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Neuroscience

मॉडलिंग स्टेम सेल व्युत्पंन सेरेब्रल Organoids का उपयोग इन विट्रो में विकासशील मानव मस्तिष्क के Zika वायरस संक्रमण

Published: September 19, 2017 doi: 10.3791/56404
Automatic Translation
*1, *2,3, 2,3, 1
1Department of Neuroscience, Novartis Institutes for BioMedical Research, 2Stanley Center for Psychiatric Research, Broad Institute of MIT and Harvard, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology and Harvard Stem Cell Institute, Harvard University
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक तकनीक विकसित मानव मस्तिष्क के Zika वायरस संक्रमण मॉडल के लिए इस्तेमाल किया । wildtype या इंजीनियर स्टेम सेल लाइनों का प्रयोग, शोधकर्ताओं इस तकनीक का उपयोग करने के लिए विभिंन तंत्र या उपचार है कि जल्दी मस्तिष्क संक्रमण को प्रभावित कर सकते है और जिसके परिणामस्वरूप Zika वायरस में microcephaly संक्रमित भ्रूण को उजागर कर सकते हैं ।

Abstract

अतिसंवेदनशील आबादी में Zika वायरस (ZIKV) का हाल ही में उद्भव microcephaly और नवजात शिशुओं में अन्य neurodevelopmental स्थितियों में अचानक वृद्धि हुई है । जबकि मच्छरों वायरल संचरण का मुख्य मार्ग है, यह भी यौन संपर्क और ऊर्ध्वाधर मां से भ्रूण संचरण के माध्यम से फैल दिखाया गया है । संचरण के इस उत्तरार्द्ध मामले में, ZIKV के अद्वितीय वायरल tropism के कारण, वायरस को मुख्य रूप से विकासशील मस्तिष्क के तंत्रिका जनक कोशिकाओं (NPCs) को लक्षित करने के लिए माना जाता है ।

यहां ZIKV संक्रमण मॉडलिंग के लिए एक विधि है, और जिसके परिणामस्वरूप microcephaly, जब मानव मस्तिष्क organoids ZIKV रहने के लिए उजागर कर रहे है वर्णित है । organoids उनके तंत्रिका जनक जनसंख्या के भीतर वायरस के उच्च स्तर का प्रदर्शन, और समय के साथ गंभीर कोशिका मृत्यु और microcephaly प्रदर्शन । यह तीन आयामी सेरेब्रल organoid मॉडल शोधकर्ताओं प्रजातियों का संचालन करने के लिए मिलान प्रयोगों का पालन करने के लिए अनुमति देता है और संभावित विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण के साथ हस्तक्षेप. मॉडल मानक दो आयामी तरीकों पर बेहतर प्रासंगिकता प्रदान करता है, और मानव विशेष सेलुलर वास्तुकला और प्रोटीन अभिव्यक्ति है कि पशु मॉडलों में संभव नहीं है शामिल हैं ।

Introduction

Zika वायरस (ZIKV) तेजी से माइक्रोनेशिया, फ्रेंच पोलिनेशिया, और अमेरिका में फैल गया है, और हाल ही में अपरा बैरियर पार करने के लिए दिखाया गया है1,2 विकासशील भ्रूण मस्तिष्क को संक्रमित करने के लिए, neurodevelopmental रोगों के लिए अग्रणी ऐसे microcephaly3,4,5,6 के रूप में । इन रोगियों के जीवन पर दीर्घकालिक प्रभाव है, और उपचार के मौजूदा कमी, शोधकर्ताओं और चिकित्सकों नेतृत्व में ZIKV संक्रमण और प्रतिकृति के पीछे तंत्र की एक बेहतर समझ के लिए हाथापाई है । पिछले अध्ययनों से इन विट्रो प्रणालियों में के ZIKV संक्रमण की जांच की है शारीरिक रूप से प्रासंगिक सेल प्रकार7,8,9, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से vivo में10 के साथ असुरक्षित और प्रतिरक्षा चूहों11,12,13 और गैर मानव रहनुमाओं14,15,16। इन अधिक परंपरागत तकनीकों के अलावा, कई समूहों स्टेम सेल लागू किया है-सेरेब्रल organoids व्युत्पंन के लिए विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण के बारे में अधिक समझते हैं । इन समूहों मानव सेरेब्रल organoids का उपयोग किया है microcephaly phenotype17,18की पुष्टि करने के लिए, वायरस प्रविष्टि19से जुड़े रिसेप्टर्स की जांच,20 संक्रमण के लिए शारीरिक प्रतिक्रियाओं की जांच , 21, और संभावित दवा के लिए स्क्रीन उंमीदवारों22। यहां तेजी से उत्पादन और संक्रमित स्टेम सेल व्युत्पंन सेरेब्रल organoids के लिए एक तकनीक का वर्णन किया है, के रूप में पहले दिखाया गया है19, विकासशील मानव मस्तिष्क के ZIKV संक्रमण की समझ में सुधार करने के लिए ।

चूंकि organoids मानक pluripotent स्टेम सेल (पीएससी) संस्कृतियों से बना रहे हैं, इस तकनीक वैज्ञानिक प्रश्नों की एक किस्म के लिए अनुमति देता है विकासशील मस्तिष्क के वायरल संक्रमण के बारे में जवाब दिया जाएगा । उदाहरण के लिए, CRISPR इंजीनियरिंग का उपयोग इन पीएससी लाइनों को organoid संक्रमण से पहले संशोधित करने के लिए किया जा सकता है जिससे vivo जेनेटिक स्टडीज19 में सबसे अधिक तेज दर पर है । इसके अतिरिक्त, मानक दो आयामी (2d) विभेद संस्कृतियों के विपरीत, organoids जटिल सेलुलर वास्तुकला है कि corticogenesis के लिए महत्वपूर्ण है प्रदर्शन, और हाल के अध्ययनों से पता चला है कि इस वास्तुकला संक्रमण पर बाधित हो सकता है 21. अंत में, organoids पैदा करने के अपेक्षाकृत कम लागत उच्च प्रवाह प्रयोग और स्क्रीनिंग के लिए अनुमति देता है जब vivo में मॉडलों की तुलना में । दूसरी ओर, वहां organoids के उपयोग के लिए कुछ नुकसान ZIKV अध्ययन कर रहे हैं । जबकि organoids 2 डी संस्कृतियों की तुलना में अधिक तार्किक रूप से प्रासंगिक हैं, वहां organoids के आकलन में अतिरिक्त चुनौतियां है उनके तीन आयामी (3 डी) प्रकृति के कारण । इमेजिंग और organoids के पृथक्करण के लिए और अधिक उपकरण और मानक 2 डी संस्कृतियों की तुलना में संसाधनों का एक बड़ा निवेश को शामिल करने के लिए जाता है । इसके अतिरिक्त, organoids vasculature और प्रतिरक्षा घटक है कि में मौजूद है कमी vivo मॉडल में , इसलिए शोधकर्ताओं ने वायरल संक्रमण के उन पहलुओं में रुचि के लिए एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल की तलाश की सलाह दी है ।

