Summary
Her presenterer vi en mikroskopi-basert protokoll for høy oppløsning bilder og en 3-dimensjonal modell av musen nevrovaskulære enhet og blod - hjerne barrieren bruker hjernen frittflytende deler. Denne metoden gjør det visualisering, analyse og kvantifisering av intracellulær organeller på BBB.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk flercellet grensesnitt som regulerer transport av molekyler mellom sirkulasjonen og hjernen. Transcytosis over BBB regulerer levering av hormoner, metabolitter og terapeutiske antistoffer til hjernen parenchyma. Her presenterer vi en protokoll som kombinerer immunofluorescence av frittflytende deler med laserskanning AC confocal mikroskopi og bildeanalyse å visualisere subcellular organeller innen endotelceller på BBB. Kombinere datasettet med 3D image analyseprogramvare gir halvautomatisk segmenteringen kvantifisering av kapillær volum og areal, samt antallet og intensiteten av intracellulær organeller på BBB. Gjenkjenning av musen endogene immunglobulin (IgG) intracellulær blemmer og kvantifisering på BBB brukes til å illustrere metoden. Denne protokollen kan potensielt brukes til granskingen av mekanismer som styrer BBB transcytosis av ulike molekyler i vivo.
Introduction
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en kontinuerlig mobilnettet barriere dannet av astrocyttene, pericytes, nerveceller og endotelceller som skiller sentralnervesystemet (CNS) fra blod sirkulasjon1. Regulering av transport over BBB spiller en avgjørende rolle i å opprettholde hjernen homeostase og er formidlet av spesialiserte egenskaper av hjernen endotelceller (BECs). Tilstedeværelse av tett intercellulære veikryss mellom BECs og en lav basale rate av transcytosis begrense paracellular og transcellular transport av blodbårne molekyler, henholdsvis2. Transcytosis veien i BECs har nylig blitt brukt til å forbedre levering av terapeutiske store molekyler til hjernen3,4. Men er mekanismer for transcytosis over BBB ennå ikke fullt preget5,6.
Omfattende arbeid har blitt gjort i vitro dechiffrere cellulære og molekylære mekanismer regulere intracellulær transport over BECs7,8,9,10, 11, men slike systemer ikke klarer å recapitulate komplekse arkitekturen og fysiologi av nevrovaskulære (NVU). På den annen side, studier i vivo12,13 gir detaljert kvantitativ informasjon om transport priser over BBB men gir ikke innsikt i intracellulær mekanismer for transport. Derfor fortsatt undersøke mobilnettet og intracellular komponentene i NVU i vivo og ex vivo svært utfordrende14. Bare et begrenset antall teknikker er mottagelig for å analysere subcellular strukturer i cellene i NVU. De fleste studier bruker elektronmikroskop, men denne teknikken er begrenset av komplekse protokollene som kreves for riktig vev forberedelse og prøve håndtering. Derfor etablerte vi en metode basert på høy oppløsning AC confocal mikroskopi som vil lette behandlingen av hjernen prøver, analyse og kvantifiseringen subcellular rom i celler av NVU.
Her beskriver vi en protokoll som benytter musen hjernen frittflytende inndelinger for å utføre kvantitativ bildebehandling av BBB og NVU på mobilnettet og subcellular. Vi testet og godkjent flere antistoffer mot image og rekonstruere NVU i tre dimensjoner. Videre kan denne protokollen imaging maksimal optisk Diffraksjon-begrenset oppløsning organeller i hjerne blodkar. Sammen med bildeanalyse, kan denne protokollen brukes til å undersøke intracellulær transport av makromolekyler over BBB under forskjellige eksperimentelle forhold, for eksempel i musen sykdom modeller av neurodegeneration.
Protocol
etiske godkjenning for denne studien ble levert av den føderale mattrygghet og veterinær kontor i Sveits. Alle dyreforsøk ble gjennomført i streng overholdelse av den sveitsiske føderale vedtekter Dyrevern og velferd og etter reglene i Association for vurdering og akkreditering av laboratoriet Animal Care International (AAALAC).
1. generasjon av hjernen Free-floating deler
- for å sikre optimal utvalg kvalitet, utarbeide en fersk løsning av 2% paraformaldehyde (PFA) i fosfat buffer saltvann (PBS) ved perfusjonen.
FORSIKTIG: PFA er moderat giftig ved hudkontakt og et sannsynlig karsinogen. Bruk nitrilhansker håndtere PFA og forberede løsningen under kjemiske avtrekksvifte.- Forberede 60 mL PFA løsning per dyr.
- Bring PFA løsning ved å øke pH med 180-200 µL av en 5 M KOH løsning for hver 100 mL PBS og oppvarming løsningen 60 ° C.
Merk: NaOH bør ikke brukes som det negativt påvirker vev bevaring på fiksering. - La løsning avkjøles til romtemperatur og bringe pH til 7.4 bruker HCl. Filter løsning ved hjelp av filter papir (se Tabell av materialer).
- Utføre en hel musen fiksering via transcardial perfusjon som beskrevet tidligere 15 med noen modifikasjoner. Først rødme blodet fra blodkar bruker 20 mL PBS så perfuse med 40 mL 2% PFA.
- Fjerne hjernen fra skallen som beskrevet tidligere 15.
- Immerse en fersk 2% PFA-perfused hjernen i 20 mL 2% PFA 7 h ved 4 ° C i post fiksering.
Merk: Øke inkubasjon i PFA er ikke anbefalt som det kan hindre oppdagelsen av intracellulær strukturer. - Mye vaske hjernen med iskald PBS.
- Embed fast hjerner i agarose.
- Forberede en 3% agarose løsning i PBS bruker mikrobølgeovn for oppvarming. Forsiktig swirl løsningen å kjøle den ned men unngå herding.
- Tørke av overskytende av PBS rundt hjernen før nedsenking i den agarose løsningen i en plastbeholder. Rotere hjernen inne agarose å fjerne luftbobler. Tillate agarose å stivne ved å kjøle den på ice.
- Nøye fjerne agarose blokken fra plast beholderen og kuttet en kube rundt hjernen med et barberblad. Montere hjernen på en vibratome for prøveklemmene (se Tabell for materiale) med cyanoacrylate lim (se Tabell for materiale). Sette av tilstrekkelig tid for limet å størkne før du fortsetter med at snitteprosessen.
- Overføring hjernen prøveholderen til bufferbrettet vibratome fylt med PBS. Bruke vibratome til delen 100 µm hjernen skiver (sagittal eller koronale). Samle hjernen inndelinger i en 6-vel plate tidligere fylt med PBS.
- På etterbehandling hjernen snitting nøye fjerne PBS og erstatte med en 1:1 løsning PBS/glyserol.
- Lagre inndelinger i PBS/glyserol på -20 ° C.
2. Cellen eller Organelle merking av Immunofluorescence flekker
- nøye overføring en hjerne inndeling til en godt av en 24-vel plate tidligere fylt med 500 µL av PBS per brønn. Delen forblir i samme brønnen til slutten av prosedyren.
- Skyll delen to ganger med 500 µL av PBS for 5 min under mild agitasjon.
- Fjerne PBS og utføre samtidige blokkering og permeabilization av hjernen skiver.
- Forberede en blokkering og permeabilization løsning med 0,3% Triton-X og 10% esel serum i PBS.
Merk: Esel serum kan erstattes med geit serum tilsvarer de vert artene av bestemte sekundære antistoffer brukes. - Ruge seksjoner med 250 µL blokkering og permeabilization løsning for 1t ved romtemperatur under mild agitasjon.
- Forberede en blokkering og permeabilization løsning med 0,3% Triton-X og 10% esel serum i PBS.
- Fjerne løsningen og legge til en PBS løsning som inneholder 5% esel serum og primære antistoffer på en passende fortynning (f.eks, 1: 100 til 1:1, 000). Ruge over natten på 4 ° C mild agitasjon.
Merk: Se Tabell for materiale for en liste av antistoffer som vellykket merker de forskjellige celletyper av NVU med denne protokollen. Den optimale fortynning av primære antistoffer må bestemmes empirisk. Fortynne alle primære antistoffer i den samme løsningen for samtidige merking av ulike antigener. Alle primære antistoffer må heves i forskjellige arter. For å forbedre antistoff penetrasjon, prøver kan bli ruges i opptil 72 h på 4 ° C. - Fjern antistoff løsning vask delene og tre ganger i 10 min i PBS under mild agitasjon ved romtemperatur. Fjern PBS og legge 250 µL PBS løsning som inneholder 5% esel serum og riktig artsspesifikke fluorescently merket sekundære antistoffer. Inkuber inndelinger ved romtemperatur 1t under mild agitasjon.
- Se Tabellen for materiale for en liste over sekundære antistoffer brukes med denne protokollen.
- Fjerne antistoff løsning og vask avsnittene tre ganger for 10 min i PBS under mild agitasjon ved romtemperatur.
- Fjerne PBS og legge til 250 µL av 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning med en siste konsentrasjon av 1 µg/mL. Inkuber inndelinger ved romtemperatur i 10 minutter under mild agitasjon. Fjerne DAPI løsning og vask deler 3 ganger i 5 min med PBS.
- Montere delen hjernen på bånd mikroskopi lysbilder (f.eks histo-bond glass lysbilder). Forsiktig fjerne overflødig PBS rundt delen på lysbildet. Legg en dråpe montering medium (se tabell for materiale) på toppen av delen hjernen og nøye dekke det med en 0,17 mm (nr 1.5) Borosilikatglass dekkglassvæske.
- Lagre prøver på 4 ° C beskyttet fra lys til å utføre image vinningen.
3. Høyoppløselig AC Confocal Imaging av blod - hjerne barrieren
- utføre bildeopptak med en egnet laserskanning AC confocal mikroskop (se Tabell for materiale) med laser linjer på 405, 488, 561 og 633 nm for magnetisering av fluorophores i blå, grønn, oransje og røde områder av lysspekteret. For bildeopptak, kan du bruke en 63 X oljeobjektiv med en numerisk blenderåpning 1.4.
- I Kjøp-menyen i programvaren som styrer mikroskopet, angi bildet oppkjøpet parametere. I rullegardinmenyen i ‘ bildestørrelse ’, Velg verdien 1024 x 1024 piksler. Endre pikselstørrelsen til en verdi mellom 200 og 300 nm ved å justere verdien for den ‘ Zoom ’ menyen ”
Merk: For analyse av intracellulær strukturer, redusere pikselstørrelsen 75 nm. Dette bildet størrelsesinnstilling vesentlig øker oppkjøpet tiden og kan bli redusert til 512 x 512 bildepunkter redusere tiden det oppkjøpet av imaging en mindre synsfelt. - i den ' oppkjøpet hastighet ' rullegardinmenyen, Velg en verdi av 400 Hz, dvs 400 linjer per sekund. I den ' systeminnstillinger & #39; menyen på ' Pikseldybde ' rullegardinmenyen, og endre verdien til 12 bit.
- i mikroskop-programmet i den ' oppkjøpet ' kategorien veksle alternativet for sekvensiell ramme oppkjøpet. Angi optisk snittykkelsen til en verdi mellom 0,75 og 1 µm for hver kanal ved å endre verdien i den ' Pinhole ' menyen.
- i kontrollpanelet for fluorescerende eksitasjon aktivere laser pålagt å opphisse optimalt fluorophores i utvalget, for eksempel en 488 nm laser linje for en grønn-emitting fluorophore.
Merk: Bruk en fluorophore spectra seer (se Tabell for materiale) velge tilstrekkelig eksitasjon laser. - i panelet fluorescerende oppdagelsen, flytter du glidebryteren for å velge bølgelengdene som skal måles i hver enkelt kanal, for eksempel mellom 510 og 550 nm for en grønn-emitting fluorophore.
Merk: Bruk en fluorophore spectra seer (se Tabell for materiale) velge tilstrekkelig oppdagelsen bølgelengdene. - Legge en dråpe neddyppingsolje med en brytningsindeks av 1.52 på dekkglassvæske med hjernen delen tilsvarer brytningsindeks glass dekkglassvæske og mål. Plasser prøven i mikroskopet og slår på epifluorescent lampen å visualisere prøven ved hjelp av mikroskop kikkerten.
- Bruke knappene på mikroskopstativet, endre filteret hjulet til å velge et filter som er nødvendige for å visualisere DAPI-farget kjerner. Bruke grov fokus for å bringe signalet fra DAPI-farget kjerner i fokus.
- Bruke knappene på mikroskopstativet, endre filtre å visualisere signalet fra vaskulær markører (for eksempel CollagenIV eller CD31) og senter synsfelt på en individuell kapillær segment.
- Trykk for å starte den live skannemodus. Under skanning justere gevinst og laser intensiteten for hver kanal å maksimere dynamikkområdet bilder og unngå pixel metning.
Merk: Bruk en look-up table hvilke merker mettet piksler for å vurdere visuelt over metning. For å unngå signalet over metning, Juster innstillingene med utvalget forventes å ha det høyeste fluorescerende signalet. - Angir verdien for linjen snitt 2.
Merk: Når du bruker oppkjøpet raskere, øke denne verdien for å redusere støy. - Etablere begynner og slutter deler for å utføre optisk z-stabler som dekker hele volumet av kapillær. Bruk en trinn størrelse på 0,45 µm.
Merk: Hvis bildene vil bli brukt for påfølgende kvantifisering, beholde samme oppkjøpet innstillinger for hele datasettet. - For kvantifisering, erverve 10 til 20 z-stabler per seksjon fra minst tre ulike mus for statistiske sammenligninger.
Merk: Skaffe det fullstendige datasettet i samme økt å redusere variasjon som oppstår eksempel bleking og laser intensitet svingninger.
4. Bilde prosessering og 3D rekonstruksjon av nevrovaskulære
- (valgfritt) for å øke aksial oppløsningen for ervervet z-stabler, utfører deconvolution av datasettet bilde ved hjelp av riktig programvare (se tabell for materiale ).
- i deconvolution programvaren, endre innstillingene til å utføre " Blind " deconvolution, (dvs. en adaptiv spilltilbud funksjonen).
- i deconvolution for, Aktiver/Deaktiver alternativet for fjerning av bakgrunnen; dette alternativet vil finne den minste intensitetsverdien i bildestakk og trekke det fra intensitetsverdiene fra alle bildepunktene i bildet.
- i deconvolution for, slå av alternativene for rescaling intensitet og resizing til 16 bit dybden; alternativene vil holde den opprinnelige intensitetsverdiene og dynamisk område bilder.
- i menyen for ' brytningsindeks ', angir du verdien til 1.52. I den ' sett bølgelengde ' menyen, Velg utslipp verdier for hver kanal i bildet. Velg for eksempel 520 for en grønn-emitting fluorophore.
- Åpne bildet datasettet bruker programvare for visualisering og analyse av 3-dimensjonale datasett (se Tabell for materiale). Trykk i bildet analyseprogramvare, den " overgå " for å vise 3D-volumet av kapillærer.
- i bildet analyse programvare presse den " Legg til ny overflate " for å segmentere kapillær overflaten. Bruk nederste pilene for å flytte mellom trinnene i overflaten opprettelsesveiviseren.
- i den ' opprette ' kategorien, angi kildekanalen til kanalen med kapillær markør, for eksempel CollagenIV, og angi areal detaljer til en verdi på 0,5 µm.
Merk: Det siste alternativet gjelder et variabelt filter bildet og bestemmer jevne overflaten. - i den ' opprette ' kategorien Vis/Skjul alternativet for absolutt intensitet terskelen.
Merk: Dette alternativet oppretter en overflate ved å generere en maske basert på absolutte intensiteten av den valgte kanalen i bildet. - På neste trinn i veiviseren for oppretting av overflaten justere lavere intensitet terskelen for overflaten ved å flytte skyvevinduet over intensitet histogrammet til gjengitte masken dekker av hele kapillær i bildet. Bestemme verdiområdet for denne parameteren empirisk for hvert datasett.
- På det siste trinnet i veiviseren for oppretting av overflaten, klikker du på rullegardinmenyen under " filtertype " og velg alternativet ' nummeret av Voxels '. Angi det minste antallet voxels til en verdi mellom 1.0e5 til 2.0e5.
Merk: Dette alternativet vil ekskludere overflater med et lite antall voxels, for eksempel små segmenter av capillaries på kant av rammen. - Ferdig overflate opprettelsesveiviseren og lagre parameterne etableringen " husker parametere " i kategorien gjenoppbygging overflaten menyen.
- Gjenta hele imaging datasett ved å laste parameteren settet brukes for det første bildet. Justere parametere for intensitet, terskel og minimum antall voxels for hvert bilde kontoen for forskjeller i bakgrunnen intensitet og kapillær morfologi, henholdsvis.
- i den ' opprette ' kategorien, angi kildekanalen til kanalen med kapillær markør, for eksempel CollagenIV, og angi areal detaljer til en verdi på 0,5 µm.
- å segmentere intracellulær vesicula strukturer (f.eks, immunglobulin-fylt endosomes), oppretter en ny kanal som bare inneholder fluorescerende signalet fra innenfor av kapillær.
Merk: Denne prosessen vil definere et område av interesse ved å opprette en maske med kapillær overflaten opprettet i trinn 4.3- Velg den ' Rediger '-menyen i den ' kapillær overflaten ' panel. Under ' maske egenskaper ', klikk " maske alle ". Velg kanalen som inneholder intracellulær vesicle signal som den ' kildekanal ' og slå alternativet " Dupliser kanal før maske ".
- i den ' maske innstillinger ' kolonne, Velg " konstant inne/utenfor " og " satt voxels utenfor overflaten: " og sette verdien til 0,00.
Merk: Denne forarbeide ville opprette en ekstra kanal i bildet hvor alle voxels utenfor kapillær masken har en intensitetsverdien 0. Kvantifisere hendelser utenfor av kapillær (dvs. i hjernen parenchyma), Velg " angi voxels innsiden overflaten: " og sette verdien til 0,00. - å segmentere vesicula strukturer, trykk for å starte det " legge til nye flekker " veiviseren. Bruk nederste pilene for å flytte mellom trinnene i overflaten opprettelsesveiviseren.
- i kategorien Opprett bruke rullegardinmenyen under " kildekanal " å velge intracellulær maskert stasjon opprettet i trinn 4.4.4.
- i kategorien Opprett under den " Spot oppdagelsen " seksjon, angi anslått XY diameteren til en verdi mellom 0,5 og 1 µm, avhengig av den gjennomsnittlige størrelsen på blemmer observert i eksperimentet. Dette alternativet angir den minste størrelsen som vil bli oppdaget av segmentering algoritmen.
- i kategorien Opprett under den " Spot oppdagelsen " delen Aktiver/Deaktiver alternativet for " bakgrunn subtraksjon ".
Merk: Dette alternativet vil jevne bildet med en Gaussian filter av 0,75 spot radius (fra verdien som ble valgt i trinn 4.4.7) og deretter trekke intensiteten av originalbildet Gaussian filtreres 0,88 spot radius. - i den ' opprette ' kategorien, trykk dropdown menyen under ' filtertype ' og velg " kvalitet ". Merk at dette vil segmentere bildet ved å bruke terskler basert på intensiteten i sentrum av flekker. Justere lavere intensitet terskelen ved å flytte skyvevinduet over den ' kvalitet ' histogrammet til flertallet av identifiserbare blemmer merkes.
Merk: Verdiområdet for denne parameteren må bestemmes empirisk for hvert datasett. - Ferdig spot opprettelsesveiviseren og lagrer etableringen parameterne ved å trykke knappen " husker parametere " i kategorien gjenoppbygging overflaten menyen.
- Gjenta hele imaging datasett ved å laste parameteren settet brukes for det første bildet. Justere parameterne for den ' kvalitet intensitet terskelen ' for hvert bilde hensyn til forskjeller i bakgrunnen intensitet.
5. Kvantifisering av intracellulær Transport på BBB
- kvantifisere volumet (i µm 3) og område (i µm 2) av kapillær segmentet. I analyseprogramvare, tilgang til statistikk panel av vaskulær overflaten opprettet i trinn 4.3. Velg den ' detaljert ' kategorien og Bruk rullegardinmenyen til å velge " alle verdier " å finne verdiene for volum og området.
- Kvantifisere antall blemmer i kapillær segmentet. I analyseprogramvare, tilgang til statistikk panelet av stedene som er opprettet i trinn 4.4. Velg den ' samlede ' kategorien for å finne verdien for antall flekker i bildet.
- Til å beregne antall blemmer per kapillær volum, for hvert bilde normalisere antall flekker av volumet beregnes i trinn 5.1. Multipliserer verdien med 1000 for å få antall blemmer per 1000 µm 3 av kapillær.
- å kvantifisere totale intensiteten i av kapillær opprette en ny overflate som dekker hele bildet følgende instruksjonene beskrevet i trinnene 4.3 med følgende modifikasjoner. Velg kanalen som inneholder relevant signal (f.eks, mIgG) som kilde og sette salgsverdi av detaljnivået areal å 5 µm. Opprette en overflate som dekker hele bildet, sette verdien av lavere intensitet terskelen til 0.
- Analyseprogramvare, tilgang statistikk panel av overflaten opprettet i trinn 5.4. Velg den " detaljert " kategorien og Bruk rullegardinmenyen til å velge " alle verdier ". Registrerer verdiene for ' intensitet summen ' for kanaler steder. Denne parameteren tilsvarer summen av personlige intensitetsverdiene over alle bildepunkter.
Merk: For en intracellulær signal, dette tilsvarer den dupliserte kanalen med voxels utenfor overflaten satt til 0,0. For et signal i hjernen parenchyma, dette tilsvarer den dupliserte kanalen med voxels inne overflate satt til 0,0. - Til å beregne fluorescens intensiteten per kapillær volum, for hvert bilde normalisere intensiteten av volumet beregnes i trinn 5.1. Multipliserer verdien med 1000 å få fluorescens intensitetsverdien per 1000 µm 3 av kapillær.
Merk: For fluorescerende signaler i hjernen parenchyma, normalisere verdiene av total bilde volumet minus kapillær volumet og multiplisere med 1000 å få totalt intensiteten per 1000 µm 3 av hjernen parenchyma. - Gjenta dette for hele datasettet og bruke riktig programvare for å utføre statistisk analyse av dataene.
Representative Results
Som eksemplene bilder Hentet fra protokollen beskrevet her, musen hjernen deler var farget med antistoffer gjenkjenne ulike komponenter i NVU inkludert kjelleren membran, astrocyttene, pericytes, og endothelial celler (se Tabell for materiale for spesifikke antistoffer brukt) (figur 1A, D, og E). På denne oppløsningen er det mulig å skille mellom individuelle astrocytic prosesser og slutten-føtter som er i direkte kontakt med kapillærer.
For å markere egnetheten av denne protokollen for å oppdage intracellulær strukturer, var hjernen inndelinger fra dyr perifert injisert med menneskelig anti-Tau mAb86 antistoff16 farget med en fluorescently merket anti-menneskelige antistoff ( Figur 1B). mAb86 er kjent for å spesifikt mål neurons uttrykke en patologisk form for Tau16. Ved hjelp av protokollen som er beskrevet her, fant mAb86 med Diffraksjon-begrenset oppløsning i individuelle vesicula strukturer i neurons (figur 1ABC). I tillegg ble endogene musen IgG oppdaget i intracellulær strukturer i endotelceller, men ikke i pericytes (figur 1D-E og figur 2).
Oppkjøpet av høyoppløselige AC confocal z-stabler av hjerne blodkar gir tredimensjonale segmentering av kapillærene og intracellulær blemmer på BBB. Figur 2 viser et eksempel på gjengivelse og segmentere en kapillær merket med CollagenIV og mus IgG-positive intracellulær blemmer. Ved kvantifisere full dataset segmentert bilder, for eksempel ved å måle antall blemmer per kapillær volum, er det mulig å studere endringer i intracellulær transport prosesser under ulike forhold. Figur 3 ABC viser forskjeller i mIgG vesicle tall og fluorescens intensitet tilsvarer mIgG på hjernen parenchyma, henholdsvis på pericyte uttømming i pdgf-bret/ret musemodell som tidligere rapporterte 17. samme tilnærming ble også nylig brukt til å analysere endringer i intracellulær transport på BBB mellom forskjellige hjernen regioner18.
Figur 1: Opplysningsarbeid flere celletyper og subcellular strukturer av nevrovaskulære enhet Representant bilder av nevrovaskulære enheten (A og D) og intracellulær blemmer i neurons (B) eller endotelceller (E) med denne protokollen. Maksimale intensitet projeksjon bildet i A (øverst) viser fordelingen av GFAP-positive astrocyttene (rød) rundt kapillærene merket av CollagenIV (grønn). Piler peker til individuelle astrocytic prosesser. Skala bar = 20 µm. På denne oppløsningen er personlige astrocytter prosessene og slutten-fot godt synlig, som vist i det forstørrede bildet av regionen eske (nederst). Pilspisser pek astrocytic slutten-fot. Skala bar = 10 µm. Viser bildet i B Oppsamling av et perifert-injisert antistoff, mAb86 (grønn), i en hippocampus Nevron. Pilspisser pek personlige mAb86-positive blemmer. Skala bar = 10 µm. Grafen i C viser linje profil intensiteten av en enkelt vesicle. Vesicle størrelsen ble anslått fra full bredde på halv maksimalt en Gaussian tilpasning (svart heltrukket linje) av intensitet kurven (grønn linje og sirkler). Bildene i D viser en tredimensjonal rekonstruksjon av en endothelial celle (grønn) omgitt av en pericyte (rød) i den basale lamina (CollagenIV, grå). Den nedre paneler Vis personlige fluorescens kanalene. Skala bar = 10 µm. Bildene i E vise lokalisering av mIgG (rød) i intracellulær blemmer i endotelceller (venstre panelet, CD31 i grønt), men ikke i pericytes (høyre panel, CD13 i grønt). Alle bilder, DAPI farget kjerner vises i blått. Skala bar = 5 µm. paneler D og E er endret fra referanse17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Tredimensjonal gjengivelse av kapillærene og intracellulær blemmer på blod - hjerne barrieren. Med protokollen beskrevet, kjøpt AC confocal oppløsning av CollagenIV-positive kapillærene (grønn) og mus IgG intracellulær blemmer (rød) ble (A). Informasjonsvinduet viser en enkelt optisk del med tverrsnitt. Pilene peker til personlige mIgG-positive blemmer i hjernen endotelceller. Panelet på høyre viser 3D rekonstruksjon av full z-stabel ved hjelp bilde prosessering programvare (se Tabell for materiale). Kapillær volumet (B) og personlige blemmer (C) ble gjort i tre dimensjoner og kvantifisert bruke bildebehandling (se Tabell for materiale). Alle bilder, DAPI farget kjerner vises i blått. Skalere barer = 5 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Kvantifisering av mIgG intracellulær lokalisering på BBB. Representant bilder å vise (A) tredimensjonale rekonstruksjoner av blodkar (merket med collagenIV, grønn) og distribusjon av mIgG (rød) C57BL/6 mus og pdgf-bret/ret pericyte utarmet mus tidligere beskrevet i19. Skalere barer = 10 µm. Bildene i B Vis segmentering av intracellulær blemmer i CollagenIV masken. The grafen i B viser kvantifisering og sammenligning av mIgG vesicle per volum av capillary. Hvert punkt representerer målinger for enkeltstående kapillær segmenter. Den heltrukne linjen viser gjennomsnittet og feilfeltene representerer standardavviket for dataene. Bildene i C viser den mIgG fluorescens signal utenfor CollagenIV masken. Tilsvarende viser grafen i C kvantifisering og sammenligning av mIgG fluorescens intensiteten i hjernen parenchyma mellom C57BL/6 mus og pdgf-bret/ret pericyte utarmet mus. Fluorescens intensitet enheter var normalisert av gjennomsnittet mIgG parenchyma intensiteten målt i alle C57BL/6 mus. Dette tallet er endret fra referanse17. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Protokollen skissert ovenfor beskriver utarbeidelse av hjernen frittflytende deler, immunofluorescent flekker, bildeopptak og analyseparametrene for høy oppløsning mikroskopi av BBB. Denne metoden er brukt nylig å undersøke lokaliseringen av antistoff levering plattformer3, transport av endogene IgG over de BBB17og heterogenitet av BBB på pericyte tap18. Fremgangsmåten i protokollen kan endres for å tilpasse bestemte målet av eksperimentet. Først forenkler bruken av tykk (100 µm) deler deres behandling under immunostai- og montering prosedyrene. Det kan også for 3D rekonstruksjon av capillary nettverket, nevrovaskulære enheten, og for generering av kapillær og NVU tverrsnitt. Men penetrasjon av antistoffer i delene vev kan variere og noen antistoff flekker kan begrenses til overfladiske laget av vev nær dekkglassvæske. Protokollen kan endres ved å øke konsentrasjonen av vaskemiddel i permeabilization trinn og/eller lengden på permeabilization skritt for å forbedre antistoff gjennomtrengning i vevet. Andre bli bildekvaliteten skadet når du prøver å hente bilder dypere i vevet (vanligvis 20 til 30 µm under overflaten) på grunn av lysspredning samt optisk avvik fra brytningsindeks feil. Du løser dette problemet, kan nye metoder for vev clearing og aktive antistoff penetrasjon20 kombineres med denne protokollen for bildet større mengder vev. Tredje utføres deconvolution etter bildeopptak å forbedre aksial oppløsningen til bildet. Valg av blind deconvolution algoritmen som brukes i denne protokollen var basert på (i) dens lette av bruk, ingen før beregning av spilltilbud funksjonen er nødvendig, (ii) dens robustness for å forbedre bildet kvalitet21, og (iii) mangel på gjenstander på mIgG intracellulær strukturer etter implementering. Avhengig av intracellulær strukturene visualisert i utvalget, kan andre deconvolution algoritmer resultere i høyere bildekvalitet. De følgende referanser21,22 gir en omfattende diskusjon om fordeler og begrensninger av flere algoritmer for bildet deconvolution. Til slutt, bruk av en bildet analyse programvarepakke tillatt oppdeling av kapillærene og intracellulær strukturer i tre dimensjoner. Tydelig bildeanalyser er ikke begrenset til programvaren som beskrives i protokollen og alternative pakker, for eksempel de i referanse23, kan brukes til segmentet bilder. Hensiktsmessigheten av ulik programvare for analyse av intracellulær strukturer på tvers av BBB bør være bekreftet empirisk ved å vurdere nøyaktigheten av bildesegmentering.
Siden denne metoden er basert på faste prøver, gir den ikke direkte informasjon om dynamikken i transcytosis over BBB. Men kan det kombineres med tid-retters eksperimenter24, for eksempel ved intravenøst injisering molekylet rundt og måle opphopning i BECs på ulike tidspunkt etter injeksjon, å rekonstruere the kinetics av intracellulær transport. Fordelen med denne tilnærmingen er at det tillater for analyse av dypt hjernen regioner, som vist i18, som er foreløpig utilgjengelig for intravital live bildebehandling tilnærminger. En kritisk trinn i protokollen er nøye overvåking av vev fiksering. Fiksering med 4% PFA dramatisk reduserer immunogenisitet intracellulær organeller og endogene eller perifert administrert immunglobuliner17 (figur 1B). En begrensning av denne protokollen er dens krav av høy kvalitet antistoffer (dvs.lav uspesifisert flekker, lav kryssreaktivitet) egnet for immunofluorescence. Forutsatt at det finnes slike reagenser, kan metoden brukes for å undersøke den intracellulære lokaliseringen av eventuelle protein av interesse. For eksempel ble protokollen brukt til å identifisere lysosomer i hjernen endotelceller17. Det bør også bemerkes at siden denne protokollen er basert på AC confocal mikroskopi, lateral oppløsningen er begrenset av Diffraksjon og kan ikke løse strukturer mindre enn ca 175 til 250 nm (figur 2).
Tidligere studier har utført detaljert analyse av mobilnettet sammensetningen av nevrovaskulære bruker AC confocal mikroskopi25,26. Imidlertid avhengig undersøke intracellulær transport på BBB av bruken av overføring elektronmikroskop19,27,28. Mens denne metoden tilbyr den høyeste lateral oppløsningen av intracellulær strukturer, forblir elektronmikroskop en utfordrende teknikk med lav overføringshastighet. Videre er antall forskjellige molekylære mål som kan visualiseres EM svært begrenset. Denne protokollen tilbyr et tilgjengelig alternativ for å undersøke intracellulær transport på BBB. Den komplette prosedyren, fra hjernen samling bildet analyse, kan utføres i 5-6 dager. Hvis egnet antistoffer er tilgjengelige, kan immunofluorescence samtidige påvisning av flere cellen typer/molekyler innenfor samme prøven. Videre kan denne protokollen kombineres med super-oppløsning mikroskopi teknikker for å overvinne begrensningene i romlig oppløsning29. Samlet kan protokoll beskrevet ovenfor kvantifisering av endringer i den intracellulære lokaliseringen av proteiner av interesse i nevrovaskulære enheten. Sin søknad om forskjellige genetisk eller farmakologiske forstyrrelser kan undersøke intracellulær struktur og transport funksjonene av BBB i vivo.
Disclosures
Forfatterne er under lønnet arbeid av Roche.
Acknowledgments
R.V. arbeid ble støttet av Roche doc. (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
