Summary
ويصف هذا البروتوكول تقنية تستخدم لنموذج زكى الإصابة بعدوى الفيروس من الدماغ البشري. استخدام wildtype أو خطوط الخلايا الجذعية هندسيا، قد الباحثين استخدام هذه التقنية للكشف عن مختلف الآليات أو العلاجات التي قد تؤثر على الإصابة المبكرة بالدماغ وصغر الرأس الناتجة في الأجنة المصابة بالفيروس زكى.
Abstract
ظهور فيروس Zika (زيكف) في السكان عرضه مؤخرا أدى إلى حدوث زيادة مفاجئة في صغر الرأس والشروط النمائية الأخرى في الأطفال حديثي الولادة. بينما البعوض هي الطريق الرئيسي لانتقال العدوى الفيروسية، كما ثبت أن ينتشر عن طريق الاتصال الجنسي والانتقال الرأسي من الأم إلى الجنين. في هذه الحالة الأخيرة لانتقال العدوى، بسبب انتحاء الفيروسية فريدة من نوعها من زيكف، يعتقد أن الهدف الغالب الفيروس الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) من الدماغ.
هنا طريقة لنمذجة الإصابة زيكف، وصغر الرأس الناتجة عن ذلك، التي تحدث عند أورجانويدس الدماغية البشرية تتعرض للعيش زيكف وهو وصف. أورجانويدس عرض مستويات عالية من الفيروس ضمن سكانها السلف العصبية، ويحمل موت الخلايا الشديدة وصغر الرأس مع مرور الوقت. يسمح هذا النموذج ثلاثي الأبعاد أورجانويد الدماغي الباحثين لإجراء تجارب الأنواع المطابقة لمراقبة ويحتمل أن تتدخل مع الإصابة زيكف من الدماغ البشري. النموذج يوفر تحسين مدى صلة أكثر الأساليب القياسية ثنائية الأبعاد، ويحتوي على بنية الخلوية الخاصة بالإنسان والتعبير البروتين التي غير ممكنة في نماذج حيوانية.
Introduction
فيروس زكى (زيكف) قد انتشر بسرعة في ميكرونيزيا، بولينيزيا الفرنسية، والأمريكتين، وأظهرت مؤخرا لعبور حاجز المشيمة1،2 لتصيب المخ الجنين النامي، مما يؤدي إلى الأمراض العصبية النمائية مثل هذه صغر الرأس3،4،،من56 . وقد أدى تأثير طويل الأجل على حياة هؤلاء المرضى، والنقص الحالي في العلاج، والباحثين والأطباء للتدافع لتحقيق فهم أفضل للآليات وراء الإصابة زيكف والنسخ المتماثل. الدراسات السابقة وقد فحص الإصابة زيكف في المختبر نظم في مجموعة متنوعة من الخلية ذات الصلة بالناحية الفسيولوجية أنواع7،،من89، فضلا عن في فيفو10 مع الفئران الأشخاص والمناعة11،،من1213 والمقدمات غير البشرية14،،من1516. وبالإضافة إلى هذه التقنيات التقليدية أكثر، نفذت عدة مجموعات أورجانويدس الدماغي المشتقة من الخلايا الجذعية لفهم المزيد عن الإصابة زيكف من الدماغ البشري. واستخدمت هذه الجماعات البشرية أورجانويدس الدماغي تأكيد17،النمط الظاهري صعل18، التحقيق في مستقبلات مرتبطة بالفيروس دخول19، دراسة الاستجابات الفسيولوجية للإصابة20 , 21، ويحتمل أن تكون الشاشة للمخدرات المرشحين22. هنا هو وصف تقنية لإنتاج وإصابة الخلايا الجذعية المشتقة دماغي أورجانويدس بسرعة، كما هو موضح سابقا،19إلى تحسين الفهم للإصابة زيكف من الدماغ البشري.
منذ أورجانويدس تتشكل من ثقافات القياسية pluripotent الخلايا الجذعية (PSC)، يسمح هذا الأسلوب لمجموعة متنوعة من المسائل العلمية الرد عليها فيما يتعلق بالتهاب فيروسي في الدماغ النامي. على سبيل المثال، قد تستخدم الهندسة كريسبر لتعديل هذه الأسطر PSC قبل الإصابة أورجانويد بوتيرة أسرع من معظم في فيفو الوراثية الدراسات19. بالإضافة إلى ذلك، خلافا لمعرض أورجانويدس في معيار ثقافتين تمايز الأبعاد (2D)، البنية الخلوية المعقدة التي حاسمة بالنسبة كورتيكوجينيسيس، وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن هذا الهيكل قد تتعطل عند الإصابة 21. وأخيراً، أن التكلفة المنخفضة نسبيا لتوليد أورجانويدس يسمح بأعلى إنتاجية التجريب والفحص عند مقارنتها بنماذج في فيفو . من ناحية أخرى، هناك بعض العيوب للاستفادة أورجانويدس لدراسة زيكف. بينما أورجانويدس أكثر بكثير من الناحية البيولوجية ذات الصلة من الثقافات 2D، هناك تحديات إضافية في تقييم أورجانويدس نظراً لطبيعتها (3D) ثلاثي الأبعاد. التصوير وتفكك أورجانويدس يميل إلى إشراك المزيد من المعدات واستثمارا أكبر من الموارد من الثقافات 2D القياسية. بالإضافة إلى ذلك، تفتقر أورجانويدس المفرج والمكونات المناعية التي موجودة في النماذج في فيفو ، حيث ينصح الباحثين المهتمين بهذه الجوانب من العدوى الفيروسية التماس بروتوكولا بديلة.
