Summary
פרוטוקול זה מתאר טכניקה המשמשת ליצור מודל Zika בנגיף של המוח האנושי המתפתח. משתמש wildtype או שורות תאי גזע מהונדסים, חוקרים עשויים להשתמש בטכניקה זו כדי לחשוף את המנגנונים השונים או טיפולים שעשויים להשפיע על דלקת המוח מוקדם, microcephaly שנוצר ב Zika הנגועים בנגיף עוברי.
Abstract
הופעתה האחרונה של וירוס Zika (ZIKV) באוכלוסיות רגישים הוביל עלייה פתאומית microcephaly ותנאים אחרים התפתחותיות אצל תינוקות רכים. בעוד יתושים הם הדרך העיקרית של שידור ויראלי, גם הוכח להתפשט דרך מגע מיני ושידור אמא-כדי-העובר אנכית. במקרה האחרון הזה של השידור, בשל tropism ויראלי ייחודי של ZIKV, הוירוס הוא האמין בעיקר יעד את עצבי ובתאים (NPCs) של המוח המתפתח.
כאן שיטת מידול לזיהום ZIKV, ולא את microcephaly וכתוצאה מכך, זה להתרחש כאשר organoids מוחית האדם נחשפים לחיות ZIKV המתוארת. Organoids להציג רמות גבוהות של וירוס בתוך אוכלוסייתם קדמון עצבית, התערוכה מוות תאי חמורה, microcephaly לאורך זמן. דגם תלת-ממדי תא צורב מוחי זה מאפשר החוקרים לערוך ניסויים מתאימים מינים כדי להתבונן והתערבות פוטנציאלי עם זיהום ZIKV של המוח האנושי המתפתח. המודל מספק רלוונטיות משופרת על פני שיטות מימדי סטנדרטי והוא מכיל ביטוי חלבון אינן אפשריות במודלים חייתיים ואדריכלות הסלולר אדם ספציפי.
Introduction
Zika וירוס (ZIKV) התפשט במהירות מיקרונזיה, פולינזיה הצרפתית, יבשת אמריקה, וזה לאחרונה הוכח לחצות את1,מכשול היפרדות2 כדי להדביק את המוח בעובר המתפתח, המוביל התפתחותיות למחלות כזה כמו microcephaly3,4,5,6 . ההשפעה לטווח ארוך על החיים של חולים אלה, והיעדר הנוכחי טיפול, הוביל חוקרים ומטפלים לטרוף לצורך הבנה טובה יותר של מנגנוני מאחורי ושכפול, זיהום ZIKV. מחקרים קודמים בחנו ZIKV זיהום של מערכות במבחנה במגוון תא רלוונטי מבחינה פיזיולוגית סוגים7,8,9, וכן in vivo10 עם עכברים immunocompetent, immunocompromised11,12,13 , קופים14,15,16. בנוסף אלה טכניקות קונבנציונליים יותר, מספר קבוצות יישמו את תאי הגזע, נגזר organoids מוחי להבין יותר על זיהום ZIKV של המוח האנושי המתפתח. קבוצות אלה נעזרו organoids מוחי אנושי כדי לאשר microcephaly פנוטיפ17,18, לחקור את קולטני לקשר וירוס ערך19, לבחון תגובות פיזיולוגיות זיהום20 , 21, שעשוי להיות מסך עבור מועמדים סמים22. הנה טכניקה עבור במהירות בהפקת. ולהדביק organoids מוחי תאי נגזר מתואר, כפי שמוצג בעבר19, כדי לשפר את ההבנה של זיהום ZIKV של המוח האנושי המתפתח.
מאז organoids נוצרים מתרבויות pluripotent סטנדרטי בתאי גזע (PSC), טכניקה זו מאפשרת למגוון רחב של שאלות בנושאים מדעיים לקבל תשובה לגבי נגיפית של המוח המתפתח. לדוגמה, ניתן להשתמש CRISPR הנדסה לשנות שורות אלה PSC לפני זיהום תא צורב בקצב מהיר יותר מאשר רוב ויוו גנטי מחקרים19. בנוסף, בניגוד סטנדרטי שתי תרבויות בידול מימד (2D) organoids תערוכת אדריכלות הסלולר מתחם זה הוא קריטי עבור corticogenesis, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי ארכיטקטורה זו תשובש על זיהום 21. בסופו של דבר, עלות נמוכה יחסית של יצירת organoids מאפשר גבוה יותר תפוקה ניסויים ההקרנה בהשוואה למודלים ויוו . מצד שני, ישנם כמה חסרונות כדי הניצול של organoids ללמוד ZIKV. בעוד organoids הן מבחינה ביולוגית הרבה יותר רלוונטי מאשר תרבויות 2D, ישנם אתגרים נוספים להערכת organoids בשל טבעם תלת מימדי (3D). הדמיה של דיסוציאציה של organoids נוטה לערב השקעה גדולה יותר משאבים מאשר בתרבויות 2D סטנדרטי וציוד נוסף. בנוסף, organoids חוסר ה להערכת ורכיבי אימונולוגי כי קיימים דגמים ויוו , אז מהחוקרים המעוניינים אילו היבטים של זיהום נגיפי מומלץ לחפש פרוטוקול חלופי.
