Summary
Этот протокол описывает метод, используемый для моделирования Зика вирусной инфекции развивающегося человеческого мозга. С помощью wildtype или инженерных стволовых клеточных линий, исследователи могут использовать эту технику для раскрыть различные механизмы или процедуры, которые могут повлиять на ранней инфекции головного мозга и полученный микроцефалия Зика вирусом эмбрионов.
Abstract
Недавнее появление Зика вируса (ZIKV) в восприимчивых групп населения привело к резкое увеличение микроцефалия и других условий психомоторного развития у новорожденных. Хотя комаров являются основные пути передачи вируса, оно также было показано для распространения через половой контакт и вертикальной передачи матери и плода. В этом последнем случае передачи, благодаря уникальной вирусный тропизм ZIKV вирус считается преимущественно целевой нейронных прогениторных клеток (НПС) развивающегося мозга.
Здесь метод для моделирования ZIKV инфекции и результирующая микроцефалия, которые возникают, когда человеческого мозга organoids подвергаются жить ZIKV описано. Organoids отображения высокий уровень вируса в пределах их нейронных прародитель населения и тяжелой клеточной смерти и микроцефалия с течением времени. Эта модель трехмерной мозгового органоид позволяет исследователям проводить эксперименты, подобранных видов, наблюдать и потенциально вмешаться с ZIKV инфекцией развивающегося человеческого мозга. Модель обеспечивает улучшение релевантности над стандартной двумерной методами и содержит специфичные для человека сотовой архитектуры и выражение протеина, не возможны в животных моделях.
Introduction
Зика вирус (ZIKV) быстро распространился в Микронезии, Французская Полинезия и Америки и недавно было показано, чтобы пересечь плацентарный барьер1,2 , чтобы заразить развивающегося мозга плода, приводит к заболеваниям нервной такого микроцефалия3,4,5,6 . Долгосрочное воздействие на жизнь этих пациентов и отсутствие лечения, в настоящее время привела исследователей и клиницистов карабкаться для лучшего понимания механизмов за ZIKV инфекции и репликации. Предыдущие исследования изучили ZIKV инфекции в vitro систем в различных физиологически соответствующие ячейки типов,78,9, а также в естественных условиях10 с иммунокомпетентных и ослабленным мышей11,12,13 и нечеловеческих приматов14,,1516. Помимо этих более традиционные методы несколько групп осуществили стволовых клеток мозга organoids понять больше о ZIKV инфекции развивающегося человеческого мозга. Эти группы использовали человеческого мозга organoids для подтверждения микроцефалия фенотип17,18, расследовать рецепторы, связанные с вирусом запись19, изучать физиологические реакции на инфекции20 , 21и, возможно, экран для наркотиков кандидатов22. Здесь описана методика для быстрого производства и заражение мозга organoids стволовых клеток, полученных, как показано ранее19, чтобы улучшить понимание ZIKV инфекции развивающегося человеческого мозга.
Так как organoids формируются из стандартных плюрипотентных стволовых клеток (PSC) культур, эта техника позволяет для различных научных вопросов ответы относительно вирусной инфекции развивающегося мозга. Например ТРИФОСФАТЫ инженерия может использоваться для изменения эти PSC линии до органоид инфекции более быстрыми темпами, чем большинство в vivo генетических исследований19. Кроме того в отличие от стандартных двух размеров (2D) дифференциация культур, organoids экспонат комплекса сотовой архитектуры, которая имеет решающее значение для corticogenesis, и недавние исследования показали, что эта архитектура может быть нарушена при инфекции 21. Наконец относительно низкая стоимость генерации organoids позволяет выше пропускная способность экспериментов и скрининга по сравнению с моделями в естественных условиях . С другой стороны есть некоторые недостатки использования organoids учиться ZIKV. В то время как organoids биологически гораздо более актуальными, чем 2D культур, есть дополнительные проблемы в оценке organoids ввиду их трехмерные (3D). Изображений и диссоциации organoids стремится привлекать больше оборудования и больших инвестиционных ресурсов, чем стандартные 2D культур. Кроме того organoids отсутствие сосудистую и иммунологические компонентов, которые присутствуют в естественных условиях модели, поэтому исследователей, заинтересованных в те аспекты вирусной инфекции рекомендуется искать альтернативный протокол.