وهناك عدد من التقنيات لتشكيل أورجانويدس البشرية ونيوروسفيريس في الثقافة، وأنها تقع عادة ضمن فئات منقوشة أو أونباتيرنيد . تنفيذ أساليب منقوشة عوامل لتنظيم Wnt، BMP، TGFβ، ومسارات الإشارات الأخرى لدفع التمايز تجاه الأنساب محددة23. أساليب أونباتيرنيد، مثل تلك الموضحة هنا، الاستفادة من الميل للخلايا الجذعية المستحثة pluripotent (إيبسكس) والخلايا الجذعية البشرية الجنينية (هيسكس) التفريق بين اتجاه نسب نيوروكتوديرمال بالافتراضي24. بعد حوالي ثلاثة أسابيع تمايز، تتكون أورجانويدس الناتجة من الهياكل نيوروبيثيليال المحاكاة البيولوجية الكبيرة، التي تحتوي على العديد من أنواع الخلايا التي لوحظت في الدماغ المبكر.
تقنية لإنتاج أورجانويدس من الثقافات PSC القياسية، وخالية من علبة التغذية بالورق، وتصيب هذه أورجانويدس مع زيكف يرد بالكامل. للتوجيهات بشأن أساليب تثقيف الحاجة PSCs خالية من علبة التغذية بالورق، يرجى الرجوع إلى المنشورات الأساليب السابقة25،26. بالإضافة إلى ذلك، من أجل تطبيق مبالغ متسقة للفيروس لتجارب متعددة، من المهم لحساب وزارة الداخلية قبل الموعد المحدد. ويتم ذلك عن طريق إجراء وي خلايا فيرو، متبوعاً بالعلاج مع تراكب المتوسطة، والحضانة، وإيمونوستينينج. الوصف وأساليب هذا الأسلوب تم وصفه سابقا19،27.
حالما تصل ثقافة PSC إلى التقاء الهدف من 50 ٪-70 ٪، الخلايا ثم فصلها وتجميعها في لوحات 96-كذلك مرفق منخفضة للغاية. الخلايا لمدة 3 أيام في الخلايا الجذعية خالية من كرة صيانة وسائل الإعلام (اللجنة)، وثم تم تحويلها إلى وسائط التعريفي العصبية لما تبقى الثقافة. متى كانت متباينة أورجانويدس لمدة 3 أسابيع، يمكن أن تجري العدوى. بأخذ الصور بشكل روتيني خلال الأسبوع التالي للإصابة، سيراقب الباحثون موت الخلية التدريجي، واضطراب أورجانويد. قد ينأى الباحثون أيضا أورجانويدس في هذا الوقت إجراء النسخي أو التنميط البروتين. ينصح بأساليب كريوسيكتيونينج ولايتشيت للتصوير، والباحثين يمكن أن نتوقع أن نرى مستويات عالية من العدوى والنسخ المتماثل الفيروسية خاصة ضمن سكان الخلية (مجلس الشعب) السلف العصبية أورجانويدس. وفي نهاية المطاف، هذا الأسلوب يسمح الباحثون لدراسة آليات العدوى الفيروسية للدماغ البشري مع معدات منخفضة التكلفة ومحدودية سرعة.
Protocol
1. "إنشاء أورجانويدس الدماغي" من اللجنة التوجيهية/هيس الثقافة 2D (يوم 0)
ملاحظة: هذا البروتوكول يفترض أن تجري صيانة الخلايا الجذعية (SC) في اللجنة المتوسطة مع فيترونيكتين أو جيلتريكس الركيزة. إذا استخدام خلايا الجذعية بديل، عالي البروتين استزراع وسائل الإعلام، فإنه من المستحسن للثقافات SC الانتقال إلى اللجنة للممرات اثنين على الأقل قبل البدء في تشكيل أورجانويد. لم يتم اختبار البروتوكول مع أساليب الثقافة اتفاقية استكهولم على أساس التغذية.
- SC العادية استخدام صيانة الطرق 25 ، 26، جلب الثقافات لالتقاء 50%-70%. هذا عادة 3-4 أيام بعد باساجينج، على الرغم من أن هذا يمكن أن تعتمد على خط الثقافة الطريقة والخلية.
ملاحظة: هناك حاجة الآبار حوالي 2 من لوحة 6-جيدا لإنتاج لوحة كاملة 96-جيدا من أورجانويدس- - تفقد الثقافات عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد في 10 X-20 X التكبير لضمان مورفولوجيا مستعمرة صحية، مع لا تمايز الاكتشاف.