ישנן מספר טכניקות היווצרות של האדם organoids ו- neurospheres בתרבות, הם בדרך כלל נופלים בתוך הקטגוריות בדוגמת או בסך . שיטות בדוגמת ליישם גורמים לווסת ונ ט, BMP, TGFβ ו איתות המסלולים אחרות כדי לדחוף בידול לכיוון מסוים שושלות23. שיטות בסך, כמו זה שמתואר כאן, תוכלו לנצל הנטייה לכיוון תאי גזע pluripotent מושרה (iPSCs), תאי גזע עובריים (hESCs) להבדיל לכיוון שושלת neuroectodermal לפי ברירת מחדל24. לאחר כשלושה שבועות של בידול, organoids שנוצר מורכב מבני neuroepithelial הביוני גדולים, המכילים מספר סוגי תאים הם נצפו במוח המתפתח מוקדם.
הטכניקה בהפקת organoids מתרבויות PSC רגיל, ללא מזין, מדביק אלה organoids עם ZIKV מוצג במלואו. להדרכה על שיטות culturing לצורך מגירסה נטולת מזין, עיין בשיטות קודמות פרסומים25,26. בנוסף, על מנת להחיל כמויות עקבית של וירוס עבור ניסויים מרובים, זה חשוב לחשב את MOI מבעוד מועד. פעולה זו מתבצעת על-ידי עריכת זיהום של תאים Vero, ואחריו טיפול עם כיסוי בינוני, דגירה של immunostaining. תיאורים ושיטות של טכניקה זו כבר שתואר לעיל19,27.
ברגע התרבות PSC מגיע המפגש יעד של 50% - 70%, התאים ואז הפומבית, המצטברים לוחות 96-ובכן מצורף נמוך במיוחד. התאים הן נשמרות למשך 3 ימים ללא קסנו תאי גזע תחזוקה בתקשורת (SCMM), ובהמשך הוסב באמצעי התקשורת העצבית אינדוקציה לשארית של התרבות. ברגע organoids יש הבדיל למשך 3 שבועות, הזיהום יכול להתבצע. מאת באופן שגרתי לקיחת תמונות במהלך השבוע בעקבות זיהום, תקפידו חוקרים מוות תאי מתקדמת, שיבוש תא צורב. חוקרים עשויים גם מביצועם organoids את זה הזמן לנהל את תעתיק או פרוטיאומיה מבנית פרופיל. שיטות Cryosectioning lightsheet מומלצים עבור הדמיה, חוקרים יכולים לצפות לראות רמות גבוהות של זיהום, שכפול ויראלי במיוחד בתוך האוכלוסיות תא (NPC) קדמון עצבית ב organoids. בסופו של דבר, טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לבחון במהירות על מנגנוני נגיפית של המוח האנושי עם ציוד בעלות נמוכה ומוגבל.
Protocol
1. יצירת Organoids מוחין מ iPSC / hESC תרבות 2D (יום 0)
הערה: פרוטוקול זה מבוסס על ההנחה כי תאי גזע (SC) תחזוקה מתנהל SCMM בינוני עם vitronectin או Geltrex המצע. אם משתמש תא גזע אלטרנטיבי, חלבון culturing מדיה, מומלץ מעבר SC בתרבויות SCMM לפחות שני קטעים לפני ליזום היווצרות תא צורב. הפרוטוקול לא נבדק עם שיטות התרבות SC מבוסס-מזין-
- SC רגיל באמצעות תחזוקה שיטות 25 , 26, להביא תרבויות הנהרות 50% - 70%. זה בדרך כלל 3-4 ימים לאחר passaging, אבל זה יכול להיות תלוי בשיטה תרבות קו תא.
הערה: כ- 2 בארות מצלחת 6-ובכן יש צורך לייצר צלחת מלאה 96-ובכן organoids. - לבחון תרבויות דרך brightfield מיקרוסקופית בהגדלה X-20 X 10 כדי להבטיח מורפולוגיה המושבה בריא, עם אין בידול לזיהוי.
- להביא SCMM 37 ° C אמבט מים חמים, ולאחר הפשרה בקבוקון 50 µL 50 מ מ Y-27632 (מעכב רוק), 2 מ של ניתוק אנזימטי מגיב לטמפרטורת החדר.
- להכין צלחת טוב של U-התחתון 96 מצורף נמוך במיוחד (אולה) פיפטה P200 רב-ערוצי, מאגר ריאגנט 25 מ ל.
- Aliquot 45 מ של SCMM בשפופרת חרוט 50-mL, ולהוסיף 45 µL של 50 מ מ Y-27632. לערבב ביסודיות על ידי triturating.
- ואקום תשאף שתי הבארות המכיל SCs ולאחר להוסיף במהירות 1 מ"ל של ריאגנט ניתוק אנזים ללא כל טוב באמצעות פיפטה של P1000. דגירה את הצלחת ב חממה 37 ° C עבור 4 דק
- ואקום תשאף הבארות שטופלו, ומוסיפים 1 מ"ל של ניתוק אנזימטי מגיב מכל קידוח באמצעות פיפטה של P1000.
- Incubate הצלחת ב חממה 37 ° C עבור 5 דק נוספות
- הסר את הלוחית ולבחון הבארות שטופלו. טפח בעדינות על הצלחת לשבור את התאים צבורים. אם תאים גדולים אשכולות עדיין גלויים, דגירה את הצלחת למשך 2 דקות נוספות-37 ° C. חזור על שלב זה עד אשכולות כבר אינם גלויים בעין בלתי מזוינת.
- ברגע התאים כראוי חלופה מועדפת, להוסיף 1 מ"ל של SCMM מכל קידוח לנטרל אנזימים דיסוציאציה. בריכה mL 4 של השעיה תא צינור חרוטי 50-mL ולקחת קטן aliquot לספירת תאים.
- להחזיר כל בארות הנותרים, לא מטופל בצלחת תחזוקה החממה 37 ° C.
- תוך ספירה, centrifuge התליה תא ב g x 300 עבור 5 דק.
- לקבוע את המספר הכולל של תאים, לחשב את הסכום של SCMM + Y-27632 פתרון זה יהיה צורך להשיג השעיה 60,000 תאים/mL-
- בקפידה ואקום וארוקן את תגובת שיקוע והוסף את הנפח מחושב של SCMM + Y-27632 פתרון. מערבבים 5 - 10 פעמים עם pipet 5-mL, הבטחת השעיה אחיד תא.
- מיד להעביר התליה תא לשמורה ריאגנט ולאחר פיפטה 150 µL לבאר כל צלחת אולה U-התחתון 96-ובכן באמצעות פיפטה P200 רב-ערוצי. זה יוצר 96 organoids נפרדים, שכל אחד מהם בתחילה המורכב תאים 9,000.
- צנטריפוגה הצלחת ב g x 150 עבור מינימלית 1
- מקם את הצלחת לתוך החממה 37 ° C, ואל תפריעי את הצלחת. בשביל ה 48
2. תא צורב מוחי תחזוקה (יום 2)
µL- להכין 17 מ של SCMM עם 17 של 50 מ מ Y-27643 צינור חרוטי 50-mL. לחמם את SCMM + Y-27632 פתרון 37 ° C באמבט מים חמים.
- לוקח את הצלחת תא צורב של החממה, וצייר בעזרת פיפטה P200 רב-ערוצי מוגדר 75 µL, לאט לאט עד בינוני מהקצה של הבאר על השורה הראשונה. ברגע המדיום נשלפה, במהירות לגרש גב בינוני לתוך הבאר להרים organoids והתאים רופף. חזור על פעולה זו עבור כל שורה.
הערה: טכניקה זו, ןלהל " פיזור, " מרימה פסולת הסלולר, את תא צורב לתוך ההשעיה. תא צורב כיורים במהירות לתחתית הבאר, בעוד ההריסות קטן נשאר ההשעיה, ומאפשרת יוסרו עם שינוי מדיה. פעולה זו מסייעת למנוע תא צורב את נח על פסולת הסלולר במהלך תרבות.- לאחר כל בארות כבר התפזרו, המתן 15 s כדי להבטיח כי organoids טבענו לתחתית של כל טוב.
- לאט ובזהירות תשאף µL 75 בינוני כל טוב באמצעות פיפטה P200 רב-ערוצי ולא לוותר על לשמורה פסולת.
הערה: רוב המשתמשים מדי פעם האחות של תא צורב במהלך הזנות רגיל. הדבר יכול להתרחש בערך 1% מהזמן. אנא תכנן בהתאם להבטיח שלא מספיק organoids לשרוד לנקודות זמן הניסוי. - העברת SCMM + Y-27632 פתרון לשמורה ריאגנט, ונותנות 150 µL לתוך כל תא צורב היטב באמצעות פיפטה P200 רב-ערוצי את.
- למקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 37 ° C.
3. תא צורב מוחי תחזוקה (3 ביום)
- חם 17 מ"ל של SCMM עד 37 ° C, זה הזמן מבלי Y-27643.
- עם פיפטה P200 רב-ערוצי, מוגדר 100 µL, לפזר את כל בארות של צלחת תא צורב (ראה שלב 2.2). חכה 15 s כדי להבטיח כי organoids טבענו לתחתית של בארות שלהם.
- להכין מאגר פסולת, להעביר SCMM ומחוממת לתוך מאגר מקור.
- בקפידה תשאף µL 125 בינוני מכל קידוח, ולהחליף עם 150 µL של טרי SCMM באמצעות פיפטה P200 רב-ערוצי את.
- למקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 37 ° C.
4. תא צורב מוחי תחזוקה (יום 4 +)
הערה: התנהגות זו תחזוקה שוטפת בכל יום עד זיהום.
- לפני תחילת השידור ביום 4, להכין עצבית אינדוקציה (NI) בינוני.
- הפשרה aliquot 250 µL של 2 מ"ג/מ"ל הפארין, יחד עם אחת 5 מ"ל בקבוקון מוסף N-2 X 100. הוסף את µL 250 של הפארין, 5 מ של 100 X N-2 מ של 100 X MEM-NEAA עד 500 מ"ל של DMEM / F12 + GlutaMAX. סטרילי לסנן את הפתרון מעורב במסנן 500 מ"ל.
הערה: תמשיך ני ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש; ני נמשך עד שבועיים לפני בינוני טרי צריך להיות מוכן.
- הפשרה aliquot 250 µL של 2 מ"ג/מ"ל הפארין, יחד עם אחת 5 מ"ל בקבוקון מוסף N-2 X 100. הוסף את µL 250 של הפארין, 5 מ של 100 X N-2 מ של 100 X MEM-NEAA עד 500 מ"ל של DMEM / F12 + GlutaMAX. סטרילי לסנן את הפתרון מעורב במסנן 500 מ"ל.
- חם 17 מ ל ני בינוניים עד 37 מעלות צלזיוס.
- עם פיפטה P200 רב-ערוצי, מוגדר 100 µL, לפזר את כל בארות של צלחת תא צורב (ראה שלב 2.2). חכה 15 s כדי להבטיח כי organoids טבענו לתחתית של בארות שלהם.
- להכין מאגר פסולת, העברת ני ומחוממת לשמורה מקור.
- בקפידה תשאף µL 125 בינוני מכל קידוח, ולהחליף עם 125 µL של ני טריים באמצעות פיפטה P200 רב-ערוצי את.
- למקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 37 ° C.
5. תא צורב זיהום עם ZIKV (~ יום 24)
הערה: לאחר כ- 3 שבועות של בידול, אינטרנט שםתהיה מבנים גדולים neuroepithelial, רוזטות גלוי בתוך תא צורב זה יהיה מאוד לזיהומים ZIKV.
- להביא ארל ' s 1 X מאוזנת מלח פתרון (EBSS), 1 X PBS ו ני ל- C ° 37 באמבט מים חמים.
- Dilute ZIKV הריכוז הידוע ב- 1 X EBSS הזיהום היעד הריבוי של זיהום (MOI).
הערה: Titrations של MOIs שונה מומלץ להשיג תגובה מינון ויראלי. זו עשויה להשתנות לפי זן וירוס; עבור בקרת האוויר VR-1838, בקרת האוויר VR-1843, MOI טיפוסי ערכי נע בין 0.1 ל 10). - בזהירות הסר בינוני כל תא צורב היטב באמצעות פיפטה P200 של ערוץ אחד. להוסיף במהירות 200 µL ל- 1 X PBS כל טוב באמצעות פיפטה רב-ערוצי P200 לשטוף את organoids.
- בזהירות הסר בינוני כל תא צורב היטב באמצעות פיפטה P200 של ערוץ אחד. להוסיף במהירות 50 µL 1 X EBSS בלבד (מעושה זיהום) או ZIKV וירוס פתרון טוב ולהבטיח כי תא צורב לגמרי שקוע. חזור על כל תא צורב זה להיות נגועים לחקר.
- למקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 37 ° C עבור ה 2
הערה: המקננת organoids נגועה ואימץ עבור משך הזה צריך לא להשפיע באופן משמעותי את הצמיחה שלהם לעומת ללא הפרעה organoids. - כ 30 דקות לפני הדגירה ויראלי הוא השלים, aliquot 25 מ ל ני לתוך צינור חרוטי 50-mL, ולהביא 37 ° C באמבט מים חמים.
- לאחר חשיפה ויראלית הושלם, לשטוף את organoids עם µL 200 ל- PBS 1 X עבור כל טוב, לאפשר organoids להסתפק 15 s ולאחר מכן הסר 1 X PBS באמצעות פיפטה של ערוץ אחד P200.
- µL להוסיף 200 של ני טריים לכל טוב, ולמקם בחזרה לתוך החממה.
- אופציונלי: ליום 0 זמן הצבע, organoids עשוי לדימות שעה לאחר זיהום.
- המשך לתרבות על-ידי החלפת 125 µL NI בכל יום אחר באמצעות שיטת הפיזור (ראה שלב 4). יש להקפיד השלך בילה מדיה וטיפים, זה מכיל חלקיקים ZIKV זיהומית.
Representative Results
במהלך היום להק תא צורב, SC תרבויות צריכות להיות בשלב הצמיחה יומן, שבה הם 50% - 70% confluent, כפי שמוצג באיור 1(A-C). תרבויות יוצרות מושבות מעוגל עם קצוות ברורים, הבארות צריכה להיות ברורה של בידול איור 1(D-E). אם בידול מתרחש, מומלץ לערוך לבחור כדי להסיר לנקות את האזורים הנגועים בתוך הצלחות לפחות יום אחד לפני יצירת organoids. אם חלק גדול של התרבות הוא הבדיל, ייתכן צורך לנהל מעבר נוסף תת, להפשיר בקבוקון חדשים או לשנות את תאי הגזע טכניקות תרבות כדי להבטיח כי organoids נוצרת על ידי תרבויות תאי גזע טהור.
הדיסוציאציה ע י שילוב של ניתוק אנזים ו אנזימטי ריאגנטים הטיפול אמור להוביל בעיקר תאים בודדים, אך עדיין ייתכנו אגרגטים קטנים של תאים ציין במהלך ספירת. הנוכחות של אגרגטים קטנים לא מופיע כדי לשבש את היווצרות תא צורב, אבל זה עשוי להשפיע על דיוק ספירה. מומלץ כי באשמות נעשים עבור דגימה, אם הסעיפים להשתנות על ידי מעל 20%, זה עשוי להיות נחוץ להגדיל את זמן הדיסוציאציה singularize תאים נוספים.
ברגע התאים הם נזרע, ויצא למטה לתוך צלחת אולה U-התחתון 96-ובכן (איור 2א), הם יופיעו כמו סדין שטוחים, צפיפות של תאים על החלק התחתון של כל טוב. התאים לצבור לאט במשך היומיים הבאים. עדיף שלא להפריע את הצלחת במהלך 48 שעות אלה, כמו כוחות מכני עלולות לשבש את הצבירה מעוצב-באופן רופף. עבור 10 הימים הראשונים, תא צורב יישאר בעיקר כדורית, יגדל מ ~ 300 מיקרומטר 600-800 מיקרומטר (איור 2B). עוד מבנים הנצפה מתחילים להופיע בתא צורב בין יום 10 יום 20 (איור 2C-E). ביום 24, חוקרים צריך להיות מסוגל להתבונן רוזט-מבני דרך מיקרוסקופ brightfield (איור 2F). והמשיכו את התרבות, אלה מבנים neuroepithelial עשוי להגדיל כמות וגודל במשך מספר ימים (איור 2G). במהלך הזנות, החוקר יבחינו כמויות ניכרות של פסולת איסוף שבתחתית כל טוב, במיוחד במהלך 2 השבועות הראשונים של תרבות. טכניקת פיזור שמתואר בשלב 2.2 מסיר רוב הנפולת הסלולר למניעת ההריסות אפופטוטיים להיפגע מרכישות על הזנות מרובות (איור 3א). פסולת זו יכולה להפריע הדמיה, זה יכול לעשות את זה יותר מאתגר כדי להתבונן ולכמת מוות תאי דלקת-induced ולאחר שזה מספק אסימטרי למנהיגנו תא צורב שכנות העלולה להשפיע על בידול. אם טכניקת פיזור מתנהל כראוי, זה צריך להיות מופחת (איור 3בג, 3D-E).
מומלץ לערוך cryosections או lightsheet הדמיה כדי לבדוק את מבנה קליפתי ויוצרים בתוך organoids. ב- organoids 25 יום, מבנים רוזט ואזורי חדרית הם נראים בבירור דאפי (איור 4א), צביעת פוספו-vimentin (איור 4B). הנוכחות של TBR2 (איור 4ג) מציין כי אבות ביניים יוצרים, עם מורפולוגיה שמרמז ההעברה כלפי חוץ. MAP2 + (איור 4D) נוירונים לאכלס את האזורים החיצוניים של כל רוזט. מכל אלה חלבונים, אחד יכול לדמיין את אזור חדרית (VZ), אזור subventricular (SVZ), אזור ביניים (עז) וכן לוחית בקליפת המוח (CP) בתוך כל רוזט (איור 4E, 4E'). אחד יכול להמשיך תרבות אלה organoids על מנת לצפות בשלבים מאוחרים יותר של התפתחות. אמנם לקרנל בקליפת המוח אינו בולט גם בסוג זה של תא צורב, המתג טבעי כדי gliogenesis להתרחש הרבה כמו ויוו. זה יכול להיות שנצפו ביום 108 organoids, שבו חלק גדול של התאים אקספרס או MAP2 או GFAP (איור 4F-אני).
המשתמשים עשויים לצפות לראות הבדלים בגודל תא צורב על ידי כ 3 ימים לאחר זיהום ZIKV, בהתאם למשרד הפנים ויראלי להחיל את organoids (איור 5A-B). לאחר 3 ימים אלה, יהיו גם עלייה בפסולת הסלולר בבארות נגועים לעומת הבארות מעושה. ההפרש בין גודל תא צורב יגדל במהלך השבוע הבא, עד organoids נגוע מתחילות להיקרע לגזרים (איור 5C-D). מגוון של מבחני עשוי לשמש בשלב זה לחקור מנגנונים זיהום, כולל חילוץ RNA נגיפי ו- cryosectioning (מומלץ נוגדנים דיווחו על השולחן של החומרים). על cryosectioning, תקפידו משתמשים נוכחות גדולה של הווירוס באזור הפסגה של מבנים neuroepithelial, רומז על הרגישות של ובתאים עצבית (NPCs) לזיהום ZIKV (איור 6). Immunofluorescence של organoids משרטוטי גם יראה עלייה בביטוי קספאז-3 cleaved organoids הנגוע (איור 7).
איור 1 : תאי גזע מורפולוגיה המושבה לפני היווצרות תא צורב.
מושבות צריך להיות 50% - 70% confluent בזמנו של דיסוציאציה לייצר מספר גדול של organoids עקבית. (א) Sparse, נזרע לאחרונה תרבויות שטרם הגעת יומן הגידול שלב, לא יפיק organoids רבים. (B) ברגע התאים מגיע המפגש המתאים, הם מוכנים דיסוציאציה. חשוב גם כי מושבות אלו ומפוקחים כדי להבטיח כי הם ברורים של בידול. (ג) מושבות שנלקחו רחוק מדי תגיע למפגש יתר והם אינם מומלצים עבור היווצרות תא צורב. תרבויות במדינה הזו נוטים יותר מכילים תאים המבדילים. (ד) קצוות המושבה צריך להיות ברור, עם מורפולוגיה תאים עקבית של תאים מעוגלים במרכז, מוארך מעט תאים כלפי הקצוות. (ה) בידול מינימלי צריך להיות נוכח בתרבויות. אם תאים גדול יותר, שעברו שיטוח הם נצפו על או לקצוות של המושבות (חץ לבן) מהווים יותר מ בערך 1% של התרבות, מומלץ כי מעברים פיק-כדי-הסר או נוספים נערכים כדי ליצור אוכלוסיה תאי גזע אחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : גידול מוחי תא צורב לאורך זמן.
(א) דיאגרמה לייצור organoids מוחי ועד לכרטיסי מגירסה הקפיד קסנו-חופשית, נטולת מזין בינוני. (B) 8 הימים הראשונים, organoids ישאר בעיקר כדורית עם כמה תכונות לזיהוי. הקוטר של תא צורב ינוע מ מיקרומטר כ 300 ל- 500 מיקרומטר. (ג-ה) ביום 10 אזורים ברורים יתחיל להיות לזיהוי ברחבי הפריפריה של organoids, הם יאבדו צורה כדורית שלהם. הם ימשיכו להגדיל בגודל כ- 1 מ"מ קוטר, תלוי במידה רבה שורת התאים בשימוש לייצר את organoids. (נ) לאחר כ 20 ימים של בידול, משתמשים תקפידו היווצרות מבנים neuroepithelial (חץ שחור) באזורים היקפיים ברורה של organoids רוב. אלה כוללים מורפולוגיה טבעתי, עם מבנים הפסגה הבזליים מחקה את אלה של קליפת המוח המתפתח. (G) מבנים neuroepithelial אלה ימשיכו לצמוח ולהגדיל בגודל של 20-30 ימים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : פינוי של פסולת הסלולר באמצעות פיזור להאכיל טכניקה.
במהלך הצמיחה תא צורב, כמות גדולה של מוות של תאים הוא צפוי, והוא יכול להוביל הצטברות של פסולת הסלולר סביב הבסיס של תא צורב. (א) טכניקת פיזור מתוארים מאפשר לחוקרים להסיר את מרבית הנפולת במהלך כל הזנה. כדי לעשות זאת, בעזרת פיפטה P200 רב-ערוצי, לאט לאט למשוך את המדיום בשימוש, במהירות לגרש אותו להרים את הלכלוך תא צורב ותא לתוך ההשעיה. תא צורב מהר יירד לתחתית הבאר, ובו בזמן שידור רגיל יכול להתבצע. דוגמאות תא צורב יום 6 לפני (B) , לאחר האכלה פיזור (ג) מציג צמצום פסולת ניכר. זה ממשיך למשך מספר שבועות, כפי שהראה על יום 18 תא צורב לפני (D) ואחרי (E) פיזור האכלה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : אפיון organoids מוחי באמצעות אימונוהיסטוכימיה.
תמונות Lightsheet של organoids מוחי מוצגים לספק דוגמה של הארכיטקטורה הסלולר צורות. יום 25, דאפי (א) פוספור-Vimentin (B) מציינות רוזטות בודדים, אזורי חדרית, בהתאמה. (ג) TBR2 תוויות ביניים אבות כי נודדות כלפי חוץ, MAP2 (ד) תוויות נוירונים אשר יצרו בצלחת קורטיקלית. (E, E') השילוב של חלבונים אלה מראה בבירור את החוק הביוגנטי של פיתוח קורטיקלית במודלים תא צורב המוח. (F-אני) ביום 108, שאירע gliogenesis, עם תערובת של GFAP + MAP2 + תאים לאכלס הרבה תא צורב. VZ = אזור חדרית, SVZ = אזור subventricular, איז = אזור ביניים, CP = צלחת קורטיקלית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : השפלה של הנגוע organoids.
(א) תמונות שדה בהיר של ואימץ נגועה ZIKV organoids מוחי-MOI = 0.1 ו-10. התמונות צולמו מיד לאחר זיהום (יום 0), כמו גם כמו 3 ו 6 ימים לאחר הפגיעה. (בג) תמונות Brightfield של שאריות תאים המקיפים מעושה (B) ו- (ג) ZIKV נגועה-MOI = 10 organoids מוחי 3 ימים לאחר הפגיעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 6 : Cryosection ו- immunofluorescence של נגוע organoids.
יום 24 organoids נחשפו ZIKV-MOI = 0.1, ו cryosectioned 6 ימים לאחר מכן. בשלב זה, יש נוכחות ברורה של וירוס באזורי חדרית, subventricular וביניים של תא צורב שבו שוכנות ובתאים עצבית, עכשיו, דונלד רדיאלי. (א) דרך מכתים גרעינית, אזורי neuroepithelial אלה הם נראים בבירור עקב (החצים הלבנים) לצפיפות גבוהה של גרעינים בצורת מבנים דמויי טבעת סביב המשטח הפסגה. (B) על ידי צביעת למעטפת ויראלי, אחד ניתן להבחין נוכחות גבוהה יחסית של וירוס בתוך מבנים אלה רוזט (חץ לבן). שימו לב כי יש כמות קטנה של הוירוס קיים בתאים שונים היקפיים לא מזוהה. (C-D) MAP2 או אחרים ספציפיים נוירון כתמי הצג כי ישנם נוירונים נוכח בתרבויות שאינן מופיעות להידבק בנגיף כאשר בשכבות עם הכתם ויראלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 7 : ביקע קספאז-3 immunofluorescence של תא צורב נגועים.
לאחר ההדבקה, אחד עשויים להשתמש אפופטוטיים להיפגע אינדיקטורים לחקור את המנגנונים של מוות של תאים המתרחשות בתוך organoids. בדוגמה זו, organoids 24 יום נחשפו ZIKV-MOI = 0.1, ו cryosectioned 6 ימים לאחר מכן. (א) organoids נגוע להראות אין מעטפת נגיפית (4G 2 חלבון), ואת כמות מזערית של קספאז cleaved-3 עקב אפופטוזיס homeostatic המתרחשים בתוך הרקמה. (B) רוזטות נגועים מתחילים להראות רמות גבוהות של אפופטוזיס. (ג) רוזטות כי הם מראה זיהום חמור באמצעות 4G 2 כתמים גם נוטים להפגין רמות גבוהות של קספאז-3 cleaved באזורים אלה. יש קשר ישיר בין חומרת הזיהום וביטוי קספאז-3 cleaved בתוך רוזטות נגועים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
ישנם מספר אזהרות שיש לקחת בחשבון בעת ניצול אנושי organoids מוחי לחקור זיהום ZIKV. שיקול חשוב אחד את היווצרות תא צורב והוא המבנה תלויים במידה רבה לקו תאי הגזע שממנו הם נוצרו. בעת השוואה בין שורות תאים, כולל קווי הנדסה isogenic; עדיף להגיע למסקנות באמצעות subclones מרובות, אידיאלי מספר שורות תאי הגזע. בנוסף בשל ההפרש בין שורות תאים, ניסויים פיילוט כדי להבטיח כי בידול הנכון הוא המתרחשים organoids זה מומלץ. בעוד המבנים neuroepithelial גלויים על ידי מיקרוסקופ brightfield, הוא גם הציע לערוך ניסויים לרביעיית-PCR או cryosectioning כדי לחפש בידול עצבית סמנים כגון PAX6 או פוספו-vimentin.
אחד צריך גם צופים השתנות ניכר בין organoids בתוך התא באותה השורה. בשל אופיו בסך של הפרוטוקול, המספר והגודל של מבנים neuroepithelial יכול להשתנות בין organoids בודדים. בדרך כלל, אפשר לצפות לפחות שניים גדול (> מיקרומטר 200 בקוטר מאת D24) רוזטות עצבית לכל תא צורב. מסיבה זו, מחקרי האורך, כגון ההתבוננות בשינוי גודל תא צורב על זיהום, הם בעיקר מחכימים. השתנות בין אצוות יכולה להתרחש גם, הגורם הסביר ביותר לכך ספירת תאים לא מדויקים או זריעה. מומלץ לערוך באשמות וכדי לוודא שהתליה תא מעורבב היטב לפני זריעה על גבי הלוחות אולה U-התחתון 96-ובכן.
כאשר culturing organoids בתוך צלחות אולה U-התחתון 96-ובכן, מתכנן לראות תופעות התאדות ניכרת מסביב לקצוות של הלוחות. הוא אידיאלי למלא את הבארות הללו PBS ולעבוד רק עם הבארות 60 מרכז. בשל האידוי, יהיו חשופים organoids ב הבארות החיצוני תנאים שונים מאשר אלה במרכז, אשר ככל הנראה ישפיעו על צמיחה ובידול שלהם. אנא שקול זה כאשר מתכננים את המספר של organoids זה יהיה צורך לניסויים. בנוסף, organoids יתחיל והדבר התבנית 96-ובכן אחרי בערך 30 ימים, אשר יהיה גלוי עקב שינוי צבע של תרבות בינוני. אם תכננתם לקחת את organoids אחרי 30 הימים, מומלץ להעביר את organoids צלחת 24-ובכן אולה. כדי לבצע את ההעברה, להשתמש במספריים לחתוך טיפ P1000 כך הפתיחה הוא הרבה יותר גדול מאשר organoids עצמם ולאחר להעביר את organoids על ידי pipetting.
Organoids המוח האנושי החזק פוטנציאל רב בקידום ההבנה של השדה של neurodevelopment ומחלות. חוקרים מוזמנים לשנות את הפרוטוקול לפי הצורך. לדוגמה, אחד יכול ליישם גורמים המתבנת כדי לשפר את יעילות בידול כלפי סוגי תאים ספציפית, ומאפשר להם לחקור את ההשפעות ויראלי על אזורים מסוימים אנטומיים. השפעות התפתחותיות ZIKV הם עדיין הבינו, אבל זו גישה חדשה ייתן חוקרים דרך נגישות מהירה, תפוקה גבוהה של חוקרים את המנגנונים של זיהום.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.
