Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56401
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University
* These authors contributed equally

Summary

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצה של מולקולות מורכבות 1b histocompatibility הגדולות-קלאסי. חיסון Qa-1-איגוד epitopes הוכח להגדיל ויסות מערכת החיסון רקמות ספציפיות, דהוא במספר מחלות אוטואימוניות. במסמך זה אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד חופפים לצורך זיהוי Qa-1 epitopes של חלבון.

Abstract

Qa-1 (הלע-E-אנוש) שייך לקבוצת 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי מולקולות (MHC-ליברות). נתונים עדכניים מראים כי מולקולות Qa-1 לשחק תפקידים חשובים ב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית, ויסות מערכת החיסון וגורם והגבלת תגובות החיסונית זיהומים וירליים. בנוסף, הגדלת פונקציונלי של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באמצעות epitope התחסנות הראו השפעות טיפוליות במספר מחלות אוטואימוניות בעלי חיים דגמים, למשל ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה, קולגן-induced דלקת מפרקים, סוכרת ולא שמנים. לכן, יש צורך דחוף שיטה ביעילות ובמהירות לזיהוי פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אשר מנצל CD8 Qa-1-מוגבל+ תא T שורות ספציפיות עבור ספריה פפטיד (OLP) חופפים לקביעת Qa-1 epitopes של חלבון. ספריית OLP זו מכילה 15-מר פפטידים חופפים המכסות לכל האורך של חלבון, פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו. באמצעות פרוטוקול זה, זיהינו לאחרונה epitope Qa-1 9-מר בגליקופרוטאין אוליגודנדרוציטים מיאלין (ש א). זה epitope ש א Qa-1 ממופה לאחרונה הוצגה לזירוז CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת+ T תאים תקנה המערכת החיסונית משופרת הזה ספציפית מיאלין. לכן, פרוטוקול זה שימושי בעתיד לפתוח בחקירה של הרומן יעדים ופונקציות של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים.

Introduction

Qa-1 שייך לקבוצה של 1b מורכבים histocompatibility הגדולות-קלאסי (MHC-ליברות) מולקולות בעכברים. Homolog האנושי שלה הוא הלע-אי ראיות קודמות הוכיחה כי מולקולות Qa-1 יש תפקודים ביולוגיים חשובים. ראשית, מולקולות Qa-1 משחק תפקיד חשוב ודיגום תאים עבור ותקינות מבנית תפקודית. בהקשר זה, Qa-1 מולקולות התפתחו מספר אסטרטגיות כדי לנטר את התיפקוד הרגיל של תא. אסטרטגיה אחת כזו מאפשרת מולקולות Qa-1 ל קומפלקסי טופס עם מנהיג מעובד פפטיד (epitope), כלומר ה-Qa-1 הקובע צירוף (אותה לא ישכחו במהרה) המעובדים של מולקולות MHC-Ia קלאסית רשתית תוך-פלזמית1. אלה של Qa-1/אותה לא ישכחו במהרה מתחמי מאוחר יותר להציג על פני השטח של התא, להיקשר לקולטנים NKG2A מעכבות בתאי NK לעכב NK הורג פעילות2. אם הביטוי של מולקולות MHC-Ia אובד, תא (למשל תא ממאיר) הופך רגיש NK להרוגשניים. האסטרטגיה אחרים מאפשר Qa-1 מולקולות להקים מתחמי Qa-1/epitope חדשים על פני התא בנכונותם ברז (טרנספורטר המשויך עיבוד אנטיגן)3 ו/או ERAAP (aminopeptidase רשתית תוך-פלזמית המשויך עיבוד אנטיגן)4 (שני ליקויים לעיתים קרובות להתרחש בתאים ממאירים). התא המבטאת אלה מתחמי Qa-1/epitope חדש יכול להיות מזוהה ואז חוסל על ידי epitope ספציפיים CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים. שנית, Qa-1 מולקולות זירוז מערכת החיסון תקנה5. בהקשר זה, מתחמי Qa-1/epitope הוכחו לעורר CD8+ הרגולציה ותאי T (Treg) חשובים למניעת נזקי בתיווך החיסון העצמי-רקמות6,7,8 ,9,10. שלישית, CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים הוכחו להגביל את תגובות מערכת החיסון נגד זיהום ויראלי11.

לכן, הגדלת ספציפי של CD8 Qa-1-restrictred epitope ספציפי+ T תאים היא אסטרטגיה פוטנציאל מבטיח עבור חיסול של תאים חריגים, על השיפור של ויסות מערכת החיסון ועל לפקד על המשמעות של תגובות חיסוניות הנוצרות על-ידי וירוס. בזמן זה טרם נקבע אם תוספת ספציפית epitope CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים באפשרותך לשפר את המערכת החיסונית מעקב ולהגביל הנוצרות על-ידי וירוס תגובות חיסוניות, מעבדות שלנו ואחרים בבירור הוכיחו את זה חיסון epitopes Qa-1 יכול להגדיל את הפונקציה של CD8 Qa-1-מוגבל+ Treg תאים ספציפיים עבור פתוגניים CD4 אוטואימוניות+ T תאים, שמוביל שליטה יעילה של CD4+ T תאית מחלות אוטואימוניות ב מגוון רחב של החיות מודלים כגון6,ניסיוני אלרגית דלקת המוח וחוט השדרה (במודל חיה של טרשת נפוצה אנושי)10, דלקת מפרקים הנגרמת קולגן (במודל חיה של דלקת מפרקים שגרונית אנושי)7, ו סוכרת שאינו שמנים (במודל חיה של האדם סוג 1 סוכרת)8. בנוסף, גילינו כי חיסון epitope Qa-1 רקמות ספציפיות מוביל פקד מסוים של דלקת החיסונית בתיווך תפולס דרך הגדלת של CD8+ Treg תאים12. ההצלחות לעיל של מחקרים פרה להצביע על הערכה מלאה התחסנות epitope Qa-1 לטיפול של רקמות ספציפיות בתיווך החיסונית מחלות ואפשרות עבור הטיפול במחלות אחרות המשויכות ליקויים ברז, ERAAP.

בהתאם לכך, יש ביקוש טכנולוגיה ניתן באמינות ובמהירות לנתח Qa-1 epitopes של חלבון. בהקשר זה, תואר מספר מוגבל של epitopes Qa-1 חשוב מבחינה ביולוגית. רוב epitopes Qa-1 אלה זוהו serendipitously במהלך המחקר של CD8+ T תא התגובות חיידקים13, לקוי ברז3תאים, התאים לקויה ERAAP4ותאים הגורמות EAE6, 9. לכן, טכניקה תפוקה גבוהה רצוי לצורך זיהוי ביולוגית חשובה epitopes Qa-1 בחלבון מוגדר. בחלק זה, אנו מתארים את אסטרטגיית ספריית פפטיד (OLP) חופפים הממפה פונקציונלי epitopes Qa-1 בחלבון באמצעות CD8 Qa-1-resrticted+ תא T שורות ספציפיות עבור הבריכה OLP (OLP_pool) של חלבון.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל הניסויים נעשו בהתאם, טיפול בעלי חיים מוסדיים ו שימוש בפרוטוקול שאושרו על-ידי חיה אכפת והוועדה שימוש ב אוניברסיטת טקסס El Paso ובאוניברסיטה לומה לינדה.

1. דור של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

  1. עיצוב ספריה OLP שבו כל פפטידים 15-מר אורך הינם פפטידים סמוכים חופפים על ידי 11 חומצות אמינו.
    הערה: במחקר OLP ש א, רצף למבשר ש א [ס. מאסכאלאס] אוחזר ממסד חלבון NCBI דרך לינק זו: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. מבשר ש א (247 חומצות אמינו), אשר הכיל אות וגם פפטידים בוגרת, שימש כי רוב epitopes Qa-1 (הלע-E) שדווח אותרו אות פפטידים (למשל אותה לא ישכחו במהרה1). החל שלה אמיני, הרצפים של פפטידים 15-מר אותרו כך שני פפטידים סמוכים חפפו ידי חומצות אמינו 11 (איור 1). לפיכך, OLPs 59 בדיוק אותרו בחומצת אמינו 247 ש א מבשר. עם זאת, OLP האחרון יכול לנוע בין 12 עד 15-מר בהתאם לאורך של החלבון. בנוסף, אנו בוחרים ספריית 15-מר כי אנחנו ואחרים הראו כי 15-מר פפטידים, בעת הוספת תאים דנדריטים (Dc) או מקרופאגים, יכול להיות יעיל מעובד epitopes להכרה על ידי CD8+ T תאים14,15 .
  2. לרכוש כל פפטיד בודדים מסחרית. 5 מ"ג לכל פפטיד צריך להיות מספיק להקרנה. OLPs קטום פפטידים (6.1 שלב) יכול להיות desalted פפטידים (טוהר הוא כ- 50-70%). הטוהר של פפטיד אופטימלית (שלב 6.2) ייעשה שימוש עבור הדור של tetramer, שניתוח ביולוגי צריך להיות > 90%. לשקם את פפטידים בתנאי סטרילי.
  3. להפוך 50 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד דימתיל סולפוקסיד 100%. עבור 5 מ"ג של כל פפטיד, להוסיף 100 μL של דימתיל סולפוקסיד לתוך כל שפופרת, לערבב, ולאחסן את פפטידים ב-20 ° C. מניות אלה ישמש כדי להפוך את המניות של OLP_pool עבור הדור של CD8+ תא T קווים תגובתי ל OLP_pool. בנוסף, מניות אלה יהיו אף הן בשימוש כדי להפוך 10 מ"ג/מ"ל מניות בודדות פפטיד בקביעת היכולת של כל פפטיד בודדים כדי לעורר תגובה Qa-1-מוגבלת ב- CD8 תגובתי OLP_pool+ תא T קו.
  4. יצירת מלאי OLP_pool על-ידי הוספת אמצעי שווה של כל פפטיד לתוך צינור טריים. מלאי OLP_pool זה מכיל דימתיל סולפוקסיד 100%. במחקר OLP ש א, היו 59 OLPs12 לכן, ריכוז של כל פפטיד ב OLP_pool היה 847.46 μg/mL (50 מ"ג/מ"ל ÷ 59).
  5. להפוך את 10 מ"ג/מ"ל מניות פפטיד בודדים על-ידי המדללת (x 5) המניה 50 מ"ג/מ"ל סטרילי H2O בצלחת התחתונה V 96-ובכן (מלאי זה מכיל 20% דימתיל סולפוקסיד). להפוך את המניות האלה צלחת 96-ובכן כי הקביעה של התגובה Qa-1-מוגבלת של כל פפטיד בודדים יבוצעו בצלחת 96-ובכן באמצעות פיפטה רב-ערוצי של 8 או 12-ערוץ.
    הערה: כל פפטידים, כולל OLPs ופפטידים קטום, יש לדלל בצלחת או V-התחתון 96-ובכן או ארון מדגם 96-ובכן מלא עם צינורות 1 מ"ל מאז ההקרנה ספריית פפטיד מתבצע ב 96-ובכן צלחות באמצעות פיפטה רב-ערוצי. אם קשה לדלל פפטיד, להוסיף טיפה N NaOH 1 חכם לעזור לפזר את פפטיד.

2. לקרקע של Kb-/- Db-/- CD8+ תאי T עם K פעמו OLP_poolb-/- Db-/- תאים דנדריטים (Dc).

הערה: ישנם שני אללים Qa-1 העיקריים: אחת היא Qa-1, והשני הוא Qa-1b. מאז בעלי החיים הנפוץ עבור מחקר אקדמי, למשל C57BL/6 ועכברים Balb/c, לשאת Qa-1b, פרוטוקול זה מתאר את ההליך עבור מיפוי Qa-1b epitopes של חלבון. CD8+ T תאים המשמשים פרוטוקול זה כבר טהור מ Kb-/-Db-/- עכברים (רקע C57BL/6) ב- CD8 אילו+ T תאים מוגבלים בעיקר על ידי מולקולות MHC-ליברות-קלאסי כולל Qa-1.

  1. לייצר DCs הנגזרות מח עצם כמו שתואר לעיל12.
    1. בקצרה, תרבות מח עצם תא בודד המתלים (1 x 106 תאים/mL) RPMI-10 בינוני (RPMI 1640 בתוספת 10% סרום שור עוברית, 5.5 x 10-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ) המכילה 10 U/mL IL-4 ו- 100 U/mL GM-CSF בצלחת 6-טוב (4 מ ל/טוב) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2.
    2. יומיים לאחר מכן, להסיר תאים שאינם מחסידי היטב ולהוסיף מדיה טריים ציטוקינים.
    3. לאחר culturing התאים ביומיים, העברה שאינם מחסידי תאים המכילים ציטוקינים ומדיה חדשה לתוך צלחת 6-באר חדשה.
    4. התרבות התאים ביומיים, מתחדש עם ציטוקינים המכיל LPS ומדיה טריים (0.1 µg/mL) כדי להפעיל את בקרי התחום.
    5. 24 שעות לאחר מכן, לאסוף Dc לניסויים.
  2. . להאיר את בקרי התחום עם 3000 ראד...
    1. לחלופין, מתייחסים Dc (5 x 107 תא/mL) עם מיטומיצין C (50 μg/מ"ל) ב- PBS ב 37 מעלות צלזיוס במשך 20 דק להוסיף RPMI-0 (RPMI 1640 ללא סרום) כדי למלא את הצינור (~ 12 mL), לסובב את התאים עבור 10 דקות ומפרידה שולחני 300 ג' להשליך supernatants ו- repea t ההליך כביסה עוד פעמיים. אלה שלושה שוטף הן קריטיות כי כל הסכום שמץ של מיטומיצין C עלול לעכב את התגובה של CD8+ T תאים במהלך התרבות שיתוף של התא DC-T.
  3. התאם את הריכוז DC ל 5 x 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום (AIM-V ללא סרום בינוני בתוספת 5.5 x 10-5 מ' מרקפטואתנול 1 מ"מ נתרן פירובט, חומצת אמינו שאינן חיוניות 0.1 מ מ).
  4. הוסף את הפתרון מניות OLP_pool, אשר מכיל 100% דימתיל סולפוקסיד, אוגי כזה ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי יהיה 0.5% (200 x). במחקר OLP ש א, היה הריכוז של כל OLP, OLP_pool 847.46 μg/mL; לכן הריכוז הסופי של כל OLP בתרבות DC היה 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200).
עם זאת, וניתן לשנותם הריכוז הזה עד 100 μg/mL כל עוד הריכוז דימתיל סולפוקסיד בתרבות תא נשאר פחות מ 1%.
  • דגירה Dc בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות, לנער את התאים בעדינות כל 15 דקות.
  • במהלך תקופת הדגירה לטהר CD8+ T תאים מן הטחול שנקטפו או הלימפה של Kb-/-Db-/- עכברים באמצעות CD8 מסחרי של+ T תא ערכת טיהור, להתאים את הריכוז תא ל 10 x 106 תאים/מ ל המדיום ללא סרום המכיל U/mL 50 אינטרלוקין 2 (il-2) ו- U/mL 100 של IL-7.
  • כעת, הוסף את CD8+ T תאים לתוך צלחת 48-טוב כמו 0.5 mL/טוב (לאחר התוספת של 0.5 mL/טוב של בקרי התחום פעמו OLP_pool ב שלב 2.8, הריכוז הסופי של CD8+ T תאים יהיה 5 x 106 תאים/מ ל...).
    הערה: CD8+ T תאים מן העכבר הטחול ובלוטות הלימפה יכול להיטהר באמצעות ערכת בידוד חיובי CD8 על-ידי ביצוע ההוראה המסופקים על ידי היצרן. CD8+ T תאים שהושג חופשיים של חרוזים.
  • ספין למטה פעמו OLP_pool Dc (x 300 גרם, 10 דקות)-RT. לשקם Dc פעמו OLP_pool 2 x 106 תאים/מ ל מדיום נטול סרום ולהוסיף 0.5 mL/טוב המשקולת 48-ובכן המכיל את CD8+ T תאים (הריכוז הסופי של OLP DCs פעמו _pool הוא עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל, הריכוז הסופי של CD8+ T תאים הוא 5 x 106 תאים למ"ל, הריכוז הסופי של il-2 הוא 25 U/mL והריכוז הסופי של IL-7 הוא 50 U/mL). התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
  • יום 4, להסיר, למחוק כ-400 μL של המדיום תרבות ולהוסיף 500 μL של המדיום ללא סרום טריים המכילים 100 U/mL il-2 ו- 100U/mL של IL-7 כדי מכל קידוח. דגירה התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
  • ביום 7 או 8, לעורר מחדש את CD8 OLP_pool-איפה זה מונח+ T תאים עם OLP_pool.

    • 3. לרסטימולציה של CD8 להתקפת+ T תאים מקרופאגים פעמו עם OLP_pool

    1. ארבעה ימים לפני גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool+ T תאים, להכין 2% (v/v) לזיהוי חרוז פתרון: לשטוף 2 גר' לזיהוי חרוזים פעמיים ב- 20 mL ללא אנדוטוקסין H2O או PBS. גלולה את החרוזים לזיהוי על ידי צנטריפוגה (400 x גרם) במשך 5 דקות, resuspend ב 100 מ של PBS. אוטוקלב-15 ליברות/m עבור 20 דקות החנות בטמפרטורת החדר.
    2. מזריקים עכברים intraperitoneally 1 mL/עכבר של הפתרון חרוז לזיהוי 2% סטרילי כדי למשוך את ההעברה של monocytes/מקרופאגים חלל הצפק ה-16.
    3. ארבעה ימים לאחר מכן, להקריב את החיות כתוצאה ממנת יתר של2 CO.
      1. תחת תנאים סטריליים, לחתוך פתיחה קטנה במרכז הבטן כך הפתיחה הוא מספיק על העברת פיפטה העברה של 5 מ"ל. למלא את פיפטה העברה עם RPMI-0 והכנס את פיפטה לתוך חלל הבטן דרך הפתח.
      2. יש לשטוף את חלל הבטן על ידי pipetting. פיפטה החוצה כמה שיותר נוזלים ככל האפשר מתוך חלל הבטן לתוך צינור סטרילי (אלו מקרופאגים הצפק). חזור על השלב שטיפה 4 - 5 פעמים.
    4. . להאיר את המקרופאגים הצפק עם 3000 ראד...
      1. לחלופין, פנקו את המקרופאגים הצפק עם מיטומיצין C (בצע ההליך המתואר בסעיף 2.2 שלב).
    5. התאם את ריכוז מקרופאגים הצפק 5 x 106 תאים/מ ל מדיום נטול סרום. הוסף מלאי OLP_pool (ריכוז דימתיל סולפוקסיד הסופי הוא פחות מ 1%) ו- M-CSF (ריכוז סופי = 100 U/mL).
      הערה: במחקר זה ש א OLP ', השתמשנו דימתיל סולפוקסיד 0.5%. לפיכך, ש א OLP_pool המניה היה מדולל 200 x (למשל 1 μL של OLP_Pool ש א מניות נוספה לתוך 199 μL של מקרופאגים הצפק). לפיכך, הריכוז הסופי של כל OLP היה 4.2 μg/mL).
    6. הוסף μL 200 / (1 x 106 תאים/טוב) טוב בצלחת תרביות רקמה 48-ובכן, דגירה את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 שעות.
    7. הסר את התאים שאינם מחסידי וחרוזים לזיהוי על ידי שטיפה עדין עם μL 200/טוב של ומחוממת מראש RPMI-0.
    8. לאסוף ובריכת OLP_pool טענתי CD8+ T תאים מ- 2.10 שלב. להתאים OLP_pool בשלה CD8+ תא T ריכוז עונה 1 פרק 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 25 U/mL il-2 ו- 50 U/mL של IL-7. להוסיף 1 mL/היטב הצלחת 48-ובכן זה מכיל מקרופאגים הצפק פעמו OLP_pool.
    9. כעבור ארבעה ימים לחדש המדיום בצלחת 48-. טוב. להסיר ולמחוק כ-400 μL של המדיום תרבות לוחית התרבות 48-. טוב. להוסיף 500 μL של טרי בינוני ללא סרום המכיל 100 U/mL il-2 ו- U/mL 100 של IL-7 כל טוב. התרבות התאים-CO 37 ° C ו-5%2.
    10. שלושה או ארבעה ימים מאוחר יותר, לבחון את CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ T תאים עבור תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת על ידי assay מקושרים-אנזים immunospot (ELISPOT). לאחר הנקודה הזו מחדש להמריץ את CD8+ T תאים כל 7-10 ימים.
      הערה: המקרופאגים עדיפים גירוי מחדש של CD8 טענתי OLP_pool+ T תאים. שמנו לב CD8+ T תאים מחדש מגורה על ידי מקרופאג גדל יותר DCs בתוך חוץ גופית.

    4. קביעת OLP_pool ספציפיים, התגובה Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ תא T קו

    הערה: תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ תא T קו נקבעת על-ידי הפרשת IFNγ בעקבות גירוי OLP_pool בנוכחות C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות וזמינותו של IFNγ ELISPOT. תאים C1R ניתן להשיג באופן מסחרי. C1R. Qa-1b תאים יכולים להיווצר על-ידי transducing תאי C1R עם וקטור lentiviral Qa-1.

    1. להוסיף 100 μL/טוב של נוגדן anti-IFN-γ לכידת מדולל במאגר ציפוי (PBS) הבארות של צלחת ELISPOT.
    חותם, דגירה את הצלחת ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
  • ביום השני, לבטל את המאגר ציפוי המכיל נוגדן anti-IFN-γ לכידת להוסיף 200 μL/היטב-blocking פתרון (ללא סרום בינוני), דגירה את הצלחת. בשביל 2 h בטמפרטורת החדר.
  • להאיר את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים עם 9,600 ראד.
    1. לחלופין, לפנק את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים עם מיטומיצין C כפי שמתואר על 2.2 שלב חוץ מזה זמן הטיפול יהיה 30 דקות.
  • להתאים את C1R ואת C1R. Qa-1b תאים במדיום נטול סרום 4 x 106 תאים/מ.
  • למחוק את הפתרון חסימה בצלחת ומוסיפים את C1R ואת C1R. תאים Qa-1b -50 μL/טוב (200,000 התאים היטב), לערבב.
  • מוסיפים μL 50/טוב של 100 x מדולל OLP_pool מניות (של המדיום ללא סרום) ומערבבים היטב. דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר במשך 2-3 h.
  • התאם את CD8 לרסטימולציה OLP_pool+ T תאים 1-2 x 106 תאים למ"ל במדיום נטול סרום המכיל 150 U/mL של IL-7 ולהוסיף μL 50/טוב (50,000-100,000 תאים/טוב) לצלחת. Centrifuge את הצלחת (58 x g) במשך 5 דקות.
  • דגירה לצלחת-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה.
  • האחות תא ההשעיה. רחץ בארות 2 פעמים עם מים (DI) יונים (250 μL טוב). לאפשר בארות כדי משרים למשך 5 דקות בכל שלב שטיפה.
  • תשטוף בארות 3 פעמים עם מאגר לשטוף אני (PBS המכילה 0.05% Tween20). לאפשר בארות להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה. מאגר השטיפה השלך.
  • להוסיף 100 μL של זיהוי נוגדנים מדולל במאגר דילול (PBS המכיל 10% סרום שור עוברית (FBS)).
  • דגירה הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים.
  • לבטל את זיהוי נוגדנים פתרון. רחץ בארות 3 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.
  • להוסיף 100 μL/טוב של אנזים המספר המשלים (Streptavidin-HRP) מדולל במאגר דילול-מטריים דילול.
  • דגירה הלוחות לשעה בטמפרטורת החדר.
  • למחוק פתרון תרכיב אנזים. רחץ בארות 4 פעמים עם 250 µL/טוב לשטוף את מאגר א לאפשר וולס להשריה עבור 1 דקות בכל שלב שטיפה.
  • רחץ בארות 2 פעמים עם µL 250/II מאגר לשטוף (PBS) טוב.
  • להוסיף 100 µL של פתרון המצע (לערבב טיפה 1 = 20 µL של AEC Chromogen עם 1 מ"ל של מצע AEC) כל טוב. לפקח על פיתוח ספוט למשך 5 עד 60 דקות.
  • כאשר התוצאות הרצויות מתחילים להופיע, להפסיק את התגובה המצע ע י שטיפת וולס עם מים מזוקקים.
  • מילה נהדרת הלוחות בטמפרטורת החדר במשך שעתיים או למשך הלילה עד שהכל יבש לחלוטין. הסרה של מגש פלסטיק תחת לוחיות הרישוי יקל על ייבוש. חנות צלחות בשקית ניילון אטומה בחושך עד זה ניתוח.
  • לספור נקודות באופן ידני על-ידי בדיקת במיקרוסקופ ויבתר או שימוש בקורא צלחת ELISPOT. לראות את התוצאה נציג באיור2.

    • 5. קביעת פפטידים OLP_pool הפרט אשר לעורר את הפרשת IFN-γ מוגבלת Qa-1 ב- CD8 OLP_pool ספציפיים+ קו תא T

    1. לקבוע את פפטידים בודדים כי לעורר את ספציפי OLP_pool, הפרשת IFN Qa-1-restrictred-γ ב- CD8 OLP_pool הספציפיים+ קו תא T באמצעות לעיל תיאר IFN-γ ELISPOT assay (הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים בשימוש ELISOPT assay היא μg/מ"ל). ראה תוצאות נציג באיור3.
      הערה: ספציפי OLP, Qa-1-restircted תגובה מוגדרת כתגובה זה לפחות שלוש פעמים של התגובה בנוכחות C1R. Qa-1b תאים אבל בלי את OLP. מחקר ש א OLP, OLP68, OLP96 ו OLP105 כל הקריטריונים הללו. לכן, כל OLPs שלוש העלולים להכיל Qa-1 epitopes12 (איור 3). עם זאת, OLP105 בעקביות התפללתי התגובה החזקה; לפיכך ביצענו ניתוח מפורט של OLP105 (איור 4 , איור 5)12.

    6. זיהוי של Epitope Qa-1 אופטימלי ב- OLP 15-מר אשר מעוררת את התגובה Epitope ספציפיים, Qa-1-מוגבלת CD8 ספציפי OLP_pool+ קו תא T

    1. לסנתז C - ו N-סופני נחתך פפטידים של OLP 15-mer כפי שמוצג באיור4.
    2. לבחון את הפרשת IFN-γ ב CD8 ספציפי OLP+ תא T קו על ידי גירוי של CD8+ T תאים עם כל אחד של פפטידים קטום, כמו גם את OLP 15 הורים-מר בנוכחות C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות לעיל תיאר assay IFN-γ ELISPOT. הריכוז הסופי של כל פפטיד בודדים המשמשים את הבדיקה ELISPOT היא μg/מ"ל. פפטיד מוגדר של האופטימלית epitope Qa-1 אם פפטיד: 1) בעקביות נותן תגובה IFN-γ דומים או חזקה יותר, לעומת 15-מר פפטיד המקורי, בנוכחות C1R. Qa-1b תאים; 2) הוא בין 8 - 10-mer (פפטיד 9-מר העדיף) אשר הם המרחק פפטיד מאוגדים MHC-אני מולקולות15,17. ראה התוצאות נציג באיור5.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    העיצוב של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון

    החל קצה אמיני של חלבון, כל פפטיד הוא 15 חומצות אמינו (15-mer). לפיכך, פפטיד הראשון מתפרשת על עמדה 1 לעמדה 15. N-הסופית של פפטיד השני חופף קצה קרבוקסילי של פפטיד הראשון החומצה אמינית 11. לפיכך, פפטיד השני מתפרשת על המיקום 5 למיקום 19. לעצב את שארית פפטידים לסוף קרבוקסילי של החלבון (איור 1). בחרנו את ספריית 15-מר כי אנחנו ואחרים הראו כי 15-מר פפטידים, בעת הוספת תאים דנדריטים (Dc) או מקרופאגים, יכול להיות יעיל מעובד epitopes להכרה על ידי CD8+ T תאים14,15. מספר OLPs בספריה תלויה האורך של חלבון. בנוסף, OLP האחרון יכול לנוע בין 12 עד 15-מר בהתאם לאורך של החלבון. לדוגמה, המיאלין אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א) הוא בעל אורך של חומצות אמינו 247. ספריית OLP ש א מכיל 59 OLPs12. נציג התוצאות שהוצגו בכתב יד זה הן מניתוח של הספרייה ש א OLP.

    קביעה של תגובה ספציפית OLP_pool, Qa-1-מוגבלת CD8 מגורה-OLP_pool+ קו תא T

    יצרנו CD8+ קו תא T הייתה בשלה מאת Kב- /-Db-/- DCs פעמו עם ש א OLP_pool (MOG_pool) ואת לרסטימולציה על-ידי פעמו MOG_pool Kb-/-Db-/- הצפק macrophages כפי שמתואר פרוטוקול הנ ל (פרוטוקול 1, 2 ו- 3). כדי לקבוע את פוטנציאל תגובה ספציפית MOG_pool, Qa-1-מוגבלת CD8 הזה+ תא T קו, בדקנו את התגובה של CD8 הזה+ תא T לתור MOG_pool בנוכחות או C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות וזמינותו IFN-γ ELISPOT (איור 2) (פרוטוקול שלב 4). הנתונים שלנו הראה כי את CD8 מגורה-MOG_pool+ קו תא T מופרש רמה נמוכה של IFN-γ בנוכחות C1R. Qa-1b תאים (במקום 32 ויוצרים תאים או SFCs) אך לא תאים C1R (2 SFCs), מציע את הנוכחות של CD8+ T תאים אשר הגיב ל Qa-1-איגוד epitopes שמקורם תאים C1R (תאים C1R הם תאים אנושיים של lymphoblastoid B). SFCs היו גדל כאשר MOG_pool נוספה לתוך הבאר שהכיל תאי C1R (78 SFCs), מציע את הנוכחות של CD8+ T תאים אשר הגיבו epitopes הלא-Qa-1. SFCs היו גדל באופן דרמטי כאשר MOG_pool נוספה לתוך הבאר שהכיל C1R. Qa-1b תאים (320 SFCs), מציע את הנוכחות של CD8+ T תאים אשר הגיב ל Qa-1-איגוד פפטידים. הנתונים גם להוכיח כי MOG_pool מכיל Qa-1-איגוד epitope(s).

    הנחישות של פפטידים בודדים ב- OLP_pool אשר תורמים הפרשת IFN-γ Qa-1-מוגבלת ב CD8 תגובתי OLP_pool+ קו תא T

    כדי לקבוע את פפטידים OLP_pool אשר גירוי הפרשת IFN-γ Qa-1-מוגבלת ב- CD8 MOG_pool-ריאקטיבי+ תא T קו, אנו מגורה של CD8 תגובתי MOG_pool+ T תאים עם הפרט 59 OLPs בנוכחות או C1R או C1R. Qa-1b תאים (איור 3) (פרוטוקול שלב 5). הנתונים שלנו הראה כי SFCs האחרונים נצפתה הבארות שהכיל תאים C1R, את OLPs. לעומת זאת, SFCs גדל בבארות כל שהכיל C1R. Qa-1b והתאים את OLPs. איור 2, ואנחנו למדנו CD8+ T תאים בנוכחות C1R. Qa-1b לבדו נוצר גם SFCs. לכן, SFCs מוגברת במרבית הבארות יכול להיות בגלל שאינם ספציפיים גירוי כתוצאה המצגת של Qa-1 epitopes נגזר חלבונים תאיים בתאים C1R על ידי מולקולות Qa-1. עם זאת, OLPs ב הבארות ממוסגרת 3 ב איור 3C (B8, D12 ו- E9), אשר מתאימים 3 מסומן OLPs ב איור 3A (OLP68, OLP96 ו OLP105), פגש את הקריטריון להגדרת מענה IFN-γ OLP ספציפיים, Qa-1-מוגבלת כמו תיאר שלב 5.1 פרוטוקול12. הנתונים מראים כי OLPs 3 מכילים Qa-1 epitope(s). מאז OLP105 המיוצר באופן עקבי את ההיענות הגבוהה, ביצענו ניתוח מפורט של OLP10512.

    העיצוב של ספרייה פפטיד קטום עבור OLP 15-מר

    OLP 15-מר, אשר נקבע כדי לעורר הפרשת IFN-γ Qa-1-מוגבלת ב- CD8 תגובתי OLP_pool+ תא T קו, צריך להיות מנותח עבור epitope אופטימלי באמצעות ספריה פפטיד קטום. ספריית פפטיד קטום כזה הוא תוכנן על ידי בהדרגה לחתוך את OLP 15-מר על ידי חומצת אמינו 1-שלה N - ו C-termini (איור 4). דומה לזו MHC מחלקה אני מולקולות, Qa-1 מולקולות בעיקר לאגד 8 - 10-מר פפטידים. לכן, אנו ממליצים כי פפטיד קטום הקצר ביותר הוא 6-מר אורך.

    זיהוי של epitope Qa-1 אופטימלי ב OLP 15-מר אשר מעוררת הפרשת IFN-γ Qa-1-מוגבלת ב CD8 תגובתי OLP_pool+ קו תא T

    הנ ל N - ו C-סופני נחתך פפטידים נבדקים על כוחו מגרה הפרשת IFN-γ ב- CD8+ תא T שורה ספציפית את OLP_pool או את OLP 15-מר באמצעות ELISPOT של IFN-γ שתוארו לעיל. במחקר של Qa-1 epitopes ש א12, יצרנו CD8+ קו תא T זה היה ספציפי OLP105 ש א (איור 5A). ניתוח נוסף הראה כי N-סופני קטום 9-מר פפטיד עומדת בקריטריונים האופטימלית epitope כמו שתי שמתואר בשלב פרוטוקול 6.2 (איור 5B). לכן, הגענו למסקנה כי N-סופני נחתך 9-מר פפטיד היה האופטימלית epitope Qa-1.

    Figure 1
    איור 1: עיצוב של ספריית OLP כיסוי לכל האורך של חלבון. החל קצה אמיני, פפטידים של 15 אורך חומצת אמינו (15-mer) זוהו.N-הסופית של כל פפטיד, למעט פפטיד הראשון, חפפו את קצה קרבוקסילי של פפטיד הקודם על ידי 11 חומצות אמינו.

    Figure 2
    איור 2: גירוי MOG_pool CD8+ T תאים היו חלקית MOG_pool ספציפיים והגבילה Qa-112. במבחנה CD8+ T תאים מגורה על ידי OLP_pool ש א (MOG_pool) נבדקו לצורך בתגובה MOG_pool בנוכחות או C1R או C1R. Qa-1b תאים אנטיגן הצגת תאים באמצעות וזמינותו של IFN-γ ELISPOT. נציג ELISPOT תמונות מוצגות. מספרים של המקום ויוצרים תאים (SFCs) מוצגים בפינות השמאלית העליונה של כל טוב. CD8+ T תאים: תאים 50,000/טוב. C1R או C1R. Qa-1b תאים: תאים 200,000/טוב.

    Figure 3
    איור 3: ניתוח של OLPs ב MOG_pool אשר היו אחראים על ה-Qa-1 מוגבל לתגובה. פריסה (א) של צלחת V-התחתון 96-ובכן שהכיל את 10 מ"ג/מ"ל OLPs ש א בודדות. מספרים הבארות ייצג את תעודות הזהות OLP. הבארות 3 המסומן הכיל את OLPs פגשתי את קריטריון מענה IFN-γ OLP ספציפיים, Qa-1-מוגבלת כפי שמתואר בשלב 5.1 פרוטוקול12. (B) SFCs נציג כל היטב שהכיל את OLP של (הריכוז הסופי = 4.2 μg/mL, OLP מזהה תואם את זה ב- "A"), CD8 תגובתי MOG_pool+ T תאים (50,000 תאים טוב) ותאים C1R (200,000 התאים היטב). (ג) SFCs נציג כל היטב שהכיל את OLP של (הריכוז הסופי = 4.2 μg/mL, OLP מזהה תואם את זה ב- "A"), תגובתי MOG_pool CD8+ T תאים (50,000 תאים טוב), ו- C1R. Qa-1b תאים (200,000 התאים היטב). הבארות ממוסגרת 3 הכיל את OLPs פגשתי את קריטריון OLP ספציפיים, Qa-1-מוגבלת IFN-γ תגובה12. הדמות כבר ממאמרו של הפניה12. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 4
    איור 4: עיצוב של פפטידים קטום של פפטיד 15-מר. פפטיד 15-מר בהדרגה נחתכה ב שלה N - ו C-termini על ידי חומצת אמינו 1 ל 6-מר. את 15-mer, פפטידים קטום שלה היו אז מסונתז. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Figure 5
    איור 5: ניתוח של epitope Qa-1 אופטימלי ב- OLP105. (א) CD8 מגורה-OLP105+ תא T קו נבחנה על התגובה אל OLP68, OLP96, OLP105 בנוכחות C1R או C1R. Qa-1b תאים באמצעות ELISPOT של IFN-γ וזמינותו. SFCs נציג IFN-γ (מספרים בפינות השמאלית העליונה) מוצגים. (B) CD8 ספציפי OLP105+ תא T קו, כפי שמוצג (א), נבדקה על תגובתה פפטידים בודדים N - ו C-סופני נחתך, כפי שמוצג באיור 4, בנוכחות C1R. Qa-1b תאים באמצעות וזמינותו IFN-γ ELISPOT. OLP105: OLP 15-מר. N6-14: N-סופני נחתך OLP105 פפטידים. C6-14: C-סופני נחתך OLP105 פפטידים. CD8+ T תאים: תאים 50,000/טוב. C1R. Qa-1b תאים: תאים 200,000/טוב. מספרים העליון השאיר פינות היו SFCs לכל 50,000 CD8+ תאי T. מלבן אדום מסומן הבאר בכל הקריטריונים להגדרת של האופטימלית epitope Qa-1 ב- OLP כפי שמתואר בשלב פרוטוקול 6.2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    . הנה, תארנו פרוטוקול לניתוח Qa-1 epitopes של חלבון. ביחס פרוטוקול זה, מספר אסטרטגיות אחרות גם דווחו בעבר. ראשית, allogeneic CD8+ תא T קווים שיבוטים שימשו לצורך זיהוי ה1-אותה לא ישכחו במהרה. שנית, מוטיב Qa-1-איגוד בשם מניתוח המצב אותה לא ישכחו במהרה שימש לצורך הזיהוי של HSP60p216-224,9,epitope TCRBV8.118. שלישית, בודדים פפטידים חופפים של חלבון שימשו כדי לחסן את בעלי החיים. לאחר מכן, CD8+ T תאים מבודדים מן החיות immunized שימשו כדי לזהות את TCRBV8.2 פפטיד p42-50 שקובעה לאחר מכן עבור איגוד Qa-16,10,19. CD8 הרביעי, פונקציונלי+ תא T קווים בשילוב עם cDNA התצוגה הספרייה שימשו לצורך זיהוי ה epitope FL9 Qa-14.

    התייחסות הטכניקות הקודמות, השימוש של allogeneic CD8+ תא T קווים, שיבוטים מאי לא יהיה מתאים לניתוח epitopes Qa-1 המוצגים במהלך תגובות פיזיולוגיות של מערכת החיסון. בנוסף, צבירת נתונים מראים כי המוטיב שתואר לעיל מחייב באופן חלקי בלבד ייצגו הקיבולת מחייב פפטיד של מולקולות Qa-1. לכן, המוטיב Qa-1-איגוד המדויק עדיין לא ידוע4. יתר על כן, חיסון עם פפטיד הפרט לצורך זיהוי Qa-1 epitopes היא מייגעת. לבסוף, אסטרטגיה ספריית cDNA התצוגה כרוכה הבנייה של וקטורים רבים שנושאים באורכים שונים פפטיד עבור תאים תקנים. לעומת זאת, האסטרטגיה ספריית OLP המתוארים כאן היא פשוטה, פפטידים ממופה ידועים כדי לעורר CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים. לכן, האסטרטגיה שלנו יש יתרון ייחודי.

    האסטרטגיה המתוארים כאן משתמש ספציפי OLP_pool CD8+ T תאים אשר נוצרים על ידי במבחנה לקרקע לרסטימולציה. מקור חלופי של CD8+ T תאים יכול להיות מפני ניקוז הלימפה של kb-/-Db-/- עכבר כי הוא חיסון עם מקור חלבון20. כזה CD8 המערכת החיסונית+ T תאים ואז תוכל להיבדק IFN-γ של תגובות OLPs, פפטידים קטום לצורך זיהוי Qa-1 epitopes. באופן תיאורטי, ה- ויוו CD8 המערכת החיסונית+ T תאים קרובים למצב פיזיולוגי מאשר ה במבחנה שנוצר CD8+ T תאים. עם זאת, מצאנו כי התגובה של המערכת החיסונית CD8+ T תאים ישירות מטוהרים של עכברים לחסן היה חלש ולא נדרש לעיתים קרובות במבחנה restimulations עבור פפטיד משביע רצון הקרנת תוצאה. בנוסף, פרוטוקול זה מיועד תרגום בעתיד ללמוד האנושית של epitopes הלע-E שבה אין ויוו התחסנות אינה מעשית.

    טכנית, החלק הקריטי של פרוטוקול זה הוא הדור של CD8+ תא T קווים זה הן ספציפיות של OLP_pool או של OLP בודדים. מאז 1/Qa-פפטיד קומפלקסים יציבים לעומת קומפלקסים קלאסית MHC-אני/פפטיד21, לאחר תאים המציג אנטיגן הם פעמו עם OLPs או פפטיד, התאים פעמו צריך לשטוף בהרחבה. מצאנו כי פעמו פפטיד תאים, אם שטף בהרחבה, להפסיד או להפחית באופן משמעותי את היכולת לעורר CD8+ T תאים. לכן, אנו ממליצים לשטוף את הצגת אנטיגן פעמו פפטיד תאים פעם מיד. לפני שהם תרבותי משותף עם CD8+ T תאים.

    בנוסף, בגלל חוסר היציבות של מתחמי Qa-1/פפטיד, אנו ממליצים השימוש של מדיום ללא סרום עבור הפועמים פפטיד הגירוי של CD8+ T תאים. בנוסף, אנחנו באופן קבוע להוסיף 50 U/mL של IL-7 במהלך CD8+ T תרבית תאים וכן במהלך ELISPOT IFN-γ וזמינותו. המטרה של IL-7 היא לשמור את הכדאיות והתפקוד של CD8+ T תאים. IL-7 על ידי עצמו לא לעורר CD8+ T תאים כדי לייצר IFN-γ.

    בדומה לכל אסטרטגיות, Qa-1 epitopes ממופים באמצעות אסטרטגיה זו גם לדרוש בהמשך החקירה מובהקות ביולוגי. לדוגמה, שאלה חשובה אחת היא אם epitope ממופה ניתן להציג פיזיולוגית. כדי להתייחס לשאלה זו, DCs יכול להיות transduced עם וקטור lentiviral המבטאת החלבון מקור epitope (למשל מחקר ש א ב OLP ש א ה). לאחר מכן, התגובה של CD8 ספציפי epitope+ T תאים אוגי transduced נבדק. תגובה חיובית מרמז כי epitope ניתן מבחינה פיזיולוגית לעבד ולעדכן שהוצגו על-ידי בקרי קבוצת מחשבים. בנוסף, תוצאות תפקודי בעקבות ההכרה epitope על ידי CD8+ T תאים יש להוסיף ולחקור. בהקשר זה, הבדיקות של epitopes אותה לא ישכחו במהרה ו- FL9 Qa-1 הובילו למסקנה כי מולקולות Qa-1 חשובים עבור מעקב המערכת החיסונית1,4. בנוסף, המחקרים של HSP60p216, פפטיד TCRBV8.1, p42-50 והובילו למסקנה הזאת CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים לווסת את תגובות מערכת החיסון באמצעות מיקוד CD4 פתוגניים+ T תאים 6,7 9, ,19. יתר על כן, המחקר של ש א196 יש בפעם הראשונה גילה כי CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים לווסת תגובות מערכת החיסון על ידי מיקוד ישירות טישו כדי למנוע נזק על ידי תאי חיסון פוטנציאל החולני12 . לבסוף, אנליזה פונקציונלית של CD8 ספציפית epitope, Qa-1-מוגבלת+ תא T יכול להיות נעזר tetramer. Tetramer כזה יכול להיות מיוצר NIH tetramer הליבה מתקן (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) או חברה. כדי לבקש את הדור של tetramer, אחד עשוי לשלוח פונקציונלי הנתונים התומכים קשירה של epitope Qa-1 אופטימלית לאחרונה ממופה ל Qa-1 חלבון לאישור שלהם לדור של tetramer Qa-1.

    לסיכום, מחקרים קודמים הדגימו את CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים לשחק תפקיד חשוב בוויסות תגובות מערכת החיסון המקומית12. בהקשר זה, רקמת נזק יכול להיגרם על ידי תגובה חיסונית זה במישרין אל הרקמה. בנוסף, נפגעים לא יכול להיגרם על ידי תגובה חיסונית שמכוונת את הפתוגן הפולש. לכן, להבין את התפקיד של CD8 Qa-1-מוגבל+ T תאים בשתי רקמות שונות נזקים חשוב עבור יישומים קליניים שלהם.כדי להשיג מטרה זו, נחוץ ניתוח מעמיק של Qa-1 epitopes העצמי-רקמה או של הפתוגן הפולש. פרוטוקול זה יהיה מתאים ניתוחים אלה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    המחברים מצהירים ללא ניגוד אינטרסים.

    Acknowledgments

    אנו מודים פנלופה גרסיה על הכנת כתב היד הזה וסיוע טכני שלה. עבודה זו נתמכה על ידי מחקר וחדשנות גרנט (מעטה) מ במחלקה לרפואה באוניברסיטת לומה לינדה (681205-2967), מענק פיילוט מהחברה טרשת הלאומי (PP1685) XT.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

    Tags

    אימונולוגיה גיליון 130 חופפים פפטיד רגולציה מורכבת הלע-E המערכת החיסונית histocompatibility הגדולות Qa-1 nonclassical מעקב המערכת החיסונית
    ספריית פפטיד חופפים למפות Epitopes Qa-1 בחלבון
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J.,… More

    Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter