Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56407
Automatic Translation
1, 1
1Roche Pharma Research and Early Development (pRED), Neuroimmunology, Roche Innovation Center Basel

Summary

نقدم هنا بروتوكول المستندة إلى الفحص المجهري لتصوير عالي الدقة وإعمار الماوس بشكل ثلاثي الأبعاد الوحدة نيوروفاسكولار وحاجز الدم في الدماغ باستخدام أقسام الدماغ التعويم الحر. يسمح هذا الأسلوب للتصور والتحليل، والتقدير الكمي العضيات داخل الخلية في بي بي بي.

Abstract

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو واجهة متعددة الخلايا حيوية الذي ينظم نقل الجزيئات بين الدورة الدموية والدماغ. وينظم ترانسسيتوسيس عبر BBB إيصال الهرمونات والايض والأجسام المضادة العلاجية إلى حمة الدماغ. نقدم هنا، بروتوكول الذي يجمع بين الفلورة الأقسام التعويم الحر مع الليزر الفحص المجهري [كنفوكل] وتحليل الصور تصور سوبسيلولار العضيات داخل خلايا بطانية في بي بي بي. الجمع بين مجموعة البيانات هذه مع برمجيات تحليل الصور الثلاثية الأبعاد يسمح بتجزئة شبه الآلية والتحديد الكمي لحجم الشعرية والمساحة السطحية، فضلا عن عدد وكثافة من العضيات داخل الخلية في بي بي بي. يستخدم في الكشف عن الماوس الذاتية الغلوبولين المناعي (IgG) داخل حويصلات داخل الخلايا وكمياً في بي بي بي لتوضيح الأسلوب. يمكن تطبيق هذا البروتوكول يحتمل أن تكون للتحقيق في آليات مراقبة ترانسسيتوسيس BBB من جزيئات مختلفة في فيفو.

Introduction

حاجز الدم في الدماغ (BBB) هو حاجز خلوية مستمر شكلتها astrocytes، بيريسيتيس، والخلايا العصبية، والخلايا البطانية التي تفصل بين الجهاز العصبي المركزي (CNS) من دوران الدم1. تنظيم النقل عبر BBB يلعب دوراً حاسما في الحفاظ على التوازن في الدماغ، وهي وساطة من خصائص متخصصة في الدماغ خلايا بطانية (بكس). الحد من وجود الوصلات بين الخلايا ضيق بين بكس وانخفاض معدل القاعدية ترانسسيتوسيس النقل باراسيلولار وترانسسيلولار من الجزيئات المنقولة بالدم، على التوالي2. مؤخرا، قد تم تسخيرها في مسار ترانسسيتوسيس في بكس لتعزيز إيصال العلاجية الجزيئات الكبيرة إلى3،الدماغ4. ومع ذلك، آليات ترانسسيتوسيس عبر بي بي بي لم تتسم تماما5،6.

العمل المكثف الذي أنجز في المختبر فك الآليات الخلوية والجزيئية التي تنظم النقل داخل الخلايا عبر بكس7،،من89،10، 11، ولكن تفشل هذه النظم أن الخص بنية معقدة وفسيولوجيا لوحدة نيوروفاسكولار (NVU). من ناحية أخرى، دراسات في فيفو12،13 تقديم معلومات كمية مفصلة عن معدلات النقل عبر بي بي بي ولكنها لا توفر رؤى في آليات النقل داخل الخلايا. ولذلك، التحقيق في المكونات الخلوية وداخل الخلايا NVU في فيفو و السابقين فيفو تظل صعبة للغاية14. سوى عدد محدود من تقنيات قابلة لتحليل الهياكل سوبسيلولار داخل الخلايا NVU. معظم الدراسات استخدام الميكروسكوب الإلكتروني ولكن هذا الأسلوب محدود بالبروتوكولات المعقدة المطلوبة لإعداد الأنسجة السليمة ومعالجة عينة. ولذلك، قمنا بإنشاء منهجية استناداً إلى الفحص المجهري [كنفوكل] عالية الدقة ييسر تجهيز عينات المخ، والتحليل، والتحديد الكمي لمقصورات سوبسيلولار داخل الخلايا NVU.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول الذي يستخدم الماوس الدماغ المقاطع التعويم الحر القيام بتصوير كمية BBB و NVU على المستويين الخلوي وسوبسيلولار. ونحن اختبار والتحقق من صحة عدد من الأجسام المضادة الصورة، وإعادة بناء NVU في ثلاثة أبعاد. وعلاوة على ذلك، يسمح هذا البروتوكول التصوير بدقة حيود محدودة البصرية القصوى من العضيات داخل الشعيرات الدموية في الدماغ. جنبا إلى جنب مع تحليل الصورة، يمكن استخدام هذا البروتوكول للتحقيق بنقل الجزيئات داخل الخلايا عبر BBB تحت ظروف تجريبية مختلفة، على سبيل المثال في نماذج المرض الماوس نيوروديجينيريشن.

Protocol

الموافقة الأخلاقية لهذه الدراسة قدمت بسلامة الأغذية الاتحادية ومكتب الطب البيطري في سويسرا. وقد أجريت جميع التجارب على الحيوانات في التقيد الصارم بالقانون الاتحادي السويسري حول حماية الحيوانات والرعاية وكذلك وفقا لقواعد رابطة التقييم والاعتماد لمختبر الحيوان الرعاية الدولية (آآلاك)-

1-"جيل المخ Free-floating الأقسام"

  1. لضمان جودة العينة المثلى، تعد حلاً جديدة من 2% بارافورمالدهيد (PFA) في المحلول الملحي العازلة الفوسفات (PBS) في يوم التروية.
    تنبيه: منهاج عمل بيجين سمية معتدلة بتماس الجلد ومادة مسرطنة. استخدام قفازات النتريل إلى التعامل مع منهاج عمل بيجين، ويعد الحل تحت غطاء الأبخرة كيميائية.
    1. تحضير 60 مل من محلول منهاج عمل بيجين للحيوان الواحد.
    2. إحضار منهاج عمل بيجين إلى إيجاد حل من خلال زيادة درجة الحموضة مع 180-200 ميليلتر من حل كوه م 5 لكل 100 مل من برنامج تلفزيوني والتدفئة في حل ما يصل إلى 60 درجة مئوية.
      ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم يجب إلا تستعمل حيث أنها تؤثر سلبا على الحفاظ على الأنسجة عند التثبيت.
    3. السماح لتبرد الحل وصولاً إلى درجة حرارة الغرفة وتحقيق درجة الحموضة وصولاً إلى 7.4 باستخدام عامل تصفية HCl. الحل باستخدام ورق الترشيح (انظر الجدول للمواد)-
  2. إجراء تثبيت ماوس كله عن طريق نضح ترانسكارديال كما هو موضح سابقا 15 مع إدخال بعض التعديلات عليها. تدفق الدم من المفرج استخدام 20 مل من برنامج تلفزيوني أولاً، ثم نتخلل مع 40 مل من 2 ٪ PFA.
  3. إزالة الدماغ من الجمجمة كما هو موضح سابقا 15-
  4. تزج طازجة 2% PFA perfused الدماغ في مل 20% 2 منهاج عمل بيجين ح 7 في 4 درجات مئوية للتثبيت بعد.
    ملاحظة: زيادة في الحضانة في منهاج عمل بيجين لا ينصح كما يمكن أن يمنع الكشف عن هياكل داخل الخلايا.
  5. على نطاق واسع غسل الدماغ مع برنامج تلفزيوني المثلج.
  6. تضمين إصلاح العقول في [اغروس]- الحل
    1. تحضير [اغروس] 3% في برنامج تلفزيوني استخدام ميكروويف للتسخين. بلطف دوامة الحل ليبرد عليه ولكن تجنب التجميد.
    2. الجاف قبالة الفائض في برنامج تلفزيوني حول الدماغ قبل الانغماس في الحل [اغروس] في وعاء من بلاستيك. قم بتدوير الدماغ داخل [اغروس] لإزالة فقاعات الهواء. يسمح [اغروس] لتقوية جانب التهدئة في مدت
    3. بعناية إزالة الكتلة [اغروس] من الحاويات البلاستيكية وقطع مكعب حول الدماغ باستخدام شفرة حلاقة. جبل الدماغ على حامل عينات فيبرتوم (انظر الجدول للمواد) باستخدام الغراء cyanoacrylate (انظر الجدول للمواد). السماح بوقت كاف للغراء ترسيخ قبل الشروع تمزيقها.
  7. نقل تملأ الدماغ في صاحب العينة إلى علبة المخزن المؤقت فيبرتوم مع برنامج تلفزيوني. استخدم في فيبرتوم للفرع 100 ميكرومتر الدماغ شرائح (السهمي أو الاكليلية). جمع أجزاء الدماغ في صفيحة 6-بئر مملوءة مسبقاً ببرنامج تلفزيوني.
  8. عند الانتهاء من تقطيع الدماغ، بعناية إزالة برنامج تلفزيوني واستبدالها بمحلول 1:1 لبرنامج تلفزيوني/والغليسيرول.
  9. تخزين المقاطع في برنامج تلفزيوني/الجلسرين في-20 درجة مئوية.

2. الخلية أو عضية وسمها "تلطيخ الفلورة"

  1. بعناية نقل قسم الدماغ في بئر صفيحة 24-جيدا قبل مليئة 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني كل بئر. المقطع سوف تظل في البئر نفسها حتى نهاية الإجراء.
  2. شطف المقطع مرتين مع 500 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق تحت الانفعالات لطيف.
  3. إزالة برنامج تلفزيوني وتنفيذ حظر المتزامنة وبيرميبيليزيشن من شرائح المخ. مصل حمار تريتون العاشر و 10%
    1. تحضير حل حظر وبيرميبيليزيشن بنسبة 0.3 في المائة في برنامج تلفزيوني.
      ملاحظة: يمكن استبدال المصل حمار مع مصل الماعز لمطابقة الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الثانوية المحددة المستخدمة.
    2. احتضان الفروع مع 250 ميليلتر من عرقلة و permeabilization الحل ح 1 في درجة حرارة الغرفة تحت الانفعالات لطيف.
  4. إزالة الحل وإضافة حل برنامج تلفزيوني يحتوي على 5% حمار المصل وجسم الأولية في تمييع مناسب (مثلاً، 1: 100 إلى 1:1، 000). تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تحت الانفعالات لطيف.
    ملاحظة: انظر الجدول للمواد اللازمة لقائمة بالأجسام المضادة التي نجحت تسمية أنواع مختلفة من الخلية NVU مع هذا البروتوكول. يجب أن تحدد تمييع المثلى للأجسام المضادة الأولية تجريبيا. لوضع العلامات المتزامنة لمولدات مختلفة، تضعف جميع الأجسام الأولية في نفس الحل. يجب رفع جميع الأجسام المضادة الأولية في مختلف الأنواع. يمكن تحسين اختراق جسم، المحتضنة عينات ليصل إلى 72 ساعة في 4 ° C.
  5. إزالة جسم الحل أغسل أقسام وثلاث مرات لمدة 10 دقيقة في برنامج تلفزيوني تحت الانفعالات لطيف في درجة حرارة الغرفة. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 250 ميليلتر برنامج تلفزيوني الحل التي تحتوي على مصل حمار 5% وجسم الثانوي المسمى فلوريسسينتلي باﻷنواع الملائمة. احتضان الأقسام في درجة حرارة الغرفة ح 1 تحت الانفعالات لطيف.
    1. انظر الجدول للمواد للحصول على قائمة بالأجسام المضادة الثانوية المستخدمة مع هذا البروتوكول.
  6. إزالة المقاطع الحل ويغسل جسم ثلاث مرات لمدة 10 دقائق في برنامج تلفزيوني تحت الانفعالات لطيف في درجة حرارة الغرفة-
  7. برنامج تلفزيوني واضافه 250 ميليلتر من 4 '، حل 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) بتركيز نهائي 1 ميكروغرام/مل. احتضان الأقسام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق تحت الانفعالات لطيف. إزالة المقاطع DAPI الحل ويغسل 3 مرات لمدة 5 دقائق مع PBS.
    8. جبل
  8. المقطع الدماغ على الربط المجهري الشرائح (مثل شرائح الزجاج histo-بوند). بعناية إزالة الزائدة برنامج تلفزيوني حول المقطع على الشريحة. إضافة قطره من تصاعد المتوسطة (انظر الجدول للمواد) على رأس قسم الدماغ وعناية تغطية ذلك مع ساترة البورسليكات زجاج 0.17 ملم (رقم 1.5).
    1. تخزين العينات في 4 درجات مئوية محمية من الضوء حتى إجراء الحصول على الصورة-

3. التصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ

  1. إجراء الحصول على الصور مع ليزر-مسح مناسبة [كنفوكل] المجهر (انظر الجدول للمواد) مع خطوط الليزر على 405 و 488، 561 و 633 نانومتر للإثارة من فلوروفوريس في مناطق الطيف الضوء الأزرق والأخضر والبرتقالي والأحمر. للحصول على الصور، استخدم 63 × الهدف النفط مع فتحه عددية من 1-4-
  2. في الحصول على قائمة البرنامج الذي يتحكم المجهر، تعيين الصورة لبارامترات. في القائمة المنسدلة في ‘ حجم الصورة ’، حدد قيمة 1024 × 1024 بكسل. تعديل حجم بكسل بقيمة تتراوح بين 200 و 300 نانومتر بضبط القيمة ‘ التكبير ’ القائمة. ”
    ملاحظة: لتحليل الهياكل داخل الخلايا، تقليل حجم بكسل إلى 75 نانومتر. هذا الإعداد حجم الصورة إلى حد كبير يزيد شراء الوقت ويمكن خفضها إلى 512 × 512 بكسل لتقليل وقت الامتلاك بالتصوير مجال رؤية أصغر.
  3. في ' "سرعة اكتساب" ' القائمة المنسدلة، حدد قيمة 400 هرتز، أي 400 خطوط في الثانية الواحدة. في ' إعدادات أنظمة & #39; القائمة، حدد ' عمق البكسل ' إسقاط إلى أسفل القائمة، وقم بتغيير القيمة إلى 12 بت.
  4. في برنامج المجهر، داخل ' اقتناء ' التبويب، تبديل الخيار لاقتناء الإطار متسلسلة. تعيين سمك الفرع الضوئية إلى قيمة تتراوح بين 0.75 و 1 ميكرومتر لكل قناة بتعديل القيمة في ' الثقب ' القائمة.
  5. في لوحة للإثارة الفلورسنت، تنشيط الليزر اللازمة لإثارة على النحو الأمثل فلوروفوريس في العينة، على سبيل المثال 488 نانومتر ليزر خط فلوروفوري التي ينبعث منها الأخضر.
    ملاحظة: استخدم عارض أطياف فلوروفوري (انظر الجدول للمواد) لتحديد الليزر الإثارة الكافية.
  6. في لوحة لكشف فلوري، حرك مربع التمرير لتحديد الأطوال الموجية التي سوف يقاس في كل قناة، على سبيل المثال بين 510 و 550 نيوتن متر فلوروفوري التي ينبعث منها الأخضر.
    ملاحظة: استخدم عارض أطياف فلوروفوري (انظر الجدول للمواد) لتحديد الأطوال الموجية الكشف الكافي.
  7. إضافة قطره زيت الغمر مع الانكسار 1.52 على رأس ساترة مع قسم الدماغ لمطابقة الانكسار ساترة زجاجية والهدف. ضع العينة في المجهر وتشغيل مصباح ابيفلوريسسينت لتصور العينة باستخدام منظار مجهر.
  8. باستخدام الأزرار الموجودة على الوقوف المجهر، تغيير العجلة عامل التصفية لتحديد مرشح مناسب لتصور DAPI الملون الأنوية. استخدام التركيز الخشنة لإحضار الإشارة من نوى DAPI الملون إلى التركيز-
  9. باستخدام الأزرار الموجودة على الوقوف المجهر، تغيير عوامل التصفية لتصور الإشارة من علامات الأوعية الدموية (على سبيل المثال، كولاجينيف أو CD31) ومركز مجال الرؤية على قطعة شعرية فردية.
  10. اضغط على الزر لبدء وضع المسح الضوئي مباشرة. أثناء المسح الضوئي ضبط كثافة الليزر والكسب لكل قناة إلى أقصى حد النطاق الديناميكي للصور وتجنب التشبع بكسل-
    ملاحظة: استخدم جدول بحث الذي تسميات مشبعة بكسل لتقييم بصريا التشبع المفرط. لتجنب إشارة التشبع المفرط، قم بضبط الإعدادات مع العينة التي من المتوقع أن يكون أعلى إشارة الفلورسنت.
  11. تعيين القيمة للخط المتوسط إلى 2-
    ملاحظة: عند استخدام سرعات أعلى للحصول، بزيادة هذه القيمة الحد من الضوضاء-
  12. تأسيس تبدأ وتنتهي المقاطع لأداء مكدسات z الضوئية التي تمتد وحدة التخزين كله شعري. استخدام حجم خطوة من 0.45 ميكرومتر.
    ملاحظة: إذا كان سيتم استخدام الصور للقياس الكمي اللاحقة، الحفاظ على اقتناء نفس الإعدادات لمجموعة البيانات بالكامل-
  13. للقياس الكمي، الحصول على 10 إلى 20 z-مكدسات كل قسم من الفئران على الأقل ثلاثة مختلفة للمقارنات الإحصائية.
    ملاحظة: الحصول على مجموعة البيانات بالكامل في الدورة نفسها للحد من التقلبات الناجمة عن تقلبات عينة كثافة تبيض والليزر-