Существует ряд методов для формирования человека organoids и neurospheres в культуре, и они обычно подпадают под рисунком или неупорядоченный категории. Узорные методы реализуют факторы регулирования Wnt, BMP, TGFβ и других сигнальных путей, добиваться дифференциации сторону конкретных линий23. Неупорядоченный такие методы, как один описаны здесь, воспользуйтесь склонность к индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) и человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) дифференцировать сторону нейроэктодермальная линии по умолчанию24. После примерно трех недель дифференциации результирующий organoids состоят из больших, biomimetic нейроэпителиальных структур, которые содержат несколько типов клеток, которые наблюдаются в начале развивающегося мозга.
Техника для производства organoids от стандартных, фидер бесплатно PSC культур и заражение этим organoids с ZIKV представлена в полном объеме. Руководство по культивирования методы, необходимые для подачи Бесплатный уик обратитесь к предыдущим методы публикации25,26. Кроме того для того, чтобы применить последовательное количество вируса для нескольких экспериментов, важно рассчитать MOI впереди времени. Это делается путем проведения инфекцию клеток Веро, следуют обращения с среднего оверлея, инкубации и иммуноокрашивания. Описания и методов этой техники были ранее описанных19,27.
PSC культуры при достижении целевого объекта слияния 50-70%, клетки затем отделить и агрегированы в ультра-низким насадку 96-луночных пластины. Клетки для 3 дней в средствах массовой информации содержание xeno бесплатно стволовых клеток (ПКВВ) и затем преобразуется в нейронной индукции СМИ на оставшуюся часть культуры. Как только organoids имеют дифференцированные за 3 недели, инфекция может проводиться. Регулярно принимая изображения в течение недели после инфицирования, исследователи будут соблюдать прогрессивного клеточной смерти и нарушение органоид. Исследователи также может отделить organoids в это время проводить транскрипционный анализ или proteomic профилирования. Методы Cryosectioning и lightsheet рекомендуются для обработки изображений, и исследователи могут ожидать высокий уровень инфекции и вирусной репликации, особенно в пределах нейронных прогениторных клеток (NPC) населения в organoids. В конечном счете эта техника позволяет исследователям быстро изучить механизмы вирусной инфекции мозга человека с низкой стоимостью и ограниченным оборудования.
Protocol
1. Создание мозгового Organoids с iPSC / Госкомсанэпиднадзором 2D культуры (день 0)
Примечание: этот протокол предполагает, что содержание стволовых клеток (СК) проводится в среде ПКВВ с vitronectin или Geltrex субстрат. При использовании альтернативного, высоким содержанием белка клеточной культивирования СМИ, рекомендуется переход SC культур ПКВВ для по крайней мере два прохода до начала формирования органоид. Протокол не было протестировано на основе подачи SC культуры методами.
- Использование регулярных SC обслуживания методы 25 , 26, принести культур до 50% - 70% слияния. Обычно это 3-4 дней после пассированый, хотя это может быть зависимыми от культуры метода и клеток линии.
Примечание: Приблизительно 2 скважины от 6-ну пластины необходимо производить полный 96-луночных тарелку organoids. - Проверить культур через brightfield микроскопии в 10 X-20 крат для обеспечения здорового колонии морфологии, не поддающиеся обнаружению дифференциации.
- Принесите ПКВВ до 37 ° C в ванну с горячей водой и оттепели 50 мкл флаконе 50 мм Y-27632 (ингибитор рок) и 2 мл реагента ферментативные отряд до комнатной температуры.
- Подготовить ультра-низким насадку (Ула) 96 U-дно хорошо пластины, многоканальные пипетки Р200 и водохранилище 25 мл реактива.
- Аликвота 45 мл ПКВВ в 50-мл Конические трубки и 45 мкл 50 мм Y-27632. Смесь тщательно на истирание.
- Вакуумный аспирационная две скважины, содержащих SCs и быстро добавить 1 мл реагента фермента бесплатно отряд в каждой хорошо с помощью пипетки P1000. Инкубировать пластину в инкубаторе 37 ° C на 4 мин
- Вакуумный аспирационная обрабатываемой скважины и добавьте 1 mL реагента ферментативные отряд для каждой скважины с помощью пипетки P1000.
- Инкубировать пластину в инкубаторе 37 ° C для еще 5 минут
- Удалить пластину и изучить обрабатываемой скважины. Осторожно нажмите на пластину порвать агрегированных клетки. Если кластеры больших клеток до сих пор видны, инкубировать пластину для 2 дополнительных минут при 37 ° C. повторить этот шаг до тех пор, пока кластеры больше не видны невооруженным глазом,.
- После того, как клетки правильно отделить, добавить 1 мл ПКВВ каждой скважины для деактивации диссоциации ферментов. Бассейн 4 мл суспензии клеток в 50-мл Конические трубки и взять небольшой аликвота для подсчета клеток.
- Вернуть инкубатора 37 ° C любые оставшиеся, неочищенные скважин в пластину обслуживания.
- Во время подсчета голосов, центрифуга суспензию клеток на 300 g x 5 мин
- Определить общее количество клеток и рассчитать количество ПКВВ + Y-27632 решения, которые будут необходимы для достижения 60 000 клеток/мл суспензии.
- Тщательно вакуум аспирацию супернатант и добавить вычисляемый объем ПКВВ + Y-27632 решения. Смешайте 5 - 10 раз с 5 мл пипетки, обеспечение единой клетки подвеска.
- Немедленно передавать суспензию клеток в водохранилище реагента и Пипетка 150 мкл в каждой скважине ULA U-дно 96-луночных пластины с помощью многоканальных дозаторов Р200. Это производит 96 отдельных organoids, каждый первоначально состоящий из 9000 клеток.
- Центрифуга пластину на 150 x g за 1 мин
- Установите пластину в инкубаторе 37 ° C и не беспокоить плиты для 48 ч.
2. Церебральный органоид обслуживания (день 2)
- подготовить 17 мл ПКВВ с 17 мкл 50 мм Y-27643 в 50-мл Конические трубки. Теплый ПКВВ + Y-27632 решение до 37 ° C в ванне с горячей водой.
- Взять органоид пластина из инкубатора и с помощью многоканальных дозаторов Р200 равным 75 мкл, медленно составить среднего от края колодца в первой строке. После того, как был составлен среды, быстро высылать средних обратно в скважину поднять вверх свободные клетки и organoids. Повторите это действие для каждой строки.
Примечание: Этот метод, именуемый " дисперсии, " поднимает сотовой мусора и органоид в подвеска. Органоид быстро опускается на дно колодца, в то время как в подвеску, позволяя ему быть удалены с изменением СМИ остается меньше мусора. Это помогает предотвратить органоид от отдыха в сотовой мусора во время культуры.- После того, как все скважины были разогнаны, подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части каждой скважины.
- Медленно и осторожно аспирационная 75 мкл среды от каждой хорошо с помощью многоканальных дозаторов Р200 и отказаться от отходов водохранилище.
Примечание: Большинство пользователей время от времени аспирационная органоид во время регулярных каналов. Это может произойти примерно 1% из времени. Пожалуйста, планируйте соответственно обеспечить, что достаточно organoids дожить до времени экспериментальных точек. - Передачи ПКВВ + Y-27632 раствора в пласт реагентов и отказаться от 150 мкл в каждой органоид, хорошо с помощью многоканальных дозаторов Р200.
- Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.
3. Церебральный органоид техническое обслуживание (3 день)
- теплый 17 мл ПКВВ до 37 ° C, это время без Y-27643.
- С многоканальные пипетки P200, равным 100 мкл, разогнать все скважины органоид плиты (см. шаг 2.2). Подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части их скважин.
- Подготовить отходов водохранилища и передачи утепленные ПКВВ в источник водохранилище.
- Тщательно аспирационная 125 мкл среды от каждой скважины и заменить 150 мкл свежих ПКВВ, используя многоканальные пипетки Р200.
- Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.
4. Церебральный органоид техническое обслуживание (день 4 +)
Примечание: проводить это регулярное техническое обслуживание каждый день до инфекции.
- Перед началом канала на 4 день, подготовить среднего нейронной индукции (NI).
- Оттепель 250 мкл Алиготе 2 мг/мл гепарина, вместе с 5 мл флакон 100 X N-2 дополнения. Добавьте 250 мкл концентрированного препарата гепарин, 100 X N-2 5 мл и 5 мл 100 X MEM-NEAA в 500 мл DMEM / F12 + GlutaMAX. Стерильными фильтр смешанного решения в фильтре 500 мл.
