 | Illumina | MS-102-2001 | Use kit compatible with your equipment |
| Opti-MEM | Gibco | 31985-070 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| pMD2.G | Addgene | #12259 | VSV-G envelope vector |
| Polybrene | Sigma | TR-1003-G | |
| Polyethylenimine | Polysciences | 23966-1 | |
| psPAX2 | Addgene | #12260 | Packaging vector |
| Puromycin | Gibco | A11138-02 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 |
References
- Amir, R. E., et al. Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2. Nat Genet. 23, 185-188 (1999).
- Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome. Science. 315, 1143-1147 (2007).
- Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI. Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).
- Disteche, C. M. Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes. Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).
- Wang, J., et al. Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome. Nature. 521, E1-E4 (2015).
- Sripathy, S., et al. Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).
- Foster, S. A., Galloway, D. A. Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells. Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).
- Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. The Western Blot. Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).
- Strezoska, Z., et al. Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens. PLoS One. 7, e42341 (2012).
- Green, M. R., Sambrook, J. Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol. Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).
- Goto, Y., Takagi, N. Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse. Development. 125, 3353-3363 (1998).
- Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation. J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).
- Minajigi, A., et al. Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation. Science. 349, (2015).
- McHugh, C. A., et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature. 521, 232-236 (2015).
- Bhatnagar, S., et al. Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).
- Minkovsky, A., et al. The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation. Epigenetics Chromatin. 7, 12 (2014).
- Minkovsky, A., et al. A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase. Epigenetics Chromatin. 8, 42 (2015).