- "اللجنة تجلب" إلى 37 درجة مئوية في حمام الماء الساخن، وذوبان الجليد قنينة 50 ميليلتر من 50 مم Y-27632 (مثبط روك) و 2 مل من كاشف الأنزيمي مفرزة لدرجة حرارة الغرفة.
- إعداد صفيحة جيدا 96 يو-أسفل مرفق منخفضة للغاية (العلا) وماصة P200 الأقنية وخزان كاشف 25 مل.
- مل الكوة 45 للجنة في أنبوب 50 مل مخروطية، وإضافة ميليلتر 45 من 50 مم Y-27632. مزيج دقيق من قبل تريتوراتينج-
- فراغ نضح بئرين المحتوية على الطوائف المنبوذة، وإضافة 1 مل كاشف خالية من إنزيم مفرزة لكل جيدا باستخدام ماصة P1000 بسرعة. احتضان اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية للحد الأدنى 4
- فراغ نضح الآبار المعالجة، وإضافة 1 مل كاشف الأنزيمي مفرزة لكل بئر باستخدام ماصة P1000.
- إينكوباتي اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية أجل مقدار 5 إضافية إزالة اللوحة
- وفحص الآبار المعالجة. اضغط برفق على اللوحة لتفريق الخلايا المجمعة. إذا كانت مجموعات خلية كبيرة لا تزال مرئية، احتضان لوحة ل 2 دقيقة إضافية في 37 درجة جيم كرر هذه الخطوة حتى لم تعد مجموعات مرئية بالعين المجردة.
- مرة واحدة بشكل صحيح يتم فصل الخلايا، إضافة 1 مل اللجنة لكل بئر لإلغاء تنشيط الإنزيمات الانفصال. تجمع مل 4 من تعليق خلية في أنبوب 50 مل مخروطية وتأخذ صغيرة الكوة لخلية العد.
- العودة إلى الحاضنة 37 درجة مئوية أي الآبار المتبقية، غير المعالجة في لوحة الصيانة-
- حين العد، الطرد المركزي بتعليق خلية في 300 غرام x للحد الأدنى 5
- تحديد العدد الإجمالي للخلايا، وحساب مقدار اللجنة + Y-27632 الحل التي ستكون هناك حاجة إلى تحقيق تعليق خلايا/مل 60,000.
- بعناية فراغ نضح المادة طافية وإضافة حجم المحسوبة للجنة + Y-27632 الحل. مزيج من 5-10 مرات مع بيبيت 5 مل، ضمان تعليق خلية موحدة.
- على الفور نقل تعليق خلية في خزان كاشف، و "الماصة؛" 150 ميليلتر في كل بئر من لوحة 96 ش العلا-أسفل البئر باستخدام ماصة P200 الأقنية. وهذا ينتج 96 أورجانويدس الفردية، كل منها في البداية تتكون من خلايا 9,000.
- اللوحة في 150 x ز 1 كحد أدنى للطرد المركزي
- ضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية، وعدم الإزعاج لوحة ل 48 ه.
2. صيانة أورجانويد الدماغي (2 يوم)
ميليلتر- مل 17 التحضير للجنة مع 17 من 50 مم Y-27643 في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. الحارة للجنة + Y-27632 الحل إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء الساخن.
- لوحة أورجانويد من الحاضنة، واستخدام ماصة P200 الأقنية تعيين إلى 75 ميليلتر، رسم ببطء فوق المتوسطة من حافة البئر في الصف الأول. مرة واحدة المتوسط وقد استخلصت، بسرعة طرد الخلف متوسطة في البئر لرفع فضفاضة الخلايا وأورجانويدس. كرر هذا الإجراء لكل صف-
ملاحظة: هذا الأسلوب، يشار إليها فيما " التشتت، " المصاعد الحطام الخلوية وأورجانويد في التعليق. المصارف أورجانويد سرعة إلى أسفل البئر، بينما يبقى الحطام أصغر في تعليق، يسمح لها بإزالتها مع تغيير وسائط. هذا يساعد على منع أورجانويد من الراحة في الحطام الخلوية من خلال الثقافة.- بعد وقد تم تفريق جميع الآبار، انتظر 15 ثانية التأكد من أنه قد غرقت أورجانويدس إلى الجزء السفلي من كل بئر.
- ببطء وبعناية نضح ميليلتر 75 من المتوسطة من كل جيدا باستخدام ماصة P200 الأقنية والاستغناء عن إلى مستودع لنفايات.
ملاحظة: معظم المستخدمين نضح أحياناً أورجانويد خلال إس العادية. وهذا يمكن أن يحدث ما يقرب من 1 في المائة الوقت. الرجاء وفقا لخطة لضمان أن تكفي أورجانويدس البقاء على قيد الحياة للنقاط الزمنية التجريبية. - "اللجنة نقل" + Y-27632 الحل في خزان كاشف، والاستغناء عن 150 ميليلتر في كل أورجانويد جيدا باستخدام ماصة P200 الأقنية.
