Summary
ここで単位と血液脳関門脳浮遊セクションを使用して高解像度の画像とマウスの三次元再構成のための顕微鏡ベースのプロトコルを紹介します。このメソッドは、可視化、解析、および BBB で細胞内オルガネラの定量化のためことができます。
Abstract
血液脳関門 (BBB) は、循環と脳の分子の輸送を調節する動的な多細胞インターフェイスです。BBB のトランスサイトーシスは、ホルモン、代謝、および治療用抗体の脳実質への配信を調整します。ここでは、レーザ走査共焦点顕微鏡と BBB で内皮細胞内の細胞小器官を可視化する画像解析による浮遊セクションの蛍光抗体法を組み合わせたプロトコルを提案する.半自動抽出法と細孔容積の定量化と表面積、数、BBB で細胞内オルガネラの強度の 3 D 画像解析ソフトウェアでデータのセットを組み合わせることが可能します。細胞内小胞とその定量化、bbb 内マウス内在性免疫グロブリン (IgG) の検出は、メソッドを説明するために使用されます。このプロトコルは、異なる分子の生体内の BBB トランスサイトーシスを制御するメカニズムの調査に潜在的適用できます。
Introduction
血液脳関門 (BBB) は連続の細胞バリア アストロ サイト, ペリサイト, ニューロン, と内皮細胞によって形成される1血液循環から中枢神経系 (CNS) を分離します。BBB 輸送の規制は、脳のホメオスタシスの維持に重要な役割を果たしているし、脳血管内皮細胞 (Bec) の特殊な性質により媒介されます。Bec と基底率が低いトランスサイトーシスとタイトな上皮の存在は、血液媒介分子、2それぞれの傍細胞と transcellular の輸送を制限します。最近では、脳の3,4への治療上の大きな分子の配信を強化する Bec のトランスサイトーシス経路が利用されています。ただし、BBB にトランスサイトーシスのメカニズムまだされていない完全に特徴づけられる5,6。
広範な作業は行われている体外Bec7,8,9,10,間での細胞内輸送を調節する細胞および分子メカニズムを解読する11が、複雑なアーキテクチャと単位 (NVU) の生理機能を要約するこのようなシステムが失敗します。その一方で、研究生体内で12,13 BBB で輸送料金の詳細な定量的情報を提供が輸送の細胞内メカニズムに洞察力を提供しています。したがって、NVU の細胞および細胞内のコンポーネントを調査生体内でおよび前のヴィヴォ非常に挑戦的な14のまま。技術の限られた数だけは、NVU の細胞内細胞レベル下の構造の分析に適しています。ほとんどの研究は、電子顕微鏡を使用してが、この手法が適切なティッシュの準備と検体の取扱いに必要な複雑なプロトコルによって制限されます。したがって、脳のサンプルの処理、分析、および、NVU の細胞内細胞内コンパートメントの定量化を促進する高分解能共焦点顕微鏡に基づく方法を設けています。
ここでは、BBB と NVU は細胞および細胞内レベルでの定量的イメージングを実行するマウス脳浮遊セクションを利用するプロトコルについて述べる。我々 はテストし、イメージを作成し、3 つの次元で NVU を再構築する抗体の数を検証します。さらに、このプロトコルでは、脳の毛細血管内の細胞小器官の最大光の回折限界の解像度で画像ができます。一緒に画像解析マウス神経変性疾患モデルでたとえば、異なる実験条件下で BBB に高分子の細胞内輸送を調査するこのプロトコルを使用することができます。
Protocol
この研究のための倫理的な承認は、連邦食品の安全性とスイス連邦共和国の獣医のオフィスによって提供されました。動物の保護と福祉だけでなく評価・認定の研究所動物ケア国際 (AAALAC) 会の規則に従ってスイス連邦政府令を厳守ですべての動物実験を行なった
。1 です脳の Free-floating セクションの生成
- 最適なサンプルの質を確保するため 2% パラホルムアルデヒド (PFA) の新鮮なソリューションのリン酸バッファー生理食塩水 (PBS) で灌流の日準備。
。 注意: PFA は適度に皮膚に接触し、ありそうな発癌物質有毒物質です。PFA を処理し、化学の発煙のフードの下で溶液を調製するニトリル手袋を使用します。- 動物あたり PFA 溶液 60 mL を準備します 。 180-200 μ L の PBS のすべて 100 ml 5 M KOH 溶液で pH を大きくして 60 までソリューションを加熱によってソリューションにもたらす PFA
- ° C
注: 水酸化ナトリウム使用しないでください組織保存固定に否定的影響を及ぼす 。
- 室温までソリューションを冷ます、ろ紙を使用してソリューション塩酸フィルターを用いた 7.4 まで pH をもたらす (材料の表 を参照してください).
