Summary
La valutazione precisa della risposta di dolore in un modello animale neuropatico è fondamentale per studiare la fisiopatologia di malattie dolore e sviluppare nuovi analgesici. Presentiamo un metodo sensibile e oggettivo per determinare la funzione sensoriale del roditore posteriore della zampa di un sistema di analisi automatizzata di andatura.
Abstract
Il test di von Frey è un metodo classico che è stato ampiamente utilizzato per esaminare la funzione sensoriale degli animali di dolore neuropatico. Tuttavia, essa ha alcuni svantaggi come dati soggettivi e il requisito di uno sperimentatore qualificato, con esperienza. Ad oggi, una varietà di modifiche hanno migliorato il metodo di von Frey, ma ha ancora alcuni limiti. I rapporti recenti hanno suggerito che l'analisi di andatura produce dati più accurati e oggettivi dagli animali neuropatici. Questo protocollo viene illustrato come eseguire l'analisi automatizzata di andatura per determinare il grado di dolore neuropatico nei topi. Dopo diversi giorni di acclimatazione, i topi sono stati permessi camminare liberamente il piano di vetro per illuminare le impronte. Allora, quantificazione delle impronte e andatura sono stati effettuati attraverso video clip con analisi automatica dei vari parametri a piedi, come zona di zampa stampa, swing tempo, angolo di zampa, ecc.
Lo scopo principale di questo studio è di descrivere la metodologia di analisi automatizzata di andatura e brevemente confrontarlo con i dati della prova sensoriale classica utilizzando filamento di von Frey.
Introduction
Alterazioni patologiche del sistema nervoso indotto da disfunzione metabolica, infiammazione, infezione, trauma, ischemia, o malattia autoimmune occasionalmente provocare dolore neuropatico, che è definito come un dolore derivanti come conseguenza diretta di una lesione o malattia che interessano il sistema somatosensoriale1. Il dolore neuropatico è solito insopportabile e purtroppo, analgesici convenzionali generalmente non producono sufficiente dolore sollievo2. Delle principali caratteristiche del dolore neuropatico contiene spontanei ed evocato da stimolazione dolori (cioè, allodinia e iperalgesia). Allodynia è una risposta nocicettiva che si verifica a stimoli normalmente non doloroso, come tocco leggero o stimolazione calda. Iperalgesia indica una risposta avanzata dolore a stimoli nocivi di meccanica e/o termica3. Anche se questi due sintomi sia criticamente compromettere la qualità della vita del paziente, allodinia meccanica evocata dalla stimolazione tattile delicata è il sintomo più aggravante perché contatto soffice è difficile da evitare nella vita quotidiana.
Per studiare il meccanismo sottostante e nuovi analgesici per il trattamento del dolore neuropatico, la misura precisa della risposta dolore è essenziale. Numerosi modelli animali di dolore neuropatico hanno sviluppato risposte nocicettive su hind zampa zona a causa della sua elevata accessibilità4,5,6,7. Così, la maggior parte delle valutazioni di risposta di dolore sono stata effettuata sulla superficie plantare o dorsale della zampa posteriore mediante l'applicazione di stimoli meccanici utilizzando strumenti speciali, come filamenti di von Frey. Uno del metodo più frequentemente usato è il su e giù metodo descritto da Dixon8 e la successiva modifica versioni9,10. Tuttavia, gli sperimentatori molto qualificati, esperti sono necessari per eseguire il test di von Frey e i risultati possono essere soggettivi.
