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Neuroscience

रक्त मस्तिष्क बाधा के उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग: इमेजिंग, 3 डी पुनर्निर्माण, और Transcytosis के ठहराव

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56407
Automatic Translation
1, 1
1Roche Pharma Research and Early Development (pRED), Neuroimmunology, Roche Innovation Center Basel

Summary

यहां हम उच्च संकल्प इमेजिंग और एक तीन आयामी माउस neurovascular इकाई और रक्त मस्तिष्क बाधा मस्तिष्क मुक्त-फ्लोटिंग वर्गों का उपयोग कर के पुनर्निर्माण के लिए एक सूक्ष्म आधारित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस विधि के दृश्य, विश्लेषण, और BBB पर intracellular organelles के ठहराव के लिए अनुमति देता है ।

Abstract

रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) एक गतिशील कोशिकीय इंटरफेस है कि संचलन और मस्तिष्क के बीच अणुओं के परिवहन को नियंत्रित करता है । BBB भर में Transcytosis हार्मोन, चयापचयों, और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के लिए चिकित्सीय एंटीबॉडी के वितरण को नियंत्रित करता है । यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि BBB पर endothelial कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर organelles कल्पना करने के लिए लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोपी और छवि विश्लेषण के साथ मुक्त अस्थायी वर्गों के इम्यूनोफ्लोरेसेंस को जोड़ती है पेश करते हैं । इस डेटा के संयोजन-3 डी छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ सेट अर्द्ध स्वचालित विभाजन और केशिका मात्रा और सतह क्षेत्र के ठहराव के लिए अनुमति देता है, साथ ही संख्या और BBB पर intracellular organelles की तीव्रता । intracellular बुलबुले के भीतर माउस अंतर्जात immunoglobulin (आईजीजी) का पता लगाने और ठहराव पर उनके BBB विधि वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है । इस प्रोटोकॉल संभवतः vivo मेंविभिंन अणुओं के BBB transcytosis को नियंत्रित करने के तंत्र की जांच करने के लिए लागू किया जा सकता है ।

Introduction

रक्त-मस्तिष्क बाधा (BBB) astrocytes, pericytes, न्यूरॉन्स, और endothelial कोशिकाओं है कि रक्त परिसंचरण1से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) अलग से गठित एक सतत सेलुलर बाधा है । BBB भर में परिवहन के विनियमन मस्तिष्क homeostasis को बनाए रखने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं (BECs) के विशेष गुण द्वारा मध्यस्थता है. BECs और transcytosis के एक कम बेसल दर के बीच तंग सेलुलर जंक्शनों की उपस्थिति, रक्त जनित अणुओं की paracellular और transcellular परिवहन की सीमा क्रमशः2। हाल ही में, BECs में transcytosis मार्ग मस्तिष्क3,4के लिए चिकित्सकीय बड़े अणुओं की डिलीवरी बढ़ाने के लिए दोहन किया गया है । हालांकि, BBB भर में transcytosis के तंत्र अभी तक पूरी तरह से5,6विशेषता नहीं किया गया है ।

व्यापक काम इन विट्रो में किया गया है करने के लिए सेलुलर और आणविक तंत्र को विनियमित intracellular परिवहन BECs7,8,9,10, 11, लेकिन इस तरह की प्रणालियों neurovascular इकाई (NVU) के जटिल वास्तुकला और फिजियोलॉजी दोहराऊंगा करने में विफल । दूसरी ओर, vivo12में अध्ययन,13 BBB भर में परिवहन दरों पर विस्तृत मात्रात्मक जानकारी प्रदान करते हैं लेकिन परिवहन के intracellular तंत्र में अंतर्दृष्टि प्रदान नहीं करते. इसलिए, vivo और ex vivo में NVU की सेल् फी और intracellular कंपोनेंट्स की जांच14काफी चुनौतीपूर्ण बनी हुई है । केवल एक सीमित संख्या में तकनीक NVU की कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर संरचनाओं का विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी हैं । अधिकांश अध्ययन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हैं लेकिन इस तकनीक को उचित ऊतक तैयार करने और नमूना हैंडलिंग के लिए आवश्यक जटिल प्रोटोकॉल द्वारा सीमित है । इसलिए, हम उच्च संकल्प फोकल माइक्रोस्कोपी के आधार पर एक पद्धति की स्थापना की है कि मस्तिष्क के नमूनों के प्रसंस्करण की सुविधा होगी, विश्लेषण, और NVU की कोशिकाओं के भीतर उपसेलुलर डिब्बों के ठहराव ।

यहाँ, हम सेलुलर और सेलुलर स्तर पर BBB और NVU की मात्रात्मक इमेजिंग प्रदर्शन करने के लिए माउस मस्तिष्क मुक्त अस्थायी वर्गों का उपयोग करता है जो एक प्रोटोकॉल का वर्णन. हम परीक्षण और छवि के लिए एंटीबॉडी के एक नंबर की पुष्टि की है और तीन आयामों में NVU पुनर्निर्माण । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल अधिक से अधिक ऑप्टिकल विवर्तन-मस्तिष्क केशिकाओं के भीतर organelles के सीमित संकल्प पर इमेजिंग की अनुमति देता है । छवि विश्लेषण के साथ साथ, इस प्रोटोकॉल के लिए विभिंन प्रायोगिक शर्तों के तहत BBB भर में अणुओं के intracellular परिवहन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, neurodegeneration के माउस रोग मॉडल में उदाहरण के लिए ।

Protocol

< p class = "jove_content" > इस अध्ययन के लिए नैतिक अनुमोदन स्विट्जरलैंड के संघीय खाद्य सुरक्षा एवं पशु चिकित्सा कार्यालय द्वारा प्रदान किया गया था । सभी पशु प्रयोगों के सख्त पालन में पशु संरक्षण और कल्याण पर स्विस संघीय अध्यादेश के रूप में के रूप में अच्छी तरह से मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC) के प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन के नियमों के अनुसार आयोजित किया गया ।