Примечание: Держите NI на 4 ° C, когда не в пользе; NI длится до двух недель, прежде чем свежие среднего должен быть подготовлен.
- Оттепель 250 мкл Алиготе 2 мг/мл гепарина, вместе с 5 мл флакон 100 X N-2 дополнения. Добавьте 250 мкл концентрированного препарата гепарин, 100 X N-2 5 мл и 5 мл 100 X MEM-NEAA в 500 мл DMEM / F12 + GlutaMAX. Стерильными фильтр смешанного решения в фильтре 500 мл.
- Теплый 17 мл NI средних 37 ° C.
- С многоканальные пипетки P200, равным 100 мкл, разогнать все скважины органоид плиты (см. шаг 2.2). Подождите 15 s для обеспечения что organoids канули в нижней части их скважин.
- Подготовка отходов водохранилища и передачи утепленные NI в исходный резервуар.
- Тщательно аспирационная 125 мкл среды от каждой скважины и заменить 125 мкл свежих NI с помощью многоканальных дозаторов Р200.
- Место пластину обратно в инкубатора 37 ° С.
5. Органоид инфекции с ZIKV (~ 24 день)
Примечание: после приблизительно 3 недели дифференциации, там wiLL быть большой нейроэпителиальных структур и розеток, видимый в пределах органоид, что будет очень чувствительны к инфекции ZIKV.
- Принести Эрл ' s 1 X сбалансированный соли раствора (EBSS), 1 X PBS и NI до 37 ° C в ванне с горячей водой. Кратность
- развести ZIKV известной концентрации в 1 X EBSS к целевой инфекции инфекции (МВД).
Примечание: Титрование различных MOIs рекомендуется для достижения дозу вирусного ответа. Это может варьироваться от штамма вируса; для ATCC VR-1838 и ATCC VR-1843, типичный MOI значения в диапазоне между 0,1 и 10). - Тщательно удалить все среднего из органоид, хорошо с помощью пипетки Р200 один канал. Быстро добавить 200 мкл ПБС в каждой хорошо с помощью Р200 многоканальные пипетки мыть organoids.
- Тщательно удалить все среднего из органоид, хорошо с помощью пипетки Р200 один канал. Быстро добавьте 50 мкл 1 X EBSS-только (макет инфекции) или ZIKV вирус решение хорошо и убедитесь, что органоид полностью погружены. Повторите эти действия для каждого органоид, который должен быть инфицированы для изучения.
- Место пластину обратно в 37 ° C-инкубатор для 2 х.
Примечание: Инкубации макет инфицированных organoids за этот срок не должен значительно снижают их роста по сравнению с ненарушенных organoids. - Около 30 мин до вирусной инкубации завершена, аликвота 25 мл NI в 50-мл Конические трубки и довести до 37 ° C в ванне с горячей водой.
- После завершения вирусных воздействия, мыть organoids с 200 мкл ПБС для каждой скважины, позволяют organoids соглашаться на 15 s, а затем удалить 1 X PBS с помощью пипетки одноканальный Р200.
- Добавить 200 мкл свежие NI для каждой скважины и место обратно в инкубаторе.
- Дополнительно: за сутки 0 время точка, organoids может быть imaged один час после инфекции.
- Продолжать культуры, заменив 125 мкл NI каждый день, с помощью метода дисперсии (см. шаг 4). Не забудьте правильно утилизируйте отработанные средств массовой информации и советов, как это содержит инфекционные частицы ZIKV.
Representative Results
В течение дня формирования органоид SC культур должно быть в фазе роста журнала, в котором они находятся 50% - 70% притока, как показано на рисунке 1(A-C). Культуры должны образуют округлый колонии с различных краев, и скважин должна быть четкой дифференциации Рисунок 1(D-E). Если происходит дифференциация, рекомендуется провести выбрать для удаления для очистки в пострадавших районах в рамках пластины по крайней мере за один день до создания organoids. Если большая часть культуры продифференцировано, необходимо проводить дополнительный проход, оттепель новый флакон или изменять методы культуры стволовых клеток для обеспечения что organoids формируются культур чистой стволовых клеток.
Диссоциация сочетание лечения реагенты отряд фермента бесплатная и ферментных должно привести к главным образом одиночных клеток, хотя там может быть небольшой агрегаты клеток наблюдается во время подсчета голосов. Наличие небольших агрегатов не сорвать формирование органоид, хотя оно может повлиять на точность подсчета голосов. Рекомендуется, что несколько графов производятся за образец, и если счетчики различаются более чем на 20%, это может быть необходимо увеличить время диссоциации множественном числе клетки далее.