- وضع اللوحة العودة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
3. صيانة أورجانويد الدماغي (3 يوم)
- الحارة 17 مل اللجنة إلى 37 درجة مئوية، وهذا الوقت دون Y-27643.
- مع ماصة P200 الأقنية تعيين إلى 100 ميليلتر، تفريق جميع الآبار من لوحة أورجانويد (راجع الخطوة 2، 2). الانتظار 15 ثانية التأكد من أن أورجانويدس قد غرقت إلى أسفل آبارهم.
- إعداد مستودع نفايات وتحويل اللجنة المعالجون إلى مستودع مصدر.
- بعناية نضح ميليلتر 125 من المتوسطة من كل بئر، واستبدال 150 ميليلتر من اللجنة الجديدة باستخدام ماصة P200 الأقنية.
- وضع اللوحة العودة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
4. صيانة أورجانويد الدماغي (يوم 4 +)
ملاحظة: إجراء هذه الصيانة العادية كل يوم حتى العدوى.
- قبل أن تبدأ في التغذية على يوم 4، إعداد متوسطة العصبية التعريفي (ني).
قنينة 5 مل
- ذوبان الجليد قاسمة 250 ميليلتر للهيبارين 2 مغ/مل، جنبا إلى جنب مع واحدة من الملحق N-2 X 100. إضافة 250 ميليلتر الهيبارين و 5 مل من 100 X N-2 5 مل من 100 X MEM-نيا إلى 500 مل دميم/جلوتاماكس + F12. تصفية العقيمة الحل المختلط في عامل تصفية 500 مل.
ملاحظة: تبقى ني في 4 درجات مئوية عندما لا تكون قيد الاستعمال؛ ني يستمر لفترة تصل إلى أسبوعين قبل ينبغي إعداد متوسطة جديدة-
- ذوبان الجليد قاسمة 250 ميليلتر للهيبارين 2 مغ/مل، جنبا إلى جنب مع واحدة من الملحق N-2 X 100. إضافة 250 ميليلتر الهيبارين و 5 مل من 100 X N-2 5 مل من 100 X MEM-نيا إلى 500 مل دميم/جلوتاماكس + F12. تصفية العقيمة الحل المختلط في عامل تصفية 500 مل.
- الحارة 17 مل ني المتوسطة إلى 37 درجة مئوية.
- مع ماصة P200 الأقنية تعيين إلى 100 ميليلتر، تفريق جميع الآبار من لوحة أورجانويد (راجع الخطوة 2، 2). الانتظار 15 ثانية التأكد من أن أورجانويدس قد غرقت إلى أسفل آبارهم.
- إعداد مستودع نفايات ونقل ني المعالجون في مستودع مصدر.
- بعناية نضح ميليلتر 125 من المتوسطة من كل بئر، واستبدال مع 125 ميليلتر من ني جديدة باستخدام ماصة P200 الأقنية.
- وضع اللوحة العودة إلى حاضنة 37 درجة مئوية.
5. الإصابة أورجانويد مع زيكف (~ 24 يوم)
ملاحظة: بعد حوالي 3 أسابيع تمايز، أي هناكليرة لبنانية تكون الهياكل الكبيرة نيوروبيثيليال ومآخذ مرئية داخل أورجانويد التي سوف تكون عرضه للإصابة زيكف.
- "جلب إيرل" ' s 1 X متوازن الملح الحل (ابس) وبرنامج تلفزيوني X 1 ني إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء الساخن. تعدد
- ديلوت زيكف تركيز المعروفة في X EBSS 1 للإصابة المستهدفة للعدوى (وزارة الداخلية)-
ملاحظة: ينصح المعايرة أشهر مختلفة تحقيق استجابة جرعة فيروسية. وهذا قد تختلف من سلالة الفيروس؛ 1838 ATCC VR و ATCC VR-1843، قيم موي نموذجي يتراوح بين 0.1 و 10)-
بعناية إزالة - المتوسطة كل من أورجانويد جيدا باستخدام ماصة P200 قناة واحدة. إضافة 200 ميليلتر من 1 X PBS بسرعة إلى كل جيدا باستخدام ماصة الأقنية P200 لغسل أورجانويدس. بعناية إزالة
- المتوسطة كل من أورجانويد جيدا باستخدام ماصة P200 قناة واحدة. بسرعة إضافة 50 ميليلتر من 1 X (العدوى وهمية) ابس فقط أو زيكف الفيروسات الحل جيدا والتأكد من أن أورجانويد هو مغمورة تماما. كرر لكل أورجانويد أن تكون مصابة للدراسة-
- ضع اللوحة مرة أخرى إلى حاضنة 37 درجة مئوية حاء 2
ملاحظة: حضانة أورجانويدس المصابة بوهمية لهذه المدة لا ينبغي أن يؤثر إلى حد كبير على النمو بالمقارنة مع أورجانويدس دون عائق. - حوالي 30 دقيقة قبل الحضانة الفيروسية المكتملة، الكوة 25 مل من ني في أنبوب 50 مل مخروطية، وتجلب إلى 37 درجة مئوية في حمام ماء الساخن.
- بعد الانتهاء من التعرض الفيروسية، أغسل أورجانويدس مع 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني X 1 لكل بئر، والسماح أورجانويدس لتسوية 15 ثانية، ومن ثم إزالة 1 X برنامج تلفزيوني قناة واحدة P200 ماصة باستخدام-
- إضافة 200 ميليلتر من ني الطازجة لكل بئر، ومكان العودة إلى الحاضنة.
- اختياري: لمدة يوم واحد وقت 0 نقطة، قد تكون تصويرها أورجانويدس ساعة واحدة بعد الإصابة.
- متابعة للثقافة بالاستعاضة عن 125 ميليلتر ني كل يوم باستخدام الأسلوب تشتت (راجع الخطوة 4). يجب التأكد من التصرف بشكل صحيح للمستهلك وسائل الإعلام ونصائح، كما يحتوي على جسيمات زيكف المعدية.
Representative Results
خلال اليوم لتشكيل أورجانويد، ينبغي أن تكون الثقافات اتفاقية استكهولم في مرحلة النمو سجل، التي روافد 50 ٪-70 ٪، كما هو مبين في الشكل 1(أ-ج). الثقافات وينبغي أن تشكل مستعمرات مدورة مع حواف مميزة، والآبار التي ينبغي أن تكون واضحة لتمييز الشكل 1(د-ه). إذا كان يتم حدوث التمايز، من المستحسن إجراء اختيار لإزالة لتنظيف المناطق المتضررة داخل اللوحات قبل إنشاء أورجانويدس بيوم واحد على الأقل. إذا هو ميزت جزء كبير من الثقافة، فإنه قد يكون من الضروري إجراء ممر إضافي، وذوبان الجليد قنينة جديدة، أو تغيير تقنيات استزراع الخلايا الجذعية لضمان أن يجري تشكيل أورجانويدس الخلايا الجذعية نقية الثقافات.
الانفصال من جانب مجموعة من مفرزة خالية من إنزيم والانزيميه الكواشف العلاج ينبغي أن يؤدي إلى معظمها خلايا مفردة، على الرغم من أن قد تكون هناك مجاميع صغيرة من الخلايا التي لوحظت أثناء العد. لا تظهر وجود المجاميع الصغيرة لعرقلة تشكيل أورجانويد، على الرغم من أنه قد يؤثر على دقة العد. من المستحسن أن تتم متعددة تهم كل عينة، وإذا كانت التهم تختلف بأكثر من 20%، قد يكون ضروريا زيادة وقت الانفصال جعلها مفردة خلايا أخرى.
وبمجرد الخلايا المصنف ونسج أسفل في لوحة 96 ش العلا-أسفل بئر (الشكل 2ألف)، فستظهر كورقة مسطحة، وكثافة الخلايا في الجزء السفلي من كل بئر. سيتم تجميع الخلايا ببطء على مدى اليومين المقبلين. من الأفضل لا تخل اللوحة خلال هذه الساعات 48، كما قد تعطل قوي ميكانيكية الإجمالية شكلت فضفاضة. خلال الأيام العشرة الأولى، أورجانويد ستظل معظمهم كروية، وسوف تنمو من ميكرومتر ~ 300 إلى 600-800 ميكرون (الشكل 2ب). أكثر هياكل يمكن ملاحظتها تبدأ في الظهور في أورجانويد بين يوم 10 ويوم 20 (الشكل 2ج-ه). يوم 24، الباحثين ينبغي أن تكون قادرة على مراقبة هياكل تشبه روزيت عن طريق الفحص المجهري برايتفيلد (الشكل 2و). مع استمرار الثقافة، قد تزيد هذه الهياكل نيوروبيثيليال في الكمية والحجم على مدى عدة أيام (الشكل 2ز). خلال إس، سيلاحظ الباحث كميات كبيرة من الحطام جمع في الجزء السفلي من كل بئر، لا سيما خلال الأسبوعين الأولين من الثقافة. الأسلوب تشتت الموصوفة في الخطوة 2، 2 يزيل معظم هذا الحطام الخلوية لمنع الأنقاض apoptotic تتراكم على مدى إس متعددة (الشكل 3أ). هذا الحطام يمكن أن تتداخل مع التصوير وأنه يمكن جعله أكثر تحديا لمراقبة وقياس موت الخلية الناجمة عن الإصابة ويجوز لها أن تقدم إشارات غير متماثل إلى أورجانويد المجاورة التي يمكن أن تؤثر على التمايز. إذا كان الأسلوب تشتت تجري بشكل صحيح، وهذا ينبغي أن يكون خفض (الشكل 3ب-ج، 3D-E).
من المستحسن إجراء كريوسيكشنز أو التصوير لايتشيت لفحص البنية القشرية تشكيل داخل أورجانويدس. في يوم 25 أورجانويدس، هياكل روزيت ومناطق البطين تتجلى بوضوح في DAPI (الشكل 4أ) وتلطيخ والرمات-فيمنتين (الشكل 4ب). وجود TBR2 (الشكل 4ج) يشير إلى أن المتكفل المتوسطة تشكل، مع مورفولوجيا توحي بالهجرة إلى الخارج. MAP2 + (الشكل 4د) الخلايا العصبية ملء المناطق الخارجية من كل روزيت. واحدة من هذه البروتينات، وتصور منطقة البطين (VZ) ومنطقة سوبفينتريكولار (SVZ) والمنطقة المتوسطة (عز) ولوحة القشرية (CP) داخل كل روزيت (الشكل 4ه، 4E '). واحد يمكن أن تستمر ثقافة هذه أورجانويدس من أجل مراقبة مراحل لاحقة للتنمية. بينما الطبقات القشرية ليست مكانة بارزة في هذا النوع من أورجانويد، يحدث التحول الطبيعي إلى جليوجينيسيس كثيرا كما يفعل في فيفو. وهذا يمكن ملاحظته في أورجانويدس اليوم 108، الذي أعرب عن جزء كبير من الخلايا MAP2 أو توصيني (الشكل 4و--أنا).
قد تتوقع المستخدمين لرؤية الاختلافات في حجم أورجانويد قبل حوالي 3 أيام بعد الإصابة زيكف، بحسب وزارة الداخلية الفيروسية تطبيق على أورجانويدس (الشكل 5أ-ب). بعد هذه الأيام 3، كما ستكون هناك زيادة في الحطام الخلوية في الآبار المصابة مقارنة بالآبار صورية. وسيزيد هذا الفرق في حجم أورجانويد على مدى الأسبوع التالي، حتى تبدأ أورجانويدس المصابة لكسر بعيداً (الشكل 5ج-د). يمكن استخدام مجموعة متنوعة من الاختبارات في هذه المرحلة التحقيق في آليات العدوى، بما في ذلك استخراج الحمض النووي الريبي الفيروسية وكريوسيكتيونينج (مستحسن الأجسام المضادة التي ذكرت في الجدول للمواد). عند كريوسيكتيونينج، ستحتفل المستخدمين وجود إعداد كبيرة من الفيروس في منطقة قمي الهياكل نيوروبيثيليال، مما يوحي بقابلية الخلايا العصبية السلف (الشخصيات) للإصابة زيكف (الشكل 6). سوف تظهر الفلورة أورجانويدس مقطعة أيضا زيادة في التعبير caspase-3 ملصوق في أورجانويدس المصابة (الشكل 7).
الشكل 1 : مورفولوجيا الخلايا الجذعية مستعمرة قبل تشكيل أورجانويد.
ينبغي أن تكون المستعمرات روافد 50%-70% في وقت الانفصال لإنتاج عدد كبير من أورجانويدس متسقة. (أ) سبرز، الثقافات المصنف مؤخرا لم يبلغوا بعد سجل النمو تدريجيا، ولن تنتج العديد من أورجانويدس. (ب) حالما تصل الخلايا إلى التقاء السليم، أنهم مستعدون للانفصال. من المهم أيضا أن هذه المستعمرات تخضع للتفتيش للتأكد من أنها واضحة للتفريق. (ج) سيتم التوصل إلى التقاء الإفراط المستعمرات التي تتخذ بعيداً جداً ولا ينصح لتشكيل أورجانويد. الثقافات في هذه الحالة من المرجح أن تحتوي على خلايا مميزة. (د) حواف مستعمرة ينبغي أن تكون متميزة، مع الخلية متسقة مورفولوجيا الخلايا مدورة في المركز، وممدود الخلايا نحو الحواف قليلاً. (ه) ينبغي أن تكون المفاضلة الحد الأدنى الحالي في الثقافات. إذا لوحظت في المراكز أو حواف المستعمرات (رؤوس بيضاء) خلايا أكبر حجماً والأرض ويشكلون أكثر من حوالي 1% الثقافة، فمن المستحسن أن فقرات إضافية أو اختيار لإزالة تجري لتشكيل عدد خلايا الجذعية موحدة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2 : أورجانويد الدماغي النمو مع مرور الوقت-
(أ) رسم تخطيطي لإنتاج أورجانويدس الدماغي من 2D PSCs الاحتفاظ في المتوسطة خالية من كرة، خالية من علبة التغذية بالورق. (ب) لمدة 8 أيام الأولى، أورجانويدس سيبقى معظمهم كروية مع عدد قليل من السمات القابلة للاكتشاف. القطر من أورجانويد سوف تتراوح ميكرومتر تقريبا 300 إلى 500 ميكرومتر. (ج-ه) في يوم 10 وسوف تبدأ مناطق أكثر وضوحاً لتكون قابلة للاكتشاف حول محيط أورجانويدس وأنها سوف تفقد شكلها كروي. أنهم سوف تواصل زيادة في الحجم إلى حوالي 1 مم في القطر، ويتوقف إلى حد كبير على خط الخلية المستخدمة لإنتاج أورجانويدس. (و) بعد حوالي 20 يوما تمايز، ستحتفل المستخدمين تكوين هياكل نيوروبيثيليال (رؤوس سوداء) في المناطق الطرفية واضحة في معظم أورجانويدس. يكون لهذه مورفولوجيا مثل الحلبة، مع هياكل قمي والقاعدية محاكاة تلك القشرة النامي. (ز) سوف تواصل هذه الهياكل نيوروبيثيليال في النمو وزيادة في الحجم لما يقرب من 20-30 يوما. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إزالة الحطام الخلوية عن طريق التشتت آر تقنية-
أثناء النمو أورجانويد، وكمية كبيرة من موت الخلية المتوقعة، ويمكن أن يؤدي إلى تراكم الحطام الخلوية المحيطة بقاعدة أورجانويد. (أ) الأسلوب تشتت يصور يسمح الباحثون لإزالة معظم هذا الحطام أثناء كل تغذية. للقيام بذلك، استخدام ماصة P200 الأقنية، رسم ببطء حتى المتوسطة المستخدمة وسرعة طرد لرفع الأنقاض أورجانويد وخلية في التعليق. سوف تنخفض أورجانويد بسرعة إلى أسفل البئر، في الوقت الذي يمكن أن تجري في تغذية منتظمة. أمثلة على أورجانويد يوم 6 قبل (ب) وبعد (ج) تشتت تغذية يبين الحد من الحطام الكبيرة. يستمر هذا لعدة أسابيع، كما يتضح من أورجانويد 18 يوم قبل (د) وبعد (ه) التغذية التشتت. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : وصف أورجانويدس الدماغي عن طريق إيمونوهيستوتشيميستري-
تظهر الصور لايتشيت من أورجانويدس الدماغي لتقديم مثال البنية الخلوية التي تشكل. في يوم 25، DAPI (A) والفوسفور-فيمنتين (ب) تشير إلى مأخذ الفردية ومناطق البطين، على التوالي. (ج) TBR2 تسميات المتكفل الوسيطة التي يتم ترحيلها إلى الخارج، و MAP2 تسميات (د) الخلايا العصبية التي شكلت في لوحة القشرية. (ه، ه ') المزيج من هذه البروتينات يبين بوضوح خلاصة للتنمية القشرية في نماذج أورجانويد الدماغية. (و--أنا) يوم 108، حدث جليوجينيسيس، مع خليط من توصيني + و MAP2 + الخلايا ملء الكثير من أورجانويد. VZ = منطقة البطين، سفز = سوبفينتريكولار المنطقة، عز = متوسط المنطقة، CP = لوحة القشرية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 5 : تدهور المصابة أورجانويدس.
(أ) مجال مشرق الصور وهمية والمصابين زيكف أورجانويدس الدماغي في وزارة الداخلية = 0, 1 و 10. صور اتخذت فورا بعد الإصابة (يوم 0)، فضلا عن 3 و 6 أيام بعد الإصابة. (ب-ج) صور برايتفيلد من حطام الخلايا المحيطة موك (ب) (ج) إصابة زيكف في وزارة الداخلية = 10 أورجانويدس الدماغي 3 أيام بعد الإصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 6 : كريوسيكشن والفلوره للمصابين أورجانويدس.
تعرضت يوم 24 أورجانويدس إلى زيكف في وزارة الداخلية = 0.1، وكريوسيكتيونيد بعد 6 أيام. وفي هذه المرحلة، هناك وجود واضح للفيروس في مناطق البطين، سوبفينتريكولار، والمتوسطة من أورجانويد، حيث تتواجد الخلايا العصبية السلف وإطلاق شعاعي. (أ) عن طريق تلطيخ النووية، هذه المناطق نيوروبيثيليال واضحة للعيان الواجب (الأسهم البيضاء) بكثافة عالية من الأنوية التي تشكل هياكل تشبه الطوق حول سطح قمي. (ب) تلطيخ للمغلف الفيروسي، يستطيع المرء أن يلاحظ وجود مرتفع نسبيا للفيروس داخل هذه الهياكل روزيت (رؤوس بيضاء). علما أن هناك كمية صغيرة من الفيروسات الموجودة في مختلف الخلايا الطرفية مجهولة. (ج-د) MAP2 أو الأخرى الخاصة بالخلايا العصبية البقع تظهر أن هناك الخلايا العصبية الموجودة في الثقافات التي لا يبدو أن تكون مصابة بالفيروس عند مضافين مع وصمة عار الفيروسية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 7 : المشقوق الفلورة caspase-3 من المصابين أورجانويد.
بعد الإصابة، واحد قد تستخدم المؤشرات apoptotic للتحقيق في آليات موت الخلايا التي تحدث داخل أورجانويدس. في هذا المثال، تعرضت يوم 24 أورجانويدس إلى زيكف في وزارة الداخلية = 0.1، وكريوسيكتيونيد بعد 6 أيام. (أ) إظهار أورجانويدس مصابة لا المغلف الفيروسي (2 4 البروتين)، والحد أدنى من ملصوق caspase-3 بسبب التماثل الساكن المبرمج التي تحدث في الأنسجة. (ب) يبدأ مأخذ المصابة لإظهار مستويات متزايدة من المبرمج. (ج) مأخذ التي تظهر شديدة العدوى عن طريق 2 4 تلطيخ أيضا تميل إلى مستويات عالية من ملصوق caspase-3 في هذه المناطق. وهناك علاقة مباشرة بين شدة الإصابة وملصوق caspase-3 التعبير داخل مأخذ المصابة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Discussion
وهناك العديد من المحاذير أخذها في الاعتبار عند استخدام أورجانويدس المخ البشري للتحقيق في الإصابة زيكف. أحد الاعتبارات المهمة هو أن تشكيل أورجانويد وهيكل يعتمد اعتماداً كبيرا على خط الخلايا الجذعية التي تتشكل منها. العناية عند مقارنة بين خطوط الخلايا، بما في ذلك خطوط هندستها اسوي؛ فمن الأفضل لجعل استنتاجات استخدام سوبكلونيس متعددة، ومن الناحية المثالية من خطوط الخلايا الجذعية متعددة. بالإضافة إلى ذلك بسبب هذا الاختلاف في خطوط الخلايا، يوصي بتجارب رائدة لضمان حدوث تمايز السليم في أورجانويدس. في حين تظهر بالفحص المجهري برايتفيلد الهياكل نيوروبيثيليال، يقترح أيضا إجراء تجارب بكر قرة أو كريوسيكتيونينج للبحث عن علامات التمايز العصبية مثل PAX6 أو فيمنتين والرمات.
وينبغي أن المرء أيضا تباين كبير بين أورجانويدس داخل نفس خط الخلية. نظراً لطبيعة البروتوكول أونباتيرنيد، يمكن أن تختلف عدد وحجم هياكل نيوروبيثيليال بين أورجانويدس الفردية. عادة، يمكن أن نتوقع على الأقل اثنان كبير (> 200 ميكرومتر في القطر ب D24) مأخذ العصبية الواحدة أورجانويد. لهذا السبب، الدراسات الطولية، مثل مراقبة التغيير في حجم أورجانويد عند الإصابة، لا سيما المنير. التباين بين دفعات قد يحدث أيضا، مع السبب الأرجح لذلك يجري عد الخلايا غير دقيقة أو البذر. من المستحسن القيام بتهم متعددة والتأكد من تعليق خلية يختلط جيدا قبل البذر على لوحات 96 ش العلا-أسفل البئر.
عند استزراع أورجانويدس في لوحات 96 ش العلا-أسفل البئر، خطة بشأن رؤية آثار التبخر كبيرة حول حواف الصفائح. ومثالي لملء هذه الآبار مع برنامج تلفزيوني وتعمل فقط مع الآبار 60 مركز. بسبب التبخر، أورجانويدس في الآبار الخارجي سوف يتعرض لظروف مختلفة عن تلك الموجودة في المركز، والتي يرجح أن تؤثر على النمو والتمايز. يرجى النظر في هذا عند التخطيط لعدد أورجانويدس التي ستكون هناك حاجة لإجراء تجارب عليها. بالإضافة إلى ذلك، سوف يبدأ أورجانويدس كسا شكل 96-جيدا بعد 30 يوما تقريبا، التي ستكون مرئية بسبب تلون الثقافة المتوسطة. إذا تخطط لأخذ أورجانويدس في الماضي 30 يوما، فمن المستحسن نقل أورجانويدس إلى لوحة العلا 24-جيدا. إجراء النقل واستخدام مقص لقص تلميح P1000 حيث يكون الافتتاح أكبر بكثير من أورجانويدس أنفسهم، ونقل أورجانويدس واسطة بيبيتينج.
أورجانويدس المخ البشري إمكانات كبيرة في تعزيز الفهم للحقل للنماء العصبي والأمراض. الباحثون مدعوون إلى تعديل البروتوكول على النحو اللازم. على سبيل المثال، يمكن تنفيذ أحد العوامل الزخرفة لتحسين كفاءة التمايز تجاه أنواع خلية معينة، والسماح لهم لاستكشاف آثار الفيروسية في بعض المناطق التشريحية. آثار عصبية زيكف هي لا تزال غير مفهومة، ولكن هذا النهج الجديد سوف تعطي الباحثين بطريقة ميسرة وسريعة، والفائق التحقيق آليات العدوى.
Disclosures
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون بريسيلا لام يانغ وبوري جيه دومينيك من مدرسة هارفارد الطبية للمساعدة في النشر الأولى والتحديد الكمي زيكف. كما نود أن نشكر ناثانيل دال كيركباتريك لدعم التصوير. وأيد المركز ستانلي K.E. للبحوث النفسية ومعهد الخلايا الجذعية في جامعة هارفارد.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