Acknowledgments
המחברים תודה פריסילה ל' יאנג דומיניק ובורי ג' של הספר לרפואה בהרווארד לעזרה עם הפצת הראשונית, כימות של ZIKV. אנחנו גם רוצה להודות קירקפטריק ד נתנאל לתמיכה הדמיה. השולט נתמכה על ידי המרכז סטנלי עבור מכון תא גזע הרווארד ומחקר פסיכיאטריות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR | StemCell Technologies | 5873 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650-100ML | |
| Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) | Gibco | 10565-018 | (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502-048 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) | Gibco | 11140-050 | |
| Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) | GE Healthcare Life Sciences | SH30029.02 | |
| Stericup Filter (500mL) | Millipore | 220009-140 | |
| Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom | Corning | 7007 | |
| Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) | Integra | 4312 | |
| Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ | Rainin | 17013810 | |
| Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible | Thermo Scientific | 75007210 | |
| Culture Plate Centrifuge Rotor | Thermo Scientific | 75005706 | |
| Vero Cells | ATCC | CCL-81 | For virus expansion, if necessary |
| Zika Virus (Uganda Strain) | ATCC | VR-1838 | Other strains may be used |
| Zika Virus (Puerto Rico Strain) | ATCC | VR-1843 | Other strains may be used |
| phospho-vimentin | MBL | D076-3 | mouse polyclonal, 1:250 dilution |
| TBR2 | Abcam | ab23345 | rabbit polyclonal, 1:300 dilution |
| MAP2 | Novus | NB300-213 | chicken polyclonal, 1:1500 dilution |
| GFAP | Cell Signaling Technologies | CST12389S | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| D1-4G2 flavivirus envelope protein | EMD Millipore | MAB10216 | mouse monoclonal, 1:500 dilution |
| cleaved caspase-3 | Cell Signaling Technologies | 9661 | rabbit polyclonal, 1:200 dilution |
| 488 anti-mouse IgG | Thermo Fisher | A-11001 | goat polyclonal, 1:1000 |
| 594 anti-rabbit IgG | Thermo Fisher | A-11037 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
| 647 anti-chicken IgY | Thermo Fisher | A-21449 | goat polyclonal, 1:1000 dilution |
References
- Jurado, K. A., et al. Zika virus productively infects primary human placenta-specific macrophages. JCI Insight. 1, 1-6 (2016).
- Quicke, K. M., et al. Zika Virus Infects Human Placental Macrophages. Cell Host Microbe. 20, 83-90 (2016).
- Brasil, P., et al. Zika Virus Infection in Pregnant Women in Rio de Janeiro - Preliminary Report. New Engl J Med. 375, 2321-2334 (2016).
- Mlakar, J., et al. Zika Virus Associated with Microcephaly. New Engl J Med. 374, 951-958 (2016).
- Rubin, E. J., Greene, M. F., Baden, L. R. Zika Virus and Microcephaly. New Engl J Med. 374, 984-985 (2016).
- Soares de Oliveira-Szejnfeld, P., et al. Congenital Brain Abnormalities and Zika Virus: What the Radiologist Can Expect to See Prenatally and Postnatally. Radiology. , 161584 (2016).
- Hamel, R., et al. Biology of Zika Virus Infection in Human Skin Cells. J Virol. 89, 8880-8896 (2015).
- Tang, H., et al. Zika Virus Infects Human Cortical Neural Progenitors and Attenuates Their Growth. Cell Stem Cell. 18, 587-590 (2016).
- Xu, M., et al. Identification of small-molecule inhibitors of Zika virus infection and induced neural cell death via a drug repurposing screen. Nat Med. 22, 1101-1107 (2016).
- Morrison, T. E., Diamond, M. S. Animal Models of Zika Virus Infection, Pathogenesis, and Immunity. Journal of virology. , 00009-00017 (2017).
- Lazear, H. M., et al. A Mouse Model of Zika Virus Pathogenesis. Cell Host Microbe. 19, 720-730 (2016).
- Manangeeswaran, M., Ireland, D. D. C., Verthelyi, D., Tonelli, L., Wang, V. Zika (PRVABC59) Infection Is Associated with T cell Infiltration and Neurodegeneration in CNS of Immunocompetent Neonatal C57Bl/6 Mice. PLOS Pathog. 12, 1006004 (2016).
- Miner, J. J., et al. Zika Virus Infection in Mice Causes Panuveitis with Shedding of Virus in Tears. Cell reports. 16, 3208-3218 (2016).
- Dudley, D. M., et al. A rhesus macaque model of Asian-lineage Zika virus infection. Nat Commun. 7, 12204 (2016).
- Li, X. -F., et al. Characterization of a 2016 Clinical Isolate of Zika Virus in Non-human Primates. EBioMedicine. 12, 170-177 (2016).
- Osuna, C. E., et al. Zika viral dynamics and shedding in rhesus and cynomolgus macaques. Nat Med. 22, 1448-1455 (2016).
- Cugola, F. R., et al. The Brazilian Zika virus strain causes birth defects in experimental models. Nature. , (2016).
- Garcez, P. P., et al. Zika virus impairs growth in human neurospheres and brain organoids. Science. 352, 816-818 (2016).
- Wells, M. F., et al. Genetic Ablation of AXL Does Not Protect Human Neural Progenitor Cells and Cerebral Organoids from Zika Virus Infection. Cell Stem Cell. 19, 703-708 (2016).
- Dang, J., et al. Zika Virus Depletes Neural Progenitors in Human Cerebral Organoids through Activation of the Innate Immune Receptor TLR3. Cell Stem Cell. 19, 258-265 (2016).
- Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell Stem Cell. 20, 397-406 (2017).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
- Eiraku, M., et al. Self-Organized Formation of Polarized Cortical Tissues from ESCs and Its Active Manipulation by Extrinsic Signals. Cell Stem Cell. 3, 519-532 (2008).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2012).
- Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8, 424-429 (2011).
- Beers, J., et al. Passaging and colony expansion of human pluripotent stem cells by enzyme-free dissociation in chemically defined culture conditions. Nat Protoc. 7, 2029-2040 (2012).
- Contreras, D., Arumugaswami, V. Zika Virus Infectious Cell Culture System and the In Vitro. Prophylactic Effect of Interferons. J Vis Exp. , e10-e13 (2016).
