Summary
Her præsenterer vi en mikroskopi-baseret protokol for høj opløsning imaging og en tre-dimensionel rekonstruktion af musen neurovaskulære enhed og blod - hjerne barrieren ved hjælp af hjernen frit svævende sektioner. Denne metode giver mulighed for visualisering, analyse og kvantificering af intracellulære organeller på BBB.
Abstract
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en dynamisk flercellede interface, der regulerer transporten af molekyler mellem omsætning og hjernen. Transcytosis på tværs af BBB regulerer levering af hormoner, metabolitter og terapeutiske antistoffer til hjernen parenkym. Vi præsenterer her, en protokol, der kombinerer immunfluorescens af frit svævende sektioner med laser scanning Konfokal mikroskopi og billedanalyse til at visualisere subcellulært organeller i endothelial celler på BBB. Kombinere dette datasæt med 3D billede analyse software giver mulighed for den semi-automatiske segmentering og kvantificering med kapillar volumen og areal, samt antallet og intensiteten af intracellulære organeller på BBB. Påvisning af musen endogene immunoglobulin (IgG) i intracellulære vesikler og deres kvantificering på BBB bruges til at illustrere metoden. Denne protokol kan potentielt anvendes til undersøgelse af de mekanismer, der styrer BBB transcytosis af forskellige molekyler in vivo.
Introduction
Blod - hjerne barrieren (BBB) er en kontinuerlig cellulære barriere dannet af astrocytter, pericytes, neuroner og endotelceller, der adskiller det centrale nervesystem (CNS) fra blod omsætning1. Regulering af transport på tværs af BBB spiller en afgørende rolle i at opretholde hjernen homøostase og er medieret af specialiserede egenskaber i endothelial hjerneceller (BECs). Tilstedeværelsen af stramme intercellulære kryds mellem BECs og en lav basal transcytosis grænse for paracellular og transcellular transport af blodbårne molekyler, henholdsvis2. For nylig, transcytosis pathway i BECs har været udnyttes til at øge levering af terapeutiske store molekyler til hjernen3,4. Mekanismerne i transcytosis på tværs af BBB har dog endnu ikke været fuldt karakteriseret5,6.
Omfattende arbejde er blevet gjort i vitro for at dechifrere de cellulære og molekylære mekanismer, der regulerer intracellulær transport på tværs af BECs7,8,9,10, 11, men sådanne systemer undlader at sammenfatte de komplekse arkitektur og fysiologi af neurovaskulære enhed (NVU). På den anden side undersøgelser i vivo12,13 give detaljerede kvantitative oplysninger om transportpriser på tværs af BBB men give ikke indsigt i de intracellulære mekanismer af transport. Derfor forbliver undersøge de cellulære og intracellulære komponenter af NVU i vivo og ex vivo meget udfordrende14. Kun et begrænset antal teknikker er indstillet til at analysere subcellulært strukturer i cellerne i NVU. De fleste undersøgelser bruger elektronmikroskopi, men denne teknik er begrænset af protokollerne komplekse kræves for korrekt væv forberedelse og prøve håndtering. Derfor oprettede vi en metode baseret på høj opløsning Konfokal mikroskopi, der ville lette behandlingen af hjernen prøver, analysen og kvantificering af subcellulært rum inden for celler af NVU.
Her, beskriver vi en protokol, der udnytter mus hjernen frit svævende sektioner for at udføre kvantitative billeddannelse af BBB og NVU på cellulært og subcellulært niveau. Vi testet og godkendt en række antistoffer mod billede og rekonstruere NVU i tre dimensioner. Derudover tillader denne protokol imaging på maksimal optisk diffraktion-begrænset opløsning organeller i hjernen kapillærerne. Sammen med billedanalyse, kan denne protokol bruges til at undersøge intracellulær transport af makromolekyler på tværs af BBB under forskellige forsøgsbetingelser, f.eks i mus sygdomsmodeller af neurodegeneration.
Protocol
etisk godkendelse for denne undersøgelse blev leveret af føderale fødevaresikkerhed og veterinære kontor i Schweiz. Alle dyreforsøg blev gennemført i nøje overholdelse af den schweiziske føderale bekendtgørelse om dyrebeskyttelse og dyrevelfærd samt efter reglerne i foreningen for evaluering og akkreditering af Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. generation af hjernen Free-floating sektioner
- for at sikre optimal prøve kvalitet, forberede en frisk løsning af 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat buffer saltvand (PBS) på dagen for perfusion.
Forsigtig: PFA er moderat giftigt ved hudkontakt og en sandsynlig kræftfremkaldende. Bruge nitrilhandsker til at håndtere PFA og forberede løsningen under en kemisk stinkskab.- Forberede 60 mL af PFA løsning storkreatur.
- Bring PFA i løsning ved at øge pH med 180-200 µL af en 5 M KOH løsning for hver 100 mL PBS og varme løsning op til 60 ° C.
Bemærk: NaOH bør ikke anvendes, da det negativt påvirker væv bevarelse efter fiksering. - Lad løsning køle ned til stuetemperatur og bringe pH ned til 7.4 bruger HCl. Filter løsning ved hjælp af filtrerpapir (Se Tabel of Materials).
- Udføre en hel mus fiksering via transcardial perfusion som tidligere beskrevet 15 med nogle ændringer. Første skylle blodet fra Vaskulaturen ved hjælp af 20 mL PBS så perfuse med 40 mL 2% PFA.
- Fjerne hjernen fra kraniet som tidligere beskrevet 15.
- Fordyb en frisk 2% PFA-perfunderet hjernen i 20 mL 2% PFA i 7 timer ved 4 ° C for efter fiksering.
Bemærk: Øge inkubation i PFA er ikke anbefales, da det kan forhindre påvisning af intracellulære strukturer. - Grundigt vaske hjernen med iskold PBS.
- Embed fast hjerner i agarosegelelektroforese.
- Forbered en 3% Agarosen løsning i PBS ved hjælp af en mikrobølgeovn til opvarmning. Forsigtigt swirl løsning for at køle det ned men undgå solidificering.
- Tørre ud overskydende af PBS omkring hjernen før fordybelse i Agarosen løsning i en plastikbeholder. Rotere hjernen inde Agarosen at fjerne luftbobler. Tillad Agarosen størkne ved at køle det ned på ice.
- Omhyggeligt fjerne Agarosen blok fra den plastikbeholder og skære en kube omkring hjernen ved hjælp af et barberblad. Montere hjernen på en vibratome præparatholderen (Se Tabel af materialer) ved hjælp af ren lim (Se Tabel af materialer). Tillad tilstrækkelig tid til lim til at størkne inden du fortsætter med at skære.
- Overførsel hjernen i præparatholderen til pufferkar vibratome fyldt med PBS. Brug vibratome punkt 100 µm hjernen skiver (sagittal eller koronale). Indsamle hjernen sektioner i en 6-godt plade tidligere fyldt med PBS.
- Ved efterbehandling hjernen skæring, forsigtigt fjerne PBS og erstatte med en 1:1 løsning af PBS/glycerol.
- Opbevar sektioner i PBS/glycerol ved -20 ° C.
2. Celle eller Organelle mærkning ved immunfluorescens farvning
- omhyggeligt overførsel en hjerne sektion i en brønd på en 24-godt plade tidligere fyldt med 500 µL af PBS pr. brønd. Afsnittet vil forblive i den samme godt indtil slutningen af proceduren.
- Skylles afsnit to gange med 500 µL af PBS i 5 min under blid agitation.
- Fjerne PBS og udføre samtidige blokering og permeabilization af hjernen skiver.
- Forbered en blokering og permeabilization løsning med 0,3% Triton-X og 10% æsel serum i PBS.
Bemærk: Æsel serum kan erstattes med ged serum til at matche vært arten af de specifikke sekundære antistoffer bruges. - Ruger sektioner med 250 µL af blokering og permeabilization løsning til 1 time ved stuetemperatur under blid agitation.
- Forbered en blokering og permeabilization løsning med 0,3% Triton-X og 10% æsel serum i PBS.
- Fjerne løsningen og tilføje en PBS løsning som indeholder 5% æsel serum og den primære antistof på en passende fortynding (fx, 1: 100 til 1:1, 000). Der inkuberes natten over ved 4 ° C under blid agitation.
Bemærk: Se Tabel af materialer til en liste af antistoffer, der med held mærker de forskellige celletyper i NVU med denne protokol. Den optimale fortynding af primære antistoffer skal bestemmes empirisk. For samtidige mærkning af forskellige antigener, fortyndes alle primære antistoffer i den samme løsning. Alle primære antistoffer skal hæves i forskellige arter. For at forbedre antistof penetration, kan prøverne inkuberes i op til 72 timer ved 4 ° C. - Fjern antistof løsning og vask sektioner tre gange i 10 min i PBS under blid agitation ved stuetemperatur. Fjern PBS og tilsæt 250 µL PBS løsning indeholdende 5% æsel serum og den passende artsspecifik fluorescently mærket sekundær antistof. Inkuber sektioner ved stuetemperatur i 1 time under blid agitation.
- Se Tabel af materialer for en liste over de sekundære antistoffer bruges sammen med denne protokol.
- Fjerne antistof løsning og vask afsnit tre gange i 10 min i PBS under blid agitation ved stuetemperatur.
- Fjerne PBS og tilføje 250 µL af en 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) løsning med en endelig koncentration på 1 µg/mL. Inkuber sektioner ved stuetemperatur i 10 minutter under blid agitation. Fjerne DAPI løsning og vask afsnit 3 gange for 5 min med PBS.
- Montere afsnittet hjernen på limning mikroskopi dias (fx Histò-bond glas lysbilleder). Fjern forsigtigt overskydende PBS omkring sektionen på diaset. Tilføj en dråbe af montering medium (se tabel af materialer) på toppen af afsnittet hjernen og omhyggeligt dække det med en 0,17 mm (No. 1,5) borsilikatglas coverslip.
- Opbevare prøver ved 4 ° C beskyttet mod lys indtil udfører billede erhvervelse.
3. Høj opløsning Konfokal Imaging af blod - hjerne barrieren
- udføre image erhvervelse med en egnet laser-scanning Konfokal mikroskop (Se Tabel af materialer) med laser linjer på 405, 488, 561 og 633 nm for excitation af fluorophores i de blå, grøn, orange og rød regioner af det lysspektrum. For image erhvervelse, bruge en 63 X olie mål med en numerisk blænde af 1.4.
- i erhvervelse menu af den software, der styrer mikroskop, indstille billedet erhvervelse parametre. I drop-down menuen af ‘ Image size ’, Vælg en værdi på 1024 x 1024 pixels. Ændre pixelstørrelse til en værdi mellem 200 og 300 nm ved at justere værdien af den ‘ Zoom ’ menuen. ”
Bemærk: analyse af intracellulære strukturer, reducere pixelstørrelse til 75 nm. Dette billede størrelsesindstilling væsentligt øger erhvervelse tid og kan reduceres til 512 x 512 pixel til at reducere tid, erhvervelse af imaging et mindre synsfelt. - i den ' erhvervelse hastighed ' drop-down menuen, Vælg en værdi af 400 Hz, dvs. 400 linjer pr. sekund. I den ' systemer indstillinger & #39; menuen, Vælg den ' pixeldybde ' rullemenuen, og ændre værdien til 12 bit.
- i mikroskop software, inden for den ' erhvervelse ' tab, Skift indstillingen for sekventielle ramme erhvervelse. Angiv optisk snittykkelsen til en værdi mellem 0,75 og 1 µm for hver kanal ved at ændre værdien i den ' Pinhole ' menuen.
- i panelet for fluorescerende excitation, aktivere laser skal optimalt excite fluorophores i stikprøven, for eksempel en 488 nm laser linje for en grøn-udsender fluorophore.
Bemærk: Brug en fluorophore spektre viewer (Se Tabel af materialer) at vælge passende excitation laser. - i panelet for fluorescerende påvisning, Flyt skyderen for at vælge de bølgelængder, der måles i hver kanal, for eksempel mellem 510 og 550 nm for en grøn-udsender fluorophore.
Bemærk: Brug en fluorophore spektre viewer (Se Tabel af materialer) at vælge passende påvisning bølgelængder. - Tilsættes en dråbe immersionsolie med et brydningsindeks på 1,52 på toppen af coverslip med afsnittet hjernen til at matche brydningsindekset af glas coverslip og mål. Prøven anbringes i mikroskopet og drej på epifluorescerende lampe til at visualisere prøven ved hjælp af mikroskop kikkert.
- Ved hjælp af knapperne på mikroskopholderen, ændre filteret hjulet til at vælge en passende til at visualisere DAPI-farvede kerner filter. Brug grov fokus til at bringe signalet fra DAPI-farvede kerner i fokus.
- Ved hjælp af knapperne på mikroskopholderen, ændre filtre til at visualisere signalet fra vaskulære markører (for eksempel CollagenIV eller CD31) og centrum af synsfeltet på en individuel kapillær segment.
- Tryk på knappen for at starte live scan-tilstand. Under scanningen justere gevinst og laser intensiteten for hver kanal at maksimere det dynamiske område af billederne og undgå pixel mætning.
Bemærk: Brug en look-up tabel, som etiketter mættede pixel for at visuelt vurdere over mætning. For at undgå signal over farvemætning, justere indstillingerne med prøven, der forventes at have den højeste fluorescerende signal. - Angiver værdien for linjen i gennemsnit 2.
Bemærk: Når du bruger højere erhvervelse hastigheder, øge denne værdi for at reducere støj. - Etablere begynder og slutter sektioner til at udføre optisk z-stakke, der strækker sig over hele mængden af kapillar. Bruge en trin størrelse på 0,45 µm.
Bemærk: Hvis billeder vil blive anvendt til efterfølgende kvantificering, holde de samme erhvervelse indstillingerne for det komplette datasæt. - For kvantificering, erhverve 10 til 20 z-stakke pr. afsnit fra mindst tre forskellige mus for statistiske sammenligninger.
Bemærk: Erhverve den fulde datasæt i den samme session at reducere variabiliteten udspringer prøve blegning og laser intensitet udsving.
4. Billede forarbejdning og 3D rekonstruktion af neurovaskulære enhed
- (valgfrit) til at øge aksial opløsningen af de erhvervede z-stakke, udføre deconvolution af image data sæt ved hjælp af passende software (Se tabel af materialer ).
- i deconvolution software, ændre indstillinger til at udføre " blinde " deconvolution, (dvs., ved hjælp af en adaptiv punkt-opslag funktionen).
- i deconvolution softwareindstillinger, Skift indstillingen for baggrund fjernelse; denne indstilling vil bestemme den mindste intensitet i en billedstak og trække det fra intensitetsværdierne fra alle pixel i billedet.
- i deconvolution softwareindstillinger, skifte ud valgmuligheder nemlig rescaling intensitet og resizing til 16 bit dybde; disse indstillinger vil holde de oprindelige intensitetsværdier og dynamikområde billeder.
- i menuen for ' brydningsindeks ', placere værdien hen til 1,52. I den ' indstille bølgelængde ' menuen, Vælg emission værdier for hver kanal, billede. For eksempel, vælge 520 til en grøn-udsender fluorophore.
- Åbne billedet datasæt ved hjælp af software velegnet til visualisering og analyse af 3-dimensionelle datasæt (Se Tabel af materialer). Billede analyse software, tryk på den " overgå " knap til at gengive 3D-versionen af kapillærer.
- i billed analyse software presse den " Tilføj ny overflade " knap til at segmentere kapillær overfladen. Brug pilene nederst til at flytte mellem trinene i guiden overflade skabelse.
- i den ' Opret ' fanen, skal kildekanalen til kanalen med kapillar markør, for eksempel CollagenIV, og angive areal detaljer til en værdi på 0,5 µm.
Bemærk: Indstillingen sidstnævnte gælder en Gaussisk filter for billedet og bestemmer glathed af overfladen. - i den ' skabe ' tab, Skift indstillingen for absolutte intensitet tærskel.
Bemærk: Denne indstilling opretter en overflade ved at generere en maske baseret på den absolutte intensiteten af den valgte kanal i billedet. - På næste trin i guiden overflade skabelse, justere den lavere intensitet tærskel for overfladen ved at flytte den glidende vindue på tværs af intensitet histogrammet indtil afsmeltet masken dækker det hele kapillær i billedet. Bestemme værdiintervallet for denne parameter empirisk for hvert datasæt.
- På det sidste trin i guiden overflade skabelse, klik på rullemenuen under " filtertype " og vælge indstillingen ' antallet af Voxels '. Angiv det mindste antal voxels til en værdi mellem 1.0e5 til 2.0e5.
Bemærk: Denne indstilling vil udelukke overflader med et lille antal voxels, for eksempel, små segmenter af kapillærer på kanten af rammen. - Afslutte guiden overflade skabelse og gemme skabelse parametre ved at klikke på " Husk parametre " under fanen genopbygge i menuen overflade.
- Gentag proceduren for hele imaging datasæt ved at indlæse den parameter, der bruges til det første billede. Justere parametrene for intensitet, tærskel og mindste antal voxels for hvert billede at tage højde for forskelle i baggrunden intensitet og kapillær morfologi, hhv.
- i den ' Opret ' fanen, skal kildekanalen til kanalen med kapillar markør, for eksempel CollagenIV, og angive areal detaljer til en værdi på 0,5 µm.
- At segmentere intracellulære vesikulære strukturer (fx, immunoglobulin-fyldt endosomes), først oprette en ny kanal, der kun indeholder fluorescerende signal fra indenfor kapillar.
Bemærk: Denne proces vil definere en region af interesse ved at oprette en maske ved hjælp af kapillar overfladen skabt taktfast 4.3- Vælg den ' edit ' menu i den ' kapillær overflade ' panel. Under ' maske egenskaber ', skal du klikke på " maske alle ". Vælg den kanal, der indeholder det intracellulære vesikel signal som den ' kilde kanal ' og skifte indstillingen " duplikere kanal før du anvender maske ".
- i den ' mask indstillingerne ' kolonne, skal du vælge " konstant inde i/uden for " og " sæt voxels udenfor overflade til: " og sæt dens værdi til 0,00.
Bemærk: Denne proces vil oprette en ekstra kanal i det billede, hvor alle voxels uden for kapillær masken vil har en intensitetsværdien 0. At kvantificere begivenheder uden for kapillær (dvs. i hjernen parenkym), vælge " sæt voxels inde i overfladen at: " og sæt dens værdi til 0,00. - Segment vesikulære strukturer, tryk på knappen for at starte den " tilføje nye steder " guiden. Brug pilene nederst til at flytte mellem trinene i guiden overflade skabelse.
- i fanen Opret bruge drop-down menuen under " kildekanalen " at vælge den intracellulære maskerede kanal skabt taktfast 4.4.4.
- i fanen Opret under den " Spot opdagelse " afdeling, Angiv den anslåede XY diameter til en værdi mellem 0,5 og 1 µm, afhængigt af den gennemsnitlige størrelse af vesikler observeret i eksperiment. Denne indstilling bestemmer den mindste størrelse, som vil blive opdaget af segmentering algoritme.
- i fanen Opret under den " Spot opdagelse " afdeling, Skift indstillingen for " baggrund subtraktion ".
Bemærk: Denne indstilling vil udglatte billedet med en Gaussisk filter af 0,75 spot radius (fra værdien i trin 4.4.7), og derefter fratrække intensiteten af det oprindelige billede Gaussisk filtreret af 0,88 spot radius. - i den ' skabe ' fanen, tryk på dropdown menuen under ' filtertype ' og vælg " kvalitet ". Bemærk at dette vil opdele billedet ved at anvende tærskler baseret på intensitet i midten af steder. Justere intensiteten selvrisiko ved at flytte den glidende vindue på tværs af den ' kvalitet ' histogram indtil fleste af identificerbare vesikler mærkes.
Bemærk: Værdiintervallet for denne parameter skal bestemmes empirisk for hvert datasæt. - Afslutte guiden spot skabelse og gemme skabelse parametre ved at trykke på knappen " Husk parametre " under fanen genopbygge i menuen overflade.
- Gentag proceduren for hele imaging datasæt ved at indlæse den parameter, der bruges til det første billede. Justere parametrene for den ' kvalitet intensitet tærskel ' for hvert billede at tage højde for forskelle i baggrunden intensitet.
5. Kvantificering af intracellulær Transport på BBB
- kvantificere mængden (i µm 3) og området (i µm 2) kapillær-segmentet. I analyse software, få adgang til panelet statistikker i det vaskulære overflade skabt taktfast 4.3. Vælg den ' detaljeret ' under fanen, og Brug rullemenuen til at vælge " alle værdier " at finde værdierne for volumen og område.
- Kvantificere antallet af vesikler i kapillær målgruppen. I analyse software, få adgang til panelet statistik af steder skabt taktfast 4.4. Vælg den ' samlede ' tab for at finde værdien af det samlede antal af Steder i billedet.
- Til at beregne antallet af vesikler pr. kapillær volumen, til hvert billede normalisere antallet af steder volumen beregnet i trin 5.1. Formere denne værdi af 1.000 at få antallet af vesikler pr. 1.000 µm 3 af kapillar volumen.
- Til at kvantificere den samlede intensitet inden for kapillar oprette en ny overflade, der dækker hele billedet følgende instruktionerne beskrevet trin 4.3 med følgende ændringer. Vælg den kanal, der indeholder den relevante signal (f.eks., mIgG) som kilde kanal og indstille værdien af detaljeringsniveauet areal til 5 µm. Hvis du vil oprette en overflade, der dækker hele billedet, indstille værdien af de lavere intensitet tærskel til 0.
- i analyse software, få adgang til panelet statistikker i overfladen skabt taktfast 5.4. Vælg den " detaljeret " under fanen, og Brug rullemenuen til at vælge " alle værdier ". Værdier for ' intensitet summen ' for kanaler af interesse; Denne parameter svarer til summen af individuelle intensitetsværdierne over alle pixels.
Bemærk: For en intracellulær signal, dette svarer til den duplikerede kanal med voxels uden for overfladen angivet til 0,0. For et signal i hjernen parenkym, dette svarer til den duplikerede kanal med voxels inde i overfladen angivet til 0,0. - Til at beregne fluorescens-intensiteten pr. kapillær volumen, til hvert billede normalisere intensiteten af volumen beregnet i trin 5.1. Formere denne værdi af 1.000 får fluorescens intensitet værdi pr. 1.000 µm 3 af kapillar volumen.
Bemærk: For fluorescerende signaler i hjernen parenkym, normalisere værdierne af det samlede billede volumen minus den kapillære volumen og ganges med 1.000 at få den samlede støtteintensitet pr. 1.000 µm 3 i hjernen parenkym. - Du gentage proceduren for hele datasættet og bruge passende software til at udføre statistisk analyse af data.
Representative Results
Som repræsentative eksempler på billeder fremstillet af protokollen beskrevet her, mus hjernen sektioner var plettet med antistoffer genkende forskellige komponenter af NVU herunder basalmembranen, astrocytter, pericytes, og endothelial celler (jf. Tabel af materialer til specifikke antistoffer bruges) (figur 1A, D, og E). På denne beslutning er det muligt at skelne de enkelte astrocytic processer og ende-fødder, der er i direkte kontakt med kapillærerne.
For at fremhæve egnetheden af denne protokol til påvisning af intracellulære strukturer, var hjernen sektioner fra dyr perifert indsprøjtning med humant anti-Tau mAb86 antistof16 farves med en fluorescently mærket-anti-humant antistof ( Figur 1B). mAb86 er kendt for at specifikt mål neuroner at udtrykke en patologisk form af Tau16. Ved hjælp af den protokol, der er beskrevet heri, blev mAb86 fundet med diffraktion-begrænset opløsning inden for enkelte vesikulære strukturer inden for neuroner (figur 1B-C). Derudover blev endogene mus IgG opdaget i intracellulære strukturer i endothelial celler men ikke i pericytes (fig. 1D-E og figur 2).
Erhvervelse af høj opløsning Konfokal z-stakke af hjernen Vaskulaturen giver mulighed for tre-dimensionelle segmentering af kapillærer og intracellulære vesikler på BBB. Figur 2 viser et eksempel på processen med rendering og segmentere en kapillær mærkes med CollagenIV og mus IgG-positive intracellulære vesikler. Af kvantificere en fulde datasæt af segmenterede billeder, for eksempel ved at måle antallet af vesikler pr. kapillær volumen, er det muligt at studere ændringer i intracellulær transport processer under forskellige betingelser. Figur 3 B-C viser forskellene i mIgG vesikel antallet og fluorescens intensitet svarende til mIgG på hjernen parenkym, henholdsvis ved pericyte iltsvind i musemodel pdgf-bret/ret som tidligere rapporteret 17. den samme fremgangsmåde også for nylig blev brugt til at analysere ændringer i intracellulær transport på BBB mellem forskellige hjernen regioner18.
Figur 1: Mærkning af flere celletyper og subcellulært strukturer af neurovaskulært unit. Repræsentative billeder af neurovaskulære enhed (A og D) og intracellulære vesikler indeholdt i neuroner (B) eller endotelceller (E) opnået med denne protokol. Den maksimale intensitet projektion billede i A (øverst) viser fordelingen af GFAP-positive astrocytter (rød) omgivende kapillærer mærket af CollagenIV (grøn). Pilene peger på individuelle astrocytic processer. Skalalinjen = 20 µm. Ved denne beslutning er den enkelte astrocyte processer og ende-fødder klart synlige, som vist i det zoomede billede af boxed regionen (nederst). Pilespidser peg astrocytic end-fødder. Skalalinjen = 10 µm. Billede b viser ophobning af et perifert injiceres antistof, mAb86 (grøn), inden for en hippocampus neuron. Pilespidser peg på individuelle mAb86-positive vesikler. Skalalinjen = 10 µm. Figur c viser line profil intensiteten af en enkelt vesikel. Vesikel størrelse blev anslået fra den fulde bredde på halv maksimalt en Gaussisk fit (sort streg) af intensitet kurven (grøn linje og cirkler). Billeder i D viser en tredimensionel rekonstruktion af en endothelial celler (grønne) omgivet af en pericyte (rød) inden for basal lamina (CollagenIV, grå). Panelerne lavere Vis individuelle fluorescens-kanaler. Skalalinjen = 10 µm. Billeder i E Vis lokalisering af mIgG (rød) i intracellulære vesikler i endothelial celler (venstre panel, CD31 i grøn) men ikke i pericytes (højre panel, CD13 i grøn). I alle billeder, DAPI farves kerner er vist med blåt. Skalalinjen = 5 µm. paneler D og E er blevet ændret fra reference17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Tre-dimensionelle gengivelse af kapillærer og intracellulære vesikler på blod - hjerne barrieren. Med protokollen beskrevet erhvervet Konfokal højopløsningsbilleder af CollagenIV-positive kapillærer (grøn) og mus IgG intracellulære vesikler (rød) blev (A). Panelet til venstre viser en enkelt optisk sektion med tværsnit. Pilene peger på individuelle mIgG-positive vesikler i endothelial hjerneceller. Panelet til højre viser 3D genopbygningen fuld z-stak ved brug af image processing software (Se Tabel af materialer). Kapillar volumen (B) og individuelle vesikler (C) blev gjort i tre dimensioner og kvantificeres ved hjælp af billedbehandlingsprogram (Se Tabel af materialer). I alle billeder, DAPI farves kerner er vist med blåt. Skalere barer = 5 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Kvantificering af mIgG intracellulære lokalisering på BBB. Repræsentative billeder viser (A) tre-dimensionelle rekonstruktioner af kapillærer (mærket med collagenIV, grønne) og fordelingen af mIgG (rød), C57BL/6 mus og pdgf-bret/ret pericyte forarmet mus tidligere beskrevet i19. Skalere barer = 10 µm. Billeder i B viser segmenteringen af intracellulære vesikler i CollagenIV maske. The figur b viser kvantificering og sammenligning af mIgG vesikel antallet pr. volumen af kapillar. Hvert punkt repræsenterer målinger fra enkelte kapillær segmenter. Den faste linje viser middelværdien og fejllinjer repræsenterer standardafvigelsen af dataene. Billeder i C Vis den mIgG fluorescens signal udenfor CollagenIV maske. Ligeledes viser grafen i C kvantificering og sammenligning af mIgG fluorescens intensitet i hjernen parenkym mellem C57BL/6 mus og pdgf-bret/ret pericyte forarmet mus. Fluorescens intensitet enheder var normaliseret af den gennemsnitlige mIgG parenkym intensitet måles i alle C57BL/6 mus. Dette tal er blevet ændret fra reference17. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Den protokol, der er skitseret ovenfor beskriver forberedelse af hjernen frit svævende sektioner, immunfluorescent farvning, image erhvervelse og analyseparametre for høj opløsning mikroskopi af BBB. Denne metode har været for nylig brugt til at undersøge lokalisering af antistof levering platforme3, transport af endogene IgG på tværs af BBB17og heterogenitet af BBB ved pericyte tab18. Forskellige trin i protokollen kan ændres for at tilpasse sig til de specifikke mål for eksperimentet. Første, brug af tykke (100 µm) sektioner letter håndteringen under procedurerne for immunfarvning og montering. Det giver også mulighed for 3D rekonstruktion af den kapillære netværk, neurovaskulære enhed, og generation af kapillar og NVU tværsnit. Dog penetration af antistoffer i afsnittene væv kan variere og nogle antistoffarvning kan være begrænset til de overfladiske lag af væv tæt på coverslip. Protokollen kan ændres ved at øge koncentrationen af vaskemiddel under trinnet permeabilization og/eller længden af permeabilization skridtet til at forbedre antistof penetration ind i vævet. Andet, billedkvalitet kan blive kompromitteret, når du forsøger at erhverve billeder dybere i væv (normalt 20 til 30 µm under overfladen) på grund af lysspredning samt optiske aberrationer fra brydningsindeks uoverensstemmelse. For at løse dette problem, kan nye metoder til væv clearing og aktive antistof penetration20 kombineres med denne protokol til billedet større mængder af væv. For det tredje udføres deconvolution efter billede erhvervelse at forbedre aksial opløsningen af billedet. Valget af den blinde deconvolution algoritme bruges i denne protokol var baseret på (i) sin brugervenlighed, som ingen før beregning af funktionen punkt-spredning er nødvendig, (ii) dens robusthed til at forbedre billed kvalitet21, og (iii) manglende artefakter på mIgG intracellulære strukturer efter gennemførelsen. Afhængigt af de intracellulære strukturer visualiseret i stikprøven, kan andre deconvolution algoritmer resultere i højere billedkvalitet. De følgende referencer21,22 giver en omfattende diskussion om de fordele og begrænsninger af yderligere algoritmer til billede deconvolution. Endelig tilladt at bruge et billede analyse softwarepakken segmenteringen af kapillærer og intracellulære strukturer i tre dimensioner. Klart billedanalyse er begrænset ikke til den software, der er beskrevet i protokollen og alternative pakker, for eksempel de drøftet i reference23, kan anvendes til segment billeder. Egnetheden af forskellige software-programmer til analyse af intracellulære strukturer på tværs af BBB skal verificeres empirisk ved at vurdere nøjagtigheden af billedsegmentering.
Da denne metode er baseret på faste prøver, giver det ikke direkte oplysninger om dynamikken af transcytosis på tværs af BBB. Men det kan kombineres med tidsforløb eksperimenter24, for eksempel af intravenøst indsprøjte molekyle af interesse og måle dens ophobning i BECs på forskellige tidspunkter efter injektion, at rekonstruere forsvindingskinetik intracellulær transport. Fordelen ved denne fremgangsmåde er, at det giver mulighed for analyse af dyb brain regioner, som vist i18, der er i øjeblikket utilgængelig for intravital live imaging tilgange. Et kritisk trin i protokollen er omhyggelig overvågning af væv fiksering. Fiksering med 4% PFA dramatisk reducerer immunogenicitet af intracellulære organeller og endogene eller perifert administreret immunoglobuliner17 (figur 1B). En begrænsning af denne protokol er dens krav om høj kvalitet antistoffer (dvs., lav uspecifik farvning, lav krydsreaktivitet) egnet til immunfluorescens. Forudsat at sådanne reagenser er tilgængelige, kan metoden anvendes til at undersøge den intracellulære lokalisering af eventuelle protein af interesse. For eksempel, blev protokollen brugt til at identificere lysosomer i hjernen endotelceller17. Det skal også bemærkes, at da denne protokol er baseret på Konfokal mikroskopi, den laterale opløsning er begrænset af diffraktion og kan ikke løse strukturer mindre end ca 175-250 nm (figur 2).
Tidligere undersøgelser har udført detaljeret analyse af cellulære sammensætningen af det neurovaskulære enhed ved hjælp af konfokalmikroskopi25,26. Imidlertid bygger undersøge intracellulær transport på BBB primært på brugen af transmissions Elektron Mikroskopi19,27,28. Mens denne metode giver den højeste laterale opløsning af intracellulære strukturer, forbliver elektronmikroskopi en udfordrende teknik med lav dataoverførselshastighed. Desuden er antallet af forskellige molekylære mål, som kan visualiseres ved EM meget begrænset. Denne protokol tilbyder tilgængelige alternativ for at undersøge intracellulær transport på BBB. Den komplette procedure, fra hjernen samling til billedanalyse, kan udføres i 5-6 dage. Hvis passende antistoffer er tilgængelige, tillader immunofluorescens samtidige påvisning af flere celle typer/molekyler inden for samme prøve. Denne protokol kan desuden kombineres med super-resolution mikroskopi-teknikker til at overvinde begrænsningerne i rumlige opløsning29. Samlet set protokollen beskrevet ovenfor giver mulighed for kvantificering af ændringer i den intracellulære lokalisering af proteiner af interesse inden for den neurovaskulære enhed. Sin ansøgning om forskellige genetiske eller farmakologiske perturbationer vil give mulighed for at undersøge de intracellulære struktur og transport funktioner af BBB i vivo.
Disclosures
Forfatterne er under lønnet beskæftigelse af Roche.
Acknowledgments
R.V. arbejde blev støttet af en Roche postdoc stipendium (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