Il sistema di analisi automatizzata di andatura può indagare disturbi neurologici e neuromuscolari misurando vari parametri di camminare liberamente commoventi roditori. In una varietà di modelli animali di lesione del nervo, il grado di nocicezione e l'effetto antinocicettivo di parecchi trattamenti può essere valutati senza l'aggiunta di un dolore stimolazione11,12,13, 14. questo sistema di analisi in grado di rilevare i parametri statici e dinamici di andatura, come: zampa stampa area (area di stampa completa zampa che entra in contatto con il pavimento), paw intensità (l'intensità media della zona come contattare zampa), (la lunghezza della falcata atteggiamento di distanza tra successivi posizionamenti della zampa stessa), fase (la durata del contatto con il terreno per una sola zampa posteriore), sequenza di passi (l'ordine in cui i quattro zampe sono collocati al piano), (la durata della fase dinamica) e velocità (calcolata di rotazione dalla lunghezza della falcata swing durata ed espressi in pixel al secondo). Questo documento viene illustrato l'utilizzo di un sistema di analisi e fornisce un breve confronto dei dati con il test di von Frey utilizzando topi costrizione cronica lesioni (CCI).
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Protocol
tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con le linee guida etiche dell'associazione internazionale per lo studio del dolore e sono stati approvati dal comitato di uso e cura degli animali istituzionale presso l'Università nazionale di Chungnam ( Daejeon, Corea del Sud).
1. induzione di CCI sul nervo sciatico
- topi ICR maschii di casa pesa 20-25 g sotto un ciclo luce/buio di 12 h a temperatura ambiente controllata (mantenuta a 20-25 ° C) e umidità (40-60%), con libero accesso al cibo e acqua. Consentire un periodo di acclimatazione per topi in camera cura degli animali di almeno 1 settimana prima dell'intervento chirurgico.
- Durante l'alloggiamento, osservare l'aspetto e il comportamento dei topi e non utilizzare topi risultati anormali attività locomotrice.
Nota: Un giorno prima dell'intervento CCI, misurare la sensibilità meccanica della zampa posteriore applicando filamenti di von Frey ed eseguire l'analisi di andatura automatizzati per ottenere valori basali normali. Quindi, assegnare casualmente topi di controllo e nei gruppi sperimentali.
- Durante l'alloggiamento, osservare l'aspetto e il comportamento dei topi e non utilizzare topi risultati anormali attività locomotrice.
- Il giorno dell'intervento, anestetizzare topi iniettando 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, intraperitoneale (IP)).
Nota: Indossare dispositivi di protezione individuale come camice chirurgico, guanti e maschera.- Pesare 2,5 g di 2,2,2-tribromoethanol e aggiungere 2-metil-2-buthanol al volume finale di 5 mL. Mantenere la soluzione lontano dalla luce (ad esempio, utilizzare un contenitore scuro o avvolgere in un foglio).
- Attendere che i reagenti per sciogliere completamente da riscaldamento a 40 ° C e mescolare per 10-30 min.
- Aggiungere acqua distillata fino al volume finale di 200 mL e mescolare fino a quando mescolati bene.
- Conservare le aliquote a 4 ° C e tenere all'oscuro. Dopo due settimane, l'anestetico deve essere sostituito con nuove aliquote.
- Iniettare un volume di 20 µ l per peso corporeo di 1 g. Ad esempio, se il peso del corpo del mouse 25g, dare 500 µ l di soluzione. La durata tipica di questa anestesia è 1 h.
Nota: Questa soluzione diventa tossica quando esposto alla luce e/o calore quindi state attenti a evitare l'esposizione alla luce e al calore. Una route di iniezione IP è altamente raccomandata.
- Quando il mouse cade in anestesia profonda, metterla sul tavolo operatorio con il lato dorsale alto (cioè, posizione prona) e sterilizzare l'area metà coscia esterna del lato destro con un tampone di alcool al 70%.
Nota: Confermare l'anestesia profonda controllando la mancanza di risposta a pizzicare o pressione stimolo sulla zampe posteriori o coda. - Indurre il CCI sul nervo sciatico destro del mouse.
- Fare un'incisione sulla pelle intorno alla zona di metà coscia di 1.0-1.5 cm di lunghezza con una lama per bisturi.
- Senza mezzi termini sezionare i muscoli della coscia con il micro-zanzara pinza emostatica per esporre il nervo sciatico.
- Legare il nervo sciatico esposto 3 volte con intervalli di 1.0-1.5 mm utilizzando una sutura in catgut cromico 4-0.
Nota: Assicurarsi di legature sciolti legando fuori il nervo sciatico fino a lieve agitazione sulla zampa posteriore ipsilateral. Il gruppo sham dei topi ha ricevuto la stessa apertura chirurgica in condizioni simili tranne senza legatura del nervo.
- Chiudere l'apertura chirurgica con 3-4 i suturare interrotti semplici usando la seta di 5-0 e sterilizzare con povidone iodio per la disinfezione della zona esterna della chirurgia.
- Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il mouse in una gabbia pulita su un rilievo di riscaldamento. Quando gli animali vengono recuperati dall'anestesia, restituirli alla loro gabbia casa.
Nota: In questo studio, gli antibiotici non sono stati usati. CCI + GBP gruppo ricevuto IP gabapentin (GBP) ad una dose di 50 mg/kg una volta al giorno come controllo positivo.
2. Misurazione di allodinia meccanica (Test di von Frey)
Nota: valutare la frequenza della risposta agli stimoli meccanici ritiro utilizzando 1 g di filamento di von Frey sulla superficie plantare della zampa posteriore ipsilateral.
- Su ogni giorno di prova, portare i topi in camera test comportamentali e acclimatare i topi nella propria gabbia a casa per almeno 30 minuti prima del test.
Nota: Indossare dispositivi di protezione individuale come camice chirurgico, guanti e maschera. - Mettere il mouse in una scatola trasparente acrilico al piano di maglia metallica e acclimatazione il mouse per 30 min.
- Applicare delicatamente 1 g di filamento di von Frey alla superficie plantare della zampa posteriore, fino a quando il filamento piega.
- Stimolazione filamento applica a ipsilateral hind zampa 10 volte con intervalli di almeno 10 s e registrare il risultato.
Nota: In questo studio, il numero di risposte di ritiro della zampa da 10 prove è indicato come percentuale della frequenza di ritiro della zampa (PWF, %). Il test di von Frey è stato effettuato ogni due giorni dopo l'intervento chirurgico CCI.
3. Esecuzione di analisi di andatura automatizzato
Nota: il sistema di analisi di andatura Visualizza ogni stampa zampa mentre l'animale sta camminando e analizza automaticamente i vari parametri di andatura, tali come stampa, della zampa zampa intensità, lunghezza della falcata, posizione fase, sequenza di passi, swing, swing velocità, ecc In questo studio, abbiamo dimostrato che cambiare area di stampa della zampa e singola posizione dopo aver convertito i dati in percentuale tra controlaterale sinistra contro zampa destra posteriore ipsilateral. Così, un risultato del 50% indica che la dimensione della stampa zampa e la durata della zampa zona a contatto con la terra, tra i lati destro e sinistro sono gli stessi. Inoltre, valori di dati inferiori si avvicina 0% indicano che la dimensione e la durata del contatto sono diminuiti nella zampa posteriore ipsilaterale rispetto al lato controlaterale (vedi pannello B della Figura 2 e Figura 3).
- Per acclimatazione, tenere i topi all'interno del dispositivo di analisi di andatura per 10 minuti una volta al giorno iniziando 5 giorni prima dell'intervento CCI.
Nota: Prova di analisi di andatura tra cui acclimatazione deve essere eseguita al buio. - Portare i topi per la camera di prova per l'analisi di andatura e ambientarsi nella loro gabbia a casa per almeno 30 minuti prima del test.
- Nella scheda di impostazione del menu del programma, impostare il " lunghezza passerella " a 30 cm e insieme la " corsa durata massima " a 5 s e il " corsa variazione massima " al 50%.
- Selezionare una telecamera registrata dal ' installazione ' scheda del ' programma ' menu.
- Selezionare " aprire acquisizione " dalla ' acquisire ' scheda del ' programma ' menu.
- Dopo il messaggio di stato, fare clic il ' sfondo a scatto ' pulsante per scattare una foto di sfondo della passerella vuota (cioè, spazio in bianco).
- Scegliere la ' Avvia acquisizione ' pulsante e posizionare un mouse sulla passerella; la registrazione si avvia automaticamente in base al movimento del mouse.
Nota: Quando il mouse entra chiaramente attraversare il passaggio pedonale, il programma classifica automaticamente questa mossa come " Compliant eseguire " con un'icona verde. Se il software non è riuscito a rilevare la stampa del piede, lo sperimentatore verrà visualizzata un'icona rossa e dovrà ripetere la registrazione. Almeno cinque piste compatibile con successo sono necessari per l'analisi. - Dopo il test, selezionare ' classificare corre ' dalla scheda di acquisizione della ' programma ' menu.
- Selezionare le esecuzioni per analisi e clicca la ' auto classificare ' pulsante.
Nota: Dopo la classificazione, tutti i parametri di statistica vengono salvati automaticamente e lo sperimentatore può trovare i risultati cliccando " Vista eseguire statistiche " dal menu Analizza.
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Representative Results
Abbiamo eseguito il test di von Frey e analisi di andatura in topi CCI automatizzata fino a 10 giorni dopo l'intervento chirurgico CCI. Per l'analisi statistica, le misure ripetute di analisi della varianza (ANOVA) bidirezionale determina gli effetti complessivi e analisi post-hoc di Dunnett è stato effettuato per determinare il valore di p tra i gruppi sperimentali.
I risultati mostrati nella Figura 1 indicano il corso di tempo dei dati del test di von Frey classica. La PWF (%) dei topi CCI è stato aumentato a 2 giorni dopo l'intervento chirurgico CCI e sostenuto per 10 giorni rispetto al gruppo di Sham. Nel gruppo di controllo positivo di CCI, GBP (50 mg/kg, IP, una volta al giorno per 10 giorni inizia 1 giorno dopo l'intervento chirurgico) notevolmente alleviati PWF CCI-aumentata. Nel gruppo finto di pannello A, PWF (%) era 8.00 ± 5,83 il timepoint pre-chirurgia (Pre), 6.00 ± 2,45 il giorno 2, 4.00 ± 2,45 il giorno 4, ± 2,00 2,00 il giorno 6, 4.00 ore 22.45 il giorno 8 e 6,00 ± 2,45 il giorno 10. Nel gruppo di CCI, PWF (%) era 2,86 ± 1.84 il Pre, 61.43 ± 5,95 il giorno 2, ± 68,57 4,59 su giorno 4, 72.86 ± 5,22 su giorno 6, ± ± 6,49 il giorno 8 e 75,71 75.71 3,69 il giorno 10. Nel gruppo di CCI + GBP, PWF (%) era 2,50 ± 1,43 sul Pre, ± 57.50 5.22 il giorno 2, 50.00 ± 4.04 su giorno 4, ± 45.00 4.81 su giorno 6, 46.25 ± ± 5,65 il giorno 8 e 47.50 4.88 il giorno 10. Nel pannello B, l'area sotto la curva (AUC) era 23.00 ± 6.00 a Sham, 317.86 ± 17,04 in CCI e ± 223.75 17.05 nel gruppo CCI + GBP.
I risultati mostrati nella Figura 2 indicano un cambiamento di corso di tempo dell'area stampa zampa dopo chirurgia CCI. I dati sono mostrati come la variazione percentuale dell'area stampa zampa tra le zampe posteriori di destra e sinistra. Se l'area di stampa della zampa è uguale a sinistra e a destra in una condizione normale, i dati saranno 50%. CCI significativamente ridotta area di stampa zampa della zampa posteriore ipsilateral 2 giorni dopo la chirurgia ed è stata mantenuta per 10 giorni. GBP recuperato notevolmente l'area di stampa zampa ridotta. Nel gruppo finto del pannello B, l'area di stampa della zampa (%) era 50.13 ± 2.13 sul Pre, 50.30 ± 1,45 il giorno 2, ± 53.24 0.80 il giorno 4, 50.30 ± 1,68 su giorno 6, 52.08 ± ± 1.79 il giorno 8 e 49.66 2.24 il giorno 10. Nel gruppo di CCI, l'area di stampa della zampa (%) era 50.71 ± 3,17 sul Pre, 0 ± 0 il giorno 2, 0 ± 0 il giorno 4, 8.86 ± 3.27 su giorno 6, 6,6 ± ± 3.20 il giorno 8 e 10.30 5,60 il giorno 10. Nel gruppo CCI + GBP, l'area di stampa della zampa (%) era 55,59 ± 2.01 il Pre, 4.65±4.17 il giorno 2, 15.18±5.57 il giorno 4, 20.20 ± 4.00 su giorno 6, ± ± 5,53 il giorno 8 e 28.40 26,01 6,04 il giorno 10.
