Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Technik verwendet, um Zika-Virus-Infektion für die Entwicklung des menschlichen Gehirns zu modellieren. Mit Wildtyp oder veränderter Zelllinien, können Forscher diese Technik verwenden, um entdecken Sie die verschiedenen Mechanismen oder Behandlungen, die frühe Infektion des Gehirns und resultierende Mikrozephalie bei Zika Virus-infizierten Embryos beeinträchtigen können.
Abstract
Die jüngste Entstehung der Zika-Virus (ZIKV) in gefährdeten Bevölkerungsgruppen führte zu einem abrupten Anstieg Mikrozephalie und andere Entwicklungsstörungen Bedingungen bei Neugeborenen. Während Mücken die Hauptroute der viralen Übertragung sind, hat sich auch gezeigt, über sexuellen Kontakt und vertikale Mutter-Fötus-Getriebe zu verbreiten. In diesem Fall der Übertragung, durch die einzigartige virale Tropismus von ZIKV wird das Virus überwiegend auf die neurale Vorläuferzellen (NPCs) für das sich entwickelnde Gehirn vermutet.
Hier auftreten eine Methode zur Modellierung von ZIKV Infektion und die daraus resultierende Mikrozephalie, wenn menschliche zerebrale Organellen ausgesetzt sind ZIKV Leben beschrieben wird. Die Organellen zeigen hohe Virus innerhalb ihrer neuronalen Vorläuferzellen Bevölkerung und weisen schwere Zelltod und Mikrozephalie im Laufe der Zeit. Dieses dreidimensionale zerebralen organoide Modell kann Forscher Experimente Arten abgestimmt zu beobachten und potenziell mit ZIKV Infektion der die Entwicklung des menschlichen Gehirns eingreifen. Das Modell bietet verbesserte Relevanz über zweidimensionale Standardmethoden und enthält Mensch-spezifische zelluläre Architektur und Protein-Expression in Tiermodellen nicht möglich sind.
Introduction
Zika-Virus (ZIKV) schnell in Mikronesien, Französisch-Polynesien und Südamerika ausgebreitet hat, und vor kurzem wurde gezeigt, dass die Plazentaschranke1,2 , um das sich entwickelnde fetale Gehirn, führt zu solchen Neurodevelopmental Krankheiten infizieren überqueren als Mikrozephalie3,4,5,6 . Die langfristige Auswirkungen dieser Patienten leben und derzeit keine Behandlung, hat Forscher und Kliniker zu klettern, für ein besseres Verständnis der Mechanismen hinter ZIKV Infektion und Replikation geführt. Frühere Studien haben ZIKV Infektion von in-vitro- Systeme in einer Vielzahl von physiologisch relevanten Zelle Arten7,8,9, als auch in Vivo10 mit untersucht. immunkompetenten und immungeschwächte Mäuse11,12,13 und nicht-menschlichen Primaten14,15,16. Zusätzlich zu diesen eher konventionellen Techniken haben mehrere Gruppen zerebrale Organellen Stammzellen abgeleitet, um mehr über ZIKV Infektion der die Entwicklung des menschlichen Gehirns verstehen umgesetzt. Diese Gruppen wurden genutzt, menschlichen zerebrale Organellen zu bestätigen die Mikrozephalie Phänotyp17,18, Rezeptoren verbunden mit Virus Eintrag19untersuchen, prüfen, physiologische Reaktionen auf Infektion20 , 21, und potenziell Bildschirm für Medikamenten-Kandidaten-22. Hier ist eine Technik für schnell produzieren und infizieren Stammzellen abgeleitete zerebralen Organellen beschrieben, wie zuvor gezeigt19, zur Verbesserung des Verständnisses der ZIKV Infektion der die Entwicklung des menschlichen Gehirns.
Da die Organellen von standard pluripotenten Stammzellen (PSC) Kulturen ausgebildet sind, erlaubt diese Technik für eine Vielzahl von wissenschaftlichen Fragen bezüglich Virusinfektion das sich entwickelnde Gehirn beantwortet werden. Beispielsweise kann CRISPR-Technik verwendet werden, ändern diese PSC Zeilen vor der organoide Infektion mit einer schnelleren Rate als die meisten in Vivo genetische19Studien. Zusätzlich, im Gegensatz zu zeigen Organellen in standard zwei-dimensionale (2D) Differenzierung-Kulturen, die komplexen zelluläre Architektur, die für Kortikogenese von entscheidender Bedeutung ist, und neuere Studien haben gezeigt, dass diese Architektur auf Infektion gestört werden kann 21. Schließlich ermöglicht die relativ niedrigen Kosten der Erzeugung von Organellen für höheren Durchsatz Experimente und Screening im Vergleich zu in-Vivo -Modelle. Auf der anderen Seite gibt es einige Nachteile der Nutzung der Organellen, ZIKV zu studieren. Während Organellen als 2D Kulturen weit mehr biologisch relevant sind, gibt es zusätzliche Herausforderungen bei der Bewertung der Organellen aufgrund ihrer dreidimensionalen (3D). Bildgebung und Dissoziation der Organellen neigt dazu, mehr Ausrüstung und eine größere Investition von Ressourcen als in standard 2D Kulturen beteiligt. Darüber hinaus fehlen Organellen das Gefäßsystem und immunologischen Komponenten, die in in Vivo Modellen, so dass Forscher interessiert, jene Aspekte der viralen Infektion geraten sind, ein alternatives Protokoll zu suchen.
Es gibt eine Reihe von Techniken für die Bildung der menschlichen Organellen und Neurosphären in der Kultur, und sie fallen in der Regel in den Kategorien gemustert oder ungemustert . Gemusterte Methoden implementieren Faktoren zur Regulierung der Wnt, BMP TGFβ und andere Signalwege zur Differenzierung gegenüber bestimmten Linien23schieben. Ungemustert Methoden, wie Sie hier beschrieben wird, profitieren Sie von der Neigung zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) und humanen embryonaler Stammzellen (HES) in Richtung einer Neuroectodermal Linie von unterscheiden Standard24. Nach ca. drei Wochen der Differenzierung bestehen die daraus resultierende Organellen aus groß, biomimetische neuroepithelialer Strukturen, die mehrere Zelltypen enthalten, die in der frühen Entwicklung des Gehirns beobachtet werden.
Die Technik für die Herstellung von Organellen von standard, Feeder-freie PSC-Kulturen und infizieren diese Organellen mit ZIKV wird ausführlich vorgestellt. Leitlinien für die Kultivierung Methoden für Feeder-freie PSCs benötigt finden Sie in vorherigen Methoden Publikationen25,26. Darüber hinaus um konsistente Mengen des Virus für mehrere Experimente gelten, ist es wichtig, die MOI vor der Zeit zu berechnen. Dies geschieht durch die Durchführung einer Infektion von Vero-Zellen, gefolgt von der Behandlung mit Overlay-Medium, Inkubation und Immunostaining. Beschreibungen und Methoden dieser Technik wurden zuvor beschriebenen19,27.
Sobald die PSC-Kultur erreicht Ziel Zusammenfluss von 50-70 %, werden die Zellen dann getrennt und in ultra-niedrigen Anlage 96-Well Platten aggregiert. Die Zellen sind für 3 Tage in Stammzellen Xeno-freie Wartung Medien (INVE) gepflegt und dann auf eine neurale Induktion-Medien für den Rest der Kultur umgewandelt. Sobald die Organellen für 3 Wochen differenziert haben, kann die Infektion durchgeführt werden. Regelmäßig nehmen Bilder in der Woche nach Infektion, werden Forscher progressive Zelltod und Störung der organoide beobachten. Forscher können auch die Organellen zu diesem Zeitpunkt transkriptionelle durchzuführen oder Proteomic profiling distanzieren. Kryoschneiden und Lichtscheibe Methoden werden empfohlen für die Bildgebung und Forscher erwarten hohe Infektionen und virale Replikation vor allem innerhalb der neuronalen Vorläuferzellen (NPC) Zellpopulationen in der Organellen. Schließlich erlaubt diese Technik Forscher, die Mechanismen der viralen Infektion des menschlichen Gehirns mit niedrigen Kosten und begrenzten Ausstattung schnell zu untersuchen.
Protocol
1. Erstellen von zerebralen Organellen von iPSC / hESC 2D Kultur (Tag 0)
Hinweis: dieses Protokoll setzt voraus, dass Stammzellen (SC) Wartung Inve Medium mit einem Vitronectin oder Geltrex erfolgt Substrat. Wenn eine alternative, proteinreiche Stammzelle Kultivierung Medien verwenden, ist es ratsam, Übergang SC Kulturen Inve für mindestens zwei Passagen vor Einleitung eines organoide Bildung. Das Protokoll wurde nicht getestet mit Feeder-basierte SC Kulturmethoden.
- Mit regelmäßigen SC Wartung Methoden 25 , 26, bringen Kulturen zum Zusammenfluss von 50-70 %. Dies ist in der Regel 3-4 Tage nach Passagierung, obwohl das Kultur-Methode und Zelle Zeile abhängig sein kann.
Hinweis: Ca. 2 Brunnen von einer 6-Well-Platte sind erforderlich, um eine volle 96-Well-Platte von Organellen produzieren. - Inspizieren Kulturen über Brightfield Mikroskopie bei 10 x-20 X Vergrößerung um gesunde Kolonie Morphologie mit Differenzierung nachweisbar sicherzustellen.
