Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane

Published: December 20, 2017 doi: 10.3791/56401
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1
1Department of Medicine, Division of Regenerative Medicine, Loma Linda University
* These authors contributed equally

Summary

Qa-1 (HLA-E insan) klasik olmayan MHC kompleksi 1b molekülleri bir gruba ait. Bağışıklama Qa-1-bağlama epitopları ile doku özgü bağışıklık yönetmelik çoğaltmak ve birkaç otoimmün hastalıkları iyileştirmek için gösterilmiştir. Burada biz bir protein Qa-1 epitopları tanımlanması için çakışan bir peptid Kütüphane strateji tanımlarlar.

Abstract

Qa-1 (HLA-E insan) (MHC-IB) molekülleri klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Son veriler ortaya koymaktadır Qa-1 moleküller hücreleri yapısal ve işlevsel bütünlüğü için ölçme, bağışıklık yönetmelik inducing ve viral enfeksiyonlara karşı bağışıklık yanıtı sınırlayan önemli rol oynarlar. Ayrıca, Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonel büyütme+ T hücreleri epitope bağışıklama birkaç otoimmün hastalığı hayvan modellerinde, örneğin deneysel Alerjik ensefalomiyelit, tedavi edici etkileri göstermiştir kollajen kaynaklı artrit ve obez olmayan diyabet. Bu nedenle, çok verimli ve hızlı bir şekilde işlevsel Qa-1 epitopları bir protein belirlemek için bir yöntem için acil bir ihtiyaç. Burada, Qa 1 kısıtlı CD8 kullanan bir iletişim kuralı tarif+ T hücre hatları belirli bir protein Qa-1 epitopları belirlenmesi için çakışan peptid (OLP) kitaplık. Bir protein tüm uzunluğu kapak 15-mer örtüşen peptidler bu OLP kitaplığı içerir ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından örtüşmesi. Bu iletişim kuralını kullanan, biz son zamanlarda bir 9-mer Qa-1 epitope miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) olarak tespit edilmiştir. Bu yeni eşlenen MOG Qa-1 epitope epitope özgü, Qa 1 kısıtlı CD8 ikna etmek için gösterildi+ T hücreleri bu gelişmiş miyelin özgü bağışıklık yönetmelik. Bu nedenle, bu iletişim kuralını roman hedeflerinden gelecekteki inceleme ve CD8 Qa 1 kısıtlı işlevler için yararlıdır+ T hücreleri.

Introduction

Qa-1 (MHC-IB) molekülleri farelerde klasik olmayan MHC kompleksi 1b grubuna aittir. Onun insan homolog olan HLA-E. Önceki kanıt Qa-1 molekülleri önemli biyolojik fonksiyonları var göstermiştir. İlk olarak, Qa-1 molekülleri hücreler yapısal ve işlevsel bütünlüğü için Etüt önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, Qa-1 moleküllerin hücrenin normal işlevi izlemek için çeşitli stratejiler gelişmiştir. Bu tür bir strateji Qa-1 moleküllerine formu kompleksleri ile işlenmiş lideri peptid (epitope), endoplazmik retikulum1klasik MHC-IA molekülleri üzerinden işlenir Yani Qa-1 determinant değiştirici (Qdm) sağlar. Daha sonra bu Qa-1/Qdm komplekslerin bir hücre yüzeyinde görüntülemek ve NK hücreleri üzerinde inhibitör NKG2A reseptörleri etkinlik2öldürme NK etkisizleştirmek için bağlayın. MHC-IA molekülleri ifade kaybolursa, bir hücre (örneğin bir malign hücre) NK2öldürmek için duyarlı hale gelir. Diğer strateji yeni Qa-1/epitope kompleksleri eksik DOKUNUN (taşıyıcı antijen işleme ile ilişkili) bir hücre yüzeyinde oluşturmak Qa-1 molekülleri sağlar3 ve/veya ERAAP (ile ilişkili endoplazmik retikulum aminopeptidaz antijen işleme)4 (her iki eksiklikleri Malign hücrelerde genellikle oluşur). Bu yeni Qa-1/epitope komplekslerin ifade hücre daha sonra tanınan ve epitope özel Qa 1 kısıtlı CD8 tarafından ortadan+ T hücreleri. İkinci olarak, Qa-1 molekül immün yönetmelik5ikna etmek. Bu bağlamda, Qa-1/epitope kompleksleri CD8 uyarmak gösterilmiştir+ immün aracılı hasara öz-doku6,7,8 önlenmesi için önemlidir düzenleyici T (Treg) hücreleri ,9,10. Üçüncü olarak, Qa 1 kısıtlı CD8+ Treg hücreler viral enfeksiyon11karşı bağışıklık yanıtı sınırlamak için gösterilmiştir.

Bu nedenle, belirli büyütme epitope özgü Qa-1-restrictred CD8+ T hücreleri anormal hücreler ortadan kaldırılması, bağışıklık düzenleme geliştirme ve büyüklüğü kontrolünü potansiyel olarak umut verici bir strateji olduğunu immün yanıt-e doğru virüs kaynaklı. Süre o olup olmadığını tespit değil büyütme epitope özgü CD8 Qa 1 kısıtlı,+ T hücreleri bağışıklık gözetim geliştirmek ve virüs kaynaklı bağışıklık yanıtı sınırlamak, laboratuarlarımızda ve diğerleri bu açıkça göstermiştir Qa-1 epitopları ile bağışıklama Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonu çoğaltmak+ Treg hücreler belirli patojenik otoimmün CD4 için+ T hücreleri CD4 verimli denetimine lider,+ T Hücre-aracılı otoimmün hastalıklarda bir hayvan çeşitli modeller deneysel Alerjik ensefalomiyelit (insan multipl skleroz bir hayvan modeli)6,10gibi kollajen kaynaklı artrit (bir hayvan modeli insan romatoid artrit)7, ve obez olmayan diyabet (bir hayvan modeli insan tip 1 diyabet)8. Buna ek olarak, biz bir doku özgü Qa-1 epitope ile bağışıklama immün aracılı iltihap o doku CD8 büyütme ile ayrıntılı denetim yol açar keşfettim+ Treg hücreler12. Preklinik çalışmalar yukarıdaki başarıları Qa-1 epitope bağışıklama immün aracılı doku özgü hastalıkların tedavisi için ve potansiyel DOKUNUN eksiklikleri ile ilişkili diğer hastalıkların tedavisi için tam bir değerlendirme için bir ihtiyaç gösterir ve ERAAP.

Buna göre güvenilir ve hızlı bir şekilde Qa-1 epitopları bir protein çözümleyebilirsiniz bir teknoloji için bir talep vardır. Bu bağlamda, biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları sınırlı sayıda tarif edilmiştir. Bu Qa-1 epitopları çoğunu serendipitously CD8 çalışma sırasında tespit edildi+ T hücre yanıt bakteri13, hücre DOKUNUN3' te eksik, hücreleri ERAAP4' te eksik ve EAE6, neden olan hücreleri 9. Bu nedenle, bir yüksek üretilen iş teknik biyolojik olarak önemli Qa-1 epitopları tanımlanmış bir protein tanımlanması için arzu edilir. Aşağıda, biz fonksiyonel Qa-1 epitopları Qa-1-resrticted CD8 kullanarak bir protein haritalar örtüşen bir peptid (OLP) Kütüphane strateji tanımlarlar+ T hücre hatları belirli bir protein OLP Havuzu (OLP_pool) için.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneylerin bir kurumsal hayvan bakım ve kullanım Protokolü hayvan bakım ve El Paso ve Loma Linda Üniversitesi'nde Texas Üniversitesi'nde kullanım Komitesi tarafından onaylanmış uygun olarak yapıldı.

1. nesil bir Protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphane

  1. Bir OLP kitaplığı içindeki tüm peptidler 15-mer uzunluğu ve bitişik peptidler 11 amino asitler tarafından üst üste tasarlayın.
    Not: MOG OLP çalışmada, MOG habercisi [Mus musculus] dizisi NCBI protein bu bağlantıyı takip ederek veritabanından: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/NP_034944. Bildirilen Qa-1 (HLA-E) epitopları çoğunu sinyal peptidler (örneğin Qdm1) yerleşmişti çünkü gerçekleştirdiği sinyal ve olgun peptidler, MOG habercisi (247 amino asitler), kullanıldı. Öyle ki iki bitişik peptidler 11 amino asitler (şekil 1) tarafından üst üste onun N-terminus adlı başlayarak, 15-mer peptidler dizisi tespit edilmiştir. Bu nedenle, tam 59 OLPs 247 amino asit MOG habercisi tespit edilmiştir. Ancak, son OLP 12'den 15-mer protein uzunluğuna bağlı olarak değişebilir. Buna ek olarak, biz ve diğerleri 15-mer peptidler, dendritik hücreler (DC) veya makrofajlar, eklendiğinde verimli olabilir göstermiştir çünkü biz 15-mer kitaplığı seçin epitopları tanıma içine CD8 tarafından işlenmiş14,15+ T hücreleri .
  2. Her bireysel peptid ticari olarak satın alabilirsiniz. 5 mg-peptid tarama için yeterli olmalıdır. OLPs ve kesilmiş peptidler (adım 6.1) desalted peptidler (yaklaşık 50-%70 saflık olduğunu) olabilir. Tetramer nesil için ve gelecekteki biyolojik analizleri için kullanılacak en iyi peptid (adım 6.2) saflığı olmalıdır > % 90. Peptidler steril koşul altında yeniden oluşturma.
  3. 50 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri % 100 DMSO içinde olun. Her peptid, 5 mg eklemek için DMSO 100 μL her tüpün içine karıştırın ve peptidler-20 ° C'de depolayın Bu hisse senetleri CD8 üretimi için bir OLP_pool stok yapmak için kullanılan+ T hücre hatları OLP_pool için reaktif. Buna ek olarak, bu hisse senetleri de 10 mg/mL bireysel peptid hisse senetleri Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool reaktif CD8 uyarmak için her bireysel peptid yeteneklerini belirlemek için yapmak için kullanılmasını+ T hücre satırı.
  4. Taze bir tüpün içine her peptid eşit bir hacmi ekleyerek yapmak OLP_pool hisse senedi. Bu OLP_pool hisse senedi % 100 DMSO içerir. MOG OLP çalışmada, 59 OLPs12vardı. Bu nedenle, OLP_pool her peptid konsantrasyon 847.46 μg/mL (50 mg/mL ÷ 59) oldu.
  5. 10 mg/mL bireysel peptid stokları sulandrarak (5 x) yapmak steril H2O bir V-alt 96-şey plaka (Bu hisselerin % 20 DMSO içerir) 50 mg/mL stoklarımızda. Çünkü her bireysel peptid Qa-1-sınırlı tepki belirlenmesi 8 veya 12 kanal çok kanallı pipet kullanarak bir 96-şey tabak içinde gerçekleştirilecek bu stokları bir 96-şey tabak içinde olun.
    Not: OLPs ve kesilmiş peptidler, dahil olmak üzere tüm peptidler, ya bir V-alt 96-şey tabak içinde seyreltilmiş veya peptid Kütüphane tarama 96-şey levha bir çok kanallı pipet kullanarak gerçekleştirilen bu yana bir 96-iyi örnek raf 1 mL tüpler ile dolu. Bir peptid sulandırmak zor yoksa 1 N NaOH damla peptid dağıtılması yardımcı olmak akıllıca ekleyin.

2. Astar kb-/- Db-/- CD8+ OLP_pool Geniş puls K T hücrelerleb-/- Db-/- dendritik hücreler (DC).

Not: İki büyük Qa-1 gen vardır: biri Qa-1birve diğer Qa-1b. Akademik araştırmalar için yaygın olarak kullanılan hayvanlar beri örneğin C57BL/6 ve Balb/c fare, carry Qa-1b, bu iletişim kuralı için eşleme Qa-1b epitopları bir protein ile ilgili yordamı açıklamaktadır. CD8+ T bu protokol için kullanılan hücre K safb-/-Db-/- hangi CD8 (C57BL/6 arka plan) farelerde+ T hücreleri Qa-1 de dahil olmak üzere çoğunlukla klasik olmayan MHC-IB moleküller tarafından kısıtlanmış.