- いくつかの変更と前述の 15 transcardial 血流を介して全体のマウス固定を行います。まず、20 mL の PBS を使用して血管から血液をフラッシュし、40 ml の 2% の灌流 PFA 。
- 上記 15 として頭蓋骨から脳を削除します 。
- 浸、たて 2 %pfa 灌流脳 2 %20 mL にポスト固定のための 4 ° C で 7 h の PFA
。 注: PFA でインキュベーションを増やすことはお勧めできません、細胞内構造の検出を防ぐことができます 。
- 氷冷 PBS で脳を広範囲洗浄します 。
- Agarose の脳を固定埋め込む。
電子レンジを使用して加熱の PBS で
- 準備 3% の agarose ソリューションです。冷却凝固を避けるためにソリューションをゆっくり旋回します 。
- はプラスチック容器にアガロース溶液に浸漬する前に脳の周りの PBS の過剰に乾かします。空気の泡を削除する agarose の中の脳を回転させます。氷で冷却して固めるためアガロースを許可
- は慎重にプラスチック容器からアガロース ブロックを削除し、かみそりの刃を使用して脳の周りのキューブをカットします。Vibratome 試料ホルダーに脳をマウント (材料表 参照) シアノアクリ レート系接着剤を使用 (材料の表 を参照してください)。前に、断面を固める接着剤のための十分な時間を許可します 。
- 転送 vibratome バッファー トレイに試料ホルダーで脳が満たされた PBS。100 μ m の脳のスライス (矢状またはコロナ) をセクションに、vibratome を使用します。以前満ちている PBS 6 ウェル プレートの脳のセクションを収集します 。
- 脳断面仕上げ、時に慎重に PBS を削除し、PBS/グリセロールの 1:1 のソリューションに置き換える 。
- -20 PBS/グリセリン セクションに格納 ° C
2。細胞や細胞小器官が蛍光染色によるラベリング
- 慎重に転送脳セクション 24 ウェル プレートのウェルに以前満ちて PBS の 500 μ L/ウェル。プロシージャの終わりまでセクションで、同じのままになります 。
- すすぎ PBS の穏やかな動揺の下で 5 分間 500 μ L で 2 回セクション 。
- 同時ブロックと脳スライスの透過を行い、PBS を削除します。
PBS の
- 準備 0.3% とブロックと透過ソリューション トリトン X と 10% ロバ血清
。 注: ロバ血清は、使用される特定の二次抗体のホスト種に合わせてヤギ血清と置き換えることができます 。
- の穏やかな動揺の下で室温で 1 時間ブロッキングと透過ソリューションの 250 μ L でセクションをインキュベートします 。
- 準備 0.3% とブロックと透過ソリューション トリトン X と 10% ロバ血清
- ソリューションを削除し、5% ロバ血清と (例えば 1:1, 000、1: 100) 適切な希釈で一次抗体を含む PBS 溶液を追加。穏やかな攪拌下の 4 ° C で一晩インキュベートします
。 注: は、正常にこのプロトコルで NVU の異なった細胞のタイプをラベル抗体のリストのための 材料表 を参照してください。一次抗体の希釈は経験的に決定する必要があります。異なった抗原の同時表示の同じソリューション内のすべての一次抗体を希釈します。すべて一次抗体は種で発生する必要があります。抗体の浸透を高めるためには、サンプルが 4 で最大 72 時間培養することができます ° C - 削除抗体ソリューション、洗うのためのセクション 3 回室温で穏やかな動揺の下で PBS で 10 分。PBS を削除し、250 μ L の PBS ソリューション含む 5% ロバ血清および適切な特異的蛍光標識二次抗体を追加します。穏やかな動揺の下で 1 時間室温でインキュベートします。
- このプロトコルと共に使用される二次抗体のリストの 材料表 を参照してください 。
- 室温で穏やかな動揺の下で PBS で 10 分間 3 回抗体ソリューションおよび洗浄セクションを削除します 。
- PBS を削除し、4 の 250 μ L を追加 '、最終濃度 1 μ G/ml と 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ソリューション。室温でのセクション穏やかな動揺の下で 10 分間インキュベートします。PBS で 5 分間 3 回 DAPI ソリューションおよび洗浄のセクションを削除します 。