- Bringen Inve auf 37 ° C in einem heißen Wasserbad und Tauwetter ein 50 µL Fläschchen mit 50 mM Y-27632 (Rock-Hemmer) und 2 mL der enzymatischen Ablösung Reagenz auf Zimmertemperatur.
- Bereiten Sie eine extrem niedrige Anlage (ULA) U-Boden-96-well-Platte, einer Mehrkanal-Pipette P200 und 25 mL Reagenz Reservoir.
- Aliquoten 45 mL Inve in einem 50 mL konische Rohr, und fügen Sie 45 µL 50 mM Y-27632. Die Mischung gründlich durch verreiben.
- Vakuum aspirieren Sie die zwei Brunnen mit SCs und schnell 1 mL Reagenz enzymfreien Loslösung zu jeder gut mit einer Pipette P1000 hinzufügen. Inkubieren Sie die Platte in einem Inkubator 37 ° C für mind. 4
- Vakuum aspirieren Sie die behandelten Brunnen, und fügen 1 mL der enzymatischen Ablösung Reagenz in jede Vertiefung mit einer Pipette P1000.
- Inkubation der Platte in einem 37 ° C Inkubator für eine zusätzliche 5 min.
- Entfernen Sie die Platte und die behandelten Brunnen zu untersuchen. Klopfen Sie leicht auf die Platte, um aggregierte Zellen aufzubrechen. Wenn große Zellcluster noch sichtbar sind, brüten die Platte für 2 zusätzliche min bei 37 ° c wiederholen Sie diesen Schritt bis Cluster nicht mehr mit dem bloßen Auge sichtbar sind.
- Sobald die Zellen richtig getrennt sind, fügen Sie 1 mL Inve in jede Vertiefung, die Dissoziation Enzyme zu deaktivieren. Bündeln Sie die 4 mL Zellsuspension in einer 50 mL konische Röhre und nehmen Sie eine kleine aliquoten für Zellzählung.
- Rückkehr alle verbleibenden, unbehandelten Brunnen in der Instandhaltung-Platte in dem Inkubator 37 ° C.
- Beim zählen, Zentrifugieren die Zellsuspension bei 300 X g für 5 min.
- Bestimmen die Gesamtzahl der Zellen, und berechnen Sie die Menge des Inve + Y-27632 Lösung, die benötigt werden, um eine 60.000 Zellen/mL Suspension zu erreichen.
- Sorgfältig Vakuum anzusaugen überstand und fügen Sie das berechnete Volumen des Inve + Y-27632 Lösung. Mischen Sie 5-10 Mal mit einer 5 mL pipettieren, Gewährleistung einer einheitlichen Zellsuspension.
- Sofort übertragen die Zellsuspension in ein Reagenz Reservoir und 150 µL pipette, in jede Vertiefung der ULA U-Boden-96-Well-Platte mit einer Mehrkanal-Pipette P200. Dies erzeugt 96 einzelnen Organellen, bestehend aus jeweils zunächst 9.000 Zellen.
- Zentrifuge die Platte 150 X g für 1 min.
- Platzieren Sie die Platte in einen Inkubator 37 ° C und stören nicht die Platte für 48 h.
2. Zerebrale organoide Wartung (Tag2)
- bereiten 17 mL Inve mit 17 µL 50 mM Y-27643 in einem 50 mL konische Röhrchen. Wärmen die Inve + Y-27632 Lösung auf 37 ° C in ein heißes Wasserbad.
- Die organoide Platte aus dem Inkubator nehmen und mit einer Multi-Channel-P200 Pipette voraussichtlich 75 µL langsam Medium vom Rand des Brunnens in der ersten Zeile erstellen. Sobald das Medium gezeichnet wurde, vertreiben Sie schnell die mittlere zurück in den Brunnen, lose Zellen und Organellen zu erheben. Wiederholen Sie diesen Vorgang für jede Zeile.
Hinweis: Diese Technik, im folgenden bezeichnet als ein " Dispersion, " hebt Zelltrümmer und die organoide in Suspension. Die organoide sinkt rasch auf den Boden des Brunnens, während die kleineren Schmutz bleibt in der Schwebe, so dass sie mit einem Medienwechsel entfernt werden. Dies hilft um zu verhindern, dass die organoide ruht in Zelltrümmer während der Kultur.- Nachdem alle Brunnen verteilt haben, warten Sie 15 s um sicherzustellen, dass die Organellen an der Unterseite von jedem Bohrloch versenkt haben.
- Langsam und vorsichtig 75 µL Medium aus jeder gut mit der Multi-Channel-P200 Pipette abzusaugen und in einem Abfall Behälter verzichten.
Hinweis: Die meisten Benutzer Aspirieren gelegentlich eine organoide während der regulären RSS-Feeds. Dies kann etwa 1 % der Fälle auftreten. Bitte planen Sie entsprechend um sicherzustellen, dass genügend Organellen zu experimentellen Zeitpunkten überleben. - Transfer Inve + Y-27632 Lösung in ein Reservoir Reagenz und 150 µL in jeder organoide gut mit der Multi-Channel-P200 Pipette zu verzichten.
- Legen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C Inkubator.
3. Zerebrale organoide Wartung (Tag3)
- Warm 17 mL Inve auf 37 ° C, dieses Mal ohne Y-27643.
- Mit Mehrkanal-Pipette P200 voraussichtlich 100 µL, zerstreuen alle Brunnen der organoide Platte (siehe Punkt 2.2). S um sicherzustellen, dass die Organellen am unteren Rand ihrer Brunnen versenkt haben warten 15.
- Bereiten ein Abfall Reservoir und erwärmten Inve in eine Quellreservoir übertragen.
- Sorgfältig Aspirieren 125 µL Medium aus jedem Brunnen, und ersetzen Sie durch 150 µL des frischen Inve mit der Mehrkanal-Pipette P200.
- Legen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C Inkubator.
4. Zerebrale organoide Wartung (Tag 4 +)
Hinweis: führen Sie regelmäßige Wartung täglich bis Infektion.
- Vor Beginn der das Futter am Tag 4, neurale Induktion (NI) Medium vorzubereiten.
- Tauwetter ein 250 µL Aliquot von 2 mg/mL Heparin, zusammen mit einer 5 mL Durchstechflasche mit 100 X n-2 Ergänzung. Fügen Sie die 250 µL Heparin, n-100 X 2 5 mL und 5 mL 100 X MEM-NEAA, 500 mL DMEM / F12 + GlutaMAX. Steril filtern die gemischte Lösung in einem Filter 500 mL.
Hinweis: Halten Sie NI bei 4 ° C bei Nichtgebrauch; NI dauert bis zu zwei Wochen bevor frisches Medium vorbereitet werden sollten.
- Tauwetter ein 250 µL Aliquot von 2 mg/mL Heparin, zusammen mit einer 5 mL Durchstechflasche mit 100 X n-2 Ergänzung. Fügen Sie die 250 µL Heparin, n-100 X 2 5 mL und 5 mL 100 X MEM-NEAA, 500 mL DMEM / F12 + GlutaMAX. Steril filtern die gemischte Lösung in einem Filter 500 mL.
- Warm 17 mL NI Mittel-bis 37 ° c
- Mit Mehrkanal-Pipette P200 voraussichtlich 100 µL, zerstreuen alle Brunnen der organoide Platte (siehe Punkt 2.2). S um sicherzustellen, dass die Organellen am unteren Rand ihrer Brunnen versenkt haben warten 15.
- Bereiten ein Abfall Reservoir und erwärmten NI in eine Quellreservoir übertragen.
- Sorgfältig Aspirieren 125 µL Medium aus jedem Brunnen, und ersetzen Sie durch 125 µL frische NI mit der Mehrkanal-Pipette P200.
- Legen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C Inkubator.
5. Organoide Infektion mit ZIKV (~ Tag 24)
Hinweis: nach ca. 3 Wochen der Differenzierung, da will werden große neuroepithelialer Strukturen und Rosetten sichtbar innerhalb der organoide, die sehr anfällig für ZIKV Infektionen werden.
- Bringen Earle ' s 1 X ausgeglichen Salz-Lösung (EBSS), 1 X PBS und NI auf 37 ° C in ein heißes Wasserbad.
- Verdünnt ZIKV bekannter Konzentration in 1 X EBSS der Ziel-Infektion Multiplizität der Infektion (MOI).
Hinweis: Titrationen von verschiedenen MOIs werden empfohlen, um eine virale Dosis-Antwort zu erreichen. Dies variiert je nach Virusstamm; für ATCC VR-1838 und ATCC VR-1843, typische MOI Werte liegen zwischen 0,1 und 10). - Entfernen Sie vorsichtig alle Mittel aus organoide nun mit einer einzigen Kanal P200 Pipette. Fügen Sie schnell 200 µL 1 X PBS zu jeder gut mit einer P200 Mehrkanal-Pipette, um die Organellen zu waschen.
- Entfernen Sie vorsichtig alle Mittel aus organoide nun mit einer einzigen Kanal P200 Pipette. Fügen Sie schnell 50 µL 1 X nur EBSS (mock Infektion) oder ZIKV-Virus-Lösung gut und sicherstellen, dass die organoide vollständig eingetaucht sind. Wiederholen Sie für jede organoide, der für die Studie infiziert werden.
- Legen Sie die Platte wieder in einem 37 ° C Inkubator für 2 h
Hinweis: Inkubation Mock-infizierten Organellen für die Dauer ihres Wachstums im Vergleich zu ungestörten Organellen nicht wesentlich auswirken sollte. - Ca. 30 min vor der viralen Inkubation ist abgeschlossen, aliquoten 25 mL NI in ein 50 mL konische Röhrchen, und bringen auf 37 ° C in ein heißes Wasserbad.
- Nach Abschluss der viralen Exposition Organellen mit 200 µL 1 X PBS für jedes gut waschen, Organellen für 15 s und dann entfernen 1 X PBS mit einer Pipette Einkanal P200 begleichen lassen.
- Fügen Sie 200 µL des frischen NI zu jedem gut, und setzen Sie wieder in den Inkubator.
- Optional: für einen Tag 0 Zeit Punkt, Organellen können eine Stunde nach der Infektion abgebildet werden.
- Weiter, um Kultur ersetzt 125 µL NI jeden zweiten Tag mit der Dispersion-Methode (siehe Schritt 4). Achten Sie darauf, entsorgen Sie verbrauchte Medien und Tipps, wie diese infektiöse ZIKV Partikel enthält.
Representative Results
Tagsüber organoide Bildung sollte SC Kulturen in der Log-Wachstumsphase, in denen sie 50 % - 70 % Zusammenfluss, sind, wie in Abbildung 1(A-C)dargestellt. Kulturen sollte abgerundete Kolonien mit deutlichen Kanten bilden, und der Brunnen sollte klar sein, der Differenzierung Abbildung 1(D-E). Wenn Differenzierung stattfindet, empfiehlt es sich, ein Pick zu entfernen um die betroffenen Gebiete innerhalb der Platten reinigen Sie mindestens einen Tag vor der Erstellung Organellen führen. Wenn ein großer Teil der Kultur differenziert wird, ist es möglicherweise erforderlich, führen einen zusätzlichen Gang, Tauwetter ein neues Fläschchen oder verändern Stammzelle-Kultur-Techniken um sicherzustellen, dass die Organellen durch reine Stammzellkulturen geformt werden.
Die Dissoziation durch eine Kombination von Enzym-frei und enzymatische Ablösung Reagenzien Behandlung dürfte vor allem Einzelzellen, wenn es möglicherweise noch kleine Aggregate der Zellen während der Zählung beobachtet. Das Vorhandensein von kleinen Aggregaten scheint nicht zu stören organoide Bildung, obwohl es Zählgenauigkeit beeinträchtigen können. Es wird empfohlen, dass mehrere Zählungen pro Probe, und wenn die Grafen von über 20 % variieren, ist es möglicherweise erforderlich, Dissoziation Zeit, singularisieren Zellen weiter zu erhöhen.
Sobald die Zellen ausgesät und nach unten in eine ULA U-Boden-96-Well-Platte (Abb. 2A) gesponnen, erscheinen sie als flache, dichten Blatt von Zellen auf der Unterseite jedes gut. Die Zellen werden in den nächsten zwei Tagen langsam aggregieren. Es empfiehlt sich nicht, die Platte während dieser 48 Stunden zu stören, wie mechanische Kräfte das lose gebildet Aggregat stören können. Für die ersten 10 Tage die organoide bleibt meist kugelförmig und wird von ~ 300 µm auf 600-800 µm (Abbildung 2B) wachsen. Mehr beobachtbaren Strukturen beginnen, in die organoide zwischen 10 und 20 Tag erscheinen (Abbildung 2C-E). Am Tag 24 sollten Forscher Rosette-wie Strukturen über Brightfield Mikroskopie (Abbildung 2F) beobachten können. Während er weiterhin die Kultur, können diese Gliazellen Strukturen in Menge und Größe über mehrere Tage (Abbildung 2G) erhöhen. Während RSS-Feeds bemerken die Forscher erhebliche Mengen von Schutt sammeln auf der Unterseite jedes gut, vor allem in den ersten 2 Wochen der Kultur. Die Dispersion im Schritt 2.2 beschriebene Technik entfernt diese Zelltrümmer zu verhindern, dass die Apoptotic Trümmer sammeln über mehrere Feeds(Abbildung 3). Diese Ablagerungen kann mit Bildgebung stören kann, es machen es schwieriger zu beobachten und Infektion-induzierte Zelltod zu quantifizieren, und es asymmetrische Signalisierung zu den benachbarten organoide, der Differenzierung beeinflussen könnten. Wenn die Dispersion Technik richtig durchgeführt wird, sollte dies reduziert (Bild 3B-C, 3D-E).
Es wird empfohlen, Cryosections oder Lichtscheibe imaging zu inspizieren die kortikale Struktur bilden innerhalb der Organellen durchzuführen. In Tag 25 Organellen sind die Rosette Strukturen und ventrikuläre Zonen in DAPI (Abb. 4A) und Phospho-Vimentin (Abbildung 4B) Färbung deutlich sichtbar. Das Vorhandensein von TBR2 (Abb. 4C) zeigt an, dass fortgeschrittene Stammväter bilden, mit eine Morphologie, die Abwanderung suggeriert. MAP2 + (Abbildung 4D) Neuronen bevölkern die äußeren Regionen jede Rosette. Aus dieser Proteine kann man sichtbar machen die ventrikuläre Zone (VZ), subventricular Zone (SVZ), Zwischenbereich (IZ) und kortikale Platte (CP) innerhalb jeder Rosette (Abbildung 4E, 4E'). Man kann weiterhin diese Organellen Kultur um späteren Stadien der Entwicklung zu beobachten. Kortikale Schichtung ist, zwar nicht so prominent in dieser Art von organoide tritt die natürliche Umstellung auf Gliogenesis viel, wie in Vivo. Dies kann bei Tag 108 Organellen, in denen ein großer Teil der Zellen express MAP2 oder GFAP beobachtet werden (Abbildung 4F-Ich).
Der Benutzer können erwarten Größenunterschiede organoide um etwa 3 Tage nach ZIKV Infektion, abhängig von der viralen MOI auf die Organellen (Abbildung 5A-B) angewendet. Nach diesen 3 Tagen werden es auch eine Erhöhung in Zelltrümmer in den infizierten Kavitäten im Vergleich zu den mock Brunnen. Dieser Größenunterschied organoide wird im Laufe der folgenden Woche, bis die infizierte Organellen beginnen sich zu brechen auseinander (Abb. 5C-D) erhöhen. Eine Vielzahl von Tests kann an dieser Stelle zur Infektionsmechanismen, einschließlich der viralen RNA-Extraktion und Kryoschneiden (Antikörper berichtet in der Tabelle Materialien empfohlen) zu untersuchen. Auf Kryoschneiden werden Benutzer eine große Präsenz des Virus in der apikalen Region neuroepithelialer Strukturen beobachten vorschlagen eine Infektanfälligkeit von neuronalen Vorläuferzellen (NPCs) ZIKV (Abbildung 6). Immunfluoreszenz von geschnittenen Organellen zeigt auch eine Erhöhung in gespalten Caspase-3 Ausdruck in den infizierten Organellen (Abbildung 7).
Abbildung 1 : Stem Cell Kolonie Morphologie vor organoide Bildung.
Kolonien sollte 50-70 % Zusammenfluss zum Zeitpunkt der Dissoziation, eine große Anzahl von konsistenten Organellen zu produzieren. (A) Sparse, vor kurzem ausgesät Kulturen noch nicht erreicht haben-Vergrößerung phase, und nicht viele Organellen produzieren. (B) sobald die Zellen die richtige Zusammenfluss erreicht haben, sind sie bereit für die Dissoziation. Es ist auch wichtig, dass diese Kolonien kontrolliert werden, um sicherzustellen, dass sie klare Differenzierung. (C) Kolonien, die zu weit genommen werden übermäßige Zusammenfluss erreichen und sind nicht für organoide Bildung empfohlen. Kulturen in diesem Zustand sind eher zu differenzierende Zellen enthalten. (D) Kolonie Kanten sollen deutlich mit konsistenten Zellmorphologie abgerundeten Zellen in der Mitte und etwas länglich Zellen zum Rand hin. (E) minimale Differenzierung sollte in den Kulturen vorhanden sein. Wenn größere, abgeflachte Zellen in den Zentren oder Kanten der Kolonien (weiße Pfeilspitzen) beobachtet werden und mehr als etwa 1 % der Kultur ausmachen, empfiehlt es sich, dass Pick zu entfernen oder zusätzliche Durchgänge durchgeführt werden, um eine einheitliche Stammzell-Bevölkerung zu bilden. klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Zerebrale organoide Wachstum im Laufe der Zeit.
(A) ein Diagramm für die Herstellung von zerebralen Organellen von 2D EAP in Xeno-frei, Feeder Medium gepflegt. (B) für die ersten 8 Tage Organellen meist kugelförmig mit erkennbaren Merkmale bleiben. Der Durchmesser der organoide wird reichen von ca. 300 µm bis 500 µm. (C-E) am 10. Tag klarer Regionen beginnt an der Peripherie der Organellen nachweisbar sein und verlieren sie ihre Kugelform. Sie werden weiterhin in der Größe bis ca. 1 mm im Durchmesser, weitgehend abhängig von der Zell-Linie verwendet wird, um die Organellen produzieren zu erhöhen. (F) nach ca. 20 Tagen der Differenzierung werden Benutzern die Bildung von Gliazellen Strukturen (schwarze Pfeilspitzen) in den klaren Randgebieten die meisten Organellen beobachten. Diese haben eine ringartige Morphologie mit apikale und basale Strukturen Nachahmung derjenigen der entwickelnden Kortex. (G) diese Gliazellen Strukturen werden weiter wachsen und Zunahme der Größe ca. 20-30 Tage. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Räumung der Zelltrümmer über Streuung feed Technik.
Während des Wachstums organoide, eine große Menge von Zelltod ist zu erwarten, und kann zur Ansammlung von Zelltrümmer rund um die Basis der organoide führen. (A) die abgebildeten Dispersion erlaubt Forschern, die meisten diese Ablagerungen bei jedem Feed zu entfernen. Um dies zu tun mit einer Mehrkanal-Pipette P200, erarbeiten Sie langsam das eingesetzte Medium und ausstoßen Sie schnell, um die Zelle und organoide Trümmer in Suspension zu heben. Die organoide sinkt schnell auf den Boden des Brunnens, zu welchem Zeitpunkt eine regelmäßige Zufuhr durchgeführt werden kann. Beispiele für einen Tag 6 organoide vor (B) und nach (C) Streuung Fütterung beträchtliche Ablagerungen Reduktion zeigt. Dies wird für mehrere Wochen fortgesetzt, dargestellt durch einen Tag 18 organoide vor (D) und nach (E) Streuung Fütterung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 4 : Charakterisierung der zerebralen Organellen über Immunohistochemistry.
Lichtscheibe Bilder der zerebralen Organellen werden gezeigt, um ein Beispiel der zellulären Architektur, die bildet. Am Tag 25, DAPI (A) und Phosphor-Vimentin (B) geben Sie einzelne Rosetten und die ventrikulären Zonen bzw.. (C) TBR2 labels, fortgeschrittene Stammväter, die nach außen abwandern und MAP2 (D) Etiketten Neuronen, die in der kortikalen Platte gebildet haben. (E, E') Die Kombination dieser Proteine zeigt deutlich die Rekapitulation der kortikalen Entwicklung in den zerebralen organoide Modellen. (F-ich) Mit dem Tag 108 Gliogenesis, mit einer Mischung von GFAP + und MAP2 + Zellen auffüllen ein Großteil der organoide aufgetreten ist. VZ = ventrikuläre Zone, SVZ = subventricular Zone, IZ = Zwischenzone, CP = kortikale Platte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 5 : Abbau von infizierten Organellen.
(A) Hellfeld Bilder von Mock und ZIKV-infizierten zerebralen Organellen in MOI = 0,1 und 10. Bilder wurden unmittelbar nach der Infektion (Tag 0), sowie 3 und 6 Tage nach der Infektion genommen. (B-C) Hellfeld-Bilder von der Umgebung Mock (B) und (C) ZIKV-infizierten auf MOI Zellenrückstand = 10 zerebrale Organellen 3 Tage nach der Infektion. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 6 : Cryosection und Immunfluoreszenz von infizierten Organellen.
Tag 24 Organellen ausgesetzt waren, zu ZIKV im MOI = 0,1 und Cryosectioned 6 Tage später. In diesem Stadium gibt es eine klare Präsenz des Virus in den ventrikulären, subventricular und mittleren Zonen organoide, wo neurale Vorläuferzellen und radialen Glia wohnen. (A) über nukleare Färbung, diese Gliazellen Regionen sind deutlich sichtbar durch (weisse Pfeile), die hohe Dichte der Atomkerne, die ringartige Strukturen um die apikale Oberfläche bilden. (B) durch Färbung für die Virushülle, kann man eine relativ hohe Präsenz des Virus innerhalb dieser Rosette Strukturen (weiße Pfeilspitzen) beobachten. Beachten Sie, dass es eine kleine Menge des Virus in verschiedenen unbekannten peripheren Zellen vorhanden. (C-D) MAP2 oder anderen Neuron-spezifische Flecken zeigen, dass es gibt Neuronen in den Kulturen, die offenbar nicht mit dem Virus, wenn mit der viralen Fleck überlagert infiziert werden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 7 : Gespalten Caspase-3 Immunfluoreszenz von infizierten organoide.
Nach der Infektion kann eine apoptotische Indikatoren verwenden, um die Mechanismen des Zelltods untersuchen, die innerhalb der Organellen auftreten. In diesem Beispiel Tag 24 Organellen ausgesetzt waren, zu ZIKV im MOI = 0,1 und Cryosectioned 6 Tage später. (A) nicht infizierte Organellen zeigen keine Virushülle (4 2 Protein), und eine minimale Menge an gespalten Caspase-3 durch homöostatische Apoptose im Gewebe auftreten. (B) infizierte Rosetten beginnen, um erhöhte der Apoptose. (C) Rosetten, die schwere Infektion über 4 2 Färbung auch zeigen tendenziell hohe gespalten Caspase-3 in diesen Regionen zu zeigen. Gibt es eine direkte Korrelation zwischen der Schwere der Infektion und gespalten Caspase-3 Ausdruck innerhalb der infizierten Rosetten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Discussion
Es gibt mehrere Vorbehalte zu prüfen, bei der Verwendung von menschlichen zerebraler Organellen, ZIKV Infektion zu untersuchen. Ein wichtiger Aspekt ist, dass organoide Bildung und Struktur ist stark abhängig von der Stammzelllinie aus denen sie gebildet werden. Achten Sie beim Vergleich zwischen Zell-Linien, einschließlich isogenen Linien entwickelt; Es empfiehlt sich, mit mehreren Subclones und idealerweise mehrere Stammzelllinien Schlüsse zu machen. Zusätzlich aufgrund dieses Unterschieds in Zelllinien, Pilotprojekte, um sicherzustellen, dass angemessene Differenzierung in den Organellen Auftritt wird empfohlen. Während die Gliazellen Strukturen Brightfield Mikroskopie sichtbar sind, wird auch vorgeschlagen, qRT-PCR oder Kryoschneiden Experimente zu neuronale Differenzierung Marker wie PAX6 oder Phospho-Vimentin suchen.
Man sollte auch erhebliche Variabilität unter Organellen innerhalb der gleichen Zelllinie vorwegnehmen. Ungemustert aufgrund des Protokolls variiert die Anzahl und Größe der Gliazellen Strukturen zwischen einzelnen Organellen. In der Regel kann man mindestens zwei große erwarten (> 200 µm im Durchmesser von D24) neuronale Rosetten pro organoide. Aus diesem Grund sind Längsschnittstudien, wie die Beobachtung von organoide Größenänderung nach Infektion, besonders aufschlussreich. Variabilität zwischen den einzelnen Chargen kann auch mit die wahrscheinlichste Ursache für das Auftreten als ungenau Zellzählung oder säen. Es wird empfohlen, mehrere Zählungen durchzuführen und sicherzustellen, dass die Zellsuspension gut vermischt ist, vor der Aussaat auf die ULA U-Boden-96-Well-Platten.
Planen Sie Organellen in ULA U-Boden-96-Well Platten Kultivierung, auf beträchtliche Verdunstung Effekte an den Rändern der Platten zu sehen. Es ist ideal, um diese Vertiefungen mit PBS auffüllen und arbeiten nur mit dem Zentrum 60 Wells. Aufgrund der Verdunstung werden Organellen in den äußeren Vertiefungen zu anderen Bedingungen als denen in der Mitte, die wahrscheinlich deren Wachstum und Differenzierung auswirken wird, ausgesetzt werden. Bitte berücksichtigen Sie dies bei der Planung der Zahl der Organellen, die für Experimente benötigt werden. Darüber hinaus startet Organellen der 96-Well-Format nach etwa 30 Tagen überwuchern die aufgrund der Verfärbung des Kulturmediums sichtbar sein wird. Wenn die Planung auf die Organellen letzte 30 Tage, empfiehlt es sich, die Organellen auf eine ULA-24-Well-Platte zu übertragen. Um die Übertragung durchführen zu können, mit einer Schere eine P1000 Spitze abgeschnitten, so dass die Öffnung viel größer als die Organellen selbst ist und übertragen Sie die Organellen durch pipettieren.
Menschlichen zerebrale Organellen halten großes Potenzial in dem Gebiet Verständnis der neuronalen Entwicklung und Krankheit. Forscher sind aufgefordert, das Protokoll nach Bedarf ändern. Zum Beispiel könnte eine Musterung Faktoren zur Verbesserung der Effizienz der Differenzierung gegenüber bestimmten Zelltypen, so dass sie die virale Auswirkungen auf bestimmte anatomischen Regionen erkunden einsetzen. Die Neurodevelopmental Auswirkungen der ZIKV sind noch kaum erforscht, aber dieses neuen Ansatzes geben Forscher eine zugänglich, schnelle und Hochdurchsatz-Art der Untersuchung der Mechanismen der Infektion.
Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.
Acknowledgments
Die Autoren danken für Hilfe mit ersten Ausbreitung und Quantifizierung von ZIKV Priscilla L. Yang und Dominique J. Burri der Harvard Medical School. Wir möchten auch Nathaniel D. Kirkpatrick für bildgebende Unterstützung danken. K.E wurde von Stanley Zentrum für psychiatrische Forschung und Harvard Stem Cell Institute unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