  1. Kemik iliği türevi DCs yukarıda açıklanan12olarak üretmek.
    1. Kısaca, RPMI-10 Orta (% 10 fetal sığır serum, 5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma RPMI 1640) kemik iliği tek hücre süspansiyonlar (1 x 106 hücre/mL) kültür 10 U/mL Il-4 ve 100 U/mL GM-CSF 37 ° c, % 5 CO26-şey plaka (4 mL/de) içeren.
    2. İki gün sonra yapışık olmayan hücreleri dikkatli bir şekilde çıkarın ve taze medya ve sitokinler ekleyin.
    3. Hücreleri başka bir iki gün sonra kültür, taze medya ve sitokinler yeni bir 6-şey plaka içeren yapışık olmayan hücreler aktarın.
    4. Hücreleri başka bir iki gün boyunca kültür ve taze medya ve LPS içeren sitokinler ile doldurulan (0.1 µg / DCs etkinleştirmek için mL).
    5. 24 saat sonra deneyler için DCs toplamak.
  2. DCs 3000 rad ile ışınlatayım.
    1. Alternatif olarak, mitomycin C ile DCs (5 x 107 hücre/mL) tedavi (50 μg/mL) PBS 20 dk. 37 ° C'de RPMI-0 (serum olmadan RPMI 1640) tüp (~ 12 mL) doldurun ve bir masa üstü santrifüj vasıl 300 x g. atma supernatants ve düşmanla 10 min için hücreleri spin eklemek t çamaşır yordamı iki kez daha. Bu üç yıkama kritik mitomycin C herhangi bir eser miktarda CD8 yanıt inhibe çünkü DC-T hücre ortak kültürü sırasında+ T hücreleri.
  3. DC konsantrasyonu 5 x 106 hücre/ml serum serbest bir ortamda (5.5 x 10-5 M 2-mercaptoethanol, 1 mM sodyum pyruvate ve 0,1 mM gerekli olmayan amino asit ile takıma AIM-V serum-Alerjik orta) ayarlayın.
  4. Öyle ki son DMSO konsantrasyonu % 0,5 (200 x) olacak % 100 DMSO, DC'ler için içeren OLP_pool hisse senedi çözüm ekleyin. MOG OLP çalışmada, OLP_pool her OLP konsantrasyonu 847.46 μg/mL vardı; Bu nedenle her OLP DC kültüründe son konsantrasyonu 4.2 μg/mL (847.46 μg/mL ÷ 200) oldu.
Ancak, hücre kültüründe DMSO konsantrasyonu % 1'den az olduğu sürece bu konsantrasyon 100 μg/mL kadar ölçeklendirilebilir.
  • 3 h için oda sıcaklığında DCs kuluçkaya ve hücreleri nazikçe her 15 dakika çalkalanır.
  • Bu kuluçka döneminde CD8 arındırmak+ T hücre hasat dalak veya lenf düğümleri kb-/-Db-/- ticari CD8 kullanarak fare+ T hücre arıtma kiti, hücre konsantrasyonu 10 x 106 hücre/ml ayarlayın 50 U/mL İnterlökin 2 (IL-2) ve 7 Il-100 U/mL içeren serum-Alerjik orta.
  • Şimdi, CD8 ekleyin+ T hücreleri içine 48-şey plaka olarak 0.5 mL/iyi (ek 0,5 mL/de Adım 2.8, CD8 son konsantrasyonu OLP_pool Geniş puls DCs, sonra+ T hücre-ecek var olmak 5 x 106 hücre/mL).
    Not: CD8+ T hücreleri fare dalak ve lenf bezleri saf üreticisi tarafından sağlanan öğretim takip ederek CD8 pozitif izolasyon Kit kullanarak. CD8+ T hücreleri elde boncuk ücretsizdir.
  • OLP_pool Geniş puls DC 2 x 106 hücre/mL serum-Alerjik orta için spin OLP_pool Geniş puls DCs (300 x g, 10 dk) RT. sulandırmak, aşağı ve 0,5 mL/iyi CD8 içerir 48-şey plaka eklemek+ T hücreleri (son konsantrasyonu OLP _pool Geniş puls DCs 1 x 106 hücre/mL, CD8 son konsantrasyonu olduğunu+ T hücreleri 5 x 106 hücre/mL, son IL-2 bölgedir 25 U/mL ise 7 Il-son konsantrasyonu 50 U/mL). 37 ° C ve % 5 CO2hücre kültür.
  • Günde 4, kaldırın ve kültür ortamının yaklaşık 400 μL atmak ve 100 U/mL IL-2 ve 100U/mL 7 Il-her şey için içeren taze serum-Alerjik orta 500 μL ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2hücreleri kuluçkaya.
  • Günde 7 veya 8, OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarmak+ T hücreleri ile OLP_pool.

    • 3. astarlanmalıdır CD8 restimulation+ T hücreleri makrofajlar ile geniş puls ile OLP_pool

    1. Dört gün önce yeniden OLP_pool astarlanmalıdır CD8 uyarılması+ T hücreleri, %2 (v/v) polyacrylamide boncuk çözüm hazırlamak: endotoksin ücretsiz iki kez 20 mL 2 g polyacrylamide boncuk yıkama H2O veya PBS. Santrifüjü (400 x g) 5 min için tarafından polyacrylamide boncuk cips ve PBS 100 mL resuspend. Otoklav 15 lb/m 20 dk. mağaza oda sıcaklığında.
    2. Fareler intraperitoneally ile 1 mL/fare çözümün monosit/makrofajlar geçiş Periton boşluğuna16içine çekmek için steril % 2 polyacrylamide boncuk enjekte.
    3. Dört gün sonra CO2 doz tarafından hayvanlar kurban.
      1. Steril koşullarda, açılış yeterli olacak bir küçük karın merkezinde açılış kesilmiş 5 mL transfer pipet geçmek için. Transfer pipet RPMI-0 ile doldurun ve pipet delikten karın boşluğuna takabilirsiniz.
      2. Karın boşluğuna pipetting tarafından durulayın. Kadar sıvı karın boşluğuna üzerinden mümkün olduğunca (Periton makrofajlar bunlar) steril tüpe pipet. Durulama adım 4 - 5 kez tekrarlayın.
    4. 3000 rad ile Periton makrofajlar ışınlatayım.
      1. Alternatif olarak, Periton makrofajlar (takip adım 2.2 içinde açıklanan yordamı) mitomycin C ile tedavi.
    5. Periton makrofajlar 5 x 106 hücre/ml serum-Alerjik orta yoğunlukta ayarlayın. OLP_pool hisse senedi (son DMSO konsantrasyonu ise % 1'den az) ekleyip M-CSF (son toplama 100 U/mL =).
      Not: Bu MOG OLP çalışmada, biz % 0.5 DMSO kullanılır. Böylece, MOG OLP_pool hisse senedi seyreltilmiş 200 x (örneğin 1 MOG hisse senedi Periton makrofajlar 199 μL eklendi OLP_Pool μL) idi. Bu nedenle, her OLP son konsantrasyonu 4.2 μg/mL) idi.
    6. 48-iyi doku kültürü tabak içinde 200 μL/iyi (1 x 106 hücreler/de) ekleyin ve 4 h için 37 ° C'de plaka kuluçkaya.
    7. Yapışık olmayan hücreleri ve polyacrylamide boncuk nazik yıkama 200 μL/iyi Önceden ısıtılmış RPMI-0 ile çıkarın.
    8. Toplamak ve havuzu OLP_pool astarlanmalıdır CD8+ T hücreleri adım 2.10. Ayarlamak OLP_pool CD8 astarlanmalıdır+ T hücre konsantrasyonu 1 x 106 hücre/ml 25 U/mL IL-2 ve 7 Il-50 U/mL içeren serum-Alerjik orta. 1 mL/iyi OLP_pool Geniş puls Periton makrofajlar içerir 48-şey plaka ekleyin.
    9. Dört gün sonra 48-şey plaka ortamda doldurmak. Kaldırmak ve 48-şey kültür tabak içinde kültür ortamının yaklaşık 400 μL atın. Taze serum-Alerjik orta içeren 100 U/ml IL-2 500 μL ve 7 Il-100 U/mL her kuyunun içine ekleyin. 37 ° C ve % 5 CO2hücre kültür.
    10. Üç ya da dört gün sonra incelemek OLP_pool restimulated CD8+ T hücreleri OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt için enzim bağlı immunospot tahlil (ELISPOT) tarafından. Bu noktadan sonra CD8 yeniden uyarmak+ T hücreleri her 7-10 gün.
      Not: Makrofajlar OLP_pool astarlanmalıdır CD8 yeniden uyarılması için tercih edilen+ T hücreleri. Biz fark CD8+ T hücreleri yeniden makrofaj tarafından uyarılan büyüdü DCs içinde vitroiyi.

    4. OLP_pool özgü tespiti, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8 T hücre+ hattı

    Not: OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool restimulated CD8+ T hücre IFNγ salgılanması stimülasyon C1R veya C1R huzurunda OLP_pool tarafından takip tarafından belirlenir. Qa-1b hücreleri bir IFNγ ELISPOT tahlil kullanarak. C1R hücreleri ticari olarak elde edilebilir. C1R. Qa-1b hücreleri Qa-1 lentiviral vektör C1R hücrelerle transducing tarafından oluşturulur.

    1. 100 μL/iyi bir yakalama anti-IFN-γ antikor (PBS) kaplama arabellekte bir ELISPOT plaka kuyu seyreltilmiş ekleyin.
    Mühür ve bir gecede 4 ° c plaka kuluçkaya.
  • İkinci gününde yakalama anti-IFN-γ antikor içeren kaplama arabellek atın ve 200 μL/iyi-blocking çözüm (serum-Alerjik orta) ekleyin ve oda sıcaklığında 2 h plaka kuluçkaya.
  • C1R ve C1R ışınlatayım. Qa-1b hücreleri 9.600 rad ile.
    1. Alternatif olarak, C1R ve C1R tedavi. Qa-1b hücreleri mitomycin dışında o tesir süresi 30 dk olacak adım 2.2 içinde açıklandığı gibi C ile.
  • C1R ve C1R ayarlayın. 4 x 106 hücre/ml serum serbest ortamda qa-1b hücreleri.
  • Plaka engelleme çözümde atmak ve C1R ve C1R ekleyin. Qa-1b hücreleri 50 μL/iyi (200.000 hücreler/de) ve karışımı.
  • 100 x 50 μL/iyi OLP_pool hisse senedi (serum-Alerjik orta) seyreltilmiş ve düzgün karıştırın. Plaka, oda sıcaklığında 2-3 h için kuluçkaya.
  • OLP_pool restimulated CD8 ayarlamak+ T hücreleri 1-2 x 106 hücre/mL 7 Il-150 U/mL içeren serum-Alerjik orta ve 50 μL/iyi (50.000-100.000 hücreler/de) plaka ekleyin. Plaka (58 x g) 5 dk santrifüj kapasitesi.
  • 37 ° C ve % 5 CO2 plaka gecede kuluçkaya.
  • Hücre süspansiyon Aspire edin. Wells deiyonize (DI) su (250 μL/de) ile 2 kere yıkayın. Her yıkama adımında 5 min için emmek kuyu izin.
  • Yıkama wells 3 kez ile yıkayın tampon (%0,05 Tween20 içeren PBS). Her yıkama adımında 1 dk. için emmek kuyu izin. Yıkama arabellek atmak.
  • Seyreltme arabellekte (% 10 fetal sığır serum (FBS) içeren PBS) seyreltilmiş algılama antikor 100 μL ekleyin.
  • Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuluçkaya.
  • Algılama antikor çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 3 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.
  • 100 μL/kuyu, 1: 100 seyreltme seyreltme arabellekte seyreltilmiş enzim eşlenik (Streptavidin-HRP) ekleyin.
  • Plakalar, oda sıcaklığında 1 h için kuluçkaya.
  • Enzim eşlenik çözüm atın. Wells her yıkama adımında 1 dk. için emmek için 4 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek ı. izin wells ile yıkayın.
  • Wells 2 kez 250 µL/iyi yıkamak arabellek II (PBS) ile yıkayın.
  • 100 µL substrat çözeltisi (mix 1 damla = 20 µL AEC Kromojen, AEC substrat 1 mL ile), her şey için ekleyin. Monitör spot geliştirme 5 ile 60 dk için.
  • İstenen sonuçları görünmeye başlar, substrat reaksiyon wells distile su ile yıkayarak durdurur.
  • Plakayı 2s için oda sıcaklığında kuruması veya kadar tamamen kuru bir gecede. Tabakaların altında plastik tepsi kaldırılması kurutma kolaylaştıracaktır. Analiz edilir kadar tabak mühürlü bir plastik torba karanlık içinde saklayın.
  • Noktalar el ile diseksiyon mikroskop altında incelemek veya bir ELISPOT plaka okuyucu kullanarak numaralandırır. Şekil 2' deki temsilcisi sonucunu görmek.

    • 5. bireysel peptidler OLP_pool içinde bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1 kısıtlı IFN γ salgılanması için teşvik tespiti+ T hücre satırı

    1. OLP_pool özel bir OLP_pool özgü CD8 Qa-1-restrictred IFN γ salgı teşvik bireysel peptidler belirlemek+ T hücre hattı ile yukarıda açıklanan IFN γ ELISPOT tahlil (son konsantrasyon kullanılan her bireysel peptid ELISOPT için tahlil 10 μg/mL'dir). Şekil 3' te temsilcisi sonuçları görürsünüz.
      Not: OLP özel, Qa-1-restircted yanıt en az üç kez C1R huzurunda yanıtının bir yanıt olarak tanımlanır. Qa-1b hücreleri ama OLP olmadan. MOG OLP çalışma, OLP68, OLP96 ve OLP105 bütün bu ölçüt araya geldi. Bu nedenle, üç OLPs potansiyel Qa-1 epitopları12 (şekil 3) içerir. Ancak, OLP105 sürekli olarak en güçlü yanıt verdi; Bu nedenle OLP105 ayrıntılı bir analiz yapılır (şekil 4 ve şekil 5)12.

    6. bir OLP_pool özgü CD8 Epitope özgü, Qa 1 kısıtlı yanıtta uyaran bir 15-mer OLP en iyi Qa-1 Epitope tanımlaması+ T hücre satırı

    1. C - ve N-kesilmiş ölümcül peptidler, şekil 4' te gösterildiği gibi 15-mer OLP sentez.
    2. Bir OLP özgü CD8 IFN γ salgı incelemek+ uyarıcı CD8 T hücre satır+ T hücreleri ile her kesilmiş peptidler hem de ebeveyn 15-mer OLP C1R veya C1R huzurunda. Yukarıdaki kullanarak Qa-1b hücreleri IFN γ ELISPOT tahlil nitelendirdi. ELISPOT tayini için kullanılan her bireysel peptid son konsantrasyonu 10 μg/mL'dir. Bir peptid durumunda en iyi Qa-1 epitope tanımlanır peptid: 1) sürekli olarak özgün 15-mer peptid, C1R huzurunda karşılaştırıldığında benzer ya da daha sert IFN γ cevap verir. Qa-1b hücreleri; 2) 8 - 10-mer (tercih edilen 9-mer peptid) arasında olduğu için MHC ilişkili peptid uzunlukları olan-ben molekülleri15,17. Şekil 5 Temsilcisi sonuçları görmek.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    Tasarım bir protein tüm uzunluğu kapsayan bir OLP Kütüphanesi

    N-terminus adlı bir protein başlamak, her peptid 15 amino asitler (15-mer) olur. Bu nedenle, ilk peptid pozisyonu 1 pozisyona 15 açıklıklı. N-terminus ikinci peptid, 11 amino asit tarafından ilk peptid C-terminus ile çakışıyor. Bu nedenle, ikinci peptid pozisyon 19 konuma 5 açıklıklı. Peptidler C-terminus protein (şekil 1) sonu geri kalanına tasarlayın. 15-mer Kütüphane seçtik çünkü biz ve diğer 15-mer peptidler, dendritik hücreler (DC) veya makrofajlar, eklendiğinde verimli olabilir göstermiştir epitopları tanıma içine CD8 tarafından işlenmiş+ T hücreleri14,15. OLPs bir Kitaplığı'nda bir protein uzunluğuna bağlıdır. Ayrıca, son OLP 12'den 15-mer protein uzunluğuna bağlı olarak değişebilir. Örneğin, miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG) 247 amino asitler uzunlukta. MOG OLP Kütüphane 59 OLPs12içerir. Bu el yazması sunulan temsilcisi MOG OLP Kütüphane analizinden sonuçlarıdır.

    OLP_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bir OLP_pool uyarılmış CD8 belirlenmesi+ T hücre satırı

    Biz bir CD8 oluşturulan+ K tarafından astarlanmalıdır T hücre kültürünüb-/-Db-/- DCs MOG OLP_pool (MOG_pool) ile geniş puls ve MOG_pool Geniş puls K restimulatedb-/-Db-/- açıklandığı gibi Periton makrofajlar söz konusu protokol (protokol 1, 2 ve 3). Potansiyel MOG_pool özgü, Qa-1-sınırlı yanıt olarak bu CD8 belirlemek için+ T hücre kültürünü, biz bu CD8 yanıt muayene+ T hücre kültürünü C1R veya C1R huzurunda MOG_pool için. Qa-1b hücreleri IFN γ ELISPOT tahlil (Şekil 2) (iletişim kuralı adım 4) kullanarak. Bizim veri gösterdi ki MOG_pool uyarılmış CD8+ T hücre kültürünü salgılanan IFN-γ C1R huzurunda düşük düzeyde. Qa-1b hücreleri (hücre oluşturmasına veya SFCs 32 Spot) ama değil C1R hücreleri (2 SFCs), CD8 varlığı öne+ T hücreleri hangi (C1R hücrelerdir insan B lymphoblastoid hücreleri) C1R hücrelerden türetilmiş Qa-1-bağlama epitopları yanıt verdi. SFCs arttı MOG_pool C1R hücrelerin (78 SFCs), bulunan kuyunun içine eklendiğinde CD8 varlığı öne+ T hücreleri hangi sigara-Qa-1 epitopları için yanıt verdi. MOG_pool C1R bulunan kuyunun içine eklendiğinde SFCs önemli ölçüde artış. Qa-1b hücreleri CD8 varlığı öne (320 SFCs),+ T hücreleri olan Qa-1-bağlama peptidler için yanıt verdi. Verileri da MOG_pool Qa-1-bağlama epitope(s) içerdiğini göstermektedir.

    Bir OLP_pool reaktif CD8 Qa 1 kısıtlı IFN-γ salgı katkıda bireysel peptidler OLP_pool içinde belirlenmesi+ T hücre satırı

    MOG_pool-reaktif CD8 Qa 1 kısıtlı IFN-γ salgı teşvik OLP_pool peptidler belirlemek için+ T hücre kültürünü, MOG_pool reaktif CD8 uyarılmış+ T hücreleri ile bireysel 59 OLPs ya C1R varlığında veya C1R. Qa-1b hücreleri (şekil 3) (iletişim kuralı adım 5). Bizim veri kaç SFCs C1R hücreleri ve OLPs bulunan kuyu içinde tespit edilmiştir gösterdi. Buna ek olarak, SFCs C1R bulunan bütün wells arttı. Qa-1b hücreleri ve OLPs. Şekil 2' den, öğrendik CD8+ T hücreleri C1R huzurunda. Qa-1b yalnız de SFCs kurdu. Bu nedenle, artan SFCs çoğu Wells C1R hücrelerde hücre içi proteinler Qa-1 moleküller tarafından türetilen Qa-1 epitopları sunulması sonucu belirsiz stimülasyon nedeni olabilir. Ancak, hangi 3 eşleşen şekil 3 c (B8, D12 ve E9) içinde 3 çerçeveli Wells OLPs OLPs şekil 3A (OLP68, OLP96 ve OLP105)'vurgulanmış, ölçütü bir OLP özgü, Qa 1 kısıtlı IFN γ yanıt olarak tanımlamak için bir araya geldi iletişim kuralı adım 5.112' açıklanan. Verileri 3 OLPs Qa-1 epitope(s) içeren öneririz. OLP105 sürekli olarak en yüksek yanıt üretilen olduğundan, OLP10512ayrıntılı analizini gerçekleştirilen.

    15-mer OLP için kesilmiş peptid kitaplığının tasarım

    OLP_pool reaktif CD8 Qa 1 kısıtlı IFN-γ salgısını uyarmak için belirlenen 15-mer OLP+ T hücre kültürünü, kesilmiş peptid kütüphane kullanarak en uygun epitope için çözümlenmesi gerekiyor. Böyle kesilmiş peptid kitaplığı aşamalı olarak 15-mer OLP 1 amino asit, onun N - ve C-termini (şekil 4) tarafından kesiliyor tarafından tasarlanmıştır. Diğer benzer MHC sınıf ı molekülleri, Qa-1 molekül ağırlıklı olarak 8 - 10-mer peptidler bağlamak. Bu nedenle, biz en kısa kesilmiş peptid 6-mer uzunluğunda olmasını öneririz.

    Bir OLP_pool reaktif CD8 Qa 1 kısıtlı IFN-γ salgılanmasını uyaran bir 15-mer OLP en iyi Qa-1 epitope tanımlaması+ T hücre satırı

    Yukarıdaki N - ve C-kesilmiş ölümcül peptidler Birlikten kuvvet bir CD8 uyarıcı IFN γ salgılanması için test+ T hücre kültürünü OLP_pool veya yukarıda açıklanan IFN γ ELISPOT kullanarak 15-mer OLP için belirli. Qa-1 epitopları MOG12çalışmada, biz bir CD8 oluşturulan+ için MOG OLP105 belirli T hücre satırı (şekil 5A). Daha fazla çözümleme N-kesilmiş 9-mer peptid en uygun bir epitope için iki kriterlerin yerine ölümcül 6.2 (5B rakam) protokolü adımda açıklanan gösterdi. Bu nedenle, N-ölümcül 9-mer kesildi sonucuna peptid oldu en iyi Qa-1 epitop.

    Figure 1
    Şekil 1: Bütün uzaklık değerlerinde bir proteinin bir OLP Kütüphane tasarımını. N-terminus adlı başlayarak, peptidler 15 amino asit (15-mer) uzunluğunda tespit edilmiştir.Önceki peptid C-terminus ile 11 amino asitler tarafından üst üste ilk peptid hariç her peptid N-terminus.

    Figure 2
    Resim 2: MOG_pool uyarılmış CD8+ T hücreleri olduğunu kısmen MOG_pool özel ve Qa 1 kısıtlı12. Vitro CD8+ T hücreleri MOG OLP_pool (MOG_pool) tarafından uyarılan C1R veya C1R huzurunda MOG_pool yanıt için muayene. Qa-1b hücreleri bir IFN γ ELISPOT tahlil kullanarak hücreleri sunulması antijen olarak. Temsilcisi ELISPOT görüntüleri gösterilir. Numaraları nokta oluşturan hücreler (SFCs) her şey sol üst köşesine gösterilir. CD8+ T hücreleri: 50.000 hücreleri/iyi. C1R veya C1R. Qa-1b hücreleri: 200.000 hücreler/iyi.

    Figure 3
    Şekil 3: Qa-1 için sorumlu olan OLPs MOG_pool içinde analizini sınırlı yanıt. (A) düzeni 10 mg/mL bulunan V-alt 96-şey plaka bireysel MOG OLPs. Sayılar Wells OLP kimliklerini ifade. Vurgulanan 3 Kuyu ölçütü iletişim kuralı adım 5.112açıklandığı gibi OLP özgü, Qa 1 kısıtlı IFN γ müdahale için bir araya geldi OLPs yer. (B) temsilcisi SFCs bir OLP bulunan her iyi (son konsantrasyonu 4.2 μg/mL, = OLP kimliği bu "A" bahisler), MOG_pool-reaktif CD8+ T hücreleri (50.000 hücreleri/de) ve C1R hücreleri (200.000 hücreler/de). (C) temsilcisi SFCs bir OLP bulunan her iyi (son konsantrasyonu 4.2 μg/mL, = OLP kimliği bu "A" bahisler), MOG_pool-reaktif CD8+ T hücreleri (50.000 hücreleri/de) ve C1R. Qa-1b hücreleri (200.000 hücreler/de). 3 çerçeveli wells bir OLP özgü, Qa 1 kısıtlı IFN γ yanıt12için kriter bir araya geldi OLPs yer. Rakam başvuru12den adapte edilmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 4
    Şekil 4: 15-mer peptid kesilmiş peptidler tasarımını. 15-mer peptid giderek onun N - ve C-termini adlı 6-mer 1 amino asit tarafından kesildi. 15-mer ve onun kesilmiş peptidler sonra sentez. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Figure 5
    Şekil 5: OLP105 en iyi Qa-1 epitope analizi. (A) bir OLP105 uyarılmış CD8+ T hücre OLP68, OLP96 ve OLP105 C1R veya C1R huzurunda yanıt için muayene. Qa-1b hücreleri bir IFN γ ELISPOT tahlil kullanarak. Temsilcisi IFN γ SFCs (üst sol köşe numaraları) gösterilir. (B) OLP105 özgü CD8+ T hücre kültürünü, (A), gösterildiği gibi muayene yanıt-e doğru bireysel N - ve C-kesilmiş ölümcül peptidler için şekil 4, C1R huzurunda gösterildiği gibi. Qa-1b hücreleri IFN γ ELISPOT tahlil kullanarak. OLP105: 15-mer OLP. N6-14: N-ölümcül OLP105 peptidler kesildi. C6-14: C-ölümcül OLP105 peptidler kesildi. CD8+ T hücreleri: 50.000 hücreleri/iyi. C1R. Qa-1b hücreleri: 200.000 hücreler/iyi. Üst köşeleri SFCs+ 50.000 CD8 başına kalmıştı T hücreleri numaralandırır. Kırmızı dikdörtgen 6.2 iletişim kuralı adımda anlatıldığı gibi bir OLP en iyi Qa-1 epitope tanımlamak için kriterlerin yerine iyi işaretlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    Burada, Qa-1 epitopları bir protein analizi için bir protokol anlatmıştık. Bu iletişim kuralı ile ilgili olarak çeşitli stratejiler de daha önce bildirildi. İlk, allojeneik CD8+ T hücre satırları ve klonlar Qdm1tanımlanması için kullanılmıştır. İkinci olarak, bir sözde Qa-1-bağlama motif Qdm analiz HSP60p216-224 ve TCRBV8.1 epitope9,18tanımlanması için kullanıldı. Üçüncüsü, bireysel örtüşen peptidler bir protein gelen hayvanlar bağışıklık için kullanıldı. Daha sonra CD8+ T hücreleri aşılı hayvanlardan izole TCRBV8.2 peptid p42-hangi daha sonra bağlama Qa-16,10,19için doğrulandı 50 tanımlamak için kullanılmıştır. Dördüncü, fonksiyonel CD8+ T hücre satırları cDNA görüntü kitaplığı ile birlikte FL9 Qa-1 epitope4tanımlanması için kullanılmıştır.

    Referans olarak önceki teknikleri, allojeneik CD8 kullanımı+ T hücre hatları ve klonlar Mayıs fizyolojik bağışıklık yanıtı sırasında sunulan Qa-1 epitopları analiz etmek için uygun olmayabilir. Ayrıca, yukarıda açıklanan bağlama motifi yalnızca kısmen Qa-1 moleküllerin peptid-Bağlama kapasitesi temsil edebilir biriken verileri göstermektedir. Bu nedenle, tam Qa-1-bağlama motifi4hala bilinmemektedir. Ayrıca, bağışıklama Qa-1 epitopları tanımlanması için bireysel peptid ile zahmetli olduğunu. Son olarak, hücre transfection için farklı peptid yüksekliği taşıyan birçok vektörel çizimler inşaat cDNA görüntü kitaplığı strateji içerir. Buna ek olarak, burada açıklanan OLP Kütüphane strateji basit ve eşlenen peptidler Qa 1 kısıtlı CD8 teşvik bilinen+ T hücreleri. Bu nedenle, bizim strateji benzersiz bir avantaj vardır.

    Açıklanan strateji burada OLP_pool özgü CD8 kullanır+ T hücreleri hangi vitro astar ve restimulation tarafından oluşturulur. CD8 alternatif kaynağı+ T hücreler lenf düğümleri bir k drene olabilirb-/-Db-/- ile kaynak protein20aşı fare. Böyle bağışıklık CD8+ T hücreleri o zaman muayene OLPs ve Qa-1 epitopları tanımlanması için kesilmiş peptidler IFN γ yanıt için. Teorik olarak, in vivo bağışıklık CD8+ T hücreleri CD8 vitro oluşturulan daha fizyolojik durumuna yakın+ T hücreleri. Ancak, bağışıklık CD8 yanıt bulduk+ T hücreleri doğrudan aşılı fareler saf zayıf ve sık sık gerekli vitro restimulations tatmin edici bir peptid sonuç eleme için yapıldı. Ayrıca, bu iletişim kuralını HLA-E epitopları neyin içinde vivo bağışıklama pratik değil insan çalışma gelecekteki çeviri için tasarlanmıştır.

    Teknik olarak, bu iletişim kuralını kritik parçası CD8 kuşağıdır+ T hücre hatları OLP_pool veya bireysel bir OLP için özeldir. Qa-1/peptid kompleksi antijen sunan hücreler ile OLPs ya da bir peptid Geniş puls sonra klasik MHC-ben/peptid kompleksi21' e, göre de kararsız olduğundan pulsed hücreleri kapsamlı bir şekilde yıkanmalıdır değil. Peptid Geniş puls hücreleri, kapsamlı, yıkanmış Eğer kaybetmek veya CD8 teşvik yeteneği önemli ölçüde azaltmak olduğunu bulduk+ T hücreleri. Bu nedenle, peptid Geniş puls antijen sunan yıkama hücreleri bir kez daha önce CD8 ile birlikte kültürlü hemen öneririz+ T hücreleri.

    Ayrıca, Qa-1/peptid kompleksi istikrarsızlık nedeniyle peptid darbe için serum içermeyen bir ortam kullanımı ve CD8 uyarılması öneririz+ T hücreleri. Ayrıca, biz düzenli olarak CD8 sırasında 7 Il-50 U/mL eklemek yanı sıra IFN γ ELISPOT sırasında tahlil+ T hücre kültür. 7 Il amacı canlılığı ve CD8 fonksiyonu muhafaza etmektir+ T hücreleri. IL-7 tek başına CD8 teşvik değil+ T hücreleri IFN γ üretmek için.

    Benzer şekilde tüm stratejileri, bu strateji tarafından eşlenen Qa-1 epitopları da daha fazla araştırma için biyolojik önemi gereken. Örneğin, bir önemli soru olup olmadığını eşlenmiş epitope fizyolojik olarak sunulabilir vardır. Bu soruyu çözmek için DCs epitope kaynak protein (örneğin MOG MOG OLP çalışma) ifade eder lentiviral bir vektör ile transduced. Daha sonra yanıt epitope özgü CD8+ T transduced DCs hücrelere inceledi. Olumlu bir yanıt epitope olabilir fizyolojik olarak işlenen ve DC'ler tarafından sunulan olduğunu göstermektedir. Buna ek olarak, CD8 tarafından epitope tanıma sonucu olarak fonksiyonel sonuçları+ T hücreleri daha fazla soruşturma. Bu bağlamda, Qdm ve FL9 Qa-1 epitopları analizleri Qa-1 molekül immün gözetim1,4için önemli sonuç yol açmıştır. Ayrıca, HSP60p216, TCRBV8.1 peptid, çalışmaları ve p42-50 o Qa 1 kısıtlı CD8 sonuca açmıştır+ T hücreleri düzenleyen patojenik CD4 hedefleme yoluyla bağışıklık yanıtı+ T hücreleri 6,7 ,9,19. Ayrıca, have MOG196 çalışmanın ilk kez bu açığa için Qa 1 kısıtlı CD8+ T hücreleri doğrudan potansiyel patojenik otoimmün hücreleri12 tarafından zarar önlemek için bir doku hedefleyerek bağışıklık yanıtı düzenlemek . Son olarak, bir epitope özgü, Qa 1 kısıtlı CD8 fonksiyonel analiz+ T hücre tetramer tarafından yoluyla. Böyle tetramer NIH tetramer çekirdek tesis (http://tetramer.yerkes.emory.edu/) veya bir şirket üretilmektedir. Bir tetramer nesil istemek için kendi onay için Qa-1 tetramer nesil için yeni eşlenen en iyi Qa-1 epitope Qa-1 protein bağlamayı destekler işlev veri gönderebilir.

    Sonuç olarak, önceki çalışmalar göstermiştir bu Qa 1 kısıtlı CD8+ T hücreleri yerel bağışıklık yanıtı12yönetmelikte önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, doku hasar doğrudan doku hedefleyen bir bağışıklık yanıtı tarafından neden olabilir. Ayrıca, ikincil hasar bir istilacı patojen hedefleyen bir bağışıklık yanıtı tarafından neden olabilir. Bu nedenle, CD8 Qa 1 kısıtlı rolünün anlaşılması bu iki+ T hücreleri farklı doku hasar klinik uygulamaları için önemli.Bu hedefe ulaşmak için kendi kendine doku veya bir istilacı patojen Qa-1 epitopları ayrıntılı bir analizi gereklidir. Bu iletişim kuralı bu analizleri için uygun olacak.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    Yazarlar hiçbir çıkar çatışması beyan ederim.

    Acknowledgments

    Biz Penelope Garcia onun teknik yardım ve bu el yazması hazırlanması için teşekkür ederiz. Bu eser tıp bölümü, Loma Linda Üniversitesi (681205-2967) bir araştırma yenilik Grant (RIG) ve ulusal multipl skleroz Derneği (PP1685) bir pilot hibe XT için tarafından desteklenmiştir.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    The protein to be analyzed N/A N/A Sequence of the protein can be obtained from NCBI
    Dimethyl sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich Cat#: D2650 SIGMA DMSO should be sterile and cell culture tested.
    Kb-/-Db-/- mice The Lackson Laboratory Stock#: 019995 We used Taconic H2-KbH2-Db doube knockout mice (Cat#: 4215-F and 4215-M) which however are not available anymore.
    AIM V Serum Free Medium ThermoFisher Scientific Cat#: 12055091
    2-mercaptoethanol ThermoFisher Scientific Cat#: 21985023
    Sodium pyruvate ThermoFisher Scientific Cat#: 11360070
    Nonessential Amino Acids ThermoFisher Scientific Cat#: 11140076
    Dynabeads CD8 Positive Isolation Kit ThermoFisher Scientific Cat#: 11333D
    Bio-Gel P-100 Bio-Rad Cat#: 150-4171
    Phoshate Balanced Solution (PBS) ThermoFisher Scientific Cat#: 20012027
    Trasfer pipette Globe Scientific Mfg#: 137238
    Murine M-CSF PeproTech Cat#: 315-02
    48-well tissue culture plates USA Scientific Cat#: CC7682-7548
    Corning Costar TC-treated Multiple well Plates, 96-well, V-shaped bottom Sigma-Aldrich Cat#: Z372129 Sigma
    1ml deep 06-well PP plate, sterile USA Scientific Item#: 1896-1110
    Recombinant murine IL-2 PeproTech Cat#: 212-12
    Recombinant murine IL-7 PeproTech Cat#L: 217-17
    Capture anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    ELISPOT plate Sigma-Aldrich Cat#: S2EM004M99
    C1R ATCC Cat#: ATCC CRL-1993
    C1R.Qa-1b Custom made (GenBank access#: NM_010398.3)
    Qa-1 lentiviral vector GeneCopoeia Product#: Mm02955
    Detection anti-IFN-γ antibody BD Biosciences Cat#: 551881
    Tween20 Sigma-Aldrich Cat#: P9416
    Streptavidin-HRP BD Biosciences Cat#: BD557630
    AEC substrate BD Biosciences Cat#: 551951
    ImmunoSpot Analyzer ImmunoSpot Any immunoSpot analyer should work for this purpose.

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Aldrich, C. J., et al. Identification of a Tap-dependent leader peptide recognized by alloreactive T cells specific for a class Ib antigen. Cell. 79 (4), 649-658 (1994).
    2. Vance, R. E., Kraft, J. R., Altman, J. D., Jensen, P. E., Raulet, D. H. Mouse CD94/NKG2A is a natural killer cell receptor for the nonclassical major histocompatibility complex (MHC) class I molecule Qa-1(b). J Exp Med. 188 (10), 1841-1848 (1998).
    3. Oliveira, C. C., et al. The nonpolymorphic MHC Qa-1 mediates CD8+ T cell surveillance of antigen-processing defects. J Exp Med. 207 (1), 207-221 (2010).
    4. Nagarajan, N. A., Gonzalez, F., Shastri, N. Nonclassical MHC class Ib-restricted cytotoxic T cells monitor antigen processing in the endoplasmic reticulum. Nat Immunol. 13 (6), 579-586 (2012).
    5. Hu, D., et al. Analysis of regulatory CD8 T cells in Qa-1-deficient mice. Nat Immunol. 5 (5), 516-523 (2004).
    6. Tang, X., et al. Regulation of immunity by a novel population of Qa-1-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells. J Immunol. 177 (11), 7645-7655 (2006).
    7. Leavenworth, J. W., Tang, X., Kim, H. J., Wang, X., Cantor, H. Amelioration of arthritis through mobilization of peptide-specific CD8+ regulatory T cells. J Clin Invest. 123 (3), 1382-1389 (2013).
    8. Wu, Y., Zheng, Z., Jiang, Y., Chess, L., Jiang, H. The specificity of T cell regulation that enables self-nonself discrimination in the periphery. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (2), 534-539 (2009).
    9. Panoutsakopoulou, V., et al. Suppression of autoimmune disease after vaccination with autoreactive T cells that express Qa-1 peptide complexes. J Clin Invest. 113 (8), 1218-1224 (2004).
    10. Tang, X., Maricic, I., Kumar, V. Anti-TCR antibody treatment activates a novel population of nonintestinal CD8 alpha alpha+ TCR alpha beta+ regulatory T cells and prevents experimental autoimmune encephalomyelitis. J Immunol. 178 (10), 6043-6050 (2007).
    11. Holderried, T. A., Lang, P. A., Kim, H. J., Cantor, H. Genetic disruption of CD8+ Treg activity enhances the immune response to viral infection. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (52), 21089-21094 (2013).
    12. Wang, X., et al. Targeting Non-classical Myelin Epitopes to Treat Experimental Autoimmune Encephalomyelitis. Sci Rep. 6, 36064 (2016).
    13. Lo, W. F., Dunn, C. D., Ong, H., Metcalf, E. S., Soloski, M. J. Bacterial and host factors involved in the major histocompatibility complex class Ib-restricted presentation of Salmonella Hsp 60: novel pathway. Infect Immun. 72 (5), 2843-2849 (2004).
    14. Xu, W., et al. The nucleocapsid protein of Rift Valley fever virus is a potent human CD8+ T cell antigen and elicits memory responses. PLoS One. 8 (3), e59210 (2013).
    15. Schumacher, T. N., et al. Peptide selection by MHC class I molecules. Nature. 350 (6320), 703-706 (1991).
    16. Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M. The isolation and characterization of murine macrophages. Curr Protoc Immunol. , Chapter 14, Unit 14, 11 (2008).
    17. Guo, H. C., et al. Different length peptides bind to HLA-Aw68 similarly at their ends but bulge out in the middle. Nature. 360 (6402), 364-366 (1992).
    18. Soloski, M. J., Metcalf, E. S. The involvement of class Ib molecules in the host response to infection with Salmonella and its relevance to autoimmunity. Microbes Infect. 3 (14-15), 1249-1259 (2001).
    19. Smith, T. R., et al. Dendritic cells use endocytic pathway for cross-priming class Ib MHC-restricted CD8alphaalpha+TCRalphabeta+ T cells with regulatory properties. J Immunol. 182 (11), 6959-6968 (2009).
    20. Kalra, A., Mukherjee, P., Chauhan, V. S. Characterization of fine specificity of the immune response to a Plasmodium falciparum rhoptry neck protein, PfAARP. Malar J. 15, 457 (2016).
    21. Kambayashi, T., et al. The nonclassical MHC class I molecule Qa-1 forms unstable peptide complexes. J Immunol. 172 (3), 1661-1669 (2004).

    Tags

    Örtüşen peptid Qa-1 nonclassical MHC kompleksi HLA-E bağışıklık yönetmelik immün gözetim İmmünoloji sayı: 130,
    Qa-1 epitopları bir protein eşlemek için çakışan Peptide Kütüphane
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J.,… More

    Xu, Y., Wasnik, S., Baylink, D. J., Berumen, E. C., Tang, X. Overlapping Peptide Library to Map Qa-1 Epitopes in a Protein. J. Vis. Exp. (130), e56401, doi:10.3791/56401 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter