Summary
Qui presentiamo un protocollo basato su microscopia per imaging ad alta risoluzione e una ricostruzione tridimensionale del mouse unità neurovascolare e barriera emato - encefalica utilizzando sezioni digalleggiante del cervello. Questo metodo consente la visualizzazione, analisi e quantificazione degli organelli intracellulari a BBB.
Abstract
Emato - encefalica (BBB) è un'interfaccia dinamica multicellulare che regola il trasporto delle molecole tra la circolazione e il cervello. Transcitosi attraverso la Bee regola la consegna di ormoni, metaboliti e gli anticorpi terapeutici al parenchima del cervello. Qui, presentiamo un protocollo che unisce immunofluorescenza delle sezioni digalleggiante con scansione laser confocale e analisi delle immagini per visualizzare gli organelli sottocellulari all'interno delle cellule endoteliali a BBB. Combinando questo set di dati con software di analisi di immagine 3D consente la segmentazione semi-automatizzata e quantificazione del volume capillare e superficie, nonché il numero e intensità degli organelli intracellulari a BBB. La rilevazione dell'immunoglobulina endogeno del mouse (IgG) all'interno di vescicole intracellulari e loro quantificazione a BBB viene utilizzata per illustrare il metodo. Questo protocollo può essere applicato potenzialmente all'indagine dei meccanismi di regolazione BBB transcitosi di molecole differenti in vivo.
Introduction
Emato - encefalica (BBB) è una barriera cellulare continua formata da neuroni, astrociti, cellule endoteliali e periciti che separa il sistema nervoso centrale (SNC) dal sangue circolazione1. Il regolamento di trasporto attraverso la Bee svolge un ruolo cruciale nel mantenimento dell'omeostasi del cervello ed è mediato dalla proprietà specializzate delle cellule endoteliali cerebrali (BECs). La presenza di giunzioni intercellulari strette tra BECs e un basso tasso basale di transcitosi limitare il trasporto paracellulare e transcellulare di molecole ematica, rispettivamente2. Recentemente, la via di transcitosi in BECs è stata sfruttata per migliorare la fornitura di grandi molecole terapeutiche al cervello3,4. Tuttavia, i meccanismi di transcitosi attraverso la Bee non sono ancora stati completamente caratterizzato5,6.
Vasto lavoro è stato fatto in vitro per decifrare i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il trasporto intracellulare attraverso BECs7,8,9,10, 11, ma tali sistemi non riescono a ricapitolare l'architettura complessa e la fisiologia dell'unità neurovascolare (NVU). D'altra parte, gli studi in vivo12,13 fornire dettagliate informazioni quantitative sui tassi di trasporto attraverso la Bee ma non forniscono le comprensioni nei meccanismi intracellulari di trasporto. Di conseguenza, indagando i componenti cellulari e intracellulari il NVU in vivo ed ex vivo rimane molto impegnativo14. Solo un numero limitato di tecniche è suscettibile di analizzare strutture subcellulari all'interno delle cellule il nvu. Maggior parte degli studi utilizza la microscopia elettronica, ma questa tecnica è limitata dai protocolli complessi necessari per la corretta preparazione e trattamento dei campioni. Quindi, abbiamo stabilito una metodologia basata sulla microscopia confocale ad alta risoluzione che faciliterebbe l'elaborazione dei campioni del cervello, l'analisi e la quantificazione dei compartimenti subcellulari all'interno delle cellule il nvu.
Qui, descriviamo un protocollo che utilizza sezioni digalleggiante di cervello di topo per eseguire imaging quantitativo del BBB e NVU a livello cellulare e subcellulare. Abbiamo testato e approvato un certo numero di anticorpi anti-immagine e ricostruire il NVU in tre dimensioni. Inoltre, questo protocollo permette la formazione immagine la risoluzione ottica massima di diffrazione limitata degli organelli all'interno dei capillari del cervello. Insieme con analisi dell'immagine, questo protocollo consente