После того, как клетки являются семенами и закрученная вниз в ULA U-дно 96-луночных плиты (рисA), они будут отображаться как плоские, плотный лист клеток в нижней части каждой скважины. Клетки будет медленно собирать в течение следующих двух дней. Это лучше не мешать пластину во время этих 48 часов, как механических сил может нарушить слабо сформированные агрегатной функции. Для первых 10 дней органоид останется главным образом сферической и будет расти от ~ 300 мкм до 600-800 мкм (рис. 2B). Более заметных структур начинают появляться в органоид между 10 и 20 день (рис. 2C-E). Днем 24 Исследователи должны быть в состоянии соблюдать розетка подобных структур через brightfield микроскопии (Рисунок 2F). Продолжая культуры, эти структуры нейроэпителиальных может увеличение количества и размера в течение нескольких дней (рис. 2G). Во время каналы исследователь заметите значительное количество мусора, собирая в нижней части каждой скважины, особенно в течение первых 2 недель культуры. Дисперсия метод, описанный в шаге 2.2 удаляет большую часть этой сотовой мусора, чтобы предотвратить apoptotic мусора накапливается над несколько каналов (рисA). Этот мусор может мешать изображений, это может сделать его более сложным для наблюдения и количественно инфекции индуцированной клеточной смерти, и она может обеспечить асимметричный сигнализации для соседних органоид, которые могут повлиять на дифференциации. Если метод дисперсии проводится должным образом, это должно быть сокращено (рис. 3-Б, 3D-E).
Рекомендуется проводить cryosections или lightsheet изображений для проверки корковой структуры формирования в рамках organoids. В день 25 organoids розетка структуры и желудочковая зоны хорошо видны в DAPI (рис. 4A) и пятнать фосфо виментин (Рисунок 4B). Наличие TBR2 (рис. 4C) указывает промежуточные прародителями формования, с морфологии, что предполагает внешней миграции. MAP2 + (рис. 4D) нейронов заполнить внешнее регионах каждой розетки. Из этих белков, можно визуализировать Вентрикулярная зона (VZ), Субвентрикулярная зона (SVZ), промежуточная зона (IZ) и корковые пластины (CP) в пределах каждой розетки (рис. 4E, 4E'). Можно продолжить культуры эти organoids для того чтобы наблюдать более поздних стадиях развития. В то время как корковых слоев не как видно в этом типе органоид, естественный переход к глиогенез происходят гораздо как это делает в естественных условиях. Это можно наблюдать в день 108 organoids, в котором большая часть клеток выразить MAP2 или СВМС (рис. 4F-I).
Пользователи могут ожидать увидеть различия в размерах органоид, приблизительно 3 дня после ZIKV инфекции, в зависимости от вирусных MOI, применяется к organoids (рис. 5A-B). После 3 дней также будет увеличение в сотовой мусора в зараженные колодцы, по сравнению с макет скважин. Эта разница в органоид размер будет увеличиваться на следующей неделе, до тех пор, пока зараженных organoids начинают нарушать друг от друга (рис. 5C-D). Целый ряд анализов может использоваться на данный момент для изучения механизмов инфекции, включая вирусной РНК добыча и cryosectioning (рекомендуется антител, сообщается в таблице материалов). После cryosectioning пользователи будут наблюдать значительное присутствие вируса в регионе апикальной нейроэпителиальных структур, предлагая нейронных прогениторных клеток (НПС) подверженность инфекции ZIKV (рис. 6). Иммунофлюоресценции секционного organoids также покажет увеличение экспрессии рассеченного каспазы-3 в зараженных organoids (рис. 7).
Рисунок 1 : Морфология стволовых клеток колонии до формирования органоид.
