Summary
QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b moleculen. Immunisatie met QA--1-bindende epitopes heeft aangetoond dat weefsel-specifieke immuunregulatie vergroten en verbeteren van verschillende auto-immuunziekten. Hierin beschrijven we een overlappende peptide bibliotheek strategie voor de identificatie van QA--1 epitopes in een eiwit.
Abstract
QA-1 (HLA-E in mens) behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen. Recente gegevens suggereren dat QA--1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit, inducerende immuunregulatie, en de beperking van immuun reacties op virale infecties. Bovendien, functionele vergroting van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen via epitoop immunisatie therapeutische effecten heeft aangetoond in verschillende auto-immuunziekte diermodellen, bijvoorbeeld experimentele allergische encephalomyelitis, collageen-geïnduceerde artritis en nietzwaarlijvige diabetes. Daarom is er dringend behoefte aan een methode die snel en efficiënt functionele QA--1 epitopes in een eiwit identificeren kan. Hier beschrijven we een protocol dat gebruikmaakt van Qa-1-beperkte CD8+ T cel lijnen specifiek voor een overlappende peptide (OLP) bibliotheek voor het bepalen van de QA--1 epitopes in een eiwit. Deze OLP bibliotheek bevat 15-mer overlappende peptiden die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit en aangrenzende peptiden overlappen door 11 aminozuren. Met behulp van dit protocol, we onlangs geïdentificeerd een epitoop QA--1 9-mer in myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG). Deze nieuw toegewezen MOG QA--1 epitoop bleek voor het opwekken van epitoop-specifieke, QA--1-beperkte CD8+ T cellen die verbeterde myeline-specifieke immuunregulatie. Dit protocol is daarom nuttig voor toekomstige onderzoek van nieuwe doelstellingen en functies van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen.
Introduction
QA-1 behoort tot een groep van niet-klassieke grote histocompatibility complex 1b (MHC-Ib) moleculen in muizen. De menselijke homolog is HLA-E. Vorige bewijs heeft aangetoond dat QA--1 moleculen belangrijke biologische functies hebben. Ten eerste, QA--1 moleculen spelen een belangrijke rol in de landmeetkunde cellen voor structurele en functionele integriteit. In dit verband QA--1 moleculen geëvolueerd verschillende strategieën voor het controleren van de normale functie van een cel. Een dergelijke strategie kunt QA--1 moleculen naar formulier complexen met een verwerkte leider peptide (epitope), dat wil zeggen de Qa-1 determinant modifier (Qdm) dat is verwerkt uit klassieke MHC-Ia moleculen in het endoplasmatisch reticulum-1. Deze QA--1/Qdm complexen later weer op het oppervlak van een cel en een binding met remmende NKG2A receptoren op NK-cellen voor de remming van de NK activiteit2doden. Als de expressie van MHC-Ia moleculen verbroken wordt, wordt een cel (bijvoorbeeld een kwaadaardige cel) gevoelig voor NK doden2. De andere strategie mogelijk maakt QA--1 moleculen te vormen nieuwe QA--1/epitoop complexen op het oppervlak van een cel dat tekortschiet in TAP (vervoerder gekoppeld aan antigeen processing)3 en/of ERAAP (endoplasmatisch reticulum aminopeptidase gekoppeld in4 van het antigeen processing) (beide tekortkomingen vaak voorkomen in kwaadaardige cellen). De cel die deze nieuwe QA--1/epitoop complexen uitdrukt kan vervolgens worden herkend en uitgeschakeld door de epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen. Ten tweede, QA--1 moleculen induceren immuunregulatie5. In dit verband QA--1/epitoop complexen is aangetoond dat het stimuleren van CD8+ regulatoire T (Walter) cellen die belangrijk voor de preventie van immuun-gemedieerde schade van zelf-weefsels6,7,8 zijn ,9,10. Ten derde, Qa-1-beperkte CD8+ Treg cellen is aangetoond dat het beperken van de immuunrespons tegen virale infectie11.
Dus, de vergroting van het specifieke van epitoop-specifieke QA--1-restrictred CD8+ T cellen is een potentieel veelbelovende strategie voor het wegwerken van abnormale cellen, voor de verhoging van de immuunregulatie, en voor de controle van de omvang van virus-geïnduceerde immuunreacties. Terwijl het is niet vastgesteld of vergroting van epitoop-specifieke Qa-1-beperkte CD8+ T cellen kunnen vergroten immuun toezicht en virus-geïnduceerde immuunreacties beperken, onze laboratoria en anderen hebben duidelijk aangetoond dat immunisatie met QA--1 epitopes kan vergroten de functie van Qa-1-beperkte CD8+ Treg specifieke cellen voor pathogene auto-immune CD4+ T cellen, wat leidt tot efficiënte controle van CD4+ T-cel-gemedieerde auto-immune ziekten in een scala aan dierlijke modellen zoals experimentele allergische encefalomyelitis (een dierlijk model van menselijke multiple sclerose)6,10, collageen-geïnduceerde artritis (een dierlijk model van menselijke reumatoïde artritis)7, en nietzwaarlijvige diabetes (een dierlijk model van menselijke type 1 diabetes)8. Daarnaast hebben we ontdekt dat immunisatie met een epitoop weefsel-specifieke QA--1 tot een specifiek besturingselement van immuun-gemedieerde ontsteking in dat weefsel door vergroting van CD8 leidt+ Treg cellen12. De bovenstaande successen van preklinische studies geven een behoefte aan een volledige beoordeling van QA--1 epitoop immunisatie voor de behandeling van weefsel-specifieke immuun-gemedieerde aandoeningen en potentieel voor de therapie van andere ziekten in verband met tekortkomingen in de kraan en ERAAP.