वहां संस्कृति में मानव organoids और neurospheres के गठन के लिए तकनीक का एक नंबर रहे हैं, और वे आम तौर पर नमूनों या un pattern ed श्रेणियों के भीतर गिर जाते हैं । नमूनों तरीके Wnt, BMP, TGFβ, और अंय संकेत रास्ते को विनियमित करने के लिए विशिष्ट वंश23की ओर भेदभाव धक्का कारकों को लागू । ऐसी एक यहां वर्णित के रूप में unpatterned तरीके,, प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (iPSCs) और मानव भ्रूण स्टेम सेल (hESCs) के लिए प्रवृत्ति का लाभ लेने के लिए डिफ़ॉल्ट द्वारा एक neuroectodermal वंश की ओर अंतर24। भेदभाव के लगभग तीन सप्ताह के बाद, जिसके परिणामस्वरूप organoids बड़े, biomimetic neuroepithelial संरचनाओं कि कई कोशिका प्रकार है कि जल्दी विकासशील मस्तिष्क में मनाया जाता है शामिल हैं ।

मानक, फीडर मुक्त पीएससी संस्कृतियों से organoids के उत्पादन के लिए तकनीक, और ZIKV के साथ इन organoids संक्रमण पूर्ण में प्रस्तुत किया है । संवर्धन फीडर मुक्त पीएससी के लिए आवश्यक तरीकों पर मार्गदर्शन के लिए, पिछले तरीकों प्रकाशन25,26कृपया देखें । इसके अतिरिक्त, कई प्रयोगों के लिए वायरस के अनुरूप मात्रा लागू करने के लिए, यह समय से आगे मुि की गणना करने के लिए महत्वपूर्ण है. यह वीरो कोशिकाओं के संक्रमण का आयोजन, मध्यम, गर्मी और immunostaining ओवरले के साथ उपचार के बाद किया जाता है । वर्णन और इस तकनीक के तरीकों को पहले19,27वर्णित किया गया है ।

एक बार जब पीएससी संस्कृति 50%-७०% के लक्ष्य संगम पर पहुंचती है, तो कोशिकाओं को असंबद्ध और अल्ट्रा-कम लगाव ९६-वेल प्लेट्स में एकत्रित कर लिया जाता है । कोशिकाओं एक्सो में 3 दिनों के लिए बनाए रखा है मुक्त स्टेम सेल रखरखाव मीडिया (SCMM), और फिर संस्कृति के शेष के लिए एक तंत्रिका प्रेरण मीडिया में परिवर्तित । एक बार organoids 3 सप्ताह के लिए भेदभाव किया है, संक्रमण का आयोजन किया जा सकता है । नियमित रूप से संक्रमण के बाद सप्ताह के दौरान छवियों को लेकर, शोधकर्ताओं प्रगतिशील सेल मौत और organoid के विघटन का निरीक्षण करेंगे । शोधकर्ताओं ने इस समय organoids को transcriptional या proteomic profile का संचालन करने के लिए अलग भी कर सकते हैं । Cryosectioning और lightsheet तरीकों इमेजिंग के लिए सिफारिश की है, और शोधकर्ताओं ने संक्रमण और वायरल प्रतिकृति के उच्च स्तर विशेष रूप से तंत्रिका जनक सेल (एनपीसी) में organoids में आबादी के भीतर देखने की उंमीद कर सकते हैं । अंततः, इस तकनीक शोधकर्ताओं तेजी से कम लागत और सीमित उपकरणों के साथ मानव मस्तिष्क के वायरल संक्रमण के तंत्र की जांच करने के लिए अनुमति देता है ।

Protocol

< p class = "jove_title" > 1. iPSC/hESC 2d संस्कृति से सेरेब्रल Organoids बनाना (0 दिन)

< p class = "jove_content" > नोट: यह प्रोटोकॉल मानता है कि स्टेम सेल (SC) रखरखाव SCMM माध्यम में आयोजित किया जाता है एक vitronectin या Geltrex के साथ सब्सट्रेट. यदि एक वैकल्पिक, उच्च प्रोटीन स्टेम सेल संवर्धन मीडिया का उपयोग कर, यह संक्रमण अनुसूचित जाति संस्कृतियों के लिए सलाह दी जाती है organoid गठन की शुरुआत से पहले ंयूनतम दो मार्ग के लिए SCMM । प्रोटोकॉल फीडर आधारित अनुसूचित जाति संस्कृति विधियों के साथ परीक्षण नहीं किया गया है ।

  1. नियमित SC रखरखाव विधियों का उपयोग < सुप वर्ग = "xref" > 25 , < सुप वर्ग = "xref" > 26 , संस्कृतियों को 50%-७०% संगम में लाएं । यह आमतौर पर 3-4 दिन passaging के बाद है, हालांकि यह संस्कृति विधि और सेल लाइन पर निर्भर कर सकते हैं ।
    नोट: एक 6-अच्छी तरह से थाली से लगभग 2 कुओं organoids.
    2. की एक पूरी ९६ अच्छी तरह से थाली का उत्पादन करने की जरूरत है
  2. 10x-20X आवर्धन पर brightfield माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संस्कृतियों का निरीक्षण करने के लिए स्वस्थ कॉलोनी आकृति सुनिश्चित, कोई पता लगाने के भेदभाव के साथ ।
  3. लाओ SCMM को ३७ & #176; ग एक गरम पानी में स्नान, और गल एक ५० & #181; एल की शीशी ५० mM Y-२७६३२ (रॉक अवरोधक) और एंजाइमी टुकड़ी के 2 मिलीलीटर के कमरे के तापमान के लिए एजेंट ।
  4. एक अल्ट्रा कम लगाव (ुला) U-नीचे ९६ अच्छी तरह से थाली, एक मल्टीचैनल P200 पिपेट, और एक 25 मिलीलीटर एजेंट जलाशय तैयार करते हैं ।
  5. Aliquot ४५ मिलीलीटर में SCMM के ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब, और जोड़ें ४५ & #181; L के ५० mM Y-२७६३२ । triturating.
    6. द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण
  6. वैक्यूम SCs युक्त दो कुओं महाप्राण, और जल्दी से एक अच्छी तरह से एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए एंजाइम मुक्त टुकड़ी के 1 मिलीलीटर एजेंट जोड़ें । एक ३७ & #176 में थाली मशीन, 4 min.
    7. के लिए सी मशीन
  7. वैक्यूम इलाज कुओं महाप्राण, और एक अच्छी तरह से एक P1000 पिपेट का उपयोग करने के लिए एंजाइमी टुकड़ी रिएजेंट के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
    1. में थाली एक ३७ & #176; सी एक अतिरिक्त 5 मिनट के लिए मशीन
    2. थाली निकालें और इलाज कुओं की जांच । धीरे थाली पर नल को एकत्रित कोशिकाओं को तोड़ने के लिए । यदि बड़े सेल क्लस्टर अभी भी दिखाई दे रहे हैं, ३७ पर 2 अतिरिक्त मिनट के लिए थाली मशीन & #176; C. इस चरण को दोहराएँ जब तक कि क्लस्टर अब नग्न आंखों से दिखाई दे रहे हैं.
  8. एक बार कोशिकाओं को ठीक से असंबद्ध हैं, SCMM एंजाइमों को निष्क्रिय करने के लिए एक अच्छी तरह से पृथक्करण के 1 मिलीलीटर जोड़ें । पूल एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में सेल निलंबन के 4 मिलीलीटर और सेल गिनती के लिए एक छोटे से aliquot ले लो ।
    1. के रखरखाव की थाली में किसी भी शेष, अनुपचारित कुओं को वापस ३७ & #176; सी मशीनर.
  9. जबकि गिनती, 5 मिनट के लिए ३०० x g पर सेल निलंबन केंद्रापसारक
  10. कोशिकाओं की कुल संख्या निर्धारित करते हैं, और SCMM + Y-२७६३२ समाधान है कि एक ६०,००० कोशिकाओं/एमएल निलंबन प्राप्त करने के लिए आवश्यक हो जाएगा की मात्रा की गणना
  11. ध्यान से वैक्यूम महाप्राण supernatant और SCMM + Y-२७६३२ समाधान की गणना की मात्रा जोड़ें । एक समान सेल सस्पेंशन को सुनिश्चित करते हुए 5 मिलीलीटर प्लास्टिक के साथ 5-10 बार मिक्स करें ।
  12. तुरंत एक रिएजेंट जलाशय में सेल निलंबन हस्तांतरण, और पिपेट १५० & #181; ुला U-नीचे ९६ के प्रत्येक कुआं में अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग कर प्लेट । यह ९६ व्यक्तिगत organoids, प्रत्येक शुरू में ९,००० कोशिकाओं से मिलकर पैदा करता है ।
  13. 1 min.
    14. के लिए १५० x g पर थाली केंद्रापसारक
  14. प्लेट को ३७ & #176; सी मशीन में रखें, और ४८ h.
    15. के लिए प्लेट डिस्टर्ब न करें
< p class = "jove_title" > 2. सेरेब्रल Organoid मेंटेनेंस (Day 2)

  1. 17 एमएल SCMM के 17 & #181; ५० mM Y-२७६४३ का ५०-एमएल शंकु ट्यूब में तैयार करें । गर्म SCMM + Y-२७६३२ समाधान के लिए ३७ & #176; C एक गरम पानी में स्नान ।
  2. मशीन से organoid प्लेट ले, और एक मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट करने के लिए ७५ & #181 का उपयोग कर, एल, धीरे से पहली पंक्ति पर अच्छी तरह के किनारे से मध्यम आकर्षित. एक बार मध्यम खींचा गया है, जल्दी से अच्छी तरह से मध्यम वापस निष्कासित करने के लिए ढीला कोशिकाओं और organoids उठा । प्रत्येक पंक्ति के लिए यह दोहराएं ।
    नोट: यह तकनीक, इसके बाद एक & #34;d ispersion, & #34; सेलुलर मलबे और निलंबन में organoid लिफ्टों के रूप में संदर्भित । organoid तेजी से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए डूब, जबकि छोटे मलबे निलंबन में रहता है, यह एक मीडिया परिवर्तन के साथ हटाया जा करने की अनुमति । यह संस्कृति के दौरान सेलुलर मलबे में आराम करने से organoid को रोकने में मदद करता है ।
    1. के बाद सभी कुओं फैलाया गया है, 15 एस के लिए प्रतीक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें कि organoids एक अच्छी तरह से नीचे के लिए डूब गया है ।
  3. धीरे और जतन महाप्राण ७५ & #181; प्रत्येक अच्छी तरह से मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग और एक अपशिष्ट जलाशय में बांटना से माध्यम के एल ।
    नोट: अधिकांश उपयोगकर्ता कभी-कभार नियमित फ़ीड्स के दौरान एक organoid महाप्राण । यह समय के लगभग 1% हो सकता है । कृपया तदनुसार योजना सुनिश्चित करें कि पर्याप्त organoids प्रयोगात्मक समय अंक के लिए जीवित रहने के लिए ।
  4. स्थानांतरण SCMM + Y-२७६३२ समाधान एक रिएजेंट जलाशय में, और वितरण १५० & #181; L प्रत्येक organoid में अच्छी तरह से मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग कर.
  5. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
< p class = "jove_title" > 3. सेरेब्रल Organoid मेंटेनेंस (Day 3)

  1. उष्ण 17 एमएल के SCMM से ३७ & #176; ग, इस समय बिना Y-२७६४३.
  2. के साथ मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट के लिए १०० & #181; L, organoid प्लेट के सभी कुओं को फैलाएं (चरण २.२ देखें). रुको 15 एस सुनिश्चित करें कि organoids उनके कुओं के नीचे करने के लिए डूब गया है ।
  3. एक अपशिष्ट जलाशय तैयार करने और एक स्रोत जलाशय में गर्म SCMM हस्तांतरण ।
  4. जतन महाप्राण १२५ & #181; प्रत्येक कुआं से माध्यम का एल, और १५० के साथ प्रतिस्थापित & #181; l ताजा SCMM का प्रयोग मल्टीचैनल P200 पिपेट.
  5. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
< p class = "jove_title" > 4. सेरेब्रल Organoid रखरखाव (4 दिवस +)

< p class = "jove_content" > नोट: इस नियमित रखरखाव हर दूसरे दिन जब तक संक्रमण आचरण ।

  1. 4 दिन पर फ़ीड शुरू करने से पहले, तंत्रिका प्रेरण (एनआई) मध्यम तैयार करते हैं ।
    1. गल a २५० & #181; L aliquot 2 mg/एमएल हेपरिन के साथ-साथ एक 5 मिलीलीटर की शीशी 100X N-2 के पूरक । जोड़ें २५० & #181; हेपरिन, 100X N-2 के 5 मिलीलीटर, और 100X मेम के 5 मिलीलीटर-NEAA के लिए ५०० मिलीलीटर की DMEM/F12 + GlutaMAX । बाँझ फ़िल्टर एक ५०० मिलीलीटर फिल्टर में मिश्रित समाधान.
      नोट: NI at 4 & #176; C जब उपयोग में नहीं है; नी ढ़ाई से दो सप्ताह पहले ताजा माध्यम तैयार किया जाना चाहिए ।
  2. उष्ण १७ मिलि च्या नी मध्यम ते ३७ & #176; ग.
  3. के साथ मल्टीचैनल P200 पिपेट सेट के लिए १०० & #181; L, organoid प्लेट के सभी कुओं को फैलाएं (चरण २.२ देखें). रुको 15 एस सुनिश्चित करें कि organoids उनके कुओं के नीचे करने के लिए डूब गया है ।
  4. एक अपशिष्ट जलाशय तैयार करने और एक स्रोत जलाशय में गरम नी हस्तांतरण ।
  5. जतन महाप्राण १२५ & #181; प्रत्येक कुआं से माध्यम का एल, और १२५ & #181 के साथ प्रतिस्थापित करें; l ताजी नी का उपयोग मल्टीचैनल P200 पिपेट.
  6. थाली में वापस एक ३७ & #176; सी मशीनर.
< p class = "jove_title" > 5. ZIKV के साथ Organoid संक्रमण (~ दिन 24)

< p class = "jove_content" > नोट: लगभग 3 सप्ताह के अंतर के बाद, वहां will बड़े neuroepithelial संरचनाओं और organoid कि अत्यधिक ZIKV संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील हो जाएगा भीतर दिखाई rosettes ।

  1. लाएगी अर्ल् & #39; एस 1x संतुलित नमक समाधान (EBSS), 1x पंजाबस, और NI to ३७ & #176; C एक गरम पानी में स्नान ।
  2. संक्रमण (मुि) के लक्ष्य संक्रमण गुणा करने के लिए 1x EBSS में ज्ञात एकाग्रता के ZIKV पतला ।
    नोट: विभिन्न MOIs के Titrations एक वायरल खुराक प्रतिक्रिया प्राप्त करने के लिए सिफारिश कर रहे हैं. यह वायरस तनाव के द्वारा भिंन हो सकते हैं; ATCC vr-१८३८ और ATCC vr-१८४३ के लिए, विशिष्ट मुि मान ०.१ और 10 के बीच श्रेणी).
  3. ध्यान से सभी माध्यम organoid अच्छी तरह से एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर हटा दें । जल्दी जोड़ें २०० & #181; 1x पंजाबियों के एल प्रत्येक अच्छी तरह से एक P200 मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करने के लिए organoids धोने के लिए.
  4. ध्यान से सभी माध्यम organoid अच्छी तरह से एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर हटा दें । जल्दी जोड़ें ५० & #181; 1x EBSS के एल-केवल (मॉक इंफेक्शन) या ZIKV वायरस के समाधान के लिए अच्छी तरह से और सुनिश्चित करें कि organoid पूरी तरह से जलमग्न है । प्रत्येक organoid है कि अध्ययन के लिए संक्रमित होना करने के लिए दोहराएं ।
  5. एक ३७ & #176 में थाली वापस जगह; सी मशीन 2 एच
    के लिए नोट: इस अवधि के लिए नकली संक्रमित organoids मशीन काफी प्रभावित नहीं करना चाहिए उनके विकास के रूप में परेशान organoids की तुलना में ।
  6. लगभग 30 मिनट पहले वायरल मशीन पूरा हो गया है, एक ५०-एमएल शंकु ट्यूब में एनआई के aliquot 25 मिलीलीटर, और एक गर्म पानी के स्नान में ३७ & #176; C करने के लिए लाने के लिए ।
  7. के बाद वायरल एक्सपोजर पूरा हो गया है, organoids के साथ धो २०० & #181; 1x पंजाबियों के एल के लिए एक अच्छी तरह से, organoids 15 एस के लिए व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें, और फिर एक चैनल P200 पिपेट का उपयोग कर 1x पंजाबियों को हटाने ।
  8. Add २०० & #181; एक अच्छी तरह से ताजा नी के एल, और वापस मशीन में जगह है ।
    1. वै: एक दिन 0 समय बिंदु के लिए, organoids संक्रमण के बाद एक घंटे imaged हो सकता है ।
  9. की जगह से कल्चर जारी १२५ & #181; L नी हर दूसरे दिन फैलाव विधि का उपयोग कर (चरण 4 देखें) । ठीक से खर्च मीडिया और सुझावों के निपटान के लिए सुनिश्चित हो, के रूप में इस संक्रामक ZIKV कणों शामिल हैं ।

Representative Results

organoid गठन के दिन के दौरान, अनुसूचित जाति संस्कृतियों में लॉग-विकास चरण में होना चाहिए, जिसमें वे 50%-७०% धाराप्रवाह हैं, जैसा कि चित्रा 1(ए-सी)में दिखाया गया है । संस्कृतियों अलग किनारों के साथ गोल कालोनियों फार्म का होना चाहिए, और कुओं विभेद का स्पष्ट होना चाहिए चित्रा 1(डी ई)। यदि भेदभाव हो रहा है, यह करने के लिए एक पिकअप का संचालन करने के लिए हटाने की सिफारिश की है प्लेटों के भीतर प्रभावित क्षेत्रों को साफ करने के लिए organoids बनाने के लिए एक दिन से पहले । यदि संस्कृति का एक बड़ा हिस्सा विभेदित है, यह एक अतिरिक्त मार्ग का संचालन करने के लिए आवश्यक हो सकता है, गल एक नई शीशी, या बदलने स्टेम सेल संस्कृति तकनीक सुनिश्चित करने के लिए कि organoids शुद्ध स्टेम सेल संस्कृतियों द्वारा गठित किया जा रहा है ।

एंजाइम मुक्त और एंजाइमी टुकड़ी के एक संयोजन द्वारा पृथक्करण उपचार ज्यादातर एकल कोशिकाओं के लिए नेतृत्व करना चाहिए, हालांकि अभी भी कोशिकाओं के छोटे समुच्चय गिनती के दौरान मनाया जा सकता है । छोटे समुच्चय की उपस्थिति organoid गठन को बाधित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, हालांकि यह गिनती सटीकता को प्रभावित कर सकते हैं. यह अनुशंसा की जाती है कि एक से अधिक गणना प्रति नमूना किए जाते हैं, और यदि गणना 20% से भिंन है, तो पृथक्करण समय singularize कक्षों को आगे बढ़ाने के लिए आवश्यक हो सकता है ।

एक बार कोशिकाओं को वरीयता प्राप्त है और एक ुला U-नीचे ९६ में नीचे घूमती है-अच्छी तरह से प्लेट (चित्रा 2ए), वे एक अच्छी तरह के तल पर एक फ्लैट, कोशिकाओं की घने चादर के रूप में दिखाई देगा । अगले दो दिनों में कोशिकाओं को धीरे से समग्र होगा । यह सबसे अच्छा है इन ४८ घंटे के दौरान थाली परेशान नहीं है, यांत्रिक बलों के रूप में शिथिल गठन समग्र बाधित कर सकते हैं । पहले 10 दिनों के लिए, organoid ज्यादातर गोलाकार रह जाएगा, और ~ ३०० µm से 600-800 µm (चित्रा 2बी) से बढ़ेगा । अधिक चौकस संरचनाओं दिन 10 और 20 दिन के बीच organoid में दिखाई देते है (चित्रा 2सी-ई)शुरू करते हैं । 24 दिन तक, शोधकर्ताओं brightfield माइक्रोस्कोपी (चित्रा 2एफ) के माध्यम से rosette की तरह संरचनाओं का निरीक्षण करने में सक्षम होना चाहिए. संस्कृति को जारी रखते हुए, इन neuroepithelial संरचनाओं कई दिनों में मात्रा और आकार में वृद्धि हो सकती है (चित्रा 2जी) । फ़ीड के दौरान, शोधकर्ता एक अच्छी तरह से, विशेष रूप से संस्कृति के पहले 2 हफ्तों के दौरान नीचे इकट्ठा मलबे की काफी मात्रा में नोटिस जाएगा । फैलाव तकनीक २.२ कदम में वर्णित इस सेलुलर मलबे के अधिकांश को निकालता है एकाधिक पर जमा से अपोप्तोटिक मलबे को रोकने के लिए फ़ीड (चित्र 3ए) । इस मलबे इमेजिंग के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, यह और अधिक का निरीक्षण करने के लिए चुनौतीपूर्ण कर सकते है और संक्रमण प्रेरित कोशिका मौत, और यह असममित पड़ोसी organoid है कि भेदभाव को प्रभावित कर सकता करने के लिए संकेत दे सकता है । यदि फैलाव तकनीक का ठीक ढंग से संचालन किया जाए, तो यह कम होना चाहिए (चित्रा 3बी-सी, 3डी-ई) ।

यह organoids के भीतर cortical संरचना के गठन का निरीक्षण करने के लिए cryosections या lightsheet इमेजिंग आचरण करने के लिए सिफारिश की है । दिन में 25 organoids, rosette संरचनाओं और वेंट्रिकुलर क्षेत्रों में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे है DAPI (चित्रा 4ए) और phospho-vimentin (चित्रा 4बी) धुंधला । TBR2 की उपस्थिति (चित्रा 4ग) इंगित करता है कि मध्यवर्ती progenitors गठन कर रहे हैं, एक आकृति विज्ञान है कि जावक प्रवास के सुझाव के साथ । MAP2 + (चित्रा 4डी) न्यूरॉन्स प्रत्येक rosette के बाहरी क्षेत्रों आबाद. इन प्रोटीनों से, एक वेंट्रिकुलर जोन (VZ), subventricular जोन (SVZ), मध्यवर्ती क्षेत्र (IZ), और cortical प्लेट (सीपी) प्रत्येक rosette (चित्रा 4ई, 4E ') के भीतर कल्पना कर सकते हैं । एक संस्कृति इन organoids क्रम में विकास के बाद के चरणों का पालन करने के लिए जारी रख सकते हैं । जबकि cortical लेयरिंग organoid के इस प्रकार में प्रमुख के रूप में नहीं है, gliogenesis के लिए प्राकृतिक स्विच बहुत पसंद आता है यह vivo मेंकरता है । यह १०८ organoids दिन में मनाया जा सकता है, जिसमें कोशिकाओं का एक बड़ा हिस्सा या तो MAP2 या GFAP (चित्रा 4एफ मैं) व्यक्त करते हैं ।

उपयोगकर्ताओं को organoids (चित्रा 5ए बी) के लिए लागू वायरल मुि पर निर्भर करता है, ZIKV संक्रमण के बाद लगभग 3 दिनों के द्वारा organoid आकार में मतभेद देखने की उम्मीद कर सकते हैं. इन 3 दिनों के बाद, नकली कुओं की तुलना में संक्रमित कुओं में सेलुलर मलबे में भी वृद्धि होगी । organoid आकार में यह अंतर अगले सप्ताह में वृद्धि होगी, जब तक संक्रमित organoids को तोड़ने के अलावा शुरू (चित्रा 5सी-डी) । परख की एक किस्म इस बिंदु पर इस्तेमाल किया जा सकता है वायरल आरएनए निष्कर्षण और cryosectioning (अनुशंसित एंटीबॉडी सामग्री की तालिका में रिपोर्ट) सहित संक्रमण तंत्र की जांच करने के लिए । cryosectioning पर, उपयोगकर्ताओं neuroepithelial संरचनाओं के शिखर क्षेत्र में वायरस की एक बड़ी उपस्थिति का पालन करेंगे, NPCs संक्रमण (चित्रा 6) के लिए तंत्रिका जनक कोशिकाओं (ZIKV) की संवेदनशीलता का सुझाव. खोदी गई organoids की इम्यूनोफ्लोरेसेंस संक्रमित organoids (चित्रा 7) में सट caspase-3 एक्सप्रेशन में भी वृद्धि दिखाएगी ।

Figure 1
चित्र 1 : organoid गठन करने से पहले स्टेम सेल कॉलोनी आकृति विज्ञान ।
कालोनियों 50%-७०% पृथक्करण के समय में धाराप्रवाह सुसंगत organoids की एक बड़ी संख्या का उत्पादन होना चाहिए । (क) विरल, हाल ही में वरीयता प्राप्त संस्कृतियों अभी तक लॉग-विकास चरण पर नहीं पहुंची है, और कई organoids का उत्पादन नहीं होगा । (ख) एक बार जब कोशिकाएँ उचित संगम पर पहुँचती हैं तो वे पृथक्करण के लिए तैयार हो जाती हैं. यह भी महत्वपूर्ण है कि इन कॉलोनियों का निरीक्षण कर यह सुनिश्चित किया जाए कि उनमें विभेद स्पष्ट हो. (ग) कालोनियों है कि बहुत दूर ले जाया जाता है-संगम पर पहुंच जाएगा और organoid गठन के लिए अनुशंसित नहीं कर रहे हैं । इस राज्य में संस्कृतियों और अधिक अंतर कोशिकाओं को शामिल करने की संभावना है । (D) कॉलोनी के किनारों को मध्य में गोलाकार कक्षों के अनुरूप कक्ष आकृति विज्ञान के साथ, और किनारों की ओर थोड़ा लम्बी कोशिकाओं के साथ अलग होना चाहिए । (ङ) संस्कृतियों में न्यूनतम विभेद उपस्थित होना चाहिए. यदि बड़ा, चपटा कोशिकाओं केंद्रों या कालोनियों के किनारों में मनाया जाता है (सफेद ऐरोहेड) और संस्कृति का लगभग 1% से अधिक बनाने के लिए, यह सिफारिश की है कि लेने के लिए हटाने या अतिरिक्त मार्ग एक समान स्टेम सेल जनसंख्या फार्म का आयोजन किया जाता है । इस फिगर का बड़ा वर्जन देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्र 2 : समय के साथ सेरेब्रल organoid वृद्धि.
(क) 2d पीएससी से सेरेब्रल organoids के उत्पादन के लिए एक आरेख एक्सो-मुक्त, फीडर मुक्त माध्यम में बनाए रखा. (ख) पहले 8 दिनों के लिए, organoids ज्यादातर कुछ पता लगाने के सुविधाओं के साथ गोलाकार रहेगा । organoid का व्यास लगभग ३०० µm से ५०० µm तक होगा । (सी-ई) 10 दिन में, स्पष्ट क्षेत्र organoids की परिधि के आसपास detectable होना शुरू हो जाएगा, और वे अपने गोलाकार आकार खो देंगे । वे लगभग करने के लिए आकार में वृद्धि करने के लिए जारी रहेगा 1 व्यास में मिमी, काफी हद तक सेल लाइन पर निर्भर करता है organoids उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा. (च) विभेद के लगभग 20 दिनों के बाद, उपयोगकर्ता सबसे organoids के स्पष्ट परिधीय क्षेत्रों में neuroepithelial संरचनाओं (black ऐरोहेड) के गठन का निरीक्षण करेंगे । इन विकासशील प्रांतस्था के उन नकल उतार शिखर और बेसल संरचनाओं के साथ एक अंगूठी की तरह आकृति विज्ञान, है । (छ) इन neuroepithelial संरचनाओं को विकसित करने और लगभग 20-30 दिनों के लिए आकार में वृद्धि जारी रहेगी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 : फैलाव फ़ीड तकनीक के माध्यम से सेलुलर मलबे के समाशोधन.
organoid वृद्धि के दौरान, कोशिका मृत्यु की एक बड़ी राशि के लिए उंमीद की जा रही है, और सेलुलर organoid के आधार आसपास के मलबे के संचय के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । (क) चित्रित फैलाव तकनीक शोधकर्ताओं प्रत्येक फ़ीड के दौरान इस मलबे के अधिकांश को दूर करने के लिए अनुमति देता है । ऐसा करने के लिए, एक मल्टीचैनल P200 पिपेट का उपयोग कर, धीरे से इस्तेमाल किया मध्यम आकर्षित और तेजी से यह निलंबन में organoid और सेल मलबे उठाने के लिए निष्कासित । organoid जल्दी से अच्छी तरह से नीचे करने के लिए छोड़ देंगे, जिस पर समय एक नियमित रूप से फ़ीड आयोजित किया जा सकता है । एक दिन पहले 6 organoid के उदाहरण (ख) और बाद (ग) फैलाव खिला काफी मलबे में कमी से पता चलता है । यह कई हफ्तों के लिए जारी है, के रूप में एक दिन 18 organoid से पहले दिखाया गया है (डी) और उसके बाद (ई) फैलाव खिला । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 : immunohistochemistry के माध्यम से सेरेब्रल organoids के लक्षण वर्णन.
सेरेब्रल organoids के Lightsheet छवियों कि रूपों सेलुलर वास्तुकला का एक उदाहरण प्रदान करने के लिए दिखाए जाते हैं. 25 दिन, DAPI (क) और फॉस्फोरस-Vimentin (ख) व्यक्तिगत rosettes और वेंट्रिकुलर क्षेत्रों क्रमशः इंगित करते हैं । (ग) TBR2 लेबल मध्यवर्ती progenitors है कि जावक पलायन कर रहे हैं, और MAP2 (डी) लेबल न्यूरॉन्स कि cortical प्लेट में गठन किया है. (ङ, ङ ') इन प्रोटीन्स का कॉम्बिनेशन सेरेब्रल organoid मॉडल्स में cortical डिवेलपमेंट के recapitulation को साफ तौर पर दिखाता है । (एफ-आई) १०८ दिन तक, gliogenesis, GFAP का एक मिश्रण के साथ हुई है + और MAP2 + कोशिकाओं organoid के बहुत आबाद. VZ = वेंट्रिकुलर जोन, SVZ = subventricular जोन, IZ = मध्यवर्ती झोन, सीपी = cortical प्लेट. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्र 5 : संक्रमित organoids का क्षरण ।
(क) मुि = ०.१ और 10 पर नकली और ZIKV-संक्रमित सेरेब्रल organoids के उज्ज्वल क्षेत्र छवियां । छवियां संक्रमण के तुरंत बाद ले जाया गया (0 दिन), साथ ही साथ 3 और 6 दिनों के बाद संक्रमण । (बी-सी) सेल मलबे के आसपास के Brightfield छवियों (ख) नकली और (ग) ZIKV-मुि में संक्रमित = 10 सेरेब्रल organoids 3 दिनों के बाद संक्रमण. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 6
चित्र 6 : Cryosection व इम्यूनोफ्लोरेसेंस संक्रमित organoids.
दिन २४ organoids को मुि = ०.१ पर ZIKV से अवगत कराया गया, और cryosectioned ६ दिन बाद. इस स्तर पर, वहां वेंट्रिकुलर, subventricular, और organoid, जहां तंत्रिका जनक कोशिकाओं और रेडियल glia निवास के मध्यवर्ती क्षेत्रों में वायरस की स्पष्ट उपस्थिति है । (क) परमाणु दाग के माध्यम से, इन neuroepithelial क्षेत्रों स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे है कारण (सफेद तीर) नाभिक के उच्च घनत्व है कि फार्म की अंगूठी शिखर सतह के आसपास संरचनाओं की तरह । (ख) वायरल लिफाफा के लिए दाग से, एक इन rosette संरचनाओं (सफेद ऐरोहेड) के भीतर वायरस के एक अपेक्षाकृत उच्च उपस्थिति का पालन कर सकते हैं । ध्यान दें कि वहां वायरस की एक छोटी राशि के विभिंन अज्ञात परिधीय कोशिकाओं में मौजूद है । (सी-डी) MAP2 या अन्य न्यूरॉन-विशिष्ट दाग बताते हैं कि उन संस्कृतियों में न्यूरॉन्स मौजूद होते हैं जो वायरल दाग के साथ मढ़ाई करते समय वायरस से संक्रमित दिखाई नहीं देते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 7
चित्र 7 : सट caspase-3 इम्यूनोफ्लोरेसेंस संक्रमित organoid.
संक्रमण के बाद, एक अपोप्तोटिक संकेतक का उपयोग करने के लिए कोशिका मृत्यु कि organoids भीतर हो के तंत्र की जांच कर सकते हैं । इस उदाहरण में, दिन 24 organoids मुि = 0.1 पर ZIKV करने के लिए संपर्क किया गया था, और cryosectioned 6 दिन बाद । (क) संक्रमित organoids कोई वायरल लिफाफा (4G2 प्रोटीन) दिखाने के लिए, और ऊतक में होने वाली समस्थिति apoptosis के कारण सट caspase-3 की एक न्यूनतम राशि. (ख) संक्रमित rosettes apoptosis के स्तर में वृद्धि दिखाने के लिए शुरू करते हैं । (ग) Rosettes कि 4G2 दाग के माध्यम से गंभीर संक्रमण दिखा रहे है भी इन क्षेत्रों में सट caspase-3 के उच्च स्तर को प्रदर्शित करते हैं । संक्रमित rosettes के भीतर संक्रमण गंभीरता और सट caspase-3 एक्सप्रेशन के बीच सीधा संबंध है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

वहां कई निरंतर पर विचार जब मानव मस्तिष्क organoids का उपयोग करने के लिए ZIKV संक्रमण की जांच कर रहे हैं । एक महत्वपूर्ण विचार यह है कि organoid गठन और संरचना स्टेम सेल लाइन जहां से वे गठन कर रहे है पर अत्यधिक निर्भर है । isogenic इंजीनियर लाइनों सहित सेल लाइनों, के बीच तुलना करते समय ध्यान रखना; यह कई उपक्लोनों का उपयोग कर निष्कर्ष बनाने के लिए सबसे अच्छा है, और आदर्श रूप से कई स्टेम सेल लाइनों । इसके अतिरिक्त सेल लाइनों में इस अंतर के कारण, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उचित भेदभाव organoids में हो रहा है पायलट प्रयोगों की सिफारिश की है । जबकि neuroepithelial संरचनाओं brightfield माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई दे रहे हैं, यह भी qRT-पीसीआर या cryosectioning प्रयोगों जैसे PAX6 या phospho-vimentin के रूप में तंत्रिका भेदभाव मार्करों के लिए देखने के संचालन के लिए सुझाव दिया है ।

एक भी एक ही सेल लाइन के भीतर organoids के बीच काफी परिवर्तनशीलता आशा करनी चाहिए । प्रोटोकॉल की विकृत प्रकृति के कारण, संख्या और neuroepithelial संरचनाओं के आकार व्यक्तिगत organoids के बीच भिन्न हो सकते हैं । आम तौर पर, एक की उंमीद कर सकते है कम से अधिक दो बड़े (> D24 द्वारा व्यास में 200 µm) organoid प्रति तंत्रिका rosettes । इस कारण से, अनुदैर्ध्य अध्ययन, जैसे संक्रमण पर organoid आकार में परिवर्तन के अवलोकन के रूप में, विशेष रूप से शिक्षाप्रद हैं । बैचों के बीच परिवर्तनशीलता भी हो सकता है, इस गलत सेल गिनती या बोने के लिए सबसे अधिक संभावना कारण के साथ. यह एकाधिक गिनती आचरण और सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन अच्छी तरह से ुला U-नीचे ९६-अच्छी तरह से प्लेटों पर बोने से पहले मिश्रित है बनाने के लिए सिफारिश की है ।

जब संवर्धन organoids ुला यू-बॉटम ९६-वेल प्लेट्स, प्लेटों के किनारों के आसपास काफी वाष्पीकरण प्रभाव देखने पर योजना बनाते हैं । यह पंजाब के साथ इन कुओं को भरने और केवल केंद्र ६० कुओं के साथ काम करने के लिए आदर्श है । वाष्पीकरण के कारण, बाहरी कुओं में organoids केंद्र में उन लोगों की तुलना में विभिन्न स्थितियों को उजागर किया जाएगा, जिसकी संभावना उनके विकास और विभेद को प्रभावित करेगी. कृपया इस पर विचार जब organoids कि प्रयोगों के लिए आवश्यक हो जाएगा की संख्या की योजना बना । इसके अतिरिक्त, organoids लगभग 30 दिनों के बाद ९६-well स्वरूप को तबदील करने के लिए शुरू हो जाएगा, जो संस्कृति माध्यम के रंग के कारण दिखाई देगा । अगर 30 दिन पिछले organoids लेने पर योजना, यह एक ुला 24 अच्छी तरह से थाली के लिए organoids हस्तांतरण की सिफारिश की है । हस्तांतरण का संचालन करने के लिए, एक P1000 टिप में कटौती करने के लिए कैंची का उपयोग करें ताकि खोलने organoids खुद से बहुत बड़ा है, और pipetting द्वारा organoids हस्तांतरण ।

मानव मस्तिष्क organoids neurodevelopment और रोग के क्षेत्र की समझ को आगे बढ़ाने में महान क्षमता पकड़ो । शोधकर्ताओं के लिए आवश्यक के रूप में प्रोटोकॉल को संशोधित करने के लिए प्रोत्साहित किया जाता है । उदाहरण के लिए, एक विशिष्ट कोशिका प्रकार की ओर विभेदक दक्षता में सुधार करने के लिए, उन्हें कुछ संरचनात्मक क्षेत्रों पर वायरल प्रभावों का पता लगाने की अनुमति देते हुए पैटर्न कारकों को लागू कर सकता है । ZIKV के neurodevelopmental प्रभाव अभी भी खराब समझ रहे हैं, लेकिन इस नए दृष्टिकोण शोधकर्ताओं एक सुलभ, तेजी से, और संक्रमण के तंत्र की जांच का उच्च प्रवाह रास्ता दे देंगे ।

Disclosures

लेखकों की घोषणा है कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है ।

Acknowledgments

लेखकों प्रिसिला एल यांग और हार्वर्ड मेडिकल स्कूल के Dominique जे Burri प्रारंभिक प्रचार और ZIKV के ठहराव के साथ मदद के लिए धंयवाद । हम भी इमेजिंग समर्थन के लिए Nathaniel D. Kirkpatrick शुक्रिया अदा करना चाहूंगा । K.E. को मनोरोग अनुसंधान के लिए स्टेनली सेंटर और हार्वर्ड स्टेम सेल संस्थान द्वारा समर्थन दिया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enzyme-Free Detachment Reagent, ReLeSR StemCell Technologies 5873
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma-Aldrich D2650-100ML
Glutamate-supplemented DMEM/F12 (1X) Gibco 10565-018 (+)2.438 g/L sodium bicarbonate, (+)sodium pyruvate
N-2 Supplement (100X) Gibco 17502-048
MEM Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) Gibco 11140-050
Earle's Balanced Salt Solution (EBSS) GE Healthcare Life Sciences SH30029.02
Stericup Filter (500mL) Millipore 220009-140
Costar Ultra-Low Attachment Plate, 96-Well, Round Bottom Corning 7007
Low Residual Volume Reagent Reservoir (25mL) Integra 4312
Pipet-Lite Multi Pipette L12-200XLS+ Rainin 17013810
Large Centrifuge, Culture Plate-Compatible Thermo Scientific 75007210
Culture Plate Centrifuge Rotor Thermo Scientific 75005706
Vero Cells ATCC CCL-81 For virus expansion, if necessary
Zika Virus (Uganda Strain) ATCC VR-1838 Other strains may be used
Zika Virus (Puerto Rico Strain) ATCC VR-1843 Other strains may be used
phospho-vimentin MBL D076-3 mouse polyclonal,  1:250 dilution
TBR2 Abcam ab23345 rabbit polyclonal, 1:300 dilution
MAP2 Novus NB300-213 chicken polyclonal, 1:1500 dilution
GFAP Cell Signaling Technologies CST12389S rabbit polyclonal, 1:200 dilution
D1-4G2 flavivirus envelope protein EMD Millipore MAB10216 mouse monoclonal, 1:500 dilution
cleaved caspase-3 Cell Signaling Technologies 9661 rabbit polyclonal, 1:200 dilution
488 anti-mouse IgG Thermo Fisher A-11001 goat polyclonal, 1:1000
594 anti-rabbit IgG Thermo Fisher A-11037 goat polyclonal, 1:1000 dilution
647 anti-chicken IgY Thermo Fisher A-21449 goat polyclonal, 1:1000 dilution

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References

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Salick, M. R., Wells, M. F., Eggan, K., Kaykas, A. Modelling Zika Virus Infection of the Developing Human Brain In Vitro Using Stem Cell Derived Cerebral Organoids. J. Vis. Exp. (127), e56404, doi:10.3791/56404 (2017).

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