< p class = "jove_title" > 1. मस्तिष्क मुक्त-अस्थायी वर्गों की पीढ़ी

  1. इष्टतम नमूना गुणवत्ता सुनिश्चित करने के लिए, paraformaldehyde के दिन फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 2% पीएफए (छिड़काव) का एक ताजा समाधान तैयार करें ।
    सावधानी: पीएफए त्वचा संपर्क और एक संभावित यलो द्वारा मामूली विषाक्त है । पीएफए को संभालने और एक रासायनिक धुएं हुड के तहत समाधान तैयार करने के लिए नाइट्राइल दस्ताने का उपयोग करें ।
    1. प्रति पशु पीएफए समाधान के ६० मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. १८०-२०० & #181 के साथ पीएच बढ़ाने के द्वारा समाधान में पीएफए लाने; पंजाब के हर १०० मिलीलीटर के लिए एक 5 एम KOH समाधान के एल और समाधान हीटिंग को ६० & #176; C.
      नोट: NaOH इस्तेमाल नहीं किया जाना चाहिए के रूप में यह नकारात्मक निर्धारण पर प्रभाव ऊतक संरक्षण ।
    3. चलो समाधान कमरे के तापमान के लिए शांत हो जाओ और ७.४ के लिए नीचे पीएच लाने के लिए एचसीएल का उपयोग कर । फ़िल्टर काग़ज़ का उपयोग करके समाधान फ़िल्टर करें ( तालिका सामग्री देखें).
  2. transcardial छिड़काव के माध्यम से एक पूरे माउस निर्धारण प्रदर्शन के रूप में पहले से वर्णित < सुप वर्ग = "xref" > १५ कुछ संशोधनों के साथ. सबसे पहले, vasculature से खून निकलवाने पंजाब के 20 मिलीलीटर का उपयोग कर फिर perfuse के साथ ४० मिलीलीटर की 2% पीएफए.
  3. खोपड़ी से मस्तिष्क को हटाने के रूप में पहले से वर्णित < सुप class = "xref" > 15 .
  4. विसर्जित एक हौसले से 2% पीएफए-perfused & #160; मस् ती के 20 एमएल में 2% पीएफए के लिए 7 ज पर 4 & #176; ग पद निर्धारण के लिए.
    नोट: यह intracellular संरचनाओं का पता लगाने को रोका जा सकता है के रूप में पीएफए में गर्मी में वृद्धि की सिफारिश नहीं है ।
  5. बड़े पैमाने पर बर्फ ठंडा पंजाबियों के साथ मस्तिष्क धो लो ।
  6. agarose. में फिक्स्ड दिमाग एंबेड
    1. पंजाब में एक 3% agarose समाधान तैयार हीटिंग के लिए एक माइक्रोवेव का उपयोग कर । धीरे हल भंवर इसे शांत नीचे लेकिन solidification.
      2. से बचने
    2. एक प्लास्टिक कंटेनर में agarose समाधान में विसर्जन से पहले मस्तिष्क के चारों ओर पंजाब के अतिरिक्त बंद सूखी । हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए agarose के अंदर मस्तिष्क घुमाएँ । agarose बर्फ पर इसे ठंडा करके जमना के लिए अनुमति दें ।
    3. ध्यान से प्लास्टिक कंटेनर से agarose ब्लॉक को हटा दें और एक उस्तरा ब्लेड का उपयोग कर मस्तिष्क के चारों ओर एक घन में कटौती । एक vibratome नमूना धारक पर मस्तिष्क माउंट (सामग्री के तालिका देखें) cyanoacrylate गोंद का उपयोग ( सामग्री की मेज देखें) । खंड के साथ आगे बढ़ने से पहले गोंद के लिए पर्याप्त समय की अनुमति दें ।
  7. नमूनों में मस्तिष्क को vibratome बफर ट्रे के लिए पंजाबियों से भरा स्थानांतरण । vibratome का प्रयोग धारा १०० & #181; एम ब्रेन स्लाइसेस (sagittal या राज्याभिषेक) के लिए करें । पहले पंजाबियों से भरे एक 6-वेल प्लेट में ब्रेन सेक्शन लीजिए ।
    8. खत्म मस्तिष्क अनुभाग, ध्यान से पंजाबियों को हटाने और ग्लिसरॉल. के एक 1:1 समाधान के साथ बदलने पर
  8. /
  9. Store sections in पंजाब/ग्लिसरॉल at-20 & #176; C.
< p class = "jove_title" > 2. सेल या Organelle लेबलिंग इम्यूनोफ्लोरेसेंस से सना हुआ

  1. ध्यान से एक अच्छी तरह से एक 24-अच्छी तरह से पहले भरा थाली के एक कुआं में एक मस्तिष्क अनुभाग हस्तांतरण ५०० & #181 के प्रति अच्छी तरह से पंजाब के एल । यह अनुभाग प्रक्रिया के अंत तक समान रूप से ठीक रहेगा ।
  2. कुल्ला ५०० के साथ दो बार & #181; 5 मिन के लिए विनंर आंदोलन के तहत पंजाब के एल ।
  3. पंजाबियों को हटाने और एक साथ अवरुद्ध और मस्तिष्क स्लाइस के permeabilization प्रदर्शन करते हैं ।
    1. ०.३% ट्राइटन-एक्स और पंजाब में 10% गधा सीरम के साथ एक अवरुद्ध और permeabilization समाधान तैयार करते हैं ।
      नोट: गधा सीरम विशिष्ट माध्यमिक एंटीबॉडी इस्तेमाल किया की मेजबान प्रजातियों मैच के लिए बकरी सीरम के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
    2. के साथ २५० & #181; एल अवरुद्ध और कोमल आंदोलन के तहत कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए permeabilization समाधान के L ।
  4. समाधान निकालें और एक पंजाबियों 5% गधा सीरम और एक उचित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त समाधान जोड़ें ( उदा , 1:100 को 1:1000) । पर रात भर गर्मी 4 & #176; सी के तहत कोमल आंदोलन ।
    नोट: इस प्रोटोकॉल के साथ NVU के विभिन्न कक्ष प्रकारों को सफलतापूर्वक लेबल करने वाले एंटीबॉडी की सूची के लिए सामग्री की तालिका देखें. प्राथमिक एंटीबॉडी के इष्टतम कमजोर पड़ने empirically निर्धारित किया जाना चाहिए । अलग प्रतिजनों के एक साथ लेबलिंग के लिए, एक ही समाधान में सभी प्राथमिक एंटीबॉडी पतला । सभी प्राथमिक एंटीबॉडी विभिंन प्रजातियों में उठाया जाना चाहिए । एंटीबॉडी प्रवेश में सुधार करने के लिए, नमूनों को ७२ ज पर 4 & #176; C.
    5. के लिए मशीन किया जा सकता है
  5. दूर एंटीबॉडी समाधान और धो वर्गों तीन बार के लिए 10 पंजाब में कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के तहत मिनट । पंजाबियों को हटाएं और जोड़ें २५० & #181; एल पंजाबियों समाधान 5% गधा सीरम और उपयुक्त प्रजातियों-विशिष्ट फ्लोरोसेंट लेबल माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त । कोमल आंदोलन के तहत 1 एच के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी वर्गों ।
    1. इस प्रोटोकॉल के साथ इस्तेमाल किया माध्यमिक एंटीबॉडी की एक सूची के लिए सामग्री के तालिका देखें.
  6. कमरे के तापमान पर कोमल आंदोलन के तहत पंजाब में 10 मिनट के लिए एंटीबॉडी समाधान और धो वर्गों तीन बार निकालें ।
  7. हटाउन पंजाब र जोड २५० & #181; L क 4 & #39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) हल with & #160; a अंतिम एकाग्रता of 1 & #181; g/mL. कोमल आंदोलन के तहत 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर वर्गों की मशीन । DAPI समाधान और धो वर्गों को हटाने 3 पंजाबियों के साथ 5 मिनट के लिए बार ।
  8. बंधन माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर मस्तिष्क अनुभाग माउंट ( उदा, histo-बॉण्ड ग्लास स्लाइड). स्लाइड पर अनुभाग के आस-पास अतिरिक्त पंजाबियों को सावधानीपूर्वक निकालें । बढ़ते मध्यम की एक बूंद (सामग्री की तालिका देखें) मस्तिष्क अनुभाग के शीर्ष पर जोड़ें और ध्यान से यह एक ०.१७ mm के साथ कवर (No. १.५) borosilicate ग्लास coverslip.
    1. संग्रह नमूनों पर 4 & #176; C छवि प्राप्ति के प्रदर्शन तक प्रकाश से सुरक्षित.
< p class = "jove_title" > 3. रक्त मस्तिष्क बाधा के उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग

  1. एक उपयुक्त लेजर स्कैनिंग फोकल माइक्रोस्कोप के साथ छवि अधिग्रहण प्रदर्शन ( सामग्री की तालिका देखें) ४०५, ४८८, ५६१ पर लेजर लाइनों के साथ, और ६३३ एनएम के उत्तेजना के लिए हल्के स्पेक्ट्रम के नीले, हरे, नारंगी, और लाल क्षेत्रों में fluorophores । छवि अधिग्रहण के लिए, १.४ के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 63X तेल उद्देश्य का उपयोग करें.
    2. सॉफ्टवेयर है कि माइक्रोस्कोप को नियंत्रित करता है के अधिग्रहण मेनू में
  2. , छवि अधिग्रहण मापदंडों सेट. & #8216 के ड्राप-डाउन मेन्यू में; इमेज साइज & #8217;, १०२४ x १०२४ पिक्सल के मान का चयन करें । पिक्सेल आकार २०० और ३०० एनएम के बीच मान को संशोधित करने के लिए मान समायोजित करके & #8216; ज़ूम & #8217; menu. & #8221;
    नोट: intracellular संरचनाओं के विश्लेषण के लिए, पिक्सेल आकार को ७५ एनएम के लिए कम करें । यह छवि आकार पर्याप्त रूप से प्राप्ति समय बढ़ाता है और ५१२ x ५१२ पिक्सेल के लिए कम किया जा सकता है दृश्य के एक छोटे क्षेत्र इमेजिंग द्वारा अधिग्रहण समय कम करने के लिए ।
  3. & #39; अर्ज हिने & #39; ड्रॉप-डाउन मेनू में, ४०० हर्ट्ज, यानी ४०० लाइनों प्रति सेकंड के मान का चयन करें. म & #39; टम settings & #39; menu, & #39 का चयन करें;P ixel गहराई & #39; ड्रॉप डाउन मेनू, और 12 बिट करने के लिए मान बदलें ।
    4. माइक्रोस्कोप सॉफ्टवेयर में
  4. , भीतर & #39; अर्जन & #39; टैब, अनुक्रमिक फ़्रेम प्राप्ति के लिए विकल्प पर टॉगल करें. ऑप्टिकल सेक्शन मोटाई को ०.७५ और 1 & #181 के बीच के मान पर सेट करें; प्रत्येक चैनल के लिए & #39 में मान संशोधित करके;P छेद & #39; menu.
    5. फ्लोरोसेंट उत्तेजना के लिए पैनल में
  5. , को बेहतर नमूना में fluorophores उत्तेजित करने के लिए आवश्यक लेजर सक्रिय, उदाहरण के लिए एक ४८८ एनएम लेजर लाइन एक हरी उत्सर्जक fluorophore.
    के लिए नोट: पर्याप्त उत्तेजना लेज़र का चयन करने के लिए एक fluorophore स्पेक्ट्रा व्यूअर (सामग्री     की तालिका देखें) का उपयोग करें.
  6. पैनल में फ्लोरोसेंट पता लगाने के लिए, स्लाइडर ले जाने के लिए तरंग दैर्ध्य कि प्रत्येक चैनल में मापा जाएगा का चयन करें, उदाहरण के लिए के बीच ५१० और ५५० एनएम के लिए एक हरी उत्सर्जक fluorophore.
    नोट: fluorophore स्पेक्ट्रा व्यूअर का उपयोग करें (देखें सामग्री की तालिका ) पर्याप्त डिटेक्शन तरंग दैर्ध्य का चयन करने के लिए ।
  7. कांच coverslip और उद्देश्य के अपवर्तन सूचकांक से मेल करने के लिए मस्तिष्क खंड के साथ coverslip के शीर्ष पर १.५२ के एक अपवर्तन सूचकांक के साथ विसर्जन के तेल की एक बूंद जोड़ें । नमूना माइक्रोस्कोप में रखें और माइक्रोस्कोप दूरबीन का उपयोग कर नमूना कल्पना करने के लिए epifluorescent लैंप पर बारी ।
  8. माइक्रोस्कोप स्टैंड पर बटन का उपयोग कर, DAPI-सना हुआ नाभिक visualizing के लिए उपयुक्त एक फिल्टर का चयन करने के लिए फिल्टर पहिया बदल जाते हैं । ध्यान में DAPI-सना नाभिक से संकेत लाने के लिए मोटे ध्यान का प्रयोग करें.
  9. खुर्दबीन स्टैंड पर बटन का उपयोग कर, (उदाहरण के लिए, CollagenIV या CD31) संवहनी मार्करों से संकेत कल्पना करने के लिए फिल्टर बदलने के लिए और एक व्यक्ति केशिका खंड पर देखने के क्षेत्र केंद्र.
  10. लाइव स्कैन मोड शुरू करने के लिए बटन दबाएँ. स्कैनिंग के दौरान छवियों के गतिशील रेंज को अधिकतम करने और पिक्सेल संतृप्ति से बचने के लिए प्रत्येक चैनल के लिए लाभ और लेजर तीव्रता समायोजित करें.
    नोट: एक लुक-अप तालिका का उपयोग करें जो संतृप्त पिक्सेल को विज़ुअल रूप से अधिक-संतृप्तता का आकलन करने के लिए लेबल करे. संकेत से अधिक संतृप्ति से बचने के लिए, उच्चतम फ्लोरोसेंट संकेत है की उम्मीद है जो नमूना के साथ सेटिंग्स को समायोजित करें.
  11. 2.
    करने के लिए औसत पंक्ति के लिए मान सेट करें नोट: उच्च प्राप्ति की गति का उपयोग करते समय, शोर को कम करने के लिए इस मान को बढ़ाएँ.
  12. स्थापित शुरू और अंत ऑप्टिकल z-पोट कि केशिका के पूरे खंड अवधि के प्रदर्शन के लिए वर्गों । ०.४५ & #181 के चरण आकार का उपयोग करें; m.
    नोट: यदि चित्र क्रमिक ठहराव के लिए उपयोग किए जाएंगे, तो पूर्ण डेटा सेट के लिए समान प्राप्ति सेटिंग रखें.
  13. ठहराव के लिए, 10 से 20 z-स्टैक प्रति अनुभाग के लिए सांख्यिकीय तुलना के लिए ंयूनतम तीन अलग चूहों से प्राप्त ।
    नोट: नमूना ब्लीचिंग और लेज़र तीव्रता के उतार चढ़ाव से उत्पन्न होने वाली परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए एक ही सत्र में पूरा डेटा सेट प्राप्त करें.
< p class = "jove_title" > 4. छवि प्रसंस्करण और Neurovascular इकाई के 3 डी पुनर्निर्माण