- は、顕微鏡のスライド (例えば、 病理組織接着ガラス スライド) を接合部に及ぼす脳セクションをマウントします。スライドのセクションの周囲の余分な PBS を慎重に取り外します。メディアをマウントのドロップを追加 (材料の表を参照) 上の脳のセクションと慎重に 0.17 mm (1.5 号) ホウケイ酸ガラス基板にかぶせて。
- 画像集録を実行するまでの光から保護 4 ° c のサンプルを格納します 。
3。血液-脳関門の高分解能共焦点イメージング
- 実行画像集録適切なレーザ走査共焦点顕微鏡 (材料表 参照) 405、488、561、633 のレーザー ラインと nm の励起光のスペクトルの青、緑、オレンジ、赤の領域の fluorophores が付いています。画像を取得する 1.4 の開口を持つ石油目的 X 63 を使用します 。
- 買収で顕微鏡を制御するソフトウェアのメニューが画像に集録パラメーターを設定します。ドロップ ダウン メニューで ‘ イメージ サイズ ’、1024 x 1024 ピクセルの値を選択します。ピクセル サイズの値を調整することにより 200 と 300 nm の間の値を変更、‘ ズーム ’ メニュー ”
注: 細胞内構造物の解析、75 ピクセル サイズを減らす nm。この画像サイズ設定は実質的に取得時間が長くなります、狭い視野をイメージングによる取得時間を短縮する 512 × 512 ピクセルに縮小することができます 。
- で、' 集録速度 ' ドロップ ダウン メニュー、すなわち 400 行毎秒 400 Hz の値を選択します。' のシステム設定・ #39;メニュー、選択、' ピクセル深度 ' ドロップ ダウン メニュー、および 12 ビットに値を変更します 。
- 顕微鏡ソフトウェアの内、' 買収 ' タブ、連続フレーム獲得のためのオプションの切り替え。0.75 から各チャンネルの 1 μ m の値の値を変更することにより光学切片厚を設定します ' ピンホール ' メニュー 。
- 蛍光励起用パネルでアクティブ レーザーを最適刺激サンプル、緑色発光蛍光体のたとえば 488 nm レーザー ラインでフルオロ
。 注: 蛍光スペクトルのビューアーを使用して、(参照 材料表) 十分な励起レーザーを選択します 。
- 蛍光検出のパネルで 510 と 550 nm 緑色発光蛍光体の間など、各チャンネルで測定される波長を選択するスライダーに移動します
。 注: 蛍光スペクトルのビューアーを使用して、(参照 材料表) 十分な検出波長を選択します 。
- は屈折率ガラス基板と目的の屈折を一致するように脳断面 coverslip の上に 1.52 とイマージョン オイルの滴を追加します。顕微鏡でサンプルを置き、顕微鏡双眼鏡を使用してサンプルを視覚化する epifluorescent ランプをオンにします 。
- 核を DAPI 染色を可視化する適切なフィルターを選択するフィルター ホイールを変更顕微鏡スタンドのボタンを使用します。フォーカスに核を DAPI 染色から信号を持って来る粗フォーカスを使用します 。
- (例えば、CollagenIV または CD31) 血管マーカーからの信号を視覚化し、個々 の毛細血管セグメントのビューのフィールドを中心にフィルターを変更して顕微鏡スタンドのボタンを使用します 。
- は、ライブ スキャン ・ モードを開始するボタンを押します。スキャン中に画像のダイナミック レンジを最大化し、ピクセル飽和を避けるために各チャンネルのゲインとレーザーの強度を調整します
。 注: は、白とびを視覚的に評価するために飽和ピクセルを分類するルックアップ テーブルを使用します。信号の白とびを避けるためには、最高の蛍光信号があると予想されるサンプルの設定を調整します 。
- が 2 に平均線の値を設定します
。 注: 高い集録速度を使用している場合は、ノイズを低減するこの値を大ききます 。
- を確立する開始し、毛細血管の全体ボリュームをスパンする光の z スタックを実行するためのセクションを終了します。0.45 μ m のステップ サイズを使用します
。 注: 画像は、後続の定量化に使用される場合、保つ完全なデータのセットに同じ取得設定します 。
- 定量化, 統計上の比較のために少なくとも 3 つの別のマウスからセクションあたり 10 に 20 z スタックを取得します
。 注: サンプルの漂白とレーザー強度の変動から生じる変動を減らすために同じセッションで、完全なデータ セットを取得します 。
4。画像単位の処理および 3 D 再構成
- 取得した z スタックの軸の解像度を上げる、適切なソフトウェアを使用してイメージ データ セットのデコンボリューションを実行する (省略可能) (材料表を参照してください。).
- デコンボリューション ソフトウェアで実行する設定を変更 " ブラインド " デコンボリューション (すなわち、適応の点広がり関数を使用).
- デコンボリューション ソフトウェアの設定、背景の削除のためのオプションの切り替えでこのオプションは画像のスタックの最小強度値を確認し、イメージのすべてのピクセルから強度の値から減算します 。
- 強度を再スケーリングのためのオプションをオフを切り替えるデコンボリューション ソフトウェアの設定で、16 ビット深度にサイズを変更するこれらのオプションは、元の照度値と画像のダイナミック レンジにいきます 。
- のメニューで ' 屈折率 '、1.52 に値を設定します。' 設定波長 ' メニュー、選択画像の各チャンネルの値を放出。たとえば、緑色発光蛍光体の 520 を選択します 。
- 可視化と解析 (材料の表 を参照してください) 3 次元のデータ セットに適したソフトウェアを使用してイメージ データ セットを開きます。画像解析ソフトウェアでを押して、" 越え " 毛細血管の 3D ボリュームを表示するボタンです 。
- 画像解析ソフトウェア プレス 、" 追加新しい表面 " 毛管表面をセグメントします。下の矢印を使用して、サーフェスの作成ウィザードの手順間を移動する。
- で、' 作成 ' tab キー、キャピラリー マーカーで、たとえば CollagenIV、チャネルに送信元チャネルを設定し、表面積詳細を 0.5 μ m の値に設定します
。 注: 後者のオプション ガウス フィルターを画像に適用し、表面の滑らかさが決まります 。
- で、' 作成 ' 絶対輝度しきい値のオプションの切り替えタブ
。 注: このオプションは、イメージ内の選択したチャネルの絶対的な強度に基づいてマスクを生成することによってサーフェスを作成します 。
- サーフェスの作成ウィザードの次の手順にレンダリングされたマスクは、画像全体の毛細血管をカバーするまで、全体の輝度のヒストグラム スライディング ウィンドウを移動することによって表面の低輝度しきい値を調整します。各データの経験的このパラメーターの値の範囲を決定します 。
- のドロップ ダウン メニューをクリックしてサーフェス作成ウィザードの最後のステップで " フィルターの種類 " オプションを選択 ' ボクセル数 '。2.0e5 に 1.0e5 の間の値にボクセルの最小数を設定します
。 注: このオプションは、ボクセル、フレームの端に毛細血管などの小さなセグメントの数が少ないとサーフェスが除外されます 。
- サーフェスの作成ウィザードを終了し、クリックして作成パラメーターを保存 " パラメーターを覚えて " 表面のメニューの [再構築] タブにします 。
- は、最初の画像に使用するパラメーター セットをロードすることによってデータ セットを画像全体の手順を繰り返します。強度、しきい値、およびバック グラウンド強度と毛細血管の形態の違いをアカウントに各イメージのボクセルの最小数のパラメーターをそれぞれ調整します 。
- で、' 作成 ' tab キー、キャピラリー マーカーで、たとえば CollagenIV、チャネルに送信元チャネルを設定し、表面積詳細を 0.5 μ m の値に設定します
- 細胞内小胞の構造 (例えば、免疫グロブリンいっぱいエンドソーム) のセグメントは、最初だけ毛細血管内から蛍光信号が含まれている新しいチャネルを作成します
。 注: このプロセスは 4.3- 選択のステップで作成した毛細血管の表面を使用してマスクを作成することによって関心の領域を定義が、' 編集 ' のメニュー、' 毛管表面 ' パネル。下で ' プロパティをマスク ' をクリックして " マスクすべて "。細胞内小胞信号を含むチャンネルを選択、' ソース チャンネル ' とオプションの切り替え " マスクを適用する前にチャンネルを複製 ".
- で、' マスク設定 ' 列、選択 " 定数内/外 " と " 外表面ボクセルを設定: " その値を 0.00 に設定と
。 注: 毛細血管マスク外のすべての画素が 0 の強度の値を持つイメージに追加のチャネルは、このプロセスが作成されます。定量化 (すなわち、脳実質の) 毛細血管外イベント、選択 " 内面にボクセルを設定: " しその値を 0.00 に設定します 。
- 小胞構造をセグメント、開始ボタンを押して、" の新しいスポットを追加 " ウィザード。下の矢印を使用して、サーフェスの作成ウィザードの手順間を移動する 。
- [作成] タブのドロップ ダウン メニューの下でを使用して、" ソース チャンネル " 4.4.4 のステップで作成した細胞内マスク チャネルを選択します 。
- [作成] タブの下で、" スポットの検出 " セクションで、0.5 ~ 1 μ m で観察された小胞の平均サイズに応じて値を推定 XY 直径を設定実験。このオプションは、分割アルゴリズムによって検出される最小のサイズを決定します 。
- [作成] タブの下で、" スポットの検出 "] セクションで、オプションの切り替え " 背景差分 ".
注: このオプション (4.4.7 のステップで選択した値) からスポット半径を 0.75 のガウス フィルター画像を滑らか、そして 0.88 スポット半径でフィルタ リング、ガウスの元のイメージの強さを引いています 。
- で、' 作成 '] タブで、下のドロップ ダウン メニューを押して ' フィルターの種類 ' を選択、" 品質 "。観光スポットの中心での強度に基づいてしきい値を適用することによってイメージをセグメントはこれに注意してください。スライディング窓の向こうを動かして低輝度しきい値を調整、' 品質 ' ヒストグラムまで識別可能な小胞の大半がラベル付けされます
。 注: このパラメーターの値の範囲は、各データ セットに対して経験的に決定する必要があります 。
- スポット作成ウィザードを終了し、ボタンを押すと作成パラメーターを保存 " パラメーターを覚えて " 表面のメニューの [再構築] タブにします 。
- は、最初の画像に使用するパラメーター セットをロードすることによってデータ セットを画像全体の手順を繰り返します。パラメーターを調整、' 品質輝度しきい値 ' 各イメージ背景強度の違いを考慮する 。
5。BBB で細胞内輸送の定量化
- (μ m 3) の体積とキャピラリーのセグメントの (μ 2) の面積を定量化します。解析ソフトウェアで血管で 4.3 の手順で作成したサーフェスの [統計] パネルにアクセスします。選択、' 詳細 '] タブをクリックし、ドロップ ダウン メニューを使用して選択します " すべての値 " 体積と面積の値を検索する 。
- は、キャピラリーのセグメント内の小胞の数を定量化します。解析ソフトウェアで 4.4 のステップで作成したスポットの [統計] パネルにアクセスします。選択、' 全体 ' イメージのスポットの合計数の値を検索するタブです 。 イメージごとの細孔容積あたりの小胞の数を計算する
- は、ステップ 5.1 で計算されたボリュームでスポットの数を正規化します。この値を掛ける 1,000 あたり 1,000 μ m 3 細孔容積の小胞の数を取得します 。 毛細血管内の総強度を定量化する
- は、全体のイメージ次の手順 4.3 次の変更で説明されている指示をカバーする新しいサーフェスを作成します。ソース チャネルとして適切な信号 (例えば mIgG) を含むチャンネルを選択し、表面積の詳細レベルの値を 5 μ m に設定。画像全体をカバーするサーフェスを作成する低輝度しきい値の値を 0 に設定します 。
- 解析ソフトウェアでは 5.4 の手順で作成されたサーフェスの [統計] パネルにアクセスします。選択、" 詳細 "] タブをクリックし、ドロップ ダウン メニューを使用して選択します " すべての値 "。値を記録 ' 強度の合計 ' の利益のチャネルのこのパラメーターは、すべてのピクセルで個々 の強さの値の合計に相当します
。 注: 細胞内信号のためこれは 0.0 に設定画面の外側のボクセルと重複したチャネルに対応します。脳実質内の信号、この内面は 0.0 に設定ボクセルと重複したチャネルに対応します 。
イメージごとの細孔容積あたりの蛍光強度を計算する - は、ステップ 5.1 で計算された量で強度を標準化します。1,000 人あたり 1,000 μ m 3 細孔容積の蛍光強度値を取得するこの値を乗算します
。 注: 脳実質の蛍光信号の細孔容積を差し引いた合計画像ボリュームを正規化して脳実質の 1,000 μ m 3 あたり全磁力を得るため 1,000 を掛けます 。
- データセット全体に対して手順を繰り返し、適切なソフトウェアを使用して、データの統計分析を実行します 。
Representative Results
画像の代表的な例は、ここで説明されているプロトコルから取得、マウスの脳のセクションが基底膜、アストロ サイト、ペリサイト、NVU のさまざまなコンポーネントを認識する抗体で染色した、内皮細胞 (参照してください。使用される特定の抗体の材料表) (図 1 a D、およびE)。この解像度でアストロ サイトの個々 のプロセスと最後の足は毛細血管との直接接触は、区別することが可能です。
このプロトコル細胞内構造を検出するための適合性を強調するには、脳末梢人間の反タウ mAb86 抗体16注入される動物から染色蛍光標識抗ひと抗体 (図 1B)。mAb86 は、タウ16の病理学的形を表現する具体的ターゲット ニューロンに知られています。本記述されているプロトコルを使用して、mAb86 は、回折限界解像度ニューロン (図 1B C) 内の個々 の小胞構造内で検出されました。さらに、内因性マウス IgG はペリサイト (D E 図 1および図 2) ではなく細胞内構造を血管内皮細胞内で検出されました。
脳血管系の高分解能共焦点 z スタックによる毛細血管の BBB で細胞内小胞三次元のセグメンテーションが可能です。図 2では、細胞内のレンダリングと付けられて CollagenIV とマウス IgG 陽性キャピラリーをセグメント化のプロセスの例が示しています小胞。細孔容積あたりの小胞の数の測定によって例えば分割された画像の完全なデータセットを定量化することでさまざまな条件下での細胞内輸送プロセスの変化を研究することが可能です。図 3B C pdgf bret retマウス モデルで以前に報告されたとしての周皮細胞枯渇時にそれぞれ、脳実質の mIgG に対応する mIgG 小胞数と蛍光強度の違いを示しています。17です。 同じアプローチは異なる脳領域18間 bbb 細胞内輸送の変化を分析するも最近使用されました。
図 1:複数の細胞のタイプと、血管の細胞レベル下の構造の表示ユニット単位 (AとD) とニューロン (B) に含まれている細胞内の小胞またはこのプロトコルで得られた内皮細胞 (E) の代表的なイメージ。A (上) で最大強度投影画像は、周囲の毛細血管 (緑) CollagenIV ラベル GFAP 陽性アストロ サイト (赤) の分布を示します。矢印は、アストロ サイトの個々 のプロセスをポイントします。スケール バー = 20 μ m。この解像度では、個々 のアストロ サイト プロセスと終わり足箱入り地域 (下) の拡大図のように、はっきりと見える。矢印は、アストロ サイトのエンド フィートをポイントします。スケール バー = 10 μ m。Bのイメージは、末梢注入抗体、海馬ニューロン内 (緑)、mAb86 の蓄積を示しています。矢印は、個々 の mAb86 肯定的な小胞をポイントします。スケール バー = 10 μ m。Cのグラフは単一の小胞の線プロファイル強度を示しています。小胞のサイズは強度曲線 (緑のラインとサークル) のガウス適合 (黒実線) の半値全幅から推定しました。Dの画像は、基底膜 (CollagenIV、グレー) 内 (赤) (緑)、周皮細胞に囲まれた内皮細胞の三次元再構成を示しています。下のパネルは、個々 の蛍光チャネルを表示します。スケール バー = 10 μ m。Eの画像ではなくペリサイト (正しいパネルで、グリーンの CD13) が、mIgG (赤) 細胞内小胞 (左右パネル、緑色で CD31) 血管内皮細胞内の局在化を示しています。すべてのイメージの核を染色 DAPI は青で示されます。スケール バー = 5 μ m パネル D と E を参照17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 毛細血管の血液脳関門で細胞内小胞三次元レンダリングします。説明されたプロトコル、(緑) CollagenIV 肯定的な毛細血管のマウス IgG の細胞内小胞 (赤) が高分解能共焦点画像 (A) を取得しました。左側のパネルでは、断面を持つ単一光学セクションを示しています。矢印は、脳血管内皮細胞内の個々 の mIgG 肯定的な小胞をポイントします。フル z スタックを使用して右のショー 3 D 再構成に関するパネル画像処理ソフトウェア (材料の表を参照してください)。細孔容積 (B) および個々 の小胞 (C) 3 次元レンダリングされた、画像処理ソフトを用いて定量化 (材料の表を参照してください)。すべてのイメージの核を染色 DAPI は青で示されます。スケール バー = 5 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: MIgG BBB の細胞内局在性の定量化.代表的なイメージ (A) (collagenIV、緑で標識) 毛細血管の三次元再構成と mIgG の分布 (赤) c57bl/6 マウスとpdgf bret ret周皮細胞枯渇マウス19で記述されています。スケール バー = 10 μ m。Bの画像は、CollagenIV マスク内で細胞内小胞のセグメンテーションを示しています。Thb e グラフは、定量化と毛細血管の体積当たり mIgG 小胞数の比較を示しています。各ポイントは、個々 の毛細血管セグメントからの測定値を表します。実線は平均値と誤差範囲は、データの標準偏差を表します。Cショーの画像、 CollagenIV マスク外 mIgG 蛍光信号。同様に、 Cのグラフは、定量化と mIgG の蛍光強度の比較pdgf bret retと c57bl/6 マウスの脳実質周皮細胞枯渇マウスです。蛍光強度の単位は、すべて c57bl/6 マウスで測定した平均 mIgG 柔強度によって正規化されました。この図は、参照17から変更されています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
Discussion
上記で説明したプロトコルでは、BBB の高分解能顕微鏡の脳浮遊セクション、免疫蛍光染色、画像取得、解析パラメーターの準備について説明します。このメソッドは、最近抗体配信プラットフォーム3BBB の17日間で内因性の IgG の輸送、周皮細胞損失18時に BBB の不均一性のローカリゼーションを調査するために使用されています。プロトコルのさまざまなステップは、実験の特定の目標に合わせて変更できます。まず、厚い (100 μ m) セクションの使用は免疫染色、取り付けの手順の中で自分の取り扱いを容易します。キャピラリーおよび NVU 断面の世代、毛細血管、神経血管系ユニットの三次元再構成のためができます。ティッシュ セクション内にある抗体の普及率が異なる場合があり、いくつかの抗体の汚損、coverslip の近くに組織の浅層に制限することができます。プロトコルは透過のステップの間に洗剤の濃度や抗体、組織浸透を改善するために透過ステップの長さを増やすことによって変更できます。第二に、光散乱と屈折の不一致から収差のため組織 (表面の下の通常 20 に 30 μ m) の内でより深い画像を取得する際に画質が可能性します。この問題を克服するために、組織のイメージより大きいボリュームにこのプロトコルで新しい手法をクリア組織とアクティブな抗体浸透20を結合できます。第三に、デコンボリューション、イメージの軸の解像度を改善するために画像取得後実行されます。このプロトコルで使われるブラインド等化アルゴリズムの選択は、点広がり関数の事前計算する必要はありません、(i) その使いやすさに基づいていた (ii) イメージ品質21、および (iii) mIgG 展示品の不足を改善するため堅牢性実装後細胞内構造を。サンプルで可視化された細胞内構造、によって他のデコンボリューション アルゴリズムは高画質であります。以下参照21,22は、利点と追加画像デコンボリューション アルゴリズムの制限に関する広範な議論を提供します。最後に、画像解析ソフトウェア パッケージの使用は、3 つの次元で毛細血管と細胞内構造の分割を許可しました。明らかに画像解析はプロトコル、たとえば参照23で説明されている代替のパッケージに記載されているソフトウェアに制限されない、セグメント イメージに使用することができます。BBB で細胞内構造の分析のための別のソフトウェア プログラムの適合性は、画像の領域分割の精度を評価することによって経験的に確かめられる必要があります。
このメソッドは、固定サンプルに基づいている、BBB 全体ないトランスサイトーシスのダイナミクスについて直接的な情報をすることはそれ。ただし、ことができますと組み合わせることは経時実験24、たとえば静脈内投与の速度論を再構築した後異なる時点で Bec 内蓄積を測定興味の分子を注入して細胞内の輸送。このアプローチの利点は、18、現在生体のライブ イメージング技術にアクセスされるに示すように、脳深部領域の分析のためことができますです。プロトコル間の重要なステップはティッシュの固定を注意深く監視します。固定 4 %pfa が免疫原性細胞内オルガネラと内因性または末梢投与の免疫グロブリン17 (図 1 b) を大幅に削減します。このプロトコルの制限は、蛍光抗体法に適した高品質抗体 (すなわち、低い非特異染色、低交差) するという条件です。このような試薬が利用、興味のすべての蛋白質の細胞内局在を調べるメソッドを適用できます。たとえば、プロトコルは、脳血管内皮細胞17リソソームを識別するために使用されました。このプロトコルは、共焦点顕微鏡に基づいているので、横方向の解像度は回折による制限は、約 175 に 250 より小さい構造を解決することはできませんする必要があります注意も nm (図 2)。
以前の研究では、共焦点顕微鏡25,26を使用して単位の細胞構成の詳細な分析を実行しています。ただし、透過電子顕微鏡19,27,28の使用にほとんど依存 BBB の細胞内輸送を調査します。このメソッドでは、細胞内構造の最高の水平解像度を提供しています、電子顕微鏡低スループットと挑戦的な手法のままです。また、EM によって視覚化することができますを別の分子標的の数は非常に限られました。このプロトコルでは、BBB で細胞内の輸送を調査するアクセス可能な代替手段を提供しています。5 ~ 6 日で脳画像解析するコレクションからの完全な手順を実行できます。適切な抗体が利用可能な場合、蛍光は同じサンプル内で複数の細胞のタイプ/分子の同時検出を可能します。またこのプロトコルは29空間分解能の限界を克服する超解像顕微鏡技術を組み合わせることができます。全体的に、上記で説明したプロトコルは単位内の興味の蛋白質の細胞内局在変化の定量化を可能です。異なる遺伝的または薬理学的摂動の応用機能生体内でBBB の細胞内の構造とトランスポート機能を調査できるようになります。
Disclosures
著者は、ロシュ社によって支払済の雇用の下で。
Acknowledgments
R. v. の仕事は、ロシュ社員 (2014-2017) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
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