Dienovereenkomstig, is er een vraag voor een technologie die betrouwbaar en snel QA--1 epitopes in een eiwit analyseren kan. In dit verband is een beperkt aantal biologisch belangrijke QA--1 epitopes beschreven. De meeste van deze epitopen QA--1 per werden vastgesteld tijdens de studie van CD8+ T cel reacties op bacteriën13, tekort aan TAP3cellen, tekort aan ERAAP4cellen en cellen die EAE6veroorzaken, 9. Daarom is een hoge doorvoer techniek wenselijk voor de identificatie van biologisch belangrijke QA--1 epitopes in een bepaald eiwit. In het volgende, beschrijven we een overlappende peptide (OLP) bibliotheek strategie die kaarten van functionele QA--1 epitopes in een proteïne met behulp van CD8 QA--1-resrticted+ T cel lijnen specifiek voor de OLP zwembad (OLP_pool) van een eiwit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle experimenten werden gedaan met inachtneming van een institutionele Animal Care en gebruik Protocol goedgekeurd door Animal Care en gebruik Comité bij de Universiteit van Texas in El Paso en Loma Linda University.
1. generatie van een OLP bibliotheek die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit
- Ontwerp een OLP bibliotheek waarin alle peptiden zijn 15-mer in lengte, en aangrenzende peptiden overlappen door 11 aminozuren.
Opmerking: In de studie van de MOG OLP, volgorde van de voorloper van de MOG [Mus musculus] was uit NCBI eiwit database opgehaald door het volgen van deze link: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. De voorloper van MOG (247 aminozuren), die zowel signaal en volwassen peptiden, werd gebruikt omdat het merendeel van de gerapporteerde QA--1 (HLA-E) epitopes waren gevestigd in signaal peptiden (bijvoorbeeld Qdm1). Vanaf de N-terminus, werden de sequenties van 15-mer peptiden geïdentificeerd zodat twee aangrenzende peptiden door 11 aminozuren (Figuur 1 overlapt). Vandaar, precies 59 OLPs werden geïdentificeerd in de voorloper van de MOG 247 aminozuur. Echter, de laatste OLP kan variëren van 12 tot 15-mer afhankelijk van de lengte van het eiwit. Bovendien kiezen we 15-mer bibliotheek omdat wij en anderen hebben aangetoond dat 15-mer peptides, wanneer toegevoegd in dendritische cellen (DC's) of macrofagen, efficiënt kunnen worden verwerkt tot epitopes voor erkenning door CD8+ T cellen14,15 . - Elke individuele peptide commercieel kopen. 5 mg per peptide moet voldoende zijn voor de screening. OLPs en afgekapte peptiden (stap 6.1) kunnen ontzout peptiden (zuiverheid is ongeveer 50-70%). De zuiverheid van optimale peptide (stap 6.2) die wordt gebruikt voor de generatie van tetrameer en voor toekomstige biologische analyses moet > 90%. Reconstrueren de peptiden onder steriele toestand.
- 50 mg/mL individuele peptide voorraden in 100% DMSO maken. 5 mg elke peptide, voeg 100 μl van DMSO in elke buis, meng, en slaan de peptiden bij-20 ° C. Deze bestanden worden gebruikt voor het maken van een OLP_pool voorraad voor de generatie van CD8+ T cel lijnen reactief naar de OLP_pool. Bovendien zal deze bestanden ook worden gebruikt om het maken van 10 mg/mL individuele peptide voorraden voor het bepalen van het vermogen van elke individuele peptide te stimuleren een Qa-1-beperkte reactie in een OLP_pool-reactieve CD8+ T cellijn.
- Make OLP_pool voorraad door toevoeging van een gelijk volume van elke peptide in een verse buis. Deze OLP_pool voorraad bevat 100% DMSO. In de studie van de MOG OLP waren er 59 OLPs12. Vandaar, was de concentratie van elke peptide in de OLP_pool 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59).
- 10 mg/mL individuele peptide voorraden te maken door verdunnen (5 x) de voorraad van 50 mg/mL in steriel H2O in een V-bodem 96-wells-plaat (dit bestand bevat 20% DMSO). Deze voorraden in een 96-wells-plaat maken, omdat de bepaling van de Qa-1-beperkte reactie van elke individuele peptide zal worden uitgevoerd in een 96-wells-plaat met een 8 - of 12-kanaals meerkanaalspipet.
Opmerking: Alle peptides, zoals OLPs en afgekapte peptides, moeten worden verdund in ofwel een V-bodem 96-wells-plaat of een monster van de 96-Wells-rek gevuld met 1 mL buizen, aangezien de peptide bibliotheek screening wordt uitgevoerd in 96-wells-platen met een meerkanaalspipet. Als het is moeilijk te Verdun een peptide, voeg 1 N NaOH druppel verstandig om te helpen de peptide ontbinden.
2. priming van Kb-/- Db-/- CD8+ T cellen met de OLP_pool-gepulseerde Kb-/- Db-/- dendritische cellen (DC's).
Opmerking: Er zijn twee grote QA--1 allelen: een QA--1eenis, en anderzijds QA--1b. Sinds de dieren gebruikte voor academisch onderzoek, bijvoorbeeld C57BL/6 en Balb/c muizen, voeren QA--1b, dit protocol wordt de procedure beschreven voor toewijzing QA--1b epitopes in een eiwit. CD8+ T cellen die worden gebruikt in dit protocol worden gezuiverd van Kb-/-Db-/- muizen (C57BL/6 achtergrond) in welke CD8+ T cellen zijn meestal door niet-klassieke MHC-Ib moleculen met inbegrip van Qa-1 beperkt.
- Beenmerg-afgeleide DCs als eerder beschreven12produceren.
- Kort, cultuur beenmerg eencellige schorsingen (1 x 106 cellen/mL) in RPMI-10 medium (RPMI 1640 aangevuld met 10% foetale runderserum, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuur 0.1 mM) bevattende 10 U/mL IL-4 en 100 U/mL GM-CSF in een 6-well-plate (4 mL/putje) bij 37 ° C, 5% CO2.
- Twee dagen later, niet-aanhanger cellen zorgvuldig verwijderen en toevoegen van nieuwe media en cytokinen.
- Na het kweken van de cellen nog eens twee dagen, overdracht van niet-aanhanger cellen met verse media en cytokinen in een nieuwe 6-well-plaat.
- De cellen nog eens twee dagen cultuur en aangevuld met nieuwe media en cytokines met LPS (0,1 µg/mL) te activeren de DCs.
- 24 uur later, verzamelen de DCs voor experimenten.
- De DCs met 3000 Rads bestralen.
- Als alternatief, behandelen de DCs (5 x 10,7 cellen/mL) met mitomycine C (50 μg/mL) in PBS bij 37 ° C gedurende 20 min. toevoegen RPMI-0 (RPMI 1640 zonder serum) om te vullen van de buis (~ 12 mL) en draaien de cellen gedurende 10 minuten in een centrifuge tafelblad bij 300 x g. Discard supernatant en repea t de wassen procedure nog tweemaal. Deze drie wast zijn van cruciaal belang omdat elke trace hoeveelheid mitomycine C kan de reactie van CD8 remmen+ T cellen tijdens de celcultuur co DC-T.
- Pas de DC tot 5 x 106 cellen/mL in een serumvrij medium (doel-V serumvrij medium aangevuld met 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM natrium pyruvaat en niet-essentiële aminozuur 0.1 mM).
- Voeg de OLP_pool-stockoplossing, die 100% DMSO, naar de DCs bevat zodanig dat DMSO eindconcentratie 0,5% (200 x is). In de studie van de MOG OLP was de concentratie van elke OLP in de OLP_pool 847.46 μg/mL; dus was de uiteindelijke concentratie van elk OLP in de DC cultuur 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
Opmerking: CD8+ T cellen uit muis milt en lymfklieren gezuiverd kunnen worden met behulp van CD8 positieve isolatie Kit door het volgen van de instructies van de fabrikant. CD8+ T cellen verkregen vrij zijn van kralen.
3. restimulation van de primer CD8+ T cellen met macrofagen gepulseerde met de OLP_pool
- Vier dagen vóór de hernieuwde stimulatie van de OLP_pool-primer CD8+ T cellen, bereid 2% (v/v) polyacrylamide kraal oplossing: wassen 2 g van polyacrylamide kralen tweemaal in 20 mL endotoxine-vrije H2O of PBS. De parels van polyacrylamide pellet door centrifugeren (400 x g) voor 5 min en resuspendeer in 100 mL PBS. Autoclaaf 15 lb/m voor 20 min. winkel bij kamertemperatuur.
- Injecteren intraperitoneally muizen met 1 mL/muis van de steriele oplossing polyacrylamide Parel 2% voor het aantrekken van de migratie van de monocyten/macrofagen in de peritoneale holte16.
- Vier dagen later, offeren de dieren door CO2 overdosis.
- Onder steriele condities, snijd een kleine opening in het midden van de buik, zodanig dat de opening net genoeg is voor het doorgeven van een pipet 5 mL overdracht. Vul de overdracht pipet met RPMI-0 en plaats de pipet in de buik-holte door de opening.
- Spoel de buik-holte door pipetteren. Pipetteer uit zo veel vloeistof mogelijk uit de buik-holte in een steriele buis (dit zijn peritoneale macrofagen). Herhaal de spoeling stap 4 - 5 keer.
- De peritoneale macrofagen met 3000 Rads bestralen.
- U kunt ook behandelen de peritoneale macrofagen met mitomycine C (volg de procedure die wordt beschreven in stap 2.2).
- De concentratie van de peritoneale macrofagen tot 5 x 106 cellen/mL in het medium serumvrij aanpassen. Voeg OLP_pool voorraad (de eindconcentratie van DMSO is minder dan 1%) en M-CSF (eindconcentratie = 100 U/mL).
Opmerking: In deze studie MOG OLP gebruikten we 0,5% DMSO. Dus, MOG OLP_pool voorraad was verdunde 200 x (bijvoorbeeld 1 μL van MOG OLP_Pool voorraad is toegevoegd in 199 μL van peritoneale macrofagen). Vandaar, de uiteindelijke concentratie van elk OLP was 4.2 μg/mL). - Toevoegen van 200 μl per putje (1 x 106 cellen/well) in een 48-well weefselkweek plaat en de plaat bij 37 ° C gedurende 4 uur uit te broeden.
- Verwijder de cellen niet-aanhanger en de polyacrylamide kralen door zachte wassen met 200 μl per putje van de voorverwarmde RPMI-0.
- Verzamelen en zwembad de OLP_pool primer CD8+ T cellen uit stap 2.10. Passen de OLP_pool primer CD8+ T cel concentratie aan 1 x 106 cellen/mL in het serumvrij medium met 25 U/mL IL-2 en 50 U/mL voor IL-7. 1 mL/putje aan de 48-well-plaat waarin de OLP_pool-gepulseerde peritoneale macrofagen toevoegen.
- Vier dagen later, vullen het medium in de plaat van 48-well. Verwijderen en verwijderen van ongeveer 400 μL van de voedingsbodem in de platen 48-well cultuur. Voeg 500 μL van verse serumvrij middellange met 100 U/mL IL-2 en 100 U/mL voor IL-7 in elk putje. Cultuur van de cellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Drie of vier dagen later, onderzoeken de CD8 OLP_pool-restimulated+ T cellen voor OLP_pool-specifieke, QA--1-beperkte reactie door enzyme-linked immunospot assay (ELISPOT). Na dit punt opnieuw stimuleren de CD8+ T cellen elke 7-10 dagen.
Opmerking: De macrofagen zijn voorkeur voor de hernieuwde stimulatie van de OLP_pool-primer CD8+ T cellen. We hebben gemerkt dat CD8+ T cellen opnieuw gestimuleerd door de macrofaag groeide beter dan DCs in vitro.
4. vaststelling van OLP_pool-specifiek, Qa-1-beperkte reactie in een CD8 OLP_pool-restimulated+ T cel lijn
Opmerking: OLP_pool-specifieke, QA--1-beperkte reactie in een CD8 OLP_pool-restimulated+ T cellenvariëteit wordt bepaald door IFNγ afscheiding na stimulatie van de OLP_pool in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van een IFNγ ELISPOT assay. C1R cellen kunnen commercieel worden verkregen. C1R. QA-1b -cellen kunnen worden gegenereerd door het transducing van de C1R cellen met de QA--1 lentivirale vector.
- Voeg 100 μl per putje van een opname anti-IFN-γ antilichaam verdund in coating buffer (PBS) in de putjes van de plaat van een ELISPOT.
- Als alternatief, de C1R en de C1R te behandelen. QA-1b -cellen met mitomycine C zoals beschreven in de stap 2.2, behalve dat de behandeltijd 30 min zullen.
5. de bepaling van afzonderlijke Peptides in de OLP_pool die stimuleren om de Qa-1 beperkt secretie van IFN-γ in een OLP_pool-specifieke CD8+ T cellijn
- Bepalen van de afzonderlijke peptiden die het stimuleren van de OLP_pool-specifieke secretie van IFN-γ QA--1-restrictred in een OLP_pool-specifieke CD8+ T cellijn met behulp van de hierboven beschreven IFN-γ ELISPOT assay (eindconcentratie van elke individuele peptide gebruikt voor de ELISOPT is assay 10 μg/mL). Zie representatieve resultaten in Figuur 3.
Opmerking: Een OLP-specifieke, QA--1-restircted-reactie wordt gedefinieerd als een antwoord dat ten minste driemaal van de reactie in de aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen, maar zonder de OLP. In de studie van de MOG OLP, OLP68, OLP96 en OLP105 voldaan al aan dit criterium. Daarom bevatten alle de drie OLPs potentieel QA--1 epitopes12 (Figuur 3). Echter gaf de OLP105 consequent de sterkste reactie; we vandaar een gedetailleerde analyse van de OLP105 uitgevoerd (Figuur 4 en Figuur 5)12.
6. identificatie van de optimale Qa-1 epitoop in een 15-mer OLP, dat de epitoop-specifieke, QA--1-beperkte reactie in een OLP_pool-specifieke CD8 stimuleert+ T cellijn
- Synthetiseren van C - en N-terminaal afgekapt peptiden van een 15-mer OLP zoals weergegeven in Figuur 4.
- Onderzoeken van de secretie van IFN-γ in een OLP-specifieke CD8+ T cellijn door het stimuleren van de CD8+ T cellen met elk van de afgekapte peptiden, alsmede de ouderlijke 15-mer OLP in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van de hierboven beschreven IFN-γ ELISPOT assay. De uiteindelijke concentratie van elke individuele peptide gebruikt voor de bepaling van de ELISPOT is 10 μg/mL. Een peptide wordt gedefinieerd als de optimale epitoop QA--1 als de peptide: 1) consequent geeft vergelijkbare of sterker IFN-γ reactie, in vergelijking met de oorspronkelijke 15-mer peptide, in aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen; 2) is tussen 8 - 10-mer (9-mer peptide voorkeur) die zijn de lengtes van de peptide gebonden aan MHC-ik moleculen15,17. Zie Vertegenwoordiger resultaten in Figuur 5.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ontwerp van een OLP bibliotheek die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit
Vanaf de N-terminus van een eiwit, is elke peptide 15 aminozuren (15-mer). Vandaar, beslaat de eerste peptide positie 1 naar positie 15. De N-terminus van de tweede peptide overlapt met de C-terminus van de eerste peptide 11 aminozuur. Vandaar, de tweede peptide overspant de positie 5 naar positie 19. Het ontwerp van de rest van de peptiden aan het einde van de C-terminus van het eiwit (Figuur 1). We kozen voor de 15-mer bibliotheek omdat wij en anderen hebben aangetoond dat 15-mer peptides, wanneer toegevoegd in dendritische cellen (DC's) of macrofagen, efficiënt kunnen worden verwerkt tot epitopes voor erkenning door CD8+ T cellen14,15. Het aantal OLPs in een bibliotheek, is afhankelijk van de lengte van een eiwit. Bovendien, kan de laatste OLP variëren van 12 tot 15-mer afhankelijk van de lengte van het eiwit. Bijvoorbeeld, heeft myeline Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG) een lengte van 247 aminozuren. De bibliotheek MOG OLP bevat 59 OLPs12. Representatieve resultaten gepresenteerd in dit manuscript zijn uit de analyse van de MOG OLP bibliotheek.
Bepaling van OLP_pool-specifiek, QA--1-beperkte reactie in een OLP_pool-gestimuleerd CD8+ T cellijn
We genereerden een CD8+ T cellijn die werd gevuld door Kb-/-Db-/- DCs gepulseerde met MOG OLP_pool (MOG_pool) en restimulated door MOG_pool-gepulseerde Kb-/-Db-/- peritoneale macrofagen zoals beschreven in de voornoemd protocol (Protocol 1, 2 en 3). Om te bepalen potentiële MOG_pool-specifieke, QA--1-beperkte reactie in deze CD8+ T cellijn, onderzochten we de reactie van deze CD8+ T cellijn naar de MOG_pool in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van de ELISPOT IFN-γ assay (Figuur 2) (Protocol stap 4). Onze gegevens is gebleken dat de MOG_pool-gestimuleerd CD8+ T cellijn uitgescheiden een laag niveau van IFN-γ in aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen (32 Spot vorming van cellen of SFCs) maar niet C1R cellen (2 SFCs), wat suggereert de aanwezigheid van CD8+ T cellen die gereageerd op QA--1-bindende epitopes afgeleid van C1R cellen (C1R cellen zijn menselijke B lymphoblastoid cellen). SFCs werden verhoogd, toen de MOG_pool werd toegevoegd in de put die C1R cellen (78 SFCs), wat suggereert de aanwezigheid van CD8+ T cellen die gereageerd op niet-Qa-1 epitopes. SFCs waren sterk toegenomen toen de MOG_pool werd toegevoegd in de put die C1R. QA-1b -cellen (320 SFCs), wat suggereert de aanwezigheid van CD8+ T cellen die gereageerd op QA--1-bindende peptiden. De gegevens tonen ook aan dat de MOG_pool QA--1-bindende epitope(s) bevat.
Bepaling van afzonderlijke peptiden in de OLP_pool die tot de secretie van IFN-γ Qa-1-beperkt in een OLP_pool-reactieve CD8 bijdragen+ T cellijn
Om te bepalen van de peptiden in de OLP_pool die de secretie van IFN-γ Qa-1-beperkt in een MOG_pool-reactieve CD8 gestimuleerd+ T cellijn, we gestimuleerd de MOG_pool-reactieve CD8+ T cellen met individuele 59 OLPs in aanwezigheid van beide C1R of C1R. QA-1b -cellen (Figuur 3) (Protocol stap 5). Onze gegevens is gebleken dat enkele SFCs in de putjes die cellen van de C1R en de OLPs werden waargenomen. In tegenstelling, stegen SFCs in alle putjes die C1R. QA-1b -cellen en de OLPs. Uit Figuur 2, we geleerd dat CD8+ T cellen in aanwezigheid van C1R. QA-1b alleen gevormd ook SFCs. Daarom zou de toegenomen SFCs in de meeste wells als gevolg van niet-specifieke stimulatie als gevolg van de presentatie van QA--1 epitopes afgeleid van intracellulaire eiwitten in de cellen van de C1R door de QA--1 moleculen. Echter de OLPs in de 3 frame putten in Figuur 3 c (B8, D12 en E9), die gematched de 3 gewezen op OLPs in de figuur 3A (OLP68, OLP96 en OLP105), voldeed aan het criterium voor het definiëren van een OLP-specifieke, QA--1-beperkte IFN-γ reactie als beschreven in het Protocol stap 5.112. Uit de gegevens blijkt dat de 3 OLPs QA--1 epitope(s) bevatten. Aangezien de OLP105 consequent de hoogste reactie geproduceerde, wij gedetailleerde analyse van de OLP10512uitgevoerd.
Ontwerp van een afgeknotte peptide-bibliotheek voor een 15-mer OLP
Een 15-mer OLP, die is vastgesteld ter stimulering van de secretie van IFN-γ Qa-1-beperkt in de OLP_pool-reactieve CD8+ T cellijn, moet worden geanalyseerd voor de optimale epitoop met behulp van een afgeknotte peptide-bibliotheek. Zo afgekapt peptide-bibliotheek is ontworpen door geleidelijk de 15-mer OLP afknotten door 1 aminozuur op de N - en C-termini (Figuur 4). Gelijkaardig aan andere MHC klasse I moleculen, QA--1 moleculen voornamelijk binden aan 8 - 10-mer peptiden. Daarom is het raadzaam dat de kortste afgeknotte peptide 6-mer in lengte is.
Identificatie van de optimale QA--1 epitoop in een 15-mer OLP, dat de secretie van IFN-γ Qa-1-beperkt in een OLP_pool-reactieve CD8 stimuleert+ T cellijn
De bovenstaande N - en C-terminaal afgekapt peptiden zijn getest voor de sterkte in stimulerende secretie van IFN-γ in een CD8+ T cellijn specifiek voor de OLP_pool of de 15-mer OLP met behulp van de ELISPOT van IFN-γ hierboven beschreven. In de studie van QA--1 epitopes in MOG12, we genereerden een CD8+ T cellijn die specifiek voor de MOG OLP105 was (figuur 5A). Nadere analyse blijkt dat de N-terminaal afgeknotte 9-mer peptide aan de twee criteria voor een optimale epitoop als in het Protocol stap 6.2 (figuur 5B beschreven). Wij geconcludeerd dat de N-terminaal 9-mer afgekapt peptide was de optimale QA--1 epitoop.
Figuur 1: ontwerp van een OLP bibliotheek die betrekking hebben op de hele lengte van een eiwit. Vanaf de N-terminus, werden peptiden van 15 aminozuur (15-mer) lengte geïdentificeerd.De N-terminus van elke peptide, met uitzondering van de eerste peptide, overlapt met de C-terminus van de vorige peptide door 11 aminozuren.
Figuur 2: MOG_pool-gestimuleerd CD8+ T cellen werden gedeeltelijk MOG_pool specifieke en QA--1-beperkte12. In vitro CD8+ T cellen gestimuleerd door de MOG OLP_pool (MOG_pool) werden onderzocht voor de reactie op de MOG_pool in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen als antigeen presentatie van cellen met behulp van een IFN-γ ELISPOT assay. Vertegenwoordiger ELISPOT beelden worden getoond. Aantal plek-vormende cellen (SFCs) worden weergegeven op de bovenste links hoeken van elk putje. CD8+ T cellen: 50.000 cellen per putje. C1R of C1R. QA-1b -cellen: 200.000 cellen per putje.
Figuur 3: analyse van de OLPs in de MOG_pool die verantwoordelijk voor de Qa-1 waren beperkt antwoord. (A) lay-out van de V-bodem 96-wells-plaat die deel uitmaakt van de 10 mg/mL individuele MOG OLPs. Getallen in de putjes vertegenwoordigd OLP IDs. De gemarkeerde 3 putten bevatte de OLPs die voldeed aan het criterium voor een OLP-specifieke, QA--1-beperkte IFN-γ-reactie zoals beschreven in het Protocol stap 5.112. (B) vertegenwoordiger SFCs in elk putje die een OLP (eindconcentratie = 4.2 μg/mL, OLP ID gekoppeld dat in "A"), de MOG_pool-reactieve CD8+ T cellen (50.000 cellen per putje) en C1R cellen (200.000 cellen per putje). (C) vertegenwoordiger SFCs in elk putje die een OLP (eindconcentratie = 4.2 μg/mL, OLP ID gekoppeld dat in "A"), de MOG_pool-reactieve CD8+ T cellen (50.000 cellen per putje), en C1R. QA-1b -cellen (200.000 cellen per putje). De 3 ingelijste putten bevatte de OLPs die voldeed aan het criterium voor een OLP-specifieke, QA--1-beperkte IFN-γ antwoord12. De figuur is aangepast van referentie12. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: ontwerp van afgeknotte peptiden van een 15-mer peptide. Een peptide 15-mer werd geleidelijk op de N - en C-termini afgekapt door 1 aminozuur aan 6-mer. De 15-mer en de afgekapte peptiden werden vervolgens gesynthetiseerd. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: analyse van het optimale QA--1 epitoop in de OLP105. (A) een OLP105-gestimuleerd CD8+ T cellijn werd onderzocht voor de reactie op de OLP68, OLP96 en OLP105 in aanwezigheid van C1R of C1R. QA-1b -cellen met behulp van een IFN-γ ELISPOT assay. Vertegenwoordiger IFN-γ SFCs (nummers op de linker bovenhoeken) worden weergegeven. (B) de OLP105-specifieke CD8+ T cellijn, zoals in (A), werd onderzocht voor de reactie op de individuele N - en C-terminaal afgekapt peptides, zoals weergegeven in Figuur 4, in aanwezigheid van C1R. QA-1b -cellen met behulp van de ELISPOT IFN-γ assay. OLP105: een 15-mer OLP. N6-14: Afgekapt N-terminaal OLP105 peptiden. C6-14: Afgekapt C-terminaal OLP105 peptiden. CD8+ T cellen: 50.000 cellen per putje. C1R. QA-1b -cellen: 200.000 cellen per putje. Getallen op de linksboven hoeken werden SFCs per 50.000 CD8+ T-cellen. Rode rechthoek gemarkeerd de Nou dat voldoet aan de criteria voor het bepalen van de optimale QA--1 epitoop in een OLP zoals beschreven in het Protocol stap 6.2. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier hebben we een protocol voor het analyseren van QA--1 epitopes in een eiwit beschreven. Met betrekking tot dit protocol, werden verschillende andere strategieën ook eerder gemeld. Eerste, allogene CD8+ T cellijnen en klonen werden gebruikt voor de identificatie van de Qdm1. Ten tweede, een vermeende QA--1-bindende motief uit de analyse van Qdm werd gebruikt voor de identificatie van de HSP60p216-224 en een TCRBV8.1 epitoop9,18. Derde, individuele overlappende peptiden van een eiwit werden gebruikt om dieren te immuniseren. Vervolgens CD8+ T cellen geïsoleerd van de geïmmuniseerde dieren werden gebruikt voor het identificeren van de TCRBV8.2 peptide p42-50 die werd vervolgens bevestigd voor binding aan QA--16,10,19. Vierde, functionele CD8+ T cel lijnen in combinatie met cDNA display bibliotheek werden gebruikt voor de identificatie van de FL9 QA--1 epitoop4.
Verwijzing naar de eerdere technieken, het gebruik van allogene CD8+ T cel lijnen en klonen van mei niet geschikt voor het analyseren van QA--1 epitopes die worden gepresenteerd tijdens de fysiologische immuunrespons. Bovendien blijkt accumuleren gegevens dat het eerder beschreven bindende motief slechts gedeeltelijk de peptide-bindingscapaciteit van QA--1 moleculen kan betekenen. Dus, het exacte QA--1-bindende motief is nog niet bekend4. Bovendien is immunisatie met individuele peptide voor de identificatie van QA--1 epitopes moeizaam. Ten slotte, cDNA display bibliotheek strategie omvat de bouw van vele vectoren die verschillende peptide lengtes voor cel transfectie dragen. In tegenstelling, de OLP bibliotheek strategie beschreven hier is eenvoudig, en de toegewezen peptiden zijn gekend om te stimuleren Qa-1-beperkte CD8+ T cellen. Daarom is onze strategie heeft een uniek voordeel.
De strategie zoals beschreven hier gebruikt OLP_pool-specifieke CD8+ T cellen die worden gegenereerd door in vitro priming en restimulation. Een alternatieve bron van de CD8+ T cellen kunnen worden van de drainage van de lymfeklieren van een kb-/-Db-/- muis die is geïmmuniseerd met de bron eiwit20. Dergelijke immuun CD8+ T cellen kunnen vervolgens worden onderzocht voor IFN-γ reacties op OLPs en afgekapte peptiden voor de identificatie van QA--1 epitopes. In theorie de in vivo immuun CD8+ T cellen zijn dichter bij de fysiologische voorwaarde dan de in vitro gegenereerd CD8+ T cellen. Echter vonden we dat de reactie van het immuun CD8+ T cellen rechtstreeks gezuiverd van geïmmuniseerde muizen was zwak en vaak vereist in vitro restimulations voor een bevredigende peptide screening resultaat. Daarnaast is dit protocol ontworpen voor toekomstige vertaling naar menselijke studie van HLA-E epitopes waarin in vivo immunisatie niet praktisch is.
Technisch gezien is de kritische deel van dit protocol is de generatie van CD8+ T cel lijnen die specifiek zijn voor de OLP_pool of een individuele OLP. Aangezien QA--1/peptide complexen unstable in vergelijking met klassieke MHC-ik/peptide complexen21 zijn, nadat het antigeen voorstellende cellen zijn gepulseerde met de OLPs of een peptide, moeten de gepulste cellen niet uitvoerig worden gewassen. We hebben gevonden dat de peptide-gepulseerde cellen, als gewassen uitgebreid, verliest, of aanzienlijk het vermogen verminderen te stimuleren van CD8+ T cellen. Daarom raden we eens wassen de pulsed peptide antigeen presentatie cellen onmiddellijk voordat ze mede gekweekte met CD8 zijn+ T cellen.
Ook, wegens de instabiliteit van QA--1/peptide complexen, raden we het gebruik van een serumvrij medium voor de peptide pulserende en het stimuleren van CD8+ T cellen. Bovendien voegen we regelmatig 50 U/mL voor IL-7 tijdens CD8+ T cel cultuur, alsmede tijdens de IFN-γ ELISPOT assay. Het doel van de IL-7 is om de levensvatbaarheid en de functie van CD8+ T cellen. IL-7 door zelf stimuleert niet CD8+ T cellen produceren IFN-γ.
Net als bij alle strategieën, QA--1 epitopes toegewezen door deze strategie ook nader onderzoek voor biologische betekenis. Een belangrijke vraag is bijvoorbeeld of de toegewezen epitoop fysiologisch kan worden gepresenteerd. Om aan deze vraag, kunnen DCs worden transduced met een lentivirale vector, dat het epitoop bron eiwit (bijvoorbeeld MOG In the MOG OLP studie brengt). Vervolgens, de reactie van de epitoop-specifieke CD8+ T cellen aan de getransduceerde DCs is onderzocht. Een positieve reactie suggereert dat de epitoop fysiologisch kan worden verwerkt en gepresenteerd door DCs. In toevoeging, functionele gevolgen als gevolg van de erkenning van de epitoop door CD8+ T cellen moeten nader worden onderzocht. In dit verband hebben de analyses van Qdm en FL9 QA--1 epitopes geleid tot de conclusie dat QA--1 moleculen belangrijk voor immuun toezicht1,4 zijn. Bovendien, de studies van HSP60p216, TCRBV8.1 peptide, en de p42-50 hebben geleid tot de conclusie dat CD8 Qa-1-beperkte+ T cellen regelen immuunrespons via gericht op pathogene CD4+ T cellen 6,7 ,9,19. Bovendien, de studie van MOG196 heeft voor de eerste keer is gebleken dat Qa-1-beperkte CD8+ T cellen kon reguleren immuunresponsen door rechtstreeks gericht op een tissue om het te verhinderen schade door potentieel pathogene auto-immune cellen12 . Ten slotte, functionele analyse van een specifieke epitope, QA--1-beperkte CD8+ T-cel kan worden bijgestaan door tetrameer. Dergelijke tetrameer kan worden geproduceerd in NIH tetrameer kern faciliteit (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) of een bedrijf. Om te vragen de generatie van een tetrameer, kan men de functionele gegevens die ondersteuning bieden voor binden van de nieuw toegewezen optimale QA--1 epitoop aan QA--1 proteïne voor hun goedkeuring voor de generatie van een tetrameer QA--1 zenden.
Tot slot, vorige studies hebben aangetoond dat CD8 Qa-1-beperkte+ T cellen spelen een belangrijke rol in de regulatie van lokale immuunrespons op12. In dit verband kunnen weefsel schade worden veroorzaakt door een immuunrespons die zich rechtstreeks richt op het weefsel. Bovendien, kunnen collaterale schade worden veroorzaakt door een immuunrespons die zich richt op een binnenvallende pathogeen. Daarom, inzicht in de rol van Qa-1-beperkte CD8+ T cellen in deze twee verschillende weefsel schade is belangrijk voor hun klinische toepassingen.Om dit te bereiken, een grondige analyse van QA--1 epitopes in een zelf-weefsel of een binnenvallende pathogen is noodzakelijk. Dit protocol zal geschikt voor deze analyses worden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Auteurs verklaren geen belangenconflict.
Acknowledgments
Wij danken Penelope Garcia voor haar technische bijstand en de voorbereiding van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door een onderzoek subsidie voor innovatie (RIG) van het departement of Medicine aan de Loma Linda University (681205-2967) en een pilot subsidie van de National Multiple Sclerosis Society (PP1685) voor de XT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| The protein to be analyzed | N/A | N/A | Sequence of the protein can be obtained from NCBI |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | Cat#: D2650 SIGMA | DMSO should be sterile and cell culture tested. |
| Kb-/-Db-/- mice | The Lackson Laboratory | Stock#: 019995 | We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore. |
| AIM V Serum Free Medium | ThermoFisher Scientific | Cat#: 12055091 | |
| 2-mercaptoethanol | ThermoFisher Scientific | Cat#: 21985023 | |
| Sodium pyruvate | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11360070 | |
| Nonessential Amino Acids | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11140076 | |
| Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit | ThermoFisher Scientific | Cat#: 11333D | |
| Bio-Gel P-100 | Bio-Rad | Cat#: 150-4171 | |
| Phoshate Balanced Solution (PBS) | ThermoFisher Scientific | Cat#: 20012027 | |
| Trasfer pipette | Globe Scientific | Mfg#: 137238 | |
| Murine M-CSF | PeproTech | Cat#: 315-02 | |
| 48-well tissue culture plates | USA Scientific | Cat#: CC7682-7548 | |
| Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom | Sigma-Aldrich | Cat#: Z372129 Sigma | |
| 1ml deep 06-well PP plate, sterile | USA Scientific | Item#: 1896-1110 | |
| Recombinant murine IL-2 | PeproTech | Cat#: 212-12 | |
| Recombinant murine IL-7 | PeproTech | Cat#L: 217-17 | |
| Capture anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| ELISPOT plate | Sigma-Aldrich | Cat#: S2EM004M99 | |
| C1R | ATCC | Cat#: ATCC CRL-1993 | |
| C1R.Qa-1b | Custom made (GenBank access#: NM_010398.3) | ||
| Qa-1 lentiviral vector | GeneCopoeia | Product#: Mm02955 | |
| Detection anti-IFN-γ antibody | BD Biosciences | Cat#: 551881 | |
| Tween20 | Sigma-Aldrich | Cat#: P9416 | |
| Streptavidin-HRP | BD Biosciences | Cat#: BD557630 | |
| AEC substrate | BD Biosciences | Cat#: 551951 | |
| ImmunoSpot Analyzer | ImmunoSpot | Any immunoSpot analyer should work for this purpose. |
References
- Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
- Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
- Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
- Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
- Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
- Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
- Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
- Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
- Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
- Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
- Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
- Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
- Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
- Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
- Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
- Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
- Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
- Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
- Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
- Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).