  1. (वैकल्पिक) अधिग्रहीत z-पोट के अक्षीय संकल्प को बढ़ाने के लिए, उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि डेटा सेट का deconvolution प्रदर्शन ( सामग्री की तालिका देखें ).
    1. deconvolution सॉफ्टवेयर, प्रदर्शन करने के लिए सेटिंग्स परिवर्तित & #34; कज & #34; deconvolution, ( यानी , एक अनुकूली बिंदु-प्रसार समारोह का उपयोग करते हुए).
      2. deconvolution सॉफ्टवेयर सेटिंग्स में
    2. , पृष्ठभूमि को हटाने के लिए विकल्प पर टॉगल; यह विकल्प छवि स्टैक में सबसे छोटी तीव्रता मान निर्धारित करेगा और इसे छवि में सभी पिक्सेल से तीव्रता मानों से घटाएँ.
      3. deconvolution सॉफ्टवेयर सेटिंग्स में
    3. , तीव्रता reस्केलिंग और 16 बिट गहराई के लिए आकार बदलने के लिए विकल्प बंद टॉगल; इन विकल्पों के मूल तीव्रता मूल्यों और छवियों के गतिशील रेंज रखेंगे ।
    4. के मेन्यू में & #39; अपवर्तन सूचकांक & #39;, १.५२ को मान सेट करें. म & #39; तरंगित & #39 सेट करें; मेनू, प्रत्येक छवि चैनल के लिए उत्सर्जन मान का चयन करें । उदाहरण के लिए, एक हरे-उत्सर्जक fluorophore.
      5. के लिए ५२० का चयन करें
  2. दृश्य और 3-आयामी डेटा सेट के विश्लेषण के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग कर छवि डेटा सेट खोलें (सामग्री की तालिका देखें) । इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर में दबाएं & #34; बढ़चढ़कर & #34; बटन को केशिकाओं के 3d वॉल्यूम को रेंडर करने के लिए ।
  3. इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर प्रेस द & #34; केशिका सतह खंड करने के लिए नई सतह & #34; बटन जोड़ें । सरफ़ेस निर्माण विज़ार्ड में चरणों के बीच जाने के लिए नीचे तीरों का उपयोग करें ।
    1. & #39; create & #39; टैब पर, स्रोत चैनल को केशिका मार्कर वाले चैनल पर सेट करें, उदाहरण के लिए CollagenIV, और ०.५ & #181 के मान पर सतह क्षेत्र विवरण सेट करें; m.
      नोट: उत्तरार्द्ध विकल्प छवि के लिए एक गाऊसी फिल्टर लागू होता है और सतह की चिकनाई निर्धारित करता है.
    2. & #39; बनाएं & #39; टैब, पूर्ण तीव्रता थ्रेशोल्ड के लिए विकल्प पर टॉगल करें ।
      नोट: यह विकल्प छवि में चयनित चैनल के निरपेक्ष तीव्रता के आधार पर एक मुखौटा पैदा करके एक सतह बना देगा ।
    3. सतह निर्माण विज़ार्ड में अगले कदम पर, तीव्रता के पार फिसलने खिड़की ले जाकर सतह के लिए कम तीव्रता सीमा समायोजित हिस्टोग्राम जब तक प्रदान की मुखौटा छवि में पूरे केशिका शामिल हैं । प्रत्येक डेटा सेट के लिए इस पैरामीटर empirically के लिए मान श्रेणी निर्धारित करें ।
    4. सतह निर्माण विज़ार्ड के अंतिम चरण पर, ड्रॉप-डाउन मेनू पर क्लिक करें & #34; फ़िल्टर प्रकार & #34; और विकल्प & #39 का चयन करें; संख्या Voxels & #39;. voxels की ंयूनतम संख्या 1.0 e5 के बीच किसी मान के लिए सेट करने के लिए 2.0 e5.
      नोट: यह विकल्प voxels की एक छोटी संख्या के साथ सतहों को शामिल नहीं करेगा, उदाहरण के लिए, फ्रेम के किनारे पर केशिकाओं के छोटे खंडों.
    5. की सतह निर्माण विज़ार्ड समाप्त करें और क्लिक करके निर्माण पैरामीटर्स सहेजें & #34; याद रखें पैरामीटर & #34; सतह मेनू के पुनर्निर्माण टैब में ।
    6. पहले छवि के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर लोड कर पूरे इमेजिंग डेटा सेट के लिए कार्यविधि को दोहराएं । पृष्ठभूमि तीव्रता और केशिका आकृति विज्ञान, क्रमशः में अंतर के लिए खाते में प्रत्येक छवि के लिए voxels की तीव्रता, दहलीज, और न्यूनतम संख्या के लिए मापदंडों को समायोजित करें ।
  4. खंड intracellular vesicular संरचनाओं ( जैसे , immunoglobulin-भरा endosomes), पहले एक नया चैनल है कि केवल केशिका के भीतर से फ्लोरोसेंट संकेत शामिल बनाने के लिए ।
    नोट: यह प्रक्रिया चरण ४.३ में बनाई गई केशिका सतह का उपयोग कर एक मुखौटा बनाने के द्वारा ब्याज की एक क्षेत्र को परिभाषित करेगा
    1. & #39; edit & #39; मेन्यू में & #39; केशिका सरफेस & #39; पैनल । & #39; मास्क गुण & #39;, click & #34; मास्क केलेली & #34;. उस चैनल का चयन करें जिसमें intracellular पुटिका संकेत के रूप में & #39; सोर्स चैनल & #39; और विकल्प & पर टॉगल करे;D uplicate चैनल लागू करने से पहले मास्क & #34;.
    2. & #39; मास्क सेटिंग्स & #39; कॉलम, select & #34; स्थिरांक अंदर/बाहर & #34; र & #34; voxels सतह के बाहर सेट करें: & #34; और इसके मान को ०.००.
      पर सेट करें नोट: यह प्रक्रिया जहां सभी voxels केशिका मास्क के बाहर एक तीव्रता मान 0 होगा छवि में एक अतिरिक्त चैनल बना देगा । घटनाओं के बाहर केशिकाओं ( यानी , मस्तिष्क पैरेन्काइमा में), चुनें & #34; voxels के अंदर सतह सेट करने के लिए: & #34; और ०.००.
      3. करने के लिए इसके मान सेट करें
    3. को खंड vesicular संरचनाओं के लिए, बटन दबाएँ & #34 प्रारंभ करें; नए स्पॉट & #34 जोड़ें; विज़ार्ड । सरफ़ेस निर्माण विज़ार्ड में चरणों के बीच जाने के लिए नीचे तीरों का उपयोग करें ।
    4. बनाएं टैब में, ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें के अंतर्गत & #34; स्रोत चैनल & #34; चरण 4.4.4 में बनाए गए intracellular मास्क्ड चैनल का चयन करने के लिए.
    5. बनाएं टैब में, & #34; स्पॉट डिटेक्शन & #34; अनुभाग में, अनुमानित XY व्यास को ०.५ और 1 & #181; m के बीच किसी मान पर सेट करें, में देखा गया बुलबुले के औसत आकार के आधार पर प्रयोग । यह विकल्प विभाजन एल्गोरिथ्म द्वारा पता लगाया जाएगा जो सबसे छोटा आकार निर्धारित करता है ।
    6. टैब में, & #34 के तहत; स्पॉट डिटेक्शन & #34; अनुभाग, & #34 के लिए विकल्प पर टॉगल; पृष्ठभूमि घटाव & #34;.
      नोट: यह विकल्प ०.७५ स्थान त्रिज्या के एक गाऊसी फ़िल्टर के साथ छवि चिकनी जाएगा (चरण 4.4.7 में चयनित मान से) और फिर ०.८८ स्थान त्रिज्या द्वारा फ़िल्टर गाऊसी मूल छवि की तीव्रता घटाकर ।
    7. & #39; create & #39; tab, ड्रॉपडाउन मेनू के तहत दबाएं & #39; फ़िल्टर प्रकार & #39; और select & #34; गुणव & #34;. ध्यान दें कि यह स्थानों के केंद्र पर तीव्रता के आधार पर थ्रेसहोल्ड लागू करने से छवि खंड होगा । स्लाइडिंग विंडो में ले जाकर निचली तीव्रता सीमा को समायोजित करें & #39; गुणवत्ता & #39; हिस्टोग्राम जब तक कि पहचाने जाने योग्य बुलबुले के बहुमत लेबल हैं ।
      नोट: प्रत्येक डेटा सेट के लिए empirically निर्धारित करने के लिए इस पैरामीटर के लिए मान श्रेणी की आवश्यकता है ।
    8. निर्माण विज़ार्ड समाप्त करें और बटन दबाकर निर्माण पैरामीटर्स को सहेजें & #34; पैरामीटर्स को याद रखें & #34; सरफ़ेस मेनू के पुनर्निर्माण टैब में ।
    9. पहले छवि के लिए उपयोग किए गए पैरामीटर लोड कर पूरे इमेजिंग डेटा सेट के लिए कार्यविधि को दोहराएं । के लिए पैरामीटर समायोजित करें & #39; गुणवत्ता तीव्रता थ्रेशोल्ड & #39; प्रत्येक छवि के लिए पृष्ठभूमि तीव्रता में अंतर के लिए खाते के लिए ।
< p class = "jove_title" > 5. ठहराव पर Intracellular ट्रांसपोर्ट का BBB

  1. मात्रा को बढ़ाता है (in & #181; m 3 ) और क्षेत्र (in & #181; m 2 ) केशिका खंड । विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, ४.३ चरण में बनाए गए संवहनी सतह के आँकड़े पैनल का उपयोग. & #39 का चयन करें;D etailed & #39; tab, और ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करें & #34 का चयन करने के लिए; सभी मान & #34; वॉल्यूम और क्षेत्र के लिए मान ढूँढने के लिए.
  2. केशिका खंड के भीतर बुलबुले की संख्या बढ़ाता है । विश्लेषण सॉफ्टवेयर में, चरण ४.४ में बनाए गए धब्बे के आँकड़े पैनल तक पहुँचें. चयन करें & #39; कुल मिलाकर & #39; टैब छवि में स्पॉट की कुल संख्या का मान ढूँढने के लिए.
  3. केशिका मात्रा प्रति बुलबुले की संख्या की गणना करने के लिए, प्रत्येक छवि के लिए चरण ५.१ में गणना की मात्रा से धब्बे की संख्या को सामान्य. १,००० द्वारा इस मूल्य गुणा १,००० प्रति बुलबुले की संख्या प्राप्त करने के लिए & #181; m 3 की केशिका मात्रा.
  4. केशिका के भीतर कुल तीव्रता यों तो एक नई सतह है कि निंनलिखित संशोधनों के साथ ४.३ चरणों में वर्णित निर्देशों का पालन पूरी छवि को कवर बना । स्रोत चैनल के रूप में उचित संकेत ( उदा. , mIgG) वाले उस चैनल का चयन करें और सतह क्षेत्र विवरण स्तर के मान को 5 & #181; मी. पूरी छवि को कवर करने वाली सरफ़ेस बनाने के लिए, निचली तीव्रता थ्रेशोल्ड का मान 0 पर सेट करें ।
  5. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में, चरण ५.४ में बनाई गई सतह के आँकड़े फलक तक पहुँच है । & #34 का चयन करें;D etailed & #34; tab, और ड्रॉप डाउन मेनू का उपयोग करने के लिए & #34 का चयन करें; सभी मान & #34;. & #39 के लिए मान रिकॉर्ड करना; तीव्रता योग & #39; हित के चैनलों के लिए; यह पैरामीटर सभी पिक्सेल पर व्यक्तिगत तीव्रता मान का योग करने के लिए संगत है ।
    नोट: एक intracellular संकेत के लिए, यह ०.० करने के लिए सेट सतह के बाहर voxels के साथ डुप्लिकेट चैनल के लिए संगत है । मस्तिष्क पैरेन्काइमा में एक संकेत के लिए, यह ०.० के लिए सेट सतह के अंदर voxels के साथ डुप्लिकेट चैनल से मेल खाती है ।
  6. के लिए प्रतिदीप्ति तीव्रता प्रति केशिका वॉल्यूम की गणना करने के लिए, प्रत्येक छवि के लिए चरण ५.१ में परिकलित मात्रा से तीव्रता को सामान्य । इस मान को १,००० प्रति प्रतिदीप्ति तीव्रता मान प्राप्त करने के लिए गुणा करें १,००० & #181; m 3 की केशिका मात्रा.
    नोट: मस्तिष्क पैरेन्काइमा में फ्लोरोसेंट संकेतों के लिए, कुल छवि मात्रा से केशिका मात्रा शूंय से मूल्यों को सामान्य और १,००० द्वारा गुणा करने के लिए कुल तीव्रता प्रति १,००० & #181; मी ३ ऑफ ब्रेन पैरेन्काइमा.
  7. पूरे डेटा सेट के लिए प्रक्रिया को दोहराने और डेटा का सांख्यिकीय विश्लेषण करने के लिए उपयुक्त सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें ।