4. صورة التعمير 3D وتجهيز وحدة نيوروفاسكولار

  1. (اختياري) لزيادة دقة المحوري z-مكدسات المكتسبة، والقيام deconvolution مجموعة بيانات الصورة باستخدام البرمجيات المناسبة (انظر الجدول "للمواد" ).
    1. في برنامج deconvolution، تغيير الإعدادات لإجراء " الأعمى " deconvolution، (أي باستخدام دالة نقطة الانتشار تكيفية).
    2. في إعدادات البرامج deconvolution، تبديل الخيار لإزالة الخلفية؛ هذا الخيار سوف تحدد قيمة الكثافة أصغر في المكدس الصورة وطرح عليه من قيم الكثافة من كل بكسل في الصورة-
    3. في إعدادات البرامج deconvolution، تبديل إيقاف تشغيل الخيارات لإعادة قياس كثافة وتغيير حجمها إلى 16 بت عمق؛ سوف تبقى هذه الخيارات بقيم الكثافة الأصلي والنطاق الديناميكي من الصور.
    4. في القائمة ' الانكسار '، بتعيين القيمة إلى 1، 52. في ' "تعيين الطول الموجي" ' القائمة، حدد قيم الانبعاثات لكل قناة في الصورة. على سبيل المثال، حدد 520 فلوروفوري التي ينبعث منها الأخضر.
  2. فتح مجموعة بيانات الصورة باستخدام برامج مناسبة لتصور وتحليل مجموعات البيانات ثلاثية الأبعاد (انظر الجدول للمواد). في برنامج تحليل الصورة، اضغط " تفوق " زر لتقديم 3D حجم الشعيرات الدموية.
  3. في الصحافة برمجيات تحليل الصور " سطح جديد إضافة " الزر الجزء السطح الشعرية. استخدم الأسهم الموجودة أسفل للانتقال بين الخطوات في معالج إنشاء السطح.
    1. في ' إنشاء ' علامة التبويب وتعيين قناة المصدر للقناة الشعرية علامة، على سبيل المثال كولاجينيف، وتعيين التفاصيل المساحة السطحية لقيمة 0.5 ميكرومتر.
      ملاحظة: الخيار الأخير ينطبق عامل تصفية ضبابي على الصورة ويحدد نعومة السطح.
    2. في ' إنشاء ' التبويب، تبديل الخيار لعتبة كثافة مطلقة.
      ملاحظة: هذا الخيار سوف إنشاء سطح عن طريق توليد قناع استناداً إلى كثافة مطلقة للقناة المحددة في الصورة-
    3. على الخطوة التالية في معالج إنشاء السطحية، وضبط عتبة كثافة أقل للسطح تحريك الإطار الانزلاق عبر الرسم البياني كثافة حتى يغطي القناع المقدمة الشعرية كلها في الصورة. تحديد مجموعة قيمة لهذه المعلمة لكل مجموعة بيانات تجريبية.
    4. في الخطوة الأخيرة من معالج إنشاء سطح، انقر فوق القائمة المنسدلة ضمن " "نوع عامل التصفية" " وحدد الخيار ' "عدد من فوكسيلس" '. تعيين الحد الأدنى لعدد من فوكسيلس إلى قيمة تتراوح بين 1.0e5 إلى 2.0e5-
      ملاحظة: هذا الخيار سوف تستبعد السطوح مع عدد صغير من فوكسيلس، على سبيل المثال، قطاعات صغيرة من الشعيرات الدموية على حافة الإطار.
    5. الانتهاء من معالج إنشاء السطحية وحفظ المعلمات إنشاء بواسطة النقر فوق " أتذكر المعلمات " في علامة التبويب إعادة إنشاء القائمة السطح.
    6. كرر الإجراء لكل تصوير مجموعة من البيانات عن طريق تحميل مجموعة المعلمات المستخدمة للصورة الأولى. ضبط معلمات لكثافة والحد الأدنى، والحد الأدنى لعدد من فوكسيلس لكل صورة لمراعاة الاختلافات في كثافة الخلفية ومورفولوجيا الشعرية، على التوالي.
  4. إلى الجزء هياكل حويصلية داخل الخلايا (مثلاً، مملوءة بجسم مضاد اندوسوميس), أولاً بإنشاء قناة جديدة تتضمن فقط إشارة الفلورسنت من داخل شعري.
    ملاحظة: هذه العملية سوف تحدد منطقة الاهتمام بإنشاء قناع باستخدام السطح الشعرية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 3
    1. حدد ' تحرير ' القائمة في ' السطحية الشعرية ' الفريق. تحت ' قناع خصائص '، انقر فوق " "كل قناع" ". قم بتحديد القناة التي تحتوي على إشارة حويصلة داخل الخلايا ' قناة المصدر ' وتبديل الخيار " تكرار القناة قبل تطبيق قناع ".
    2. في ' قناع الإعدادات ' عمود، حدد " المستمر داخل/خارج " و " تعيين فوكسيلس خارج أرض: " وقم بتعيين القيمة الخاصة به إلى 0.00.
      ملاحظة: هذه العملية سيتم إنشاء قناة إضافية في الصورة حيث سيكون لجميع فوكسيلس خارج القناع الشعرية قيمة كثافة من 0. للتحديد الكمي للأحداث خارج الشعرية (أي، في حمة الدماغ)، واختيار " تعيين فوكسيلس داخل أرض: " وقم بتعيين القيمة الخاصة به إلى 0.00.
    3. للجزء هياكل حويصلية، اضغط على الزر لبدء " إضافة بؤر جديدة " المعالج. استخدم الأسهم الموجودة أسفل للانتقال بين الخطوات في معالج إنشاء السطح.
    4. في علامة التبويب إنشاء، استخدم القائمة المنسدلة قائمة تحت " قناة المصدر " لتحديد القناة ملثمين داخل الخلايا التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.4.4.
    5. في علامة التبويب إنشاء، تحت " بقعة الكشف " الباب، تعيين قطر XY المقدر بقيمة تتراوح بين 0.5 و 1 ميكرومتر، تبعاً لمتوسط حجم الحويصلات التي لوحظت في هذه التجربة. يحدد هذا الخيار حجم أصغر مما سوف يمكن كشفها بواسطة خوارزمية تجزئة.
    6. في علامة التبويب إنشاء، تحت " بقعة الكشف " الباب، تبديل الخيار ل " "الطرح الخلفية" ".
      ملاحظة: هذا الخيار سوف السلس الصورة مع عامل تصفية ضبابي من دائرة نصف قطرها بقعة 0.75 (من القيمة المحددة في الخطوة 4.4.7) وثم طرح كثافة الصورة الأصلية غاوسي تتم تصفيتها بواسطة دائرة نصف قطرها بقعة 0.88.
    7. في ' إنشاء ' علامة التبويب، اضغط على القائمة المنسدلة تحت ' "نوع عامل التصفية" ' وحدد " الجودة ". لاحظ أن هذا سوف الجزء من الصورة قبل تطبيق عتبات استناداً إلى الكثافة في مركز البقع. ضبط عتبة أقل كثافة بتحريك الإطار الانزلاق عبر ' الجودة ' الرسم البياني حتى هي المسمى أغلبية حويصلات محددة.
      ملاحظة: مجموعة قيمة لهذه المعلمة يجب أن يتحدد تجريبيا لكل مجموعة بيانات.
    8. الانتهاء من معالج إنشاء بقعة وحفظ معلمات تهيئة عن طريق الضغط على زر " أتذكر المعلمات " في علامة التبويب إعادة إنشاء القائمة السطح.
    9. كرر الإجراء لكل تصوير مجموعة من البيانات عن طريق تحميل مجموعة المعلمات المستخدمة للصورة الأولى. ضبط المعلمات ' عتبة كثافة نوعية ' لكل صورة لمراعاة الاختلافات في كثافة الخلفية.

5. التحديد الكمي "النقل داخل الخلايا" في بي بي بي

  1. قياس حجم (في 3 من ميكرومتر) والمنطقة (في ميكرومتر 2) الجزء الشعرية. في البرمجيات، وتحليل الوصول إلى لوحة إحصائيات سطح الأوعية الدموية التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 3. حدد ' التفصيلية ' علامة التبويب، واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد " كافة القيم " البحث عن قيم لحجم ومجال.
  2. قياس عدد حويصلات داخل الجزء الشعرية. في البرمجيات، وتحليل الوصول إلى لوحة الإحصاءات من المواقع التي تم إنشاؤها في الخطوة 4، 4. حدد ' العام ' علامة التبويب للعثور على قيمة إجمالي عدد النقاط في الصورة.
    3. تطبيع
  3. لحساب عدد حويصلات كل وحدة تخزين الشعرية، لكل صورة في عدد المواقع بحجم المحسوبة في الخطوة 5، 1. ضرب هذه القيمة بواسطة 1,000 للحصول على عدد الحويصلات الواحدة 1,000 ميكرومتر 3 من حجم الشعرية.
  4. لقياس كثافة مجموع داخل شعري إنشاء سطح جديد يغطي كامل الصورة التالية الإرشادات المبينة في الخطوات 4.3 مع إدخال التعديلات التالية. قم بتحديد القناة التي تحتوي على إشارة ذات الصلة (مثلاً، ميج) كقناة المصدر وتعيين قيمة مستوى تفاصيل المساحة السطحية إلى 5 ميكرومتر. لإنشاء سطح يغطي الصورة بأكملها، قم بتعيين قيمة عتبة كثافة أقل إلى 0-
  5. في البرمجيات، وتحليل الوصول إلى لوحة الإحصاءات من السطح بإنشائه في الخطوة 5، 4. حدد " التفصيلية " علامة التبويب، واستخدم القائمة المنسدلة لتحديد " كافة القيم ". تسجيل القيم ' "مجموع كثافة" ' لقنوات الفائدة؛ يتوافق مع هذه المعلمة إلى مجموع قيم الكثافة الفردية على كل بكسل-
    ملاحظة: لإشارة داخل الخلايا، وهذا يناظر القناة المضاعفة مع فوكسيلس خارج سطح تعيين إلى 0.0. إشارة في حمة الدماغ، وهذا يناظر القناة المضاعفة مع فوكسيلس داخل سطح تعيين إلى 0.0.
    6. تطبيع
  6. لحساب كثافة الأسفار كل وحدة تخزين الشعرية، لكل صورة الكثافة بحجم المحسوبة في الخطوة 5، 1. ضرب هذه القيمة بواسطة 1,000 للحصول على قيمة كثافة الأسفار كل 1,000 ميكرومتر 3 من حجم الشعرية.
    ملاحظة: نيون إشارات في حمة الدماغ، تطبيع القيم بحجم الصورة الإجمالية ناقص حجم الشعرية وضرب 1,000 للحصول على كثافة مجموع كل 1,000 ميكرومتر 3 من حمة الدماغ.
  7. تكرار الإجراء لمجموعة البيانات بأكملها واستخدام البرمجيات المناسبة لإجراء التحليل الإحصائي للبيانات-

Representative Results

أمثلة من الصور التي تم الحصول عليها من البروتوكول هو موضح هنا، أقسام الدماغ الماوس كانت ملطخة بالأجسام المضادة الاعتراف بمختلف مكونات NVU بما في ذلك الغشاء، أستروسيتيس، بيريسيتيس، والخلايا البطانية (انظر جدول المواد للأجسام المضادة المحددة المستخدمة) (الشكل 1A، دال، و هاء). في هذا القرار من الممكن التمييز بين العمليات الفردية التي أستروسيتيك ونهاية-أقدام التي على اتصال مباشر مع الشعيرات الدموية.

لتسليط الضوء على مدى ملاءمة هذا البروتوكول للكشف عن هياكل داخل الخلايا، أقسام الدماغ من الحيوانات حقن محيطيا ب جسم الإنسان تاو المضادة mAb8616 كانت ملطخة بجسم الإنسان لمكافحة فلوريسسينتلي المسمى ( 1 الشكلب). يعرف على وجه التحديد من الخلايا العصبية الهدف معربا عن نموذج مرضية تاو16mAb86. باستخدام بروتوكول الموصوفة هنا، تم الكشف عن mAb86 مع القرار حيود محدودة داخل هياكل حويصلية فردية داخل الخلايا العصبية (الشكل 1ب-ج). وبالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن ماوس الذاتية مفتش في هياكل داخل الخلايا داخل خلايا بطانية ولكن ليس في بيريسيتيس (د-ه منالرقم 1و الشكل 2).

الحصول على رزمة z [كنفوكل] عالية الدقة من المفرج الدماغ يسمح بتقسيم ثلاثي الأبعاد من الشعيرات الدموية والحويصلات داخل الخلايا في بي بي بي. ويبين الشكل 2 مثالاً على عملية التقديم وتجزئة الشعرية المسمى مع كولاجينيف والفأر مفتش إيجابية داخل الخلايا حويصلات. بالتحديد الكمي مجموعة كاملة من صور مجزأة، على سبيل المثال عن طريق قياس عدد حويصلات كل وحدة تخزين الشعرية، فمن الممكن لدراسة التغيرات في عمليات النقل داخل الخلايا تحت ظروف مختلفة. الشكل 3 ب-ج يوضح الاختلافات في ميج حويصلة عدد الأسفار كثافة وتناظر ميج في حمة الدماغ، على التوالي، عند استنفاد بيريسيتي في طراز الماوس pdgf بريت ريت كما ذكر سابقا 17. واستخدمت نفس النهج أيضا في الآونة الأخيرة لتحليل التغيرات في النقل داخل الخلايا في بي بي بي بين مناطق الدماغ المختلفة18.

Figure 1
رقم 1: توسيم عدة أنواع الخلايا والهياكل سوبسيلولار نيوروفاسكولار unit. صور الممثل وحدة نيوروفاسكولار (ألف و دال) وحويصلات داخل الخلايا الواردة داخل الخلايا العصبية (ب) أو خلايا بطانية (ه) التي تم الحصول عليها مع هذا البروتوكول. صورة الإسقاط أقصى شدتها في A (أعلى) يبين توزيع astrocytes توصيني-إيجابية (أحمر) المحيطة بالشعيرات الدموية صنف كولاجينيف (أخضر). الأسهم تشير إلى العمليات الفردية التي أستروسيتيك. شريط المقياس = 20 ميكرومتر. في هذا القرار، بالعمليات الفردية astrocyte ونهاية-أقدام تتجلى بوضوح، كما هو موضح في صورة أسرع من منطقة محاصر (أسفل). رؤوس الأسهم تشير إلى أقدام نهاية أستروسيتيك. شريط المقياس = 10 ميكرون. وتوضح الصورة في ب تراكم جسم حقن محيطيا، mAb86 (الأخضر)، ضمن خلية هيبوكامبال. رؤوس الأسهم تشير إلى الحويصلات mAb86 الإيجابية الفردية. شريط المقياس = 10 ميكرون. ويبين الرسم البياني في ج كثافة الشخصية خط حويصلة واحدة. وقدرت حجم حويصلة نصف الحد الأقصى من نوبة الضبابي (خط أسود صلب) منحنى كثافة (الخط الأخضر والدوائر) من العرض الكامل. إظهار الصور في د إعمار خلية غشائي (الأخضر) محاطة بيريسيتي بشكل ثلاثي الأبعاد (أحمر) داخل الصفيحة القاعدية (كولاجينيف، رمادي). لوحات أقل إظهار القنوات fluorescence الفردية. شريط المقياس = 10 ميكرون. تظهر الصور في ه توطين ميج (أحمر) في حويصلات داخل الخلايا داخل خلايا بطانية (غادر الفريق، CD31 باللون الأخضر) ولكن ليس في بيريسيتيس (اللوحة اليمنى، CD13 باللون الأخضر). في كل الصور، تظهر DAPI الملون الأنوية باللون الأزرق. شريط المقياس = 5 ميكرومتر. "ألواح د" وه وقد عدلت من مرجع17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : عرض ثلاثي الأبعاد الشعيرات الدموية والحويصلات داخل الخلايا في حاجز الدم في الدماغ- مع بروتوكول وصف، اكتسبت الاستبانة [كنفوكل] إيجابية كولاجينيف الشعيرات الدموية (الأخضر) والفأر مفتش كانت حويصلات داخل الخلايا (أحمر) (A). اللوحة اليسرى يظهر مقطع بصري واحد مع المقاطع العرضية. الأسهم تشير إلى حويصلات ميج-الإيجابية الفردية داخل خلايا الدماغ بطانية. الفريق المعني بإعادة إعمار يظهر الحق ثلاثي الأبعاد باستخدام مكدس z كامل برامج معالجة الصور (انظر الجدول للمواد). حجم الشعرية (ب) وحويصلات الفردية (ج) صدرت في ثلاثة أبعاد، وكمياً باستخدام برامج معالجة الصور (انظر الجدول للمواد). في كل الصور، تظهر DAPI الملون الأنوية باللون الأزرق. تغيير حجم أشرطة = 5 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3 : التحديد الكمي للتعريب ميج داخل الخلايا في بي بي بي. صور الممثل تظهر إعادة البناء ثلاثي الأبعاد (A) من الشعيرات الدموية (المسمى مع كولاجينيف، الأخضر) وتوزيع ميج (أحمر) في الفئران C57BL/6 وفي بيريسيتي بدجف-بريت ريت المنضب الفئران ووصف سابقا في19. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. إظهار الصور في ب تجزئة حويصلات داخل الخلايا داخل القناع كولاجينيف. الويبين الرسم البياني ه في ب القياس الكمي ومقارنة لعدد حويصلة ميج في حجم شعري. كل نقطة تمثل قياسات من القطع الشعرية الفردية. يظهر خط متصل يعني وأشرطة الخطأ يمثل الانحراف المعياري للبيانات. الصور في المعرض ج ميج fluorescence إشارة خارج القناع كولاجينيف. وبالمثل، في ج ويبين الشكل القياس الكمي ومقارنة لكثافة fluorescence ميج في حمة الدماغ بين الفئران C57BL/6 و ب pdgfret/ret بيريسيتي المنضب الفئران. تم تطبيع fluorescence كثافة الوحدات بكثافة حمة ميج متوسط قياس جميع C57BL/6 الفئران. لقد تم تعديل هذا الرقم من مرجع17. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Discussion

ويصف البروتوكول المشار إليها أعلاه إعداد الدماغ التعويم الحر المقاطع وتلطيخ إيمونوفلوريسسينت، والحصول على الصور والمعلمات التحليل المجهري عالية الاستبانة من بي بي بي. وقد استخدمت هذا الأسلوب مؤخرا للتحقيق في إضفاء الطابع المحلي على جسم تسليم منصات3، نقل مفتش الذاتية عبر ال بي بي بي17، وعدم تجانس BBB عند بيريسيتي خسارة18. يمكن تعديل خطوات مختلفة في البروتوكول أن تتكيف مع الهدف المحدد لهذه التجربة. أولاً، يسهل استخدام سميكة (100 ميكرومتر) الأقسام تعاملها خلال الإجراءات إيمونوستينينج والتركيب. كما أنه يسمح للتعمير 3D الشبكة الشعرية، ووحدة نيوروفاسكولار، وتوليد الشعرية والمقاطع العرضية NVU. ومع ذلك، اختراق الأجسام المضادة داخل أقسام الأنسجة قد تختلف وبعض تلطيخ جسم يمكن أن يقتصر على الطبقة السطحية من الأنسجة القريبة من ساترة. يمكن تعديل البروتوكول عن طريق زيادة تركيز المنظفات أثناء الخطوة permeabilization و/أو طول الخطوة permeabilization لتحسين دخول جسم إلى الأنسجة. وثانيا، يمكن أن يتعرض جودة الصورة عند محاولة الحصول على صور أكثر عمقاً داخل الأنسجة (عادة ما بين 20 إلى 30 ميكرومتر تحت السطح) بسبب تشتت الضوء، فضلا عن الانحرافات البصرية من عدم تطابق الانكسار. للتغلب على هذه المشكلة، يمكن الجمع بين أساليب جديدة لإزالة الأنسجة و اختراق جسم نشط20 مع هذا البروتوكول بصورة أكبر كميات من الأنسجة. ثالثا، يتم deconvolution بعد الحصول على الصور تحسين دقة الصورة المحورية. اختيار deconvolution أعمى الخوارزمية المستخدمة في هذا البروتوكول يستند إلى (ط) سهولة الاستخدام، كما مطلوب، لا قبل حساب الدالة نقطة الانتشار (الثاني) قوة لتحسين نوعية الصورة21، واﻻفتقار إلى (ثالثا) المصنوعات اليدوية في ميج هياكل داخل الخلايا بعد التنفيذ. اعتماداً على الهياكل داخل الخلايا التي تصور في العينة، قد يؤدي deconvolution خوارزميات أخرى أعلى جودة الصورة. 21،المراجع التالية22 تقديم مناقشة مستفيضة عن مزايا وقيود خوارزميات إضافية لصورة deconvolution. وأخيراً، يسمح باستخدام حزمة برامج تحليل الصورة تجزئة هياكل داخل الخلايا والشعيرات الدموية في ثلاثة أبعاد. من الواضح أن تحليل الصور لا تقتصر على البرامج المنصوص عليها في البروتوكول وحزم البديلة، على سبيل المثال تلك التي نوقشت في مرجع23، يمكن استخدامه للصور الجزء. وينبغي التحقق من مدى ملاءمة البرامج المختلفة لتحليل الهياكل داخل الخلايا عبر BBB تجريبيا بتقييم دقة تجزئة الصورة.

إذ يستند هذا الأسلوب على عينات ثابتة، فإنه لا يوفر معلومات مباشرة حول الديناميات من ترانسسيتوسيس عبر بي بي بي. بيد أنه يمكن دمجها مع24من التجارب المرة بالطبع، على سبيل المثال جزيء اهتمام بالحقن عن طريق الوريد وقياس تراكمه داخل بكس في نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن، إعادة إعمار حركية النقل داخل الخلايا. وميزة هذا النهج هو أنه يتيح لتحليل مناطق الدماغ العميق، كما هو مبين في18، التي يتعذر الوصول إليها حاليا للنهج التصوير لايف إينترافيتال. هو خطوة حاسمة خلال البروتوكول الرصد الدقيق لتثبيت الأنسجة. التثبيت مع 4% يقلل PFA هائلة الاستمناع العضيات داخل الخلية والمناعية الذاتية أو محيطيا تدار17 (الشكل 1B). حد من هذا البروتوكول هو متطلباتها أجسام عالية الجودة (أي، تلطيخ غير محددة منخفض، منخفض ه) مناسبة الفلورة. شريطة أن تتوفر هذه الكواشف، يمكن تطبيق الأسلوب للتحقيق في توطين أي البروتين من الاهتمام داخل الخلايا. على سبيل المثال، استخدمت في البروتوكول لتحديد ليسوسوميس في الدماغ خلايا بطانية17. ينبغي القول أيضا أن يستند هذا البروتوكول [كنفوكل] مجهرية، تحد حيود القرار الأفقي ويتعذر حل هياكل أصغر من حوالي 175 إلى 250 نيوتن متر (الشكل 2).

الدراسات السابقة بإجراء تحليل مفصل لتكوين وحدة نيوروفاسكولار باستخدام الفحص المجهري [كنفوكل]25،26الخلوية. ومع ذلك، تحقق النقل داخل الخلايا في بي بي بي يعتمد معظمها على استخدام الإرسال الميكروسكوب الإلكتروني19،،من2728. بينما يقدم هذا الأسلوب أعلى دقة أفقية من هياكل داخل الخلايا، يبقى الميكروسكوب الإلكتروني تقنية صعبة مع انخفاض الإنتاجية. وعلاوة على ذلك، عدد أهداف جزيئية مختلفة التي يمكن تصور قبل م محدودة للغاية. هذا البروتوكول يوفر بديلاً موجوداً للتحقيق في النقل داخل الخلايا في بي بي بي. كاملة، من جمع الدماغ لتحليل الصور، يمكن إجراء في 5 إلى 6 أيام. إذا كانت تتوفر الأجسام المضادة المناسبة، الفلورة يسمح الكشف المتزامن لخلية متعددة الأنواع/الجزيئات داخل نفس العينة. وعلاوة على ذلك يمكن الجمع بين هذا البروتوكول مع تقنيات الفحص المجهري القرار فائقة للتغلب على القيود الواردة في القرار المكانية29. عموما، يمكن البروتوكول المذكورة أعلاه التحديد الكمي للتغييرات في التعريب داخل الخلايا من البروتينات ذات الاهتمام داخل وحدة نيوروفاسكولار. تطبيقه للاضطرابات الوراثية أو صيدلانية مختلفة سيسمح التحقيق مهام الهيكل والنقل داخل الخلايا من بي بي بي في فيفو.

Disclosures

ويجري المؤلف أجر روش.

Acknowledgments

وأيد زيانغيانغهونغ عمل "زمالة ما بعد الدكتوراه روش" (2014-2017).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM Novus Biologicals MCA2388 Labels Brain Endothelial Cells
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin R&D Systems MAB1556 Labels Lumen of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV Biotrend BT21-5014-70 Labels Basement membrane of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Goat polyclonal antibody against CD13 R&D Systems AF2335 Labels pericytes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 Abcam ab49874 Labels Astrocytes
Use at dilution 1:100
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 Wako 019-19741 Labels Microglia
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 Fitzgerald 10R-CD107BBMSP Labels Lysosomes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 LifeTechnologies A21203 Use at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 LifeTechnologies A21202 Use at dilution 1:400
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 LifeTechnologies A21422 Use at dilution 1:400
Filter paper Sigma-Aldrich WHA10334347 Whatman prepleated qualitative filter paper
Grade 0858 1/2, grained
Cyanoacrylate glue Roth Carl 258.1 Roti Coll 1
Fluorescent Mounting medium Dako S3023 Dako fluorescent mounting medium
Adult mice The Jackson Laboratory 000664 C57BL/6J male or female mice
between 9 and 19 months of age
Vibratome Leica Biosystems 14047235612 Leica VT100S vibrating blade microtome
Laser Scanning Confocal microscope Leica Microsystems NA Leica TCS SP8 X with HyD detectors
and White light laser
Image processing software Leica Microsystems NA Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587
Image analysis software Bitplane scientific software NA Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific NA https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science
/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
  2. Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
  3. Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
  4. Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
  5. Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
  6. De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
  7. Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
  8. Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
  9. Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
  10. Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
  11. Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
  12. Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
  13. Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
  14. Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
  15. Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
  16. Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
  17. Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
  18. Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
  19. Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
  20. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  21. Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
  22. Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
  23. Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
  24. Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
  25. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
  26. Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
  27. Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
  28. Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
  29. Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).

Tags

بيولوجيا الأعصاب، 129 قضية، حاجز الدم في الدماغ، ترانسسيتوسيس، والنقل داخل الخلايا، والفحص المجهري [كنفوكل]، الفلورة، تحليل الصور
تصوير [كنفوكل] عالية الدقة لحاجز الدم في الدماغ: التصوير، وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد، والتقدير الكمي ترانسسيتوسيس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Villaseñor, R., Collin, L.… More

Villaseñor, R., Collin, L. High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis. J. Vis. Exp. (129), e56407, doi:10.3791/56407 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter