Summary
Burada mikroskobu tabanlı bir protokol için yüksek çözünürlüklü görüntü ve fare üç boyutlu rekonstrüksiyon nörovasküler birim ve kan - beyin bariyerini beyin serbest yüzer bölümleri kullanarak mevcut. Bu yöntem, görselleştirme, analiz ve BBB, hücre içi organellerin miktar için sağlar.
Abstract
Kan - beyin bariyerini (BBB) molekülleri dolaşım ve beyin arasında taşıma düzenleyen dinamik bir çok hücreli arabirimidir. Transcytosis BBB genelinde beyin parankimi hormonlar, metabolitleri ve terapötik antikorlar teslim düzenlemektedir. Burada, lazer tarama confocal mikroskobu ve BBB, endotel hücreleri içinde hücre altı organelleri görselleştirmek için görüntü analizi ile ayirt serbest yüzer bölümlerin birleştiren bir iletişim kuralı mevcut. Bu veri kümesi birleştiren 3D görüntü analiz yazılımı ile yarı otomatik segmentasyon ve miktar kılcal biriminin ve yüzey alanı, yanı sıra numarası ve BBB, hücre içi organellerin yoğunluğu sağlar. Fare endojen immünglobulin (IgG) hücre içi veziküller ve BBB, onların miktar içinde algılama yöntemi göstermek için kullanılır. Bu iletişim kuralı potansiyel olarak farklı molekül içinde vivoBBB transcytosis kontrol mekanizmaları soruşturma için uygulanabilir.
Introduction
Kan - beyin bariyerini (BBB) merkezi sinir sistemi (MSS) kan dolaşımı1den ayıran astrocytes, perisitlerden, sinir hücreleri ve endotel hücreleri tarafından kurulmuş bir sürekli hücresel engeldir. BBB arasında taşıma Yönetmeliği beyin homeostazı korumak önemli bir rol oynar ve beyin endotel hücreleri (tarafım) özel özellikleri tarafından aracılık ettiği. Sıkı hücreler arası kavşak tarafım ve transcytosis düşük Bazal oranı arasında varlığı kan yoluyla moleküllerin, sırasıyla2paracellular ve transcellular taşıma sınırı. Son zamanlarda, transcytosis yolu tarafım içinde beyin3,4için tedavi büyük moleküllerin teslim geliştirmek için harnessed. Ancak, transcytosis üzerinden BBB mekanizmaları tam olarak karakterize5,6henüz olmamıştır.
Yoğun bir çalışma vitro hücre içi taşıma tarafım7,8,9,10, düzenleyen hücresel ve moleküler mekanizmaları deşifre etmek için yapılan 11, ama bu tür sistemleri karmaşık mimarisi ve Fizyoloji nörovasküler biriminin (NVU) özetlemek başarısız. Öte yandan, çalışmalar vivo içinde12,13 ayrıntılı nicel bilgi taşıma oranları BBB sağlar ancak hücre içi taşıma mekanizmaları anlayışlar değildirler. Bu nedenle, hücresel ve hücre içi bileşenleri NVU, soruşturma vivo içinde ex vivo kalır ve çok zorlu14. Teknikleri sadece sınırlı sayıda hücre altı yapıları NVU hücrelerinin içinde analiz etmek için mükellef bulunmaktadır. Çoğu çalışmalar elektron mikroskobu kullanmak ama bu teknik uygun doku hazırlık ve örnek taşıma için gerekli karmaşık protokoller ile sınırlıdır. Bu nedenle, beyin örnekleri işlenmesi, analizi ve NVU hücrelerde hücre altı bölmeleri miktar kolaylaştırmak yüksek çözünürlüklü confocal mikroskobu üzerinde dayalı bir metodoloji kurduk.
Burada, biz hangi fare beyin serbest yüzer bölümleri BBB ve hücresel ve hücre altı düzeyde NVU nicel görüntüleme gerçekleştirmek için bir protokol tanımlamak. Biz test edilmiş ve onaylanmış antikorlar görüntü ve üç boyutlu NVU yeniden oluşturmak için bir dizi. Ayrıca, bu iletişim kuralını çözünürlükte Maksimum optik kırınım-sınırlı organelleri beyin kılcal damarlar içinde görüntüleme sağlar. Görüntü analizi ile birlikte, örneğin ateş fare hastalık modelleri içinde çeşitli deneysel koşullarda BBB genelinde oluştururlar hücre içi taşıma araştırmak için bu protokolü kullanılabilir.
Protocol
etik onay bu çalışma için Federal gıda güvenliği ve hayvan hastalıklarıyla ilgili Office İsviçre tarafından sağlanan. İsviçre federal yönetmelik hayvanları koruma ve refah yanı sıra, değerlendirme ve Akreditasyon, laboratuvar hayvan bakımı International (AAALAC) Derneği kurallarına göre sıkı bağlılık tüm hayvan deneyleri yapılmıştır.
1. nesil beyin Free-floating bölümler
- % 2 paraformaldehyde (PFA) taze bir çözüm en iyi örnek kalite için perfüzyon gününde fosfat tampon serum (PBS) hazırlayın.
Dikkat: PFA orta ciltle temas ve olası kanserojen tarafından zehirlidir. Nitril eldiven kimyasal duman başlık altında çözüm hazırlamak ve İngiltere'de yılın işlemek için kullanın.- 60 mL hayvan başına PFA çözeltisi hazırlamak.
- Bring PFA çözüm pH 180-200 µL PBS her 100 mL için 5 M KOH çözümü ile artan ve 60 kadar çözüm Isıtma ° C.
Not: doku koruma fiksasyon üzerine olumsuz etkileri gibi NaOH kullanılmamalıdır. - Oda sıcaklığında aşağı çözüm soğumaya bırakın ve filtre kağıdı kullanarak çözüm pH 7.4 HCl. filtre kullanarak aşağı getirmek (Tablo malzemeleri görmek).
- Transcardial perfüzyon ile tüm fare fiksasyon yukarıda açıklanan 15 bazı değişikliklerle olarak gerçekleştirmek. Önce kan damarlara 20 mL PBS kullanarak floş sonra % 2 ile 40 mL sıvı İngiltere'de yılın.
- Yukarıda açıklanan 15 olarak kafatası beyin kaldırmak.
- Bırakın bir taze 20 ml % %2 2 beyin PFA periosteum PFA sonrası fiksasyon için 4 ° C'de 7 h için.
Not: hücre içi yapılar tespiti önlenir PFA kuluçka artan önerilmez. - Kapsamlı buz gibi PBS ile beyin yıkamak.
- Özel beyinlerinde sabit Embed.
- Hazırla % 3 özel PBS bir mikrodalga Isıtma için kullanarak çözümde. Yavaşça sakin olun ama katılaşma önlemek için çözüm girdap.
- PBS aşırı bir plastik kap içinde özel çözüm içine daldırma önce beyin çevresinde kapalı kuru. Beynin içinde hava kabarcıkları kaldırmak için özel döndürün. Buz üzerinde aşağı soğutma tarafından kuvvetlendirmek özel izin
- Dikkatle özel blok plastik kapsayıcıdan kaldır ve jilet kullanarak beyin çevresinde bir küp kesilmiş. Beyin vibratome numune tutucu üzerine monte (Tablo malzemeleri görmek) cyanoacrylate tutkal kullanarak (Tablo malzemeleri görmek). Kesit ile devam etmeden önce kuvvetlendirmek tutkal yeterli zaman tanıyın.
- Vibratome arabellek tepsi numune sahibine beyinde dolu transfer PBS ile. 100 µm beyin dilimleri (sagittal veya koronal) bölüm için vibratome kullanın. Beyin bölümleri daha önce PBS ile dolu bir 6-şey plaka toplamak.
- Bitirme beyin kesit, üzerine dikkatle PBS kaldırmak ve yerine koymak PBS/gliserol ile bir 1:1 eriyik.
- Saklamak bölümleri PBS/gliserol içinde -20 ° c
2. Hücre veya organel etiketleme ayirt boyama tarafından
- dikkatli bir şekilde transfer bir beyin Bölüm 24-şey kalıbının kuyuya önceden doldurulmuş PBS 500 µL iyi ücret ile. Bölüm yordamının sonuna kadar aynı kuyuda kalır.
- Bölümü 500 µL ile iki kez PBS için 5 dk nazik ajitasyon altında durulayın.
- PBS kaldırmak ve eş zamanlı engelleme ve permeabilization beyin dilimleri gerçekleştirmek.
PBS
- hazırla % 0,3 ile engelleme ve permeabilization bir çözüm Triton-X ve % 10 eşek serum.
Not: Eşek serum kullanılan belirli ikincil antikor ana bilgisayar türleri eşleştirmek için keçi serumla değiştirilebilir. - Kuluçkaya 250 µL bölümlerle nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında 1 h için engelleme ve permeabilization çözüm.
- hazırla % 0,3 ile engelleme ve permeabilization bir çözüm Triton-X ve % 10 eşek serum.
- Çözümü kaldırın ve % 5 eşek serum ve uygun bir seyreltme (örneğin, 1: 100 için 1:1, 000), birincil antikor içeren bir PBS çözüm ekleyin. Gecede 4 ° c altında nazik ajitasyon kuluçkaya.
Not: Malzemeler tablo başarıyla NVU bu iletişim kuralı ile farklı hücre türleri etiket antikorlar listesi için bkz. Birincil antikorların en uygun seyreltme ampirik olarak belirlenmelidir. Aynı anda farklı antijenler etiketleme için aynı çözüm içinde tüm birincil antikorlar oranında seyreltin. Tüm birincil antikorlar farklı türler yükseltilmiş olması gereklidir. Antikor penetrasyonu artırmak için örnekleri 4'te en fazla 72 saat için inkübe ° C. - Kaldır antikor bölümler altında oda sıcaklığında hafif ajitasyon PBS 10 min için üç kez çözüm ve yıkama. PBS kaldırın ve 250 µL PBS çözüm içeren % 5 eşek serum ve uygun species-specific fluorescently etiketli ikincil antikor ekleyin. Bölümler için 1S nazik ajitasyon altında oda sıcaklığında kuluçkaya.
- Bu protokolü ile kullanılan ikincil antikorlar listesi için Malzemeler tablo bkz:.
- Altında oda sıcaklığında hafif ajitasyon PBS içinde üç kez 10 min için antikor çözüm ve yıkama bölümleri kaldır.
- Kaldırın PBS ve bir 4 250 µL ekleyin ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) çözüm 1 µg/ml nihai bir konsantrasyon ile. Nazik ajitasyon altında 10 dakika oda sıcaklığında bölümleri kuluçkaya. PBS ile 5 min için 3 kez DAPI çözüm ve yıkama bölümleri kaldırın.
- Mikroskobu slaytlar (Örneğin, histo-bond cam slayt) bağ üzerinde beyin bölümü mount. Aşırı PBS slayt üzerinde bölüm çevresinde dikkatli bir şekilde çıkarın. Montaj orta bir damla ekleyin (tablo malzemeleri görmek) üst beyin bölümü ve dikkatle 0,17 mm (No 1.5) borosilikat cam coverslip ile yeter.
- Saklamak örnekleri resim alma gerçekleştirmek kadar ışıktan korunan 4 ° C'de.
3. Yüksek çözünürlüklü Confocal görüntüleme kan - beyin bariyerini
- gerçekleştir resim alma bir uygun lazer tarama olan confocal mikroskop (Tablo malzemeleri görmek) lazer çizgilerle 405, 488, 561 ve 633 nm için uyarma Mavi, yeşil, turuncu ve kırmızı ışık spektrumu bölgelerinde fluorophores. Resim alma için petrol amaç X 63 1.4 sayısal bir diyafram ile kullanın.
- Edinme yemek listesi-in mikroskop, denetleyen bir yazılım satın alma parametreleri görüntü belirleme. Açılan menüsü içinde ‘ görüntü boyutu ’, 1024 x 1024 piksel değerini seçin. Piksel boyutu değerini ayarlayarak 200 ve 300 nm arasında bir değere değiştirin ‘ zum ’ menü. ”
Not: hücre içi yapılar analiz için piksel boyutunu azaltmak için 75 nm. Bu fotoğraf boyutu ayarını önemli ölçüde edinme süresini artırır ve daha küçük bir görüş alanı görüntüleme tarafından satın alma zamanı azaltmak için 512 x 512 piksel azaltılabilir. - İçinde ' Alım hızı ' aþaðý açýlan menüsünden, 400 Hz, değerini bir saniyede Yani 400 satırları seçin. İçinde ' sistem ayarlarını ve #39; yemek listesi, seçme ' piksel derinliği ' damla yemek listesi ve değişmek belgili tanımlık değer için 12 bit.
- İçinde mikroskop bilgisayar yazılımı içinde ' Alım ' sekmesinde, geçiş için sıralı çerçeve satın alma seçeneği. Değeri değiştirerek optik bölüm kalınlığı 0,75 ve her kanal için 1 µm arasında bir değer ayarlayın ' iğne deliği ' menü.
- Panel floresan uyarma için en iyi şekilde fluorophores örneğinde, örneğin bir 488 nm lazer çizgi yeşil yayan fluorophore için heyecanlandırmak için gerekli lazer etkinleştirin.
Not: bir fluorophore spectra Görüntüleyicisi'ni kullanın (yeterli uyarma lazer seçmek için Malzemeler tablo bkz:). - Panel floresan algılama için örneğin yeşil yayan fluorophore için 510 ve 550 nm arasında her kanaldaki ölçülecektir dalga boylarında seçmek için kaydırıcıyı hareket ettirin.
Not: bir fluorophore spectra Görüntüleyicisi'ni kullanın (yeterli algılama dalga boylarında seçmek için Malzemeler tablo bkz:). - Bir damla daldırma yağı 1.52 coverslip cam coverslip ve objektif kırılma indisini eşleşecek şekilde beyin bölümü ile tepesinde bir Kırılma indisi ile ekleyin. Örnek içinde mikroskop yer ve mikroskop dürbün örnek görselleştirmek için epifluorescent lamba açın.
- Mikroskop kürsüye düğmelerini kullanarak değiştirmek DAPI lekeli çekirdeği görüntülenmesi için uygun filtre seçmek için filtre tekerlek. Sinyal DAPI lekeli çekirdek odak haline getirmek için kaba odağı kullanın.
- Mikroskop kürsüye düğmelerini kullanarak değiştirmek filtreleri vasküler işaretleri (örneğin, CollagenIV veya CD31) sinyalini görselleştirmek ve bireysel bir Kapiler bölütü üzerindeki görüş alanı ortalamak için.
- Yaşamak-tarama modunu başlatmak için düğmesine basın. Tarama sırasında fotoğraf makinesinin dinamik alanı en üst düzeye çıkarmak ve piksel doygunluk kaçınmak her kanal için kazanç ve lazer yoğunluğunu ayarlayın.
Not: aşırı doygunluk görsel olarak değerlendirmek için doymuş piksel etiketleri bir arama tablosu kullanın. Sinyal aşırı doygunluk kaçınmak için en yüksek floresan sinyal olması beklenir örnek ile ayarlarını. - 2'ye ortalama satır değeri ayarla.
Not: daha yüksek satın alma hızlarını kullanırken, gürültüyü azaltmak için bu değeri artırın. - Ağımdaki başlar ve kılcal tüm birimi yayan optik z yığınlarının gerçekleştirmek için bölümler biter. 0,45 µm adım boyutunu kullanın.
Not: görüntüleri izleyen miktar için kullanılacaksa, tam veri kümesi için aynı alma ayarlarını tutmak. - Miktar için 10-20 z-yığınlar istatistiksel karşılaştırmalar için en az üç farklı fare bölümünden başına elde.
Not: örnek lazer diş beyazlatma ve şiddeti dalgalanmalar doğan değişkenliği azaltmak için aynı seansta tam veri kümesi elde.
4. Nörovasküler birim işleme ve 3D inşası resim
- (edinsel z yığınlarının Aksiyel çözünürlüğünü, deconvolution uygun yazılımı kullanarak görüntü veri kümesinin gerçekleştirmek için isteğe bağlı) (bkz: tablo malzemeleri ).
- Deconvolution yazılım gerçekleştirmek için ayarları değiştirmek " kör " deconvolution, (Yani, adaptif bir noktası yayıldı fonksiyonu).
- Deconvolution yazılım ayarları, geçiş için arka planı kaldırma; seçeneği bu seçenek Görüntü yığınında en küçük yoğunluk değeri belirler ve yoğunluk değerleri görüntüdeki her piksel değerden çıkarmak.
- Yoğunluğu rescaling için devre dışı deconvolution Yazılım Ayarları değiştir ve yeniden boyutlandırma için 16 bit derinliği; bu seçenekleri orijinal yoğunluk değerleri ve fotoğraf makinesinin dinamik alanı tutacak.
- Menüsü içinde ' Kırılma indisi ', 1.52 için ayarlayın. İçinde ' ayarla dalga boyu ' yemek listesi, seçme emisyon değerleri her görüntü kanal için. Örneğin, bir yeşil yayan fluorophore için 520 seçin.
- Görüntü veri görselleştirme ve analiz (bkz. Tablo reçetesi) 3 boyutlu veri kümelerinin için uygun yazılım kullanarak küme açık. Görüntü analiz yazılımı basın " Surpass " kılcal 3D hacmi işlemek için düğme.
- Görüntü analizi yazılım Basında " ekle yeni yüzey " kapiller yüzeyi segmentlere ayırmak için düğme. Yüzey oluşturma Sihirbazı'ndaki adımları arasında taşımak için alt okları kullanın.
- İçinde ' oluştur ' sekmesinde, kaynak kanalı kılcal marker ile örneğin CollagenIV, kanala ayarlayın ve yüzey alanı ayrıntı 0.5 µm değerine ayarlayın.
Not: İkinci seçenek resme Gauss filtre uygular ve yüzey düzgünlüğünü belirler. - İçinde ' oluşturmak ' sekmesinde, geçiş için mutlak yoğunluğu eşik seçeneği.
Not: Bir yüzey görüntüdeki Seçili kanala mutlak yoğunluğu dayalı bir maske oluşturarak bu seçenek oluşturacak. - Yüzey oluşturma Sihirbazı'nda bir sonraki adım, kadar işlenmiş maskesi görüntüdeki tüm kılcal kapsar arasında yoğunluk histogram sürgülü pencere taşıyarak yüzeyine daha düşük yoğunluk eşik ayarlayın. Bu parametre her veri kümesi için ampirik olarak değer aralığını belirlemek.
- Damla-aşağı yemek listesi altında yüzey oluşturma Sihirbazı'nı son adım, tıklayın " filtre türü " ve seçeneğini seçin ' Voxels numarası '. Voxels en az sayıda 2.0e5 için 1.0e5 arasında bir değere ayarlayın.
Not: Bu seçenek yüzeyler ile voxels, örneğin, küçük kesimleri kapiller çerçevenin kenar, az sayıda dışlayacaktır. - Yüzey oluşturma Sihirbazı'nı tamamladıktan ve oluşturma parametrelerini tıklatarak " parametreleri hatırlıyorum " yüzey menü yeniden Oluştur sekmesindeki.
- İlk görüntü için kullanılan parametre kümesi yükleyerek veri kümesi görüntüleme tamamı için yordamı yineleyin. Sırasıyla yoğunluğu, eşik ve voxels her görüntü için arka plan yoğunluğu ve kapiller Morfoloji, farklılıkları hesabına için en az sayıda parametrelerini ayarlamak.
- İçinde ' oluştur ' sekmesinde, kaynak kanalı kılcal marker ile örneğin CollagenIV, kanala ayarlayın ve yüzey alanı ayrıntı 0.5 µm değerine ayarlayın.
- Hücre içi veziküler yapılar (örneğin, immünglobulin dolu endosomes) segment, ilk yalnızca kılcal floresan sinyal gönderici içeren yeni bir kanal oluşturmak için.
Not: Bir bölge ilgi 4.3- seçin adımda oluşturduğunuz kapiller yüzeyi kullanarak maske oluşturarak bu işlem tanımlayacak ' düzenleme ' menüde ' kapiller yüzeyi ' Masası. Altında ' maske özelliklerini ','ı tıklatın " maskesi tüm ". Hücre içi vezikül sinyali olarak içeren kanalı seçin ' kaynak kanalı ' ve Değiştir seçeneği " maske uygulamadan önce kanal yinelenen ".
- İçinde ' maske ayarları ' sütun, select " sürekli iç/dış " ve " ayarla voxels yüzeye dışında: " ve koymak onun değer-0.00.
Not: Bu işlem ek bir kanal nerede kapiller maskesi dışında tüm voxels bir yoğunluk değeri 0 olacaktır görüntü oluşturacaktır. Olaylar dışında (Yani, beyin parankimi içinde) kılcal ölçmek, seçmek için " ayarla voxels yüzeye içinde: " ve koymak onun değer-0.00.
Veziküler yapıları segmentlere ayırmak için başlatmak için düğmesine basın - " yeni noktalar eklemek " Sihirbazı. Yüzey oluşturma Sihirbazı'ndaki adımları arasında taşımak için alt okları kullanın.
- Damla aşağı yemek listesi altında Oluştur sekmesini kullanın " kaynak kanalı " 4.4.4. adımda oluşturduğunuz hücre içi maskeli kanalı seçmek üzere:.
- Oluştur sekmesinde altında " nokta algılama " bölümünde, tahmini XY çapı 0.5 ve veziküller içinde gözlenen ortalama büyüklüğüne bağlı olarak 1 µm arasında bir değere ayarlayın deney. Bu seçenek segmentasyon algoritması tarafından algılanan en küçük boyutunu belirler.
- Oluştur sekmesinde altında " nokta algılama " bölüm, geçiş için seçeneği " arka plan çıkarma ".
Not: Bu seçenek, görüntü (değerinden 4.4.7. adımda seçtiğiniz) 0,75 spot yarıçap Gauss filtre ile pürüzsüz ve orijinal görüntü Gauss yoğunluğunu çıkartılacak şekilde filtre tarafından 0,88 spot RADIUS. - İçinde ' oluşturmak ' sekmesinde, altında aşağı açılan menü tuşuna ' filtre türü ' ve seçin " Kalite ". Bu noktalar merkezi yoğunlukta dayalı eşikleri uygulayarak görüntünün segment unutmayın. Kayan pencere boyunca taşıyarak daha düşük yoğunluk eşik ayarlayın ' Kalite ' olarak tanımlanabilir veziküller çoğunluğu etiketli kadar histogram.
Not: Bu parametre için değer aralığı her veri kümesi için ampirik olarak belirlenmesi gerekiyor. - Nokta oluşturma Sihirbazı'nı tamamladıktan ve oluşturma parametrelerini Kaydet düğmesini tıklatarak " parametreleri hatırlıyorum " yüzey menü yeniden Oluştur sekmesindeki.
- İlk görüntü için kullanılan parametre kümesi yükleyerek veri kümesi görüntüleme tamamı için yordamı yineleyin. Parametrelerini ayarlamak ' kalite yoğunluğu eşik ' arka plan yoğunluk farklılıkları hesaba her görüntü için.
5. BBB, hücre içi taşıma miktar
- ölçmek hacminde (µm 3) ve (µm 2)'deki bölgesinin Kapiler bölütü. Analiz yazılımı istatistikleri panel 4.3. adımda oluşturduğunuz damar yüzeyinin erişin. Seçin ' detaylı ' sekme ve açılır menüden seçmek için kullanın " tüm değerleri " hacim ve alan için değerleri bulmak için.
- Veziküller içinde Kapiler bölütü sayısı ölçmek. Analiz yazılımı istatistikleri panel 4.4. adımda oluşturduğunuz noktalar erişim. Seçin ' genel ' yansımada noktalar toplam sayısı değerini bulmak için sekme. Her resim için kılcal birim başına veziküller sayısını hesaplamak için
- noktaların sayısını 5.1 adımda hesaplanan birim tarafından normalleştirmek. 1000 1000 µm 3 kılcal biriminin başına veziküller sayısını bulmak için bu değeri çarpmak. Kılcal damar içinde toplam yoğunluğunu ölçmek için
- tüm görüntü aşağıdaki adımları 4.3 aşağıdaki değişiklikler ile yönergeleri açıklandığı kapsayan yeni bir yüzey oluşturmak. İçerir (örneğin, mIgG) ilgili sinyal kaynak kanalı olarak kanal seçin ve yüzey alanı ayrıntı düzeyi için 5 mikron ayarlayın. Resmin tamamını kapsayan bir yüzey oluşturmak için daha düşük yoğunluk eşik değerini 0 olarak ayarlayın.
- İstatistikleri panel 5.4. adımda oluşturduğunuz yüzey analiz yazılımı erişmek. Seçin " detaylı " sekme ve açılır menüden seçmek için kullanın " tüm değerleri ". Değerleri kayıt ' yoğunluk toplamı ' faiz; kanallar için Bu parametre bireysel yoğunluk değerleri toplamı tüm pikseller karşılık gelir.
Not: bir hücre içi sinyal için bu küme için 0.0 yüzeyi dışında voxels ile çoğaltılmış kanal karşılık gelir. Beyin parankimi sinyal için bu voxels küme 0.0 için yüzey içinde çoğaltılan kanalla karşılık gelir.
Floresan yoğunluğu her resim için kılcal birim başına hesaplamak için - yanında adım 5.1 hesaplanan güç yoğunluğu normalleştirmek. 1.000 Floresans yoğunluk değeri 1000 µm 3 kılcal biriminin başına almak için bu değeri çarpmak.
Not: Floresan sinyaller de beyin parankimi için kılcal birim eksi Toplam görüntü birimi tarafından değerleri normale ve 1000 1000 µm 3 beyin parankimi başına toplam yoğunluğu elde etmek için çarpmak. - Tüm veri kümesi için yordamı yineleyin ve verilerin istatistiksel analiz için uygun yazılımı kullanın.
Representative Results
Temsili resim örnekleri burada açıklanan iletişim kuralından olduğundan fare beyin bölümleri farklı bileşenleri de dahil olmak üzere membran, astrocytes, perisitlerden NVU tanıma antikorlar ile lekeli ve endotel hücreleri (bkz. Tablo malzemeler kullanılan belirli karşı antikorlar) (şekil 1A, D ve E). Bu çözünürlükte bireysel astrositik süreçleri ve kılcal damarlar ile doğrudan temas halinde olan son ayaklar ayırt etmek mümkündür.
Hücre içi yapılar tespit için bu protokolü uygunluğu vurgulamak için beyin bölümleri periferik insan anti-Tau mAb86 antikor16 ile enjekte hayvanlardan bir fluorescently etiketli Anti-insan antikoru ( ile lekeli Şekil 1B). mAb86 özellikle Tau16patolojik şeklinde ifade hedef nöronlar için bilinir. Burada açıklanan protokolünü kullanarak, mAb86 nöronlar (şekil 1B-C) içinde bireysel veziküler yapıları içinde kırınım-sınırlı çözünürlük ile tespit edilmiştir. Buna ek olarak, endojen fare IgG endotel hücreleri içinde hücre içi yapılar ama perisitlerden (şekil 1D-E ve Şekil 2) tespit edilmiştir.
Yüksek çözünürlüklü confocal z-yığınlarını beyin damarlara edinimi kılcal damarlar ve hücre içi veziküller BBB, üç boyutlu ayrılmasını sağlar. Şekil 2 gösterir bir örnek oluşturma ve CollagenIV ve fare IgG pozitif etiketli bir kılcal segmentlere işleminin hücre içi veziküller. Tam veri kümesi parçalı görüntüler, örneğin veziküller kılcal birim başına sayısı ölçerek tarafından miktarının, hücre içi taşıma işlemlerinde farklı koşullar altında değişiklikleri incelemek mümkündür. Şekil 3 B-C mIgG beyin parankimi, sırasıyla, daha önce bildirilen olarak pdgf-bret/ret fare modeli pericyte tükenmesi üzerine karşılık gelen mIgG vezikül numarası ve floresan yoğunluğu farklılıkları gösterir 17. aynı yaklaşımı da son zamanlarda farklı beyin bölgelerini18arasında BBB, hücre içi taşıma değişiklikleri analiz etmek için kullanıldı.
Şekil 1: Birden fazla hücre tipleri ve nörovasküler hücre altı yapıları Labelling Gordon Nörovasküler birimi (A ve D) ve hücre içi veziküller nöronlar (B) içinde bulunan ya da endotel hücreleri (E) bu iletişim kuralı ile alınan temsilcisi görüntüler. Maksimum yoğunluk projeksiyon görüntü A (üst) tarafından CollagenIV (yeşil) etiketli kılcal çevreleyen GFAP'nin pozitif astrocytes (kırmızı) dağılımı gösterir. Okları tek tek astrositik işlemler için gelin. Ölçek çubuğu 20 µm =. Bu çözünürlükte bireysel astrocyte işlem ve son-ayak kutulu bölge (alt) Yakınlaştırılmış resimdeki gösterildiği gibi açıkça görülebilir. Ok uçları astrositik son metreye işaret. Ölçek çubuğu 10 µm =. B görüntüde periferik enjekte antikor, mAb86 (yeşil), Hipokampal nöron içindeki birikimi gösterir. Ok uçları için bireysel mAb86 pozitif veziküller gelin. Ölçek çubuğu 10 µm =. C grafiğinde tek bir vezikül satır profil yoğunluğunu gösterir. Vezikül boyutu tam genişlikli Gauss bir uyum (siyah düz çizgi) yoğunluğu eğrisi (yeşil hat ve Daire) yarım en yüksek seviyede tahmin edilmiştir. D Albümdeki bir pericyte tarafından çevrili bir endotel hücre (yeşil) üç boyutlu rekonstrüksiyon Bazal lamina içinde (CollagenIV, gri) (kırmızı) göstermek. Alt panelleri bireysel Floresans kanalları göster. Ölçek çubuğu 10 µm =. E görüntüler (panel, CD31 yeşil sol) endotel hücrelerindeki (hücre içi veziküller içinde kırmızı) mIgG lokalizasyonu değil perisitlerden (doğru kapı aynası, yeşil CD13) ama göstermektedir. Tüm görüntüleri, DAPI çekirdeği lekeli mavi renkle gösterilir. Ölçek çubuğu = 5 µm. panelleri D ve E değiştirilmiş başvuru17. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Üç boyutlu işleme kılcal damar ve kan - beyin bariyerini, hücre içi veziküller. Açıklanan protokolüyle CollagenIV pozitif kılcal damarlar (yeşil) ve fare hücre içi veziküller (kırmızı) olduğunu IgG confocal görüntüleri yüksek çözünürlüklü(a)satın aldı. Sol panelde kesitlerde tek bir optik bölümü göstermektedir. Okları bireysel mIgG pozitif veziküller içinde beyin endotel hücreleri üzerine gelin. Tam z-yığın kullanmanın doğru gösterir 3D imar panelde resim işleme yazılımı ( Tablo malzemelerigörmek). Kılcal birim (B) ve bireysel veziküller (C) üç boyutlu olarak işlenir ve görüntü işleme yazılımı kullanarak sayısal ( Tablo malzemelerigörmek). Tüm görüntüleri, DAPI çekirdeği lekeli mavi renkle gösterilir. Ölçek çubukları 5 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : MIgG hücre içi yerelleştirme BBB, miktar. Temsilcisi görüntüler(a)üç boyutlu rekonstrüksiyonu (collagenIV ile yeşil etiketli) kapiller ve mIgG dağılımı (kırmızı) C57BL/6 fareler ve pdgf-bret/ret pericyte gösteren fareler tükenmiş daha önce19' açıklanan. Ölçek çubukları 10 µm =. B Albümdeki CollagenIV maske içinde hücre içi veziküller ayrılmasını göster. İncimiktar ve karşılaştırma mIgG vezikül numarasının kılcal birim başına b e grafiğini gösterir. Her noktası ölçümleri gelen bireysel kapiller kesimleri temsil eder. Düz çizgiyi ortalamasını gösterir ve hata çubukları standart sapma verileri temsil eder. C Haritayı Albümdeki mIgG floresan sinyal CollagenIV maskesi dışında. Benzer şekilde, C grafiğinde miktar ve karşılaştırma mIgG floresan yoğunluğu C57BL/6 fare ve pdgf-bret/ret arasında beyin parankimi tükenmiş pericyte fareler gösterir. Floresan yoğunluğu birimleri tarafından tüm C57BL/6 farelerde ölçülen ortalama mIgG parankimi yoğunluğu normalleştirilmiş. Bu rakam başvuru17değiştirildi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Discussion
Yukarıda özetlenen protokolünü beyin serbest yüzer bölümler, immünfloresan boyama, resim alma ve analiz parametrelerini hazırlanması için yüksek çözünürlüklü mikroskobu BBB açıklar. Bu yöntem son zamanlarda antikor teslim platformlar3, endojen IgG BBB17arasında taşıma ve pericyte kaybı18üzerine BBB heterojen lokalizasyonu araştırmak için kullanılmıştır. İletişim kuralı farklı adımlar deneme belirli hedefe adapte değiştirilebilir. İlk olarak, kalın (100 µm) bölümleri kullanımını kullandıklarında daha immunostaining ve montaj işlemleri sırasında kolaylaştırır. Ayrıca 3D kılcal ağ, nörovasküler ünitenin inşası ve üretimi NVU kesit ve kılcal sağlar. Ancak, penetrasyon antikor doku bölümleri içinde değişebilir ve bazı antikor boyama doku coverslip yakın yüzeysel tabakası tahsis edilebilir. Protokol deterjan permeabilization adım sırasında konsantrasyon ve/veya doku içine nüfuz antikor geliştirmek için permeabilization adım uzunluğu artırarak değiştirilebilir. İkinci olarak, görüntü kalitesi görüntüleri ışık saçılma yanı sıra optik aberasyonları gelen Kırılma indisi uyuşmazlığı nedeniyle (aşağıda genellikle 20-30 µm) doku içinde daha derin çalışıldığında tehlikeye olabilir. Bu sorunu çözmek için takas doku ve aktif antikor penetrasyon20 için yeni yöntemler doku görüntü daha büyük birimleri için bu protokolü ile birleştirilebilir. Üçüncü olarak, deconvolution görüntünün Aksiyel çözümlemesini geliştirmek için resim alma sonra gerçekleştirilir. Hiçbir ön hesaplama noktası yayıldı fonksiyonu olarak bu protokol için kullanılan kör deconvolution algoritması (i) kullanım kolaylığı, dayanıyordu görüntü kalitesi21ve eserler üzerinde mIgG (III) eksikliği geliştirmek için (II) onun sağlamlık uygulama sonrası hücre içi yapılar. Hücre içi yapılar örnek görüntülenir bağlı olarak, diğer deconvolution algoritmaları daha yüksek görüntü kalitesinde neden olabilir. Aşağıdaki başvuruları21,22 avantajları ve görüntü deconvolution için ek algoritmaları sınırlamaları hakkında kapsamlı bir tartışma sağlar. Son olarak, bir görüntü analiz yazılım paketi kılcal damarlar ve hücre içi yapılar ayrılmasını üç boyutlu olarak izin. Açıkçası görüntü analizi iletişim kuralı ve alternatif paketleri, örneğin bu başvuru23' te açıklanan açıklanan yazılım için sınırlı değildir, segment görüntüler için kullanılabilir. Hücre içi yapılar arasında BBB analizi için farklı yazılım programları uygunluğu ampirik olarak görüntü segmentasyonu doğruluğunu değerlendiriliyor tarafından doğrulanması gerekir.
Bu yöntem sabit örneklere dayalı beri BBB arasında transcytosis mekanizmaları hakkında doğrudan bilgi sağlamaz. Ancak, o zaman-ders deneyler24ile örneğin intravenöz faiz molekülünün enjekte ve onun birikimi tarafım içinde farklı zaman noktalarda enjeksiyon Kinetik yeniden oluşturmak için sonra ölçerek kombine edilebilir Hücre içi taşıma. Bu yaklaşımın avantajı bu şu anda intravital canlı görüntüleme yaklaşımlar ulaşılmaz olan18, gösterildiği gibi derin beyin bölgeleri, analiz için izin vermektedir. Kritik bir protokol sırasında dikkatli doku fiksasyonu izleme adımdır. Fiksasyon ile % 4 İngiltere'de yılın dramatik immünojenisite hücre içi organellerin ve endojen veya periferik yönetilen immünglobulin17 (şekil 1B) azaltır. Onun gereksinimi antikorların yüksek kaliteli (Yani, düşük non-spesifik boyama, düşük olan) ayirt için uygun Bu protokol kısıtlamasıdır. Böyle reaktifler kullanılabilir olması koşuluyla, yöntem ilgi herhangi bir proteinin hücre içi yerelleştirme araştırmak için uygulanabilir. Örneğin, protokol organellerin beyin endotel hücreleri17tanımlamak için kullanıldı. Ayrıca bu iletişim kuralı üzerinde confocal mikroskobu dayalı olduğundan, yanal çözünürlük kırınım tarafından sınırlı ve yapıları daha yaklaşık 175-250 daha küçük çözümlenemiyor unutulmamalıdır nm (Şekil 2).
Önceki çalışmalarda hücresel kompozisyon confocal mikroskobu25,26kullanarak nörovasküler biriminin ayrıntılı analizini gerçekleştirdiniz. Ancak, hücre içi taşıma BBB, soruşturma çoğunlukla transmisyon elektron mikroskobu19,27,28kullanımına dayanıyor. Bu yöntem hücre içi yapılar en yüksek yanal çözünürlük sunarken, elektron mikroskobu zorlu bir teknik iş hızı düşük kalır. Ayrıca, EM tarafından görüntülenmiştir farklı moleküler hedeflerin sayısı çok sınırlıdır. Bu iletişim kuralı BBB, hücre içi taşıma araştırmak için erişilebilir bir seçenek sunar. Tam yordam, görüntü analizi, beyin koleksiyonuna 5-6 gün içinde gerçekleştirilebilir. Uygun antikor yoksa, ayirt aynı anda birden çok hücre türleri/moleküller aynı örnek içinde algılanmasını sağlar. Ayrıca bu iletişim kuralı'nın Uzaysal çözünürlük29sınırlamaları aşmak için süper çözümleme mikroskobu teknikleri ile birlikte. Genel olarak, yukarıda açıklanan Protokolü nörovasküler birimindeki ilgi proteinlerin hücre içi yerelleştirme değişimler miktar sağlar. Onun uygulama için farklı genetik veya farmakolojik tedirginlikler BBB in vivohücre içi yapısı ve taşıma işlevlerinin soruşturma izin verir.
Disclosures
Yazarlar Roche tarafından Ücretli istihdam altındadır.
Acknowledgments
R.V. iş Roche doktora sonrası bursu (2014-2017) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