Representative Results

प्रोटोकॉल से प्राप्त छवियों के प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में यहां वर्णित है, माउस मस्तिष्क वर्गों एंटीबॉडी तहखाने झिल्ली, astrocytes, pericytes, और endothelial कोशिकाओं सहित NVU के विभिंन घटकों को पहचानने के साथ दाग थे (देखें प्रयुक्त विशिष्ट एंटीबॉडी के लिए सामग्री की तालिका ) (चित्रा 1a, डी, और ई) । इस संकल्प में व्यक्तिगत astrocytic प्रक्रियाओं और अंत पैरों कि केशिकाओं के साथ सीधे संपर्क में हैं भेद करने के लिए संभव है ।

intracellular संरचनाओं का पता लगाने के लिए इस प्रोटोकॉल की उपयुक्तता को उजागर करने के लिए, परिधीय रूप से मानव विरोधी ताऊ mAb86 एंटीबॉडी16 के साथ इंजेक्शन जानवरों से मस्तिष्क वर्गों एक फ्लोरोसेंट बला विरोधी मानव एंटीबॉडी के साथ दाग थे ( चित्रा 1बी) । mAb86 विशेष रूप से ताऊ16के एक रोग के रूप में व्यक्त ंयूरॉंस लक्ष्य के लिए जाना जाता है । इस के साथ साथ वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग, mAb86 विवर्तन के साथ पता लगाया गया था-vesicular संरचनाओं के भीतर न्यूरॉन्स के भीतर सीमित संकल्प (चित्रा 1बी सी). इसके अलावा, endothelial कोशिकाओं के भीतर intracellular संरचनाओं में अंतर्जात माउस आईजीजी का पता लगाया गया था लेकिन pericytes में नहीं (चित्रा 1डी-ई और चित्रा 2) ।

उच्च संकल्प फोकल जेड के अधिग्रहण के ब्रेन vasculature के ढेर केशिकाओं और intracellular बुलबुले के BBB में तीन आयामी विभाजन के लिए अनुमति देता है । चित्रा 2 प्रतिपादन और एक केशिका CollagenIV और माउस आईजीजी-सकारात्मक intracellular बुलबुले के साथ लेबल खंड की प्रक्रिया का एक उदाहरण से पता चलता है. द्वारा विभाजित छवियों का एक पूर्ण डेटासेट को बढ़ाता है, उदाहरण के लिए केशिका मात्रा प्रति बुलबुले की संख्या को मापने के द्वारा, यह विभिन्न स्थितियों के तहत intracellular परिवहन प्रक्रियाओं में परिवर्तन का अध्ययन करने के लिए संभव है. चित्र 3 बी सी mIgG पुटिका संख्या में मतभेद और प्रतिदीप्ति तीव्रता मस्तिष्क पैरेन्काइमा में mIgG के लिए इसी से पता चलता है, क्रमशः, pericyte में कम करने पर pdgf में कमी -बी/ माउस मॉडल के रूप में पहले की रिपोर्ट 17. इसी दृष्टिकोण से भी हाल ही में विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों18के बीच BBB में intracellular परिवहन में परिवर्तन का विश्लेषण किया गया था.

