Summary
La evaluación precisa de la respuesta al dolor en un modelo animal neuropático es fundamental investigar la patofisiología del dolor enfermedades y desarrollar nuevos analgésicos. Presentamos un método sensible y objetivo para determinar la función sensorial del roedor hind de la pata por un sistema de análisis automatizado de la marcha.
Abstract
La prueba de von Frey es un método clásico que ha sido ampliamente utilizado para examinar la función sensorial de los animales de dolor neuropático. Sin embargo, tiene algunas desventajas como datos subjetivos y el requisito de un experimentador calificado y con experiencia. Hasta la fecha, una gran variedad de modificaciones han mejorado el método de von Frey, pero todavía tiene algunas limitaciones. Los informes recientes han sugerido que el análisis de la marcha producen datos más precisos y objetivos de los animales neuropáticos. Este protocolo muestra cómo realizar el análisis de la marcha automática para determinar el grado de dolor neuropático en ratones. Después de varios días de aclimatación, los ratones se les permitía caminar libremente en el piso de cristal para iluminar huellas. Entonces, la cuantificación de la huella y del paso fueron realizados a través de clips de vídeo con el análisis automático de diversos parámetros a pie, como área de impresión, oscilación tiempo pata, ángulo de pata, etc.
El objetivo principal de este estudio es describir la metodología de análisis de la marcha automática y brevemente compararla con los datos de la prueba sensorial clásica con filamentos de von Frey.
Introduction
Los cambios patológicos del sistema nervioso inducidos por trauma, disfunción metabólica, inflamación, infección, isquemia, o enfermedad autoinmune ocasionalmente dar lugar a dolor neuropático, que se define como un dolor que se presenta como una consecuencia directa de una lesión o enfermedad que afectan el sistema somatosensorial1. El dolor neuropático es generalmente insoportable y por desgracia, analgésicos convencionales generalmente no producen suficiente de alivio de dolor2. Una característica importante del dolor neuropático contiene dolor espontáneo y evocado por el estímulo(, alodinia o hiperalgesia). Allodynia es una respuesta nociceptiva que se produce a estímulos normalmente no dolorosos, como toque de luz cálido estímulo. Hiperalgia indica una respuesta de mayor dolor a estímulos mecánicos o térmicos nocivos3. Aunque estos dos síntomas críticamente deterioran la calidad de vida de la paciente, alodinia mecánica evocada por la estimulación táctil suave es el síntoma más agravante porque contacto suave es difícil de evitar en la vida cotidiana.
Investigar el mecanismo subyacente y nuevos analgésicos para el tratamiento del dolor neuropático, la medida exacta de la respuesta al dolor es esencial. Se han desarrollado numerosos modelos animales de dolor neuropático las respuestas nociceptivas en el trasero de la pata área debido a su alta accesibilidad4,5,6,7. Así, se han realizado evaluaciones de respuesta de dolor más en la superficie plantar o dorsal de la pata trasera mediante la aplicación de estímulos mecánicos utilizando instrumentos especiales, como los filamentos de von Frey. Una el método más frecuentemente utilizado es el y por el método descrito por Dixon8 y más adelante modificado versiones9,10. Sin embargo, investigadores muy cualificados y con experiencia se requiere para realizar la prueba de von Frey y los resultados pueden ser subjetivos.
El sistema de análisis automatizado de la marcha puede investigar trastornos neurológicos y neuromusculares mediante la medición de diversos parámetros de caminar libremente mover roedores. En una gran variedad de modelos animales de lesión del nervio, pueden evaluarse el grado de nocicepción y el efecto antinociceptivo de varios tratamientos sin agregar un dolor estimulación11,12,13, 14. este sistema de análisis puede detectar parámetros de marcha estáticos y dinámicos, tales como: área de impresión (el área de la impresión completa de la pata que entra en contacto con el suelo) de la pata, pata de intensidad (intensidad media de la zona de pata contacto), (la longitud de la zancada postura de distancia entre colocaciones sucesivas de la misma pata), fase (la duración de contacto con el suelo de una sola pata trasera), secuencia de paso (el orden en que las cuatro patas se colocan en el piso), swing (la duración de la fase de oscilación) y velocidad (computado del oscilación de longitud de la zancada y duración de la oscilación expresada en píxeles por segundo). Este artículo muestra cómo utilizar un sistema de análisis y proporciona una breve comparación de los datos de la prueba de von Frey utilizando ratones neuropático de constricción crónica lesión (CCI).
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Protocol
todos los experimentos se llevaron a cabo con arreglo a las normas éticas de la Asociación Internacional para el estudio del dolor y fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso en la Universidad Nacional de Chungnam ( Daejeon, Corea del Sur).
1. inducción de CCI en nervio ciático
- casa ICR ratones machos pesa 20-25 g en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h a temperatura ambiente controlada (mantenida a 20-25 ° C) y humedad (40-60%), con libre acceso a los alimentos y agua. Permite un periodo de aclimatación para los ratones en la sala de cuidado de los animales de al menos 1 semana antes de la cirugía.
- En vivienda, observar el aspecto y comportamiento de los ratones y no utilice ratones anormal actividad locomotor.
Nota: Un día antes de la cirugía de la CCI, medir la sensibilidad mecánica de la pata trasera mediante la aplicación de filamentos de von Frey y realizar el análisis de la marcha automática para obtener los valores de referencia normal. Luego, asignar ratones al azar a los grupos experimentales y control.
- En vivienda, observar el aspecto y comportamiento de los ratones y no utilice ratones anormal actividad locomotor.
- En el día de la cirugía, anestesiar ratones inyectando 2,2,2-tribromoethanol (250 mg/kg, intraperitoneal (IP)).
Nota: Use equipo de protección personal como bata quirúrgica, guantes y mascarilla.- Pesar 2,5 g de tribromoethanol 2,2,2 y añadir 2-metil-2-buthanol a volumen final de 5 mL. Mantener la solución lejos de la luz (por ejemplo, utilizar un envase oscuro o envuelva en papel).
- Reactivos de permitir disolver totalmente por calentamiento a 40 ° C y agitación durante 10-30 min.
- Agregar agua a volumen final de 200 mL de destilado y revuelva hasta que se mezcle bien.
- Almacenar las alícuotas a 4 º C y mantener en la oscuridad. Después de dos semanas, el anestésico debe reemplazarse con nuevas alícuotas.
- Inyectar un volumen de 20 μl por peso de 1 g. Por ejemplo, si el peso del cuerpo del ratón es 25 g, dan 500 μl de solución. La duración típica de esta anestesia es de 1 h.
Nota: Esta solución se convertirá en tóxica cuando se expone a la luz o calor, así que tenga cuidado para evitar la exposición a la luz y calor. Recomienda una vía de inyección IP.
- Cuando el raton cae en la anestesia profunda, coloque en la mesa de operaciones con el lado dorsal hacia arriba (es decir, prono) y esterilizar el área mediados de-muslo externo de la derecha con una torunda de alcohol al 70%.
Nota: Confirmar anestesia profunda, comprobando la falta de respuesta o estímulo en las patas traseras o la cola de presión. - Inducir la CCI en el nervio ciático derecho del ratón.
- Hacer una incisión en la piel alrededor del área del mediados de-muslo de 1.0-1.5 cm de longitud con una hoja de bisturí.
- Sin rodeos, disecar los músculos del muslo con el micro mosquito pinza hemostática para exponer el nervio ciático.
- Ligar el nervio ciático expuesto 3 veces con intervalos de 1.0-1.5 mm mediante una sutura de catgut crómico 4-0.
Nota: Asegúrese de trompas sueltos por atar apagado el nervio ciático aparezca leve temblor en la pata trasera ipsolateral. El grupo sham de ratones recibió la misma abertura quirúrgica bajo condiciones similares excepto sin la ligadura del nervio.
- Cerrar la abertura quirúrgica con 3-4 suturas interrumpidas simples usando seda 5-0 y esterilizar con povidona yodada para la desinfección de la zona externa de la cirugía.
- Después de la cirugía, colocar el ratón en una jaula limpia en una almohadilla de calefacción. Cuando los animales se recuperen de la anestesia, devolverlos a su jaula casa.
Nota: En este estudio no se emplearon antibióticos. La CCI + GBP grupo IP gabapentina (GBP) a una dosis de 50 mg/kg una vez al día como control positivo.
2. Medición de la alodinia mecánica (prueba de von Frey)
Nota: evaluar la frecuencia de la respuesta de retirada a los estímulos mecánicos utilizando 1 g de filamentos de von Frey a la superficie plantar de la pata trasera ipsolateral.
- En cada día del examen, traer ratones a la sala de ensayo conductual y aclimatar los ratones en su propia jaula casa por al menos 30 min antes de la prueba.
Nota: Use equipo de protección personal como bata quirúrgica, guantes y máscara de. - Poner el ratón en una caja de acrílico transparente en el piso de malla metálica y aclimatar el ratón durante 30 minutos
- Suavemente aplicar 1 g de filamentos de von Frey a la superficie plantar de la pata trasera hasta que el filamento dobla.
- Estimulación de filamento de aplicar a la Cierva ipsolateral de la pata 10 veces con intervalos por lo menos 10 de s y anote el resultado.
Nota: En este estudio, el número de respuestas de retirada pata de 10 estudios clínicos se muestra como porcentaje de la frecuencia de retirada de la pata (PWF, %). La prueba de von Frey se realizó cada dos días después de la cirugía CCI.
3. Realizar análisis automatizado de la marcha
Nota: el sistema de análisis de marcha visualiza cada impresión de la pata mientras el animal está caminando y analiza automáticamente diversos parámetros de la marcha, tales como impresión de la pata pata de intensidad, la longitud de zancada, postura fase, secuencia de paso, oscilación, velocidad de swing, etc. en este estudio, mostramos que el área de impresión de la pata y solo postura después de convertir los datos en el porcentaje de cambio entre contralateral izquierda versus ipsolateral de la pata trasera derecha. Así, un resultado del 50% indica que el tamaño de la impresión de la pata y la duración de la zona de pata en contacto con el suelo, entre los lados izquierdo y derecho son los mismos. Además, valores más bajos de datos cercana al 0% indican que el tamaño y la duración del contacto están disminuidas en la pata trasera ipsolateral en comparación con el lado contralateral (ver panel B de la figura 2 y Figura 3).
- Para aclimatación, mantener los ratones dentro del dispositivo de análisis de marcha durante 10 minutos una vez al día comenzando 5 días antes de la cirugía CCI.
Nota: Prueba de análisis de marcha incluyendo la aclimatación debe realizarse en la oscuridad. - Traer los ratones a la sala de prueba para análisis de la marcha y aclimatar en su jaula casa por al menos 30 min antes de la prueba.
- En la ficha Configuración del menú del programa, establecer el " longitud de calzada " 30 cm, y set la " maxima duración " a 5 s y el " máximo de funcionamiento variación " al 50%.
- Seleccionar una cámara de registra de la ' configuración ' ficha de la ' programa ' menú.
- Seleccionar " abrir la adquisición " de la ' adquirir ' ficha de la ' programa ' menú.
- Tras el mensaje de estado, haga clic en el ' snap fondo ' botón para tomar una imagen de fondo de la pasarela de vacío (es decir, espacio en blanco).
- Haga clic en el ' iniciar adquisición ' botón y colocar un ratón en la pasarela; la grabación comienza automáticamente según el movimiento del ratón.
Nota: Cuando el ratón entra claramente a través de la pasarela, el programa automáticamente clasifica este movimiento como " obediente ejecutar " con un icono verde. Si el software no pudo detectar la huella, el experimentador verás un icono rojo y debe repetir la grabación. Al menos cinco carreras compatibles con éxito son necesarios para el análisis. - Después de la prueba, seleccione ' clasificar ejecuta ' desde la ficha de adquisición de la ' programa ' menú.
- Seleccionar las pistas para análisis y haga clic en el ' auto clasificar ' botón.
Nota: Después de la clasificación, todos los parámetros de estadística se guardan automáticamente y el experimentador puede encontrar los resultados haciendo clic en " vista ejecutar estadísticas " en el menú analyze.
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Representative Results
Hemos realizado la prueba de von Frey y automatizado de análisis de la marcha en ratones de la CCI hasta 10 días después de la cirugía de la CCI. Para el análisis estadístico, medidas repetidas de dos vías de análisis de varianza (ANOVA) determina los efectos generales, y se realizó análisis de post-hoc de Dunnett para determinar el valor de p entre los grupos experimentales.
Los resultados que se muestran en la figura 1 indican el curso temporal de los datos de prueba clásica de von Frey. La PWF (%) de los ratones de la CCI fue mayor a 2 días después de la cirugía de la CCI y sostenida durante 10 días en comparación con el grupo Sham. En el grupo de control positivo de CCI, GBP (50 mg/kg, IP, una vez al día durante 10 días se inicia un día después de la cirugía) alivió significativamente mejorado CCI PWF. En el grupo Sham de panel A, PWF (%) fue de 8.00 ± 5.83 en el punto pre-cirugía (Pre), 6,00 ± 2.45 en el día 2, 4.00 ± 2.45 el día 4, ± 2.00 2.00 en el día 6, ± 22.45 el día 8 y 6.00 4.00 ± 2.45 el día 10. En el grupo CCI, PWF (%) fue de 2.86 ± 1.84 en Pre, 61.43 ± 5,95 en el día 2, 68.57 ± 4.59 en el día 4, 72.86 ± 5.22 en el día 6, 75.71 6.49 el día 8 y 75.71 ± 3.69 el día 10. En el grupo CCI + GBP, PWF (%) fue 2.50 ± 1,43 en Pre, 57.50 ± 5.22 día 2, 50.00 ± 4.04 en el día 4, 45,00 ± 4,81 en el día 6, 46.25 5,65 el día 8 y 47.50 ± 4.88 el día 10. En el panel B, el área bajo curva (AUC) fue ± 23.00 6.00 en simulacro, 317.86 ± 17.04 en CCI y 223.75 ± 17.05 en el grupo CCI + GBP.
Los resultados que se muestran en la figura 2 indican un cambio de horario curso del área de impresión de la pata después de la cirugía de la CCI. Datos se muestran como el cambio porcentual del área de impresión de la pata entre las patas traseras derecha e izquierdas. Si el área de impresión de la pata es el mismo en los lados izquierdo y derecho en una situación normal, los datos serán 50%. CCI significativamente reducido área de impresión de la pata de la pata trasera ipsolateral 2 días después de la cirugía y se mantuvo durante 10 días. GBP recuperó notablemente el área de impresión reducida de la pata. En el grupo Sham del panel B, el área de impresión de la pata (%) fue de 50.13 ± 2.13 en Pre, 50.30 ± 1.45 en el día 2, 53.24 ± 0.80 en el día 4, 50.30 ± 1,68 en el día 6, 52.08 ± 1,79 el día 8 y 49.66 ± 2.24 el día 10. En el grupo CCI, el área de impresión de la pata (%) fue de 50.71 ± 3,17 en Pre, 0 ± 0 el día 2, 0 ± 0 en el día 4, 8.86 ± 3,27 en el día 6, 6,6 3.20 el día 8 y 10.30 ± 5,60 el día 10. En el grupo CCI + GBP, el área de impresión de la pata (%) fue de 55.59 ± 2.01 en Pre, 4.65±4.17 en el día 2, 15.18±5.57 el día 4, 20.20 ± 4.00 en el día 6, 26.01 5,53 el día 8 y 28.40 ± 6.04 el día 10.
Los resultados que se muestran en la figura 3 indican el cambio de curso de tiempo de una sola postura después de la cirugía de la CCI. Calcula los datos y se muestra como el porcentaje de cambio (similar a los datos del área de impresión de la pata). CCI reduce la postura única del lado ipsolateral y GBP había recuperado significativamente. En el grupo Sham del panel B, la única postura (%) fue de 49.31 ± 2.15 en Pre, 50.71 ± 0.67 en el día 2, 50.76 ± 0.44 en el día 4, 50,60 ± 1.11 en el día 6, ± ± 0.96 el día 8 y 49.00 51.50 2.35 el día 10. En el grupo CCI, la única postura (%) fue de ± 50.36 3.17 en Pre, 0 ± 0 el día 2, 0 ± 0 en el día 4, 11,5 ± 3.25 en el día 6, 13.61 5.04 el día 8 y 12.94 ± 6.40 el día 10. En el grupo CCI + GBP, la única postura (%) fue 52.35 ± 0,91 en Pre, 5.44 ± 4.87 en el día 2, 18.66 ± 4,33 en el día 4, 25.48 ± 4.10 en el día 6, 30.26 2.17 el día 8 y 32.24 ± 4.95 el día 10.
Figura 1: mecánico allodynia evaluado por test de von Frey en ratones CCI. Frecuencia (A) el retiro de la pata (PWF, %) en el von Frey prueba era mayor a 2 días después de la cirugía de la CCI y sostenida durante 10 días en comparación con el grupo Sham. Gabapentina (GBP, 50 mg/kg, IP) revirtió significativamente la alodinia mecánica inducida por la CCI. (B) datos acumulados de PWF se muestran como área bajo la curva. ** p < 0,01 y *** p < 0.001 versus grupo CCI. Barras de error indican la media ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: área de impresión de la pata por análisis de la marcha automática en ratones CCI. (A) captó imágenes de las patas traseras de los grupos de Sham, CCI y CCI + GBP (gabapentina, 50 mg/kg, IP) por el software de análisis. Rectángulos blancos son indicadores de pata trasera detectado por el sistema de análisis. Tenga en cuenta el menor tamaño de la pata de la CCI y esta reducción fue recuperada en parte por el tratamiento de la GBP. (B) curso temporal del área de impresión de la pata (%). Los datos son calculados como el cambio porcentual de área de impresión entre la pata trasera derecha e izquierda (p. ej., 50% indica que las mismas áreas de impresión de la pata en los lados izquierdo y derecho). * p < 0.05 y ** p < 0.01 versus grupo CCI. Barras de error indican la media ± SD
Figura 3: postura solo por análisis de la marcha automática en ratones CCI. Capturado (A) y se puede convertir imágenes de sola posición resaltada en diferentes colores para cada pata. Observe que el rastro rosa para la pata trasera ipsolateral se acorta en el grupo CCI y gabapentina (GBP, 50 mg/kg, IP) significativamente recuperó de manera similar al nivel de la farsa. (B) curso del tiempo de postura individual (%). Los datos se resumen como un gráfico de línea después de calcular el porcentaje de cambio de postura individual entre la pata trasera derecha e izquierda (p. ej., 50% indica la misma postura solo en los lados izquierdo y derecho). * p < 0.05, ** p < 0,01 y *** p < 0.001 versus grupo CCI. Barras de error indican la media ± SD. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Actualmente, medición del allodynia mecánico mediante el uso de filamentos de von Frey es el más ampliamente utilizado método en modelos animales de dolor para demostrar hipersensibilidad táctil. Como modelos animales de dolor neuropático han seguido a desarrollar, la metodología de evaluación para la función sensorial ha sido también mejorada8,9,10,15. En esos informes, se ha sugerido que estas modificaciones pueden proporcionar un reemplazo más preciso, rápido y fácil de usar para los métodos antiguos. Sin embargo, los datos de estos métodos todavía pueden verse limitados por su subjetividad y el requisito de habilidad o experiencia para realizar el método. Además, restringir los animales no se puede evitar al realizar la prueba de von Frey, y por lo tanto, el estrés relacionado con el alojamiento de los animales puede afectar los resultados de la respuesta de dolor.
El sistema de análisis automatizado de marcha automáticamente mide diversos parámetros del animal a pie (p. ej., área total de contacto de la pata al suelo, ángulo de impresión de la pata, el tiempo de postura, etc.), y por lo tanto, el experimentador puede utilizar datos más objetivos para 13,12,14,16,de análisis de17,18. Además, este método puede realizarse sin ninguna estimulación; por lo tanto, es menos invasiva y pueden obtenerse datos de los roedores libremente móviles. Como se muestra en los resultados de este estudio, la huella de tamaño y tiempo de postura de la pata trasera ipsolateral son reducidos por la cirugía de la CCI y recuperado por tratamiento GBP; resultados similares también se encuentran en el von prueba de Frey. Consistente con observaciones anteriores14, resultados de análisis de la marcha en modelos animales de dolor neuropático tienen un alto grado de correlación positiva con eso de la prueba de von Frey, lo que indica que los parámetros modificados relacionados con el CCI pueden reflejar el grado de de alodinia mecánica, uno de los síntomas más irritantes del dolor neuropático.
Aquí, ofrecemos un método sobre cómo operar el sistema de análisis de marcha automática en detalle y una breve comparación de los datos con la prueba clásica de von Frey en ratones neuropáticos CCI. En conclusión, el análisis de la marcha automática pueden ser que la más mejorada herramienta accesible para el estudio del dolor neuropático debido a es fácil de usar, objetiva y sensible.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por Chungnam University, Corea Instituto Nacional de Medicina Oriental (KIOM) y una donación de Corea salud tecnología R & D proyecto a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud & Bienestar, República de Corea (número: HI15C0007).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.9% Saline | JW Pharmaceutical | N/A | Vehicle for drugs |
| 1ml syringe | BD Plastipak | 300013 | Injecting device |
| 2, 2, 2-tribromoethanol (97% purity) | Sigma | T48402 | Anesthetic |
| 2-methyl-2-buthanol (99% purity) | Sigma | 152463 | Solvent for 2, 2, 2-tribromoethanol |
| Catwalk Automated gait analysis system | Noldus | N/A | Automatic analysis software of aniaml gait |
| Chromic catgut (4-0 thickness) | AILEE | C442 | Ligature to make chronic constriction injury on the sciatic nerve |
| Gabapentin | Sigma | Y0001280 | Analgeisc, Used as a positive control drug in this study |
| Graefe Forceps | F.S.T | 11051-10 | Surgical instrument |
| Heating Pad | DAESHIN ELECTRONICS | M-303AT | Regulation of body temperature |
| ICR Mouse | Samtaco | N/A | Experimental animal |
| Mersilk (3-0 thickness) | ETHICON | W598H | Suture material for surgical closure of skin |
| Micro-Mosquito | F.S.T | 13010-12 | Surgical instrument |
| Micro-scissors | F.S.T | 14090-09 | Surgical instrument |
| Needle holder | F.S.T | 12002-12 | Surgical instrument |
| Povidone Iodine | Firson | N/A | Disinfectant to prevent infection after surgery |
| Scalpel blade | F.S.T | 10010-00 (#10) | Surgical instrument to make an incision |
| Scalpel handle | F.S.T | 10003-12 (#3) | Surgical instrument to make an incision |
| Von-Frey filaments | North Coast | NC12775-99 | Measurement device to test sensory function for mechanical stimulation |
References
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