I risultati mostrati nella Figura 3 indicano il cambiamento di corso di tempo di una singola posizione dopo la chirurgia CCI. Dati sono stati calcolati e mostrati come la variazione percentuale (simile ai dati di area di stampa della zampa). CCI ridotto la singola posizione del lato ipsilateral e GBP significativamente recuperato esso. Nel gruppo finto del pannello B, l'unico atteggiamento (%) era 49.31 ± 2.15 il Pre, 50.71 ± 0,67 il giorno 2, 50.76 ± 0,44 il giorno 4, 50.60 ± 1,11 il giorno 6, 51.50 ± ± 0.96 il giorno 8 e 49.00 2.35 il giorno 10. Nel gruppo di CCI, la singola posizione (%) era 50.36 ± 3,17 sul Pre, 0 ± 0 il giorno 2, 0 ± 0 il giorno 4, ± 11,5 3,25 su giorno 6, ± ± 5.04 il giorno 8 e 12,94 13.61 6,40 il giorno 10. Nel gruppo CCI + GBP, l'unico atteggiamento (%) era 52.35 ± 0.91 sul Pre, 5,44 ± 4,87 il giorno 2, 18.66 ± 4.33 su giorno 4, 25.48 ± 4.10 su giorno 6, ± ± 2.17 il giorno 8 e 32,24 30.26 4.95 il giorno 10.
Figura 1: allodinia meccanica valutato dalla prova di von Frey in topi CCI. Frequenza (A) il ritiro di zampa (PWF, %) di von Frey test è stato aumentato a 2 giorni dopo l'intervento chirurgico CCI e sostenuto per 10 giorni rispetto al gruppo di Sham. Gabapentin (GBP, 50 mg/kg, IP) ha invertito significativamente l'allodinia meccanica CCI-indotta. (B) dati accumulata di PWF sono mostrati come area sotto la curva. * * p < 0,01 e * * * p < 0.001 contro gruppo di CCI. Barre di errore indicano la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Paw area di stampa di analisi automatizzata di andatura in topi CCI. (A) catturato immagini di zampe posteriori dai gruppi di Sham, CCI e CCI + GBP (gabapentin, 50 mg/kg, IP) dal software di analisi. Rettangoli bianchi sono indicatori della zampa posteriore rilevato mediante il sistema di analisi. Si noti la dimensione più piccola di zampa di CCI e questa riduzione è stato parzialmente recuperata dal trattamento GBP. (B) corso di tempo dell'area stampa zampa (%). I dati vengono calcolati come la variazione percentuale dell'area di stampa tra la zampa sinistra e destra posteriore (ad es., 50% indica le aree di stampa zampa stessa nei lati destro e sinistro). * p < 0.05 e * * p < 0,01 contro gruppo di CCI. Barre di errore indicano la media ± SD
Figura 3: posizione singola di analisi automatizzata di andatura in topi CCI. (A) catturati e immagini convertite della singola posizione evidenziate da colori diversi per ogni zampa. Si noti che la traccia di rosa per la zampa posteriore ipsilateral è accorciata nel gruppo CCI e gabapentin (GBP, 50 mg/kg, IP) significativamente recuperato allo stesso modo al livello di Sham. (B) corso di tempo della singola posizione (%). I dati vengono riepilogati come un grafico a linee dopo aver calcolato la variazione percentuale della singola posizione tra la zampa sinistra e destra posteriore (ad es., 50% indica lo stesso atteggiamento singolo nei lati destro e sinistro). * p < 0.05, * * p < 0,01 e * * * p < 0.001 contro gruppo di CCI. Barre di errore indicano la media ± SD. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Attualmente, la misura di allodinia meccanica utilizzando filamenti di von Frey è il più usato metodo in modelli animali di dolore per dimostrare ipersensibilità tattile. Come modelli animali di dolore neuropatico hanno continuato ad essere sviluppato, la metodologia di valutazione per la funzione sensitiva è stata anche migliorata8,9,10,15. In tali rapporti, è stato suggerito che queste modifiche in grado di fornire una sostituzione più precisa, veloce e facile da usare per i più vecchi metodi. Tuttavia, i dati da tali metodi ancora possono essere limitati dalla sua soggettività e il requisito di abilità o esperienza per eseguire il metodo. Inoltre, trattenendo gli animali non può essere evitato quando si esegue il test di von Frey, e pertanto lo stress legato al contenimento degli animali può influenzare i risultati di risposta di dolore.
Il sistema di analisi automatizzata di andatura misura automaticamente i vari parametri di animale camminare (ad es., superficie totale di contatto zampa al piano, angolo della stampa della zampa, tempo di presa di posizione, ecc.), e pertanto lo sperimentatore può utilizzare dati più oggettivi per analisi12,13,14,16,17,18. Inoltre, questo metodo può essere eseguito senza alcuna stimolazione; così, è meno invasiva e dati dal roditore liberamente commovente possono essere ottenuti. Come mostrato nei risultati di questo studio, il piede formato di stampa e tempo di presa di posizione della zampa posteriore ipsilateral sono ridotti dalla chirurgia CCI e recuperato dal trattamento GBP; risultati simili inoltre sono trovati in von test di Frey. Coerente con precedenti osservazioni14, risultati di analisi di andatura in modelli animali di dolore neuropatico hanno un alto grado di correlazione positiva con quello del test di von Frey, che indica che i parametri modificati CCI-correlate possono riflettere il grado di allodinia meccanica, uno dei sintomi più irritanti del dolore neuropatico.
Qui, forniamo un metodo su come far funzionare il sistema di analisi automatizzata di andatura in dettaglio e un breve confronto dei dati con il test classico di von Frey nei topi CCI. In conclusione, l'analisi automatizzata di andatura può essere che lo strumento più migliorato accessibile per lo studio del dolore neuropatico a causa di esso è facile da usare, oggettiva e sensibile.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questa ricerca è stata sostenuta da Chungnam National University, Korea Institute di medicina orientale (KIOM) e una sovvenzione della Corea salute tecnologia R & D progetto attraverso Corea salute industria Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della salute & Benessere, Repubblica di Corea (concessione numero: HI15C0007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | JW Pharmaceutical | N/A | Vehicle for drugs |
| 1ml syringe | BD Plastipak | 300013 | Injecting device |
| 2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity) | Sigma | T48402 | Anesthetic |
| 2-methyl-2-buthanol (99% purity) | Sigma | 152463 | Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol |
| Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of aniaml gait |
| Chromic catgut (4-0 thickness) | AILEE | C442 | Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve |
| Gabapentin | Sigma | Y0001280 | Analgeisc, Used as a positive control drug in this study |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11051-10 | Surgical instrument |
| Heating Pad | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | Regulation of body temperature |
| ICR Mouse | Samtaco | N/A | Experimental animal |
| Mersilk (3-0 thickness) | ETHICON | W598H | Suture material for surgical closure of skin |
| Micro-Mosquito | F.S.T | 13010-12 | Surgical instrument |
| Micro-scissors | F.S.T | 14090-09 | Surgical instrument |
| Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
| Povidone Iodine | Firson | N/A | Disinfectant to prevent infection after surgery |
| Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
| Von-Frey filaments | North Coast | NC12775-99 | Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation |
References
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