Figure 1
चित्र 1: neurovascular इकाई के एकाधिक कक्ष प्रकारों और उपसेलुलर संरचनाओं की लेबलिंग । neurovascular इकाई (ए और डी) और intracellular बुलबुले के प्रतिनिधि छवियों न्यूरॉन्स के भीतर निहित (ख) या endothelial कोशिकाओं (ई) इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त की. A (शीर्ष) में अधिकतम तीव्रता प्रोजेक्शन छवि GFAP-धनात्मक astrocytes (लाल) CollagenIV (हरा) द्वारा लेबल की गई केशिकाओं के वितरण को दिखाती है । तीर व्यक्तिगत astrocytic प्रक्रियाओं को इंगित करते हैं । स्केल बार = 20 µm । इस रिज़ॉल्यूशन पर, व्यक्तिगत astrocyte प्रक्रियाओं और अंत-चरणों को स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं, जैसा कि बॉक्स्ड क्षेत्र (नीचे) की ज़ूम की गई छवि में दिखाया गया है. ऐरोहेड पॉइंट टू astrocytic एंड-फीट । स्केल बार = 10 µm । B में छवि एक हिप्पोकैम्पस ंयूरॉन के भीतर, एक बाह्य इंजेक्शन एंटीबॉडी, mAb86 (हरा) के संचय से पता चलता है । ऐरोहेड बिंदु करने के लिए व्यक्तिगत mAb86-सकारात्मक बुलबुले । स्केल बार = 10 µm । C में ग्राफ़ किसी एकल पुटिका की रेखा प्रोफ़ाइल तीव्रता दिखाता है । पुटिका आकार पूरी चौड़ाई से एक गाऊसी फिट (काले ठोस लाइन) की तीव्रता वक्र (हरी लाइन और हलकों) की आधी अधिकतम पर अनुमान लगाया गया था । D में मौजूद छवियां एक endothelial कक्ष (हरा) का तीन-आयामी पुनर्निर्माण दिखाती है जो बेसल लेमिना (CollagenIV, धूसर) के भीतर pericyte (लाल) से घिरा होता है । निचले पैनलों व्यक्तिगत प्रतिदीप्ति चैनल दिखाते हैं । स्केल बार = 10 µm । ई में छवियों endothelial कोशिकाओं के भीतर intracellular बुलबुले में mIgG (लाल) के स्थानीयकरण दिखाने (बाएँ पैनल, CD31 हरे रंग में) लेकिन pericytes में नहीं (दाएँ पैनल, हरे रंग में CD13). सभी छवियों में, DAPI दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार = 5 µm. पैनलों D और E संदर्भ से संशोधित किया गया है17। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 : रक्त मस्तिष्क बाधा पर केशिकाओं और intracellular बुलबुले के तीन आयामी प्रतिपादन । प्रोटोकॉल के साथ वर्णित, उच्च संकल्प CollagenIV की फोकल छवियां-सकारात्मक केशिकाओं (हरा) और माउस आईजीजी intracellular बुलबुले (लाल) (A) का अधिग्रहण किया गया । बायां पैनल क्रॉस-सेक्शन के साथ एकल ऑप्टिकल अनुभाग दिखाता है । तीर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं के भीतर व्यक्तिगत mIgG-सकारात्मक बुलबुले के लिए बिंदु । सही पर पैनल पूर्ण z के 3 डी पुनर्निर्माण से पता चलता है छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर ढेर ( सामग्री की तालिकादेखें) । केशिका मात्रा (ख) और व्यक्तिगत बुलबुले (ग) तीन आयामों और छवि प्रसंस्करण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मात्रा में प्रदान की गई ( सामग्री की तालिकादेखें) । सभी छवियों में, DAPI दाग नाभिक नीले रंग में दिखाया गया है । स्केल बार्स = 5 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3 : ठहराव of mIgG intracellular स्थानीयकरण BBB. प्रतिनिधि छवियां (एक) दिखा रहा है केशिकाओं के तीन आयामी पुनर्निर्माण (collagenIV, हरे रंग के साथ लेबल) और C57BL में mIgG (लाल) के वितरण/6 चूहों और में pdgf-बीरेत/ pericyte घट चूहों पहले19में वर्णित है । स्केल पट्टियां = 10 µm । B में मौजूद छवियां CollagenIV मास्क के भीतर intracellular बुलबुले के विभाजन को दिखाती हैं । गुबी में ई ग्राफ ठहराव और केशिका की मात्रा प्रति mIgG पुटिका संख्या की तुलना से पता चलता है । प्रत्येक बिंदु व्यक्तिगत केशिका क्षेत्रों से माप का प्रतिनिधित्व करता है । ठोस पंक्ति माध्य दिखाता है और त्रुटि पट्टियां डेटा के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करती हैं । C में छवियां CollagenIV मास्क के बाहर mIgG प्रतिदीप्ति संकेत दिखाती हैं । इसी तरह, सी में ग्राफ ठहराव और C57BL के बीच मस्तिष्क पैरेन्काइमा में mIgG प्रतिदीप्ति तीव्रता की तुलना से पता चलता है/6 चूहों और pdgf-बीरेत/ pericyte घट चूहों । प्रतिदीप्ति तीव्रता इकाइयों औसत mIgG पैरेन्काइमा सभी C57BL/6 चूहों में मापा तीव्रता से सामान्यीकृत थे । यह आंकड़ा संदर्भ17से संशोधित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

ऊपर उल्लिखित प्रोटोकॉल मस्तिष्क मुक्त चल वर्गों, immunofluorescent धुंधला, छवि अधिग्रहण, और विश्लेषण BBB के उच्च संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए मापदंडों की तैयारी का वर्णन करता है । यह विधि हाल ही में एंटीबॉडी डिलिवरी प्लेटफार्मों के स्थानीयकरण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया है3, BBB17भर में अंतर्जात आईजीजी के परिवहन, और विविधता के BBB नुकसान पर pericyte के18। प्रोटोकॉल में विभिंन चरणों को प्रयोग के विशिष्ट लक्ष्य के अनुकूल बनाने के लिए संशोधित किया जा सकता है । सबसे पहले, मोटी (१०० µm) वर्गों के उपयोग immunostaining और बढ़ते प्रक्रियाओं के दौरान उनके हैंडलिंग की सुविधा । यह भी केशिका नेटवर्क, neurovascular इकाई के 3 डी पुनर्निर्माण के लिए, और केशिका और NVU पार वर्गों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है । हालांकि, ऊतक वर्गों के भीतर एंटीबॉडी के प्रवेश भिन्न हो सकते हैं और कुछ एंटीबॉडी धुंधला coverslip के करीब ऊतक के सतही परत करने के लिए प्रतिबंधित किया जा सकता है । प्रोटोकॉल permeabilization कदम के दौरान डिटर्जेंट की एकाग्रता बढ़ाने के द्वारा संशोधित किया जा सकता है और/या permeabilization कदम की लंबाई ऊतक में एंटीबॉडी पैठ में सुधार करने के लिए । दूसरे, छवि गुणवत्ता समझौता किया जा सकता है जब ऊतक के भीतर गहरी छवियों को प्राप्त करने का प्रयास (आमतौर पर 20 से 30 µm सतह के नीचे) प्रकाश बिखरने के कारण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ऑप्टिकल वाकया अपवर्तन सूचकांक से बेमेल । इस समस्या को दूर करने के लिए, ऊतक समाशोधन और सक्रिय एंटीबॉडी प्रवेश के लिए नए तरीके20 इस प्रोटोकॉल के साथ छवि को ऊतक की बड़ी मात्रा के लिए जोड़ा जा सकता है । तीसरा, deconvolution छवि अधिग्रहण के बाद किया जाता है छवि के अक्षीय संकल्प में सुधार होगा । इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया अंधा deconvolution एल्गोरिथ्म का चुनाव (i) उपयोग की अपनी आसानी पर आधारित था, के रूप में कोई पूर्व बिंदु के प्रसार समारोह की गणना की आवश्यकता है, (ii) छवि गुणवत्ता में सुधार के लिए अपनी मजबूती21, और (iii) mIgG पर कलाकृतियों की कमी कार्यांवयन के बाद intracellular संरचनाओं । नमूना में visualized intracellular संरचनाओं के आधार पर, अन्य deconvolution एल्गोरिथ्म उच्च छवि गुणवत्ता में परिणाम हो सकता है । निंनलिखित संदर्भ21,22 के लाभ और छवि deconvolution के लिए अतिरिक्त एल्गोरिदम की सीमाओं पर एक व्यापक चर्चा प्रदान करते हैं । अंत में, एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर पैकेज का उपयोग तीन आयामों में केशिकाओं और intracellular संरचनाओं के विभाजन की अनुमति दी । स्पष्ट रूप से छवि विश्लेषण प्रोटोकॉल और वैकल्पिक संकुल में वर्णित सॉफ्टवेयर के लिए प्रतिबंधित नहीं है, उदाहरण के संदर्भ में उन पर चर्चा की23, छवियों को खंड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । BBB भर में intracellular संरचनाओं के विश्लेषण के लिए विभिन्न सॉफ्टवेयर कार्यक्रमों की उपयुक्तता छवि विभाजन की सटीकता का आकलन करके empirically सत्यापित किया जाना चाहिए ।

इस विधि के बाद से निश्चित नमूनों पर आधारित है, यह BBB भर transcytosis की गतिशीलता के बारे में सीधे जानकारी प्रदान नहीं करता है । हालांकि, यह समय के साथ संयुक्त किया जा सकता है पाठ्यक्रम24प्रयोगों, उदाहरण के लिए नसों के द्वारा ब्याज की अणु इंजेक्शन और इंजेक्शन के बाद अलग समय बिंदुओं पर BECs के भीतर अपने संचय को मापने, के कैनेटीक्स पुनर्निर्माण के लिए intracellular परिवहन. इस दृष्टिकोण का लाभ यह है कि यह गहरी मस्तिष्क क्षेत्रों के विश्लेषण के लिए अनुमति देता है, के रूप में18में दिखाया गया है, जो वर्तमान में लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण intravital के लिए दुर्गम हैं. प्रोटोकॉल के दौरान एक महत्वपूर्ण कदम ऊतक निर्धारण की सावधान निगरानी है । 4% पीएफए के साथ निर्धारण नाटकीय रूप से intracellular organelles के immunogenicity को कम कर देता है और अंतर्जात या परिधीय प्रशासित इम्युनोग्लोबुलिन17 (चित्र 1b) । इस प्रोटोकॉल की कमी उच्च गुणवत्ता वाले एंटीबॉडी की अपनी आवश्यकता है (यानी, कम गैर विशिष्ट धुंधला, कम पार जेट) इम्यूनोफ्लोरेसेंस के लिए उपयुक्त । बशर्ते कि ऐसे रिएजेंट उपलब्ध हों, इस विधि से किसी भी प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण की जांच के लिए आवेदन किया जा सकता है । उदाहरण के लिए, प्रोटोकॉल मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं में lysosomes की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था17. यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रोटोकॉल के बाद से फोकल माइक्रोस्कोपी पर आधारित है, पार्श्व संकल्प विवर्तन द्वारा सीमित है और संरचनाओं लगभग १७५ २५० एनएम (चित्रा 2) से छोटे हल नहीं कर सकता ।

पिछले अध्ययनों ने फोकल माइक्रोस्कोपी25,26का उपयोग कर neurovascular इकाई के सेलुलर संरचना का विस्तृत विश्लेषण किया है । हालांकि, BBB पर intracellular परिवहन की जांच ज्यादातर संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी19,27,28के उपयोग पर निर्भर करता है । जबकि इस विधि intracellular संरचनाओं के उच्चतम पार्श्व संकल्प प्रदान करता है, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी कम प्रवाह के साथ एक चुनौतीपूर्ण तकनीक बनी हुई है । इसके अलावा, विभिंन आणविक लक्ष्य जो उंहें द्वारा visualized किया जा सकता है की संख्या बहुत सीमित है । इस प्रोटोकॉल BBB पर intracellular परिवहन की जांच करने के लिए एक सुलभ विकल्प प्रदान करता है । पूरी प्रक्रिया, मस्तिष्क संग्रह से छवि विश्लेषण करने के लिए, 5 से 6 दिनों में किया जा सकता है । यदि उपयुक्त एंटीबॉडी उपलब्ध हैं, इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक ही नमूना के भीतर कई सेल प्रकार/अणुओं का एक साथ पता लगाने की अनुमति देता है । इसके अलावा इस प्रोटोकॉल सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी तकनीक के साथ संयुक्त किया जा सकता है स्थानिक संकल्प29में सीमाओं को दूर । कुल मिलाकर, ऊपर वर्णित प्रोटोकॉल neurovascular इकाई के भीतर ब्याज के प्रोटीन के intracellular स्थानीयकरण में परिवर्तन की ठहराव सक्षम बनाता है । विभिंन आनुवंशिक या औषधीय perturbations के लिए इसका आवेदन vivo मेंBBB के intracellular संरचना और परिवहन कार्यों की जांच की अनुमति देगा ।

Disclosures

लेखकों Roche द्वारा भुगतान रोजगार के अधीन हैं ।

Acknowledgments

R.V. काम एक Roche Postdoctoral फैलोशिप (2014-2017) द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM Novus Biologicals MCA2388 Labels Brain Endothelial Cells
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody against Podocalyxin R&D Systems MAB1556 Labels Lumen of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV Biotrend BT21-5014-70 Labels Basement membrane of capillaries
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Goat polyclonal antibody against CD13 R&D Systems AF2335 Labels pericytes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 Abcam ab49874 Labels Astrocytes
Use at dilution 1:100
Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 Wako 019-19741 Labels Microglia
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 Fitzgerald 10R-CD107BBMSP Labels Lysosomes
Use at dilution 1:100
detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 LifeTechnologies A21203 Use at dilution 1:400
donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 LifeTechnologies A21202 Use at dilution 1:400
goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 LifeTechnologies A21422 Use at dilution 1:400
Filter paper Sigma-Aldrich WHA10334347 Whatman prepleated qualitative filter paper
Grade 0858 1/2, grained
Cyanoacrylate glue Roth Carl 258.1 Roti Coll 1
Fluorescent Mounting medium Dako S3023 Dako fluorescent mounting medium
Adult mice The Jackson Laboratory 000664 C57BL/6J male or female mice
between 9 and 19 months of age
Vibratome Leica Biosystems 14047235612 Leica VT100S vibrating blade microtome
Laser Scanning Confocal microscope Leica Microsystems NA Leica TCS SP8 X with HyD detectors
and White light laser
Image processing software Leica Microsystems NA Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587
Image analysis software Bitplane scientific software NA Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64
Fluorescence SpectraViewer ThermoFisher Scientific NA https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science
/cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html

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References

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तंत्रिका अंक १२९ रक्त मस्तिष्क बाधा transcytosis intracellular परिवहन फोकल माइक्रोस्कोपी इम्यूनोफ्लोरेसेंस छवि विश्लेषण
रक्त मस्तिष्क बाधा के उच्च संकल्प फोकल इमेजिंग: इमेजिंग, 3 डी पुनर्निर्माण, और Transcytosis के ठहराव
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Villaseñor, R., Collin, L.… More

Villaseñor, R., Collin, L. High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis. J. Vis. Exp. (129), e56407, doi:10.3791/56407 (2017).

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