Summary
Ce protocole décrit une technique utilisée pour modéliser l’infection par le virus Zika du cerveau humain en développement. À l’aide de type sauvage ou lignées de cellules de tige machiné, chercheurs peuvent utiliser cette technique pour découvrir les différents mécanismes ou traitements qui peuvent affecter le début infection du cerveau et qui en résulte une microcéphalie chez les embryons de Zika infectées par le virus.
Abstract
L’émergence récente de Zika virus (ZIKV) chez les populations à risque a conduit à une brusque augmentation de microcéphalie et autres conditions de développement neurologique chez les nouveau-nés. Alors que les moustiques sont la principale voie de transmission du virus, il a été démontré aussi se propager par contact sexuel et de la transmission verticale mère-à-foetus. Dans ce dernier cas de transmission, en raison de l’unique tropisme viral de ZIKV, le virus est censé cible principalement les cellules progénitrices neurales (PNJ) du cerveau en développement.
Ici une méthode de modélisation ZIKV, maladies infectieuses et la microcéphalie qui en résulte, qui se produisent lorsque organoïdes cérébrales humaines sont exposés pour vivre ZIKV est décrite. Les organoïdes affichent des niveaux élevés de virus au sein de leur population progénitrices neurales et présentent la mort cellulaire sévère et une microcéphalie au fil du temps. Ce modèle tridimensionnel organoïde cérébrale permet aux chercheurs de mener des expériences appariés selon l’espèce d’observation et d’intervention potentiellement infectées par ZIKV du cerveau humain en développement. Le modèle fournit la meilleure pertinence par rapport aux méthodes standard à deux dimensions et contient l’architecture cellulaire spécifique homme et expression de la protéine qui ne sont pas possibles dans des modèles animaux.
Introduction
Zika virus (ZIKV) s’est rapidement propagé en Micronésie, Polynésie Français et dans les Amériques et a été récemment montré à traverser la barrière placentaire1,2 , pour infecter le développement du cerveau foetal, entraînant les maladies neurologiques microcéphalie3,4,5,6 . L’impact à long terme sur la vie de ces patients et l’absence de traitement, a conduit les chercheurs et les cliniciens se démener pour une meilleure compréhension des mécanismes à l’origine de l’infection ZIKV et réplication. Des études antérieures ont examiné infection in vitro systèmes dans une variété de cellule physiologiquement les types7,8,9, mais aussi en vivo10 avec ZIKV les souris immunocompétentes et immunodéprimés11,12,13 et les primates non humains14,15,16. En plus de ces techniques plus classiques, plusieurs groupes ont mis en place des cellules souches dérivées de l’organoïdes cérébrale pour mieux comprendre l’infection ZIKV du cerveau humain en développement. Ces groupes ont utilisé des humains organoïdes cérébrale pour confirmer la microcéphalie phénotype17,18, enquêter sur les récepteurs liés aux virus entrée19, examiner les réponses physiologiques à infection20 , 21et, éventuellement, écran pour médicaments candidats22. Ici une technique de production et d’infecter les cellules souches dérivées organoïdes cérébrale rapidement est décrite, comme indiqué précédemment19, afin d’améliorer la compréhension de l’infection à ZIKV du cerveau humain en développement.
Puisque les organoïdes sont formés à partir des cultures de cellules souches (CFP) pluripotentes standard, cette technique autorise une grande variété de questions scientifiques à trancher au sujet de l’infection virale du cerveau en développement. Par exemple, génie CRISPR peut servir à modifier ces lignes CFP avant l’infection organoïde à un rythme plus rapide que la plupart en vivo génétique études19. En outre, contrairement à en standard deux cultures de différenciation (2D) dimensions, organoïdes pièce de l’architecture cellulaire complexe qui est essentiel pour exocytosis, et des études récentes ont montré que cette architecture peut être perturbée après infection 21. Enfin, le coût relativement faible de générer organoïdes permet pour l’expérimentation de débit supérieur et le dépistage par rapport à des modèles in vivo . En revanche, il y a quelques inconvénients à l’utilisation d’organoïdes pour l’étude des ZIKV. Tandis qu’organoïdes sont beaucoup plus biologiquement pertinentes que les cultures 2D, il y a des difficultés supplémentaires dans l’évaluation des organoïdes en raison de la nature en trois dimensions (3D). Imagerie et dissociation d’organoïdes tend à impliquer davantage d’équipement et un investissement plus important de ressources que dans les cultures 2D standards. En outre, organoïdes n’ont pas le système vasculaire et composants immunologiques qui sont présents dans des modèles in vivo , que les chercheurs intéressés par les aspects de l’infection virale sont conseillés de chercher un autre protocole.
Il y a un certain nombre de techniques pour la formation d’organoïdes humaine et neurospheres en culture, et ils tombent généralement dans les catégories de motifs ou supprimée . Motifs de méthodes implémentent facteurs pour réguler le Wnt, BMP, TGFβ et autres voies de signalisation pour pousser la différenciation vers des lignées spécifiques23. Méthodes supprimées, comme celui décrit ici, profiter de la tendance pour les cellules souches pluripotentes induites (CISP) et les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) pour différencier vers une lignée neuroectodermique par défaut24. Après environ trois semaines de la différenciation, les organoïdes qui en résulte se composent de grandes, structures neuroépithéliales de biomimétique qui contiennent plusieurs types de cellules qui sont observés dans le cerveau en développement précoce.
La technique de production organoïdes de cultures CFP standards, chargeur-sans et d’infecter ces organoïdes avec ZIKV est présentée dans son intégralité. Pour des conseils sur les méthodes de culture nécessaire pour PSC feeder-gratuit, veuillez vous reporter aux précédentes méthodes publications25,26. En outre, afin d’appliquer cohérentes quantités de virus pour des expériences multiples, il est important de calculer le ministère de l’intérieur avance. Cela se fait en procédant à une infection des cellules Vero, suivi par un traitement au moyen de superposition, incubation et immunostaining. Descriptions et les méthodes de cette technique ont été décrites précédemment19,27.
Une fois que la culture de la CFP atteint le confluent de la cible de 50 % - 70 %, les cellules sont alors dissociées et regroupées en plaques de 96 puits de fixation ultra faible. Les cellules sont maintenues pendant 3 jours dans les médias de maintenance xeno-libérer des cellules souches (CPAM) et ensuite convertis en un média de l’induction neurale pour le reste de la culture. Une fois que les organoïdes sont différenciées pour 3 semaines, l’infection peut se dérouler. En prenant régulièrement des images pendant la semaine suivant l’infection, les chercheurs observera mort cellulaire progressive et une perturbation de l’organoïde. Chercheurs peuvent également dissocier les organoïdes à ce moment de mener transcriptionnel ou profilage protéomique. Les méthodes cryosectioning et lightsheet sont recommandées pour l’imagerie et les chercheurs peuvent s’attendre à voir des niveaux élevés d’infection et de la réplication virale, en particulier dans les populations de cellules (NPC) progénitrices neurales dans l’organoids. En fin de compte, cette technique permet aux chercheurs d’étudier rapidement les mécanismes d’infection virale du cerveau humain avec un équipement limité et faible coût.
Protocol
- Apporter Earle ' s 1 X Balanced Salt Solution (EBSS), 1 X PBS et NI à 37 ° C dans un bain d’eau chaude. Multiplicité de
- diluer ZIKV de concentration connue en 1 X EBSS à l’infection de la cible de l’infection (MOI).
Remarque : Titrages de MOIs différents sont recommandés afin d’atteindre une réponse dose virale. Cela peut varier selon la souche du virus ; ATCC VR-1838 et ATCC VR-1843, MOI typique valeurs s’échelonnent entre 0,1 et 10). - Retirer soigneusement tous les moyen d’organoïde bien à l’aide d’une pipette de P200 monocanal. Rapidement ajouter 200 µL de solution 1 PBS X pour chaque bien en utilisant une pipette multicanaux P200 pour laver l’organoïdes.
- Retirer soigneusement tous les moyen d’organoïde bien à l’aide d’une pipette de P200 monocanal. Rapidement ajouter 50 µL de 1 X EBSS seule (infection simulacre) ou solution antivirus ZIKV de bien et de faire en sorte que l’organoïde est complètement immergée. Répéter pour chaque organoïde c’est d’être infectés à l’étude.
- Placer la plaque dans un incubateur à 37 ° C pendant 2 h.
Remarque : Incubation organoïdes infectés par mock pour cette durée ne devrait pas influer significativement leur croissance par rapport à organoïdes non perturbés. - Environ 30 min avant l’incubation virale est terminé, aliquote de 25 mL de NI dans un tube conique de 50 mL et porter à 37 ° C dans un bain d’eau chaude.
- Une fois exposition virale est terminée, laver l’organoïdes avec 200 µL de solution de 1 PBS X pour chaque puits, permet organoïdes se contenter de 15 s et puis enlever 1 X PBS à l’aide d’une pipette monocanal P200.
- Ajouter 200 µL de frais NI à chaque bien et remettez dans l’incubateur.
- En option : pour une journée de temps 0 point, organoïdes peut être photographié une heure après l’infection.
- Continuer à la culture en remplaçant 125 µL NI tous les autres jours à l’aide de la méthode de dispersion (voir étape 4). Veillez à bien disposer de médias usé et conseils, car il contient des particules infectieuses ZIKV.
Representative Results
Figure 2 : Croissance cérébrale organoïde au fil du temps.
(A) un diagramme pour la production d’organoïdes cérébrale de la 2D PSC maintenues dans un milieu xeno-libre, chargeur. (B) pour les 8 premiers jours, organoïdes restera surtout sphériques avec peu de fonctionnalités détectable. Le diamètre de l’organoïde variera de quelque 300 µm à 500 µm. (C-E) au jour 10, régions plus claires commencera à être détectable à la périphérie de l’organoïdes, et ils perdront leur forme sphérique. Ils vont continuer à augmenter en taille d’environ 1 mm de diamètre, dépend en grande partie de la lignée cellulaire utilisée pour produire l’organoïdes. (F) après une vingtaine de jours de différenciation, utilisateurs observera la formation de structures neuroépithéliales (flèches noires) dans les régions périphériques clair d’organoïdes la plupart. Ceux-ci ont une morphologie annulaires, avec structures basales et apicales imitant celles du cortex en voie de développement. (G) , ces structures neuroépithéliales continuera de croître et d’augmenter en volume pendant environ 20-30 jours. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Enlèvement des débris cellulaires par l’intermédiaire de dispersion nourrir technique.
Au cours de la croissance organoïde, une grande quantité de mort cellulaire doit s’y attendre et peut conduire à l’accumulation de débris cellulaires entourant la base de l’organoïde. (A) la technique de dispersion dépeinte permet aux chercheurs d’enlever la plupart de ces débris au cours de chaque flux. Pour cela, à l’aide d’une pipette multicanaux de P200, élaborer lentement le moyen utilisé et expulser rapidement pour soulever les débris organoïde et de cellules en suspension. L’organoïde chutera rapidement au fond du puits, date à laquelle on peut effectuer un flux régulier. Exemples d’un jour 6 organoïde avant (B) et après que (C) dispersion alimentation montre la réduction considérable de débris. Cela continue pendant plusieurs semaines, comme en témoigne un organoïde 18 jours avant (D) et après la tétée de dispersion (E) . S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Caractérisation des organoïdes cérébraux par immunohistochemistry.
Lightsheet image d’organoïdes cérébrale est affichées pour donner un exemple de l’architecture cellulaire qui constitue. Au jour 25, DAPI (A) et phosphore-vimentine (B) indiquer les rosaces individuelles et les zones ventriculaires, respectivement. (C) TBR2 Etiquettes progéniteurs intermédiaires qui migrent vers l’extérieur et MAP2 (D) les étiquettes les neurones qui se sont formées dans la plaque corticale. (E, E') La combinaison de ces protéines montre clairement la récapitulation du développement cortical dans les modèles organoïde cérébrale. (F-I) Par jour 108, gliogenesis a eu lieu, avec un mélange de GFAP + et cellules MAP2 + remplissage d’une grande partie de l’organoïde. VZ = zone ventriculaire, SVZ = zone sous-ventriculaire, IZ = zone intermédiaire, CP = plaque corticale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Dégradation des infectés organoïdes.
(A) des images de champ lumineux de Mock et ZIKV-infection cérébrale organoïdes à MOI = 0,1 et 10. Des images ont été prises immédiatement après l’infection (jour 0), ainsi que 3 et 6 jours après l’infection. (B-C) Images de fond clair des débris cellulaires entourant mock (B) et (C) ZIKV-infectés à MOI = 10 organoïdes cérébral 3 jours après l’infection. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Cryosection et immunofluorescence des infectés organoïdes.
Jour 24 organoïdes ont été exposés à la ZIKV à MOI = 0,1 et sectionnés 6 jours plus tard. À ce stade, il y a une claire présence du virus dans les zones ventriculaires sous-ventriculaire et intermédiaires de l’organoïde, où résident des cellules progénitrices neurales et cellules gliales radiales. (A) Via la coloration des noyaux, ces régions neuroépithéliales sont clairement visibles dus (flèches blanches) à la haute densité des noyaux qui forment des structures annulaires autour de la surface apicale. (B) par la souillure de l’enveloppe virale, on peut observer une présence relativement élevée du virus au sein de ces structures de rosette (flèches blanches). Notez qu’il y a une petite quantité de virus présent dans les cellules périphériques divers non identifiés. (C-D) Map2 ou autre neurone-spécifique taches Voir la qu’il y a des neurones présents dans les cultures qui ne semblent pas être infectés par le virus lorsque recouvert la tache virale. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 7 : Clivé caspase-3 immunofluorescence des infectés organoïde.
Après l’infection, on peut employer apoptotic indicateurs d’étudier les mécanismes de mort cellulaire qui se produisent au sein de l’organoids. Dans cet exemple, jour 24 organoïdes ont été exposés au ZIKV à MOI = 0,1 et sectionnés 6 jours plus tard. (A) organoïdes non infectés ne montrent aucune enveloppe virale (2 de 4 protéines) et une quantité minimale de la caspase-3 clivés en raison de l’apoptose homéostatiques qui se produisent dans le tissu. (B) Infected rosettes commencent à montrer des niveaux accrus de l’apoptose. (C) les Rosettes qui font preuve d’une infection grave via 4 2 coloration aussi ont tendance à des niveaux élevés de la caspase-3 clivés dans ces régions. Il y a une corrélation directe entre la gravité de l’infection et clivée expression de caspase-3 dans les rosettes infectés. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Discussion
Il y a plusieurs avertissements à considérer lors de l’utilisation humaine organoïdes cérébrale pour enquêter sur l’infection ZIKV. Une considération importante est que la formation organoïde et structure dépend fortement de la lignée de cellules souches dont ils sont formés. Prenez soin lors de la comparaison entre les lignées cellulaires, y compris les lignées isogéniques de génie ; Il est préférable de tirer des conclusions à l’aide de multiples sous-clones et idéalement de plusieurs lignées de cellules souches. En outre, en raison de cette différence dans les lignées cellulaires, des expériences pilotes pour s’assurer que la différenciation appropriée se produit dans l’organoïdes est recommandé. Alors que les structures neuroépithéliales sont visibles par microscopie à fond clair, il est également suggéré de mener des expériences qRT-PCR ou cryosectioning pour rechercher des marqueurs de différenciation neurale comme PAX6 ou phospho-vimentine.
On devrait également s’attendre à une variabilité considérable parmi les organoïdes dans la même lignée de cellules. En raison de la nature supprimée du protocole, le nombre et la taille des structures neuroépithéliales peuvent varier entre organoïdes individuels. En règle générale, on peut s’attendre au moins deux grandes (> 200 µm de diamètre sur D24) neurales rosettes par organoïde. Pour cette raison, les études longitudinales, telles que l’observation d’un changement de taille d’organoïde après infection, sont particulièrement éclairantes. La variabilité entre les lots peut-être également survenir, avec la cause la plus probable pour cela étant le comptage des cellules erronées ou l’ensemencement. Il est recommandé d’effectuer plusieurs chefs d’accusation et de s’assurer de que la suspension cellulaire est bien mélangée avant l’ensemencement sur les plaques de fond ULA U 96 puits.
Lorsque la culture organoïdes à plaques fond ULA U 96 puits, plan en voyant les effets d’évaporation considérable autour des bords des plaques. Il est idéal pour remplir ces puits avec du PBS et ne fonctionnent qu’avec les puits de 60 Centre. En raison de l’évaporation, organoïdes dans les puits extérieurs seront exposés à des conditions différentes que celles dans le centre, qui sera probablement une incidence sur leur croissance et la différenciation. S’il vous plaît, pensez-y lorsque vous planifiez le nombre d’organoïdes qui seront nécessaires pour les expériences. En outre, organoïdes vont commencer à proliférer au format 96 puits après environ 30 jours, qui sera visibles en raison de la décoloration du milieu de culture. Si l’intention de prendre l’organoïdes au-delà des 30 jours, il est recommandé de transférer l’organoïdes sur une plaque de 24 puits ULA. Pour effectuer le transfert, utiliser des ciseaux pour couper un bout de P1000 afin que l’ouverture est beaucoup plus grande que les organoïdes eux-mêmes et transférer l’organoïdes de pipetage.
Organoïdes cérébrales humaines tenir grand potentiel pour faire avancer la compréhension du champ du développement neurologique et maladies. Les chercheurs sont invités à modifier le protocole comme nécessaire. Par exemple, on pourrait implémenter facteurs de structuration pour améliorer l’efficacité de la différenciation vers des types de cellules spécifiques, leur permettant d’explorer les répercussions virales sur certaines régions anatomiques. Les effets sur le développement neurologique des ZIKV sont encore mal compris, mais cette nouvelle approche va donner des chercheurs d’étudier les mécanismes de l’infection de manière accessible, rapide et haut débit.
Disclosures
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun intérêt financier concurrentes.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Priscilla L. Yang et Dominique J. Burri de la Harvard Medical School pour aide à la propagation initiale et la quantification des ZIKV. Nous tenons également à remercier Nathaniel D. Kirkpatrick pour le soutien d’imagerie. K.E. a été soutenu par le centre de Stanley pour la recherche en psychiatrie et l’Institut de cellules souches de Harvard.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
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