Колонии должно быть 50% - 70% притока в то время диссоциации производить большое количество последовательно organoids. (A) Sparse, недавно посеяны культуры еще не достигли роста журнала этап и не будет производить много organoids. (B) после того, как клетки достичь надлежащего слияния, они готовы к диссоциации. Важно также, что эти колонии досмотр, позволяющий убедиться, что они ясны дифференциации. (C) колонии, которые принимаются слишком далеко достигнет чрезмерной слияния и не рекомендуются для формирования органоид. Культур в этом состоянии, скорее всего, содержат дифференцирования клетки. (D) колонии края должны быть различны, с последовательным клеток морфология округлые клеток в центре и слегка удлиненные клетки к краям. (E) минимальные различия должны присутствовать в культурах. Если большие, плоские клетки наблюдаются в центры или края колоний (белые стрелки) и составляют более чем примерно 1% культуры, то рекомендуется, что выбрать для удаления или дополнительные проходы проводятся сформировать единый стволовых клеток населения.
Рисунок 2 : Церебральный органоид рост с течением времени.
(A) схему для производства мозгового organoids из 2D ЦОНов поддерживается в xeno бесплатно, фидер средний. (B) за первые 8 дней, organoids останется главным образом сферические с несколько обнаружению функций. Диаметр органоид будет варьироваться от приблизительно 300 мкм до 500 мкм. (C-E) на 10 день, яснее регионов начнет поддаваться обнаружению вокруг периферии organoids, и они потеряют их сферическую форму. Они будут продолжать увеличиваться в размере примерно 1 мм в диаметре, в значительной степени в зависимости от линии клетки, используется для производства organoids. (F) после примерно 20 дней дифференциации, пользователи будут наблюдать формирование структур (черные стрелки) нейроэпителиальных в ясно периферийных регионах большинство organoids. Они имеют кольца как морфология, с апикальной и базальных структур, подражая тех развивающихся коры. (G) эти нейроэпителиальных структуры будет продолжать расти и увеличение размера приблизительно 20-30 дней. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Очистка сотовой мусора через дисперсии кормить техника.
Во время роста органоид, большое количество клеточной смерти ожидается и может привести к накоплению сотовой мусора вокруг базы органоид. (A) изображены дисперсии техника позволяет исследователям удалить большую часть этого мусора во время каждого канала. Чтобы сделать это, используя многоканальные пипетки P200, медленно составить используется средний и быстро изгнать его поднять органоид и ячейки мусор в подвеска. Органоид быстро упадет на дно колодца, на которой может проводиться регулярное питание. Примеры 6 день органоид до (B) и после кормления дисперсии (C) показывает значительные мусора сокращения. Это продолжается в течение нескольких недель, как показано в день 18 органоид перед (D) и после кормления дисперсии (E) . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : Характеристика мозгового organoids через иммуногистохимия.
Показано, что Lightsheet изображения мозга organoids являют собой пример сотовой архитектуры, которая формирует. В день 25, DAPI (A) и фосфор виментин (B) указывают отдельные розетки и желудочковая зон, соответственно. (C) TBR2 этикетки промежуточных прародителей, которые переносятся наружу и MAP2 (D) этикетки нейронов, которые сформировались в пластину кортикального слоя. (E, E') Сочетание этих белков ясно показывает резюме корковых развития церебрального органоид моделей. (Ф-я) В день 108 произошла глиогенез, смесью СВМС + и MAP2 + заполнение большую часть органоид клетки. VZ = Вентрикулярная зона, SVZ = Субвентрикулярная зона, IZ = промежуточная зона, CP = корковых пластины. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5 : Деградация зараженных organoids.
(A) светлые области изображения макет и ZIKV-инфицированных мозгового organoids в MOI = 0,1 и 10. Снимки были сделаны сразу после заражения (день 0), а также 3 и 6 дней после инфицирования. (B-C) Brightfield изображения мусора клеток, окружающих макет (B) и (C) ZIKV-инфицированных в MOI = 10 мозговой organoids 3 дней после инфицирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 6 : Cryosection и иммунофлюоресценции из инфицированных organoids.
День 24 organoids были подвержены ZIKV в МВД = 0.1 и cryosectioned 6 дней спустя. На данном этапе существует четкое наличие вируса в желудочков, субвентрикулярной и промежуточной зонах органоид, где проживают нейронных прогениторных клеток и радиальной глии. (A) через ядерных окрашивание, эти регионы нейроэпителиальных хорошо видны из-за (белые стрелки) до высокой плотности ядер, которые формируют кольцо как структуры вокруг апикальной поверхности. (B) путем пятнать для вирусного конверт, можно наблюдать относительно высокой присутствие вируса в этих структурах розетка (белые стрелки). Обратите внимание, что существует небольшое количество вируса присутствует в различных неопознанных периферийные клетки. (C-D) MAP2 или другой нейрон конкретных пятна показывают, что есть нейроны в культурах, которые не заражены вирусом при наложении с вирусной пятно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7 : Расщепляется каспазы-3 иммунофлюоресценции зараженных органоид.
После инфекции можно использовать показатели apoptotic расследовать механизмы смерти клетки, которые происходят в пределах organoids. В этом примере, день 24 organoids были подвержены ZIKV в МВД = 0.1 и cryosectioned 6 дней спустя. (A) неинфицированных organoids показать не вирусный конверт (4 g 2 белка) и минимальное количество рассеченного каспазы-3 за счет гомеостатических апоптоза, происходящих в тканях. (B) зараженные розеток начинают показывать повышение уровня апоптоза. (C) розетки, которые показывают тяжелой инфекции через 4 g 2 окрашивания также склонны проявлять высокий уровень рассеченного каспазы-3 в этих регионах. Существует прямая корреляция между тяжести инфекции и рассеченного каспазы-3 выражения внутри инфицированных розеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Есть несколько моментов, нужно учитывать при использовании человеческого мозга organoids расследовать ZIKV инфекции. Одно из важных соображений является что органоид формирование и структура сильно зависит от линии стволовых клеток, из которых они формируются. Соблюдайте осторожность при сравнении между клеточных линий, включая isogenic инженерных линий; Это лучше сделать выводы, используя несколько subclones и в идеале несколько линий стволовых клеток. Кроме того благодаря этой разнице в клеточных линий, рекомендуется экспериментальные опыты для обеспечения надлежащего разграничения происходит в organoids. В то время как нейроэпителиальных структуры видны brightfield микроскопии, предлагается также проводить эксперименты qRT ПЦР или cryosectioning искать нейронных дифференциация маркеры например PAX6 или фосфо виментин.
Следует также ожидать значительной изменчивости среди organoids в пределах одной и той же линии клеток. Из-за неупорядоченный характер протокола количество и размер нейроэпителиальных структур может варьироваться между отдельными organoids. Как правило, можно ожидать по крайней мере две большие (> 200 мкм в диаметре D24) Нейронные розетки за органоид. По этой причине продольного исследования, например, наблюдение изменений в размер органоид после инфекции, особенно поучительный. Изменчивость между партиями возможны также, с наиболее вероятной причиной для этого неточной клеток подсчета или посев. Рекомендуется проводить несколько графов и убедиться, что суспензию клеток хорошо перемешивается перед посевом на ULA U-дно 96-луночных пластин.
При культивировании organoids в ULA U-дно 96-луночных пластины, план увидев последствия значительного испарения по краям пластин. Это идеальное место для заполнения этих скважин с PBS и работать только с 60 скважин центр. Из-за испарения organoids в наружной скважин будет подвергаться воздействию различных условиях, чем те, в центре, который скорее всего будет влиять на их рост и дифференцировку. Пожалуйста, учитывайте это при планировании количество organoids, которые будут необходимы для экспериментов. Кроме того organoids начнет зарастают 96-луночных формат после примерно 30 дней, которые будут видны благодаря окраске питательной среды. Если планируете принимая organoids за последние 30 дней, рекомендуется передать organoids пластины 24-ну Ула. Для осуществления перевода, используйте ножницы, чтобы вырезать кончик P1000, так что открытие гораздо больше, чем organoids сами и передача organoids закупорить.
Человеческого мозга organoids держать большой потенциал в развитии понимания области нейроразвития и болезней. Исследователи, предлагается изменить протокол при необходимости. Например один может реализовать патронирования факторы повышения эффективности дифференциация к типы конкретных клеток, позволяя им исследовать вирусных воздействия на определенных анатомических областей. Эффекты нервной ZIKV все еще плохо поняты, но этот новый подход даст исследователи доступным, быстрый и высок объём способ изучения механизмов инфекции.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют никаких финансовых интересов.
Acknowledgments
Авторы благодарят за помощь с первоначального распространения и количественной оценки ZIKV Ян л Присцилла и Доминик J. Бурри из Гарвардской медицинской школы. Мы также хотели бы поблагодарить Натаниэль D. Киркпатрик для поддержки визуализации. К.е. поддержали центр Стэнли психиатрических исследований и Гарвардского института стволовых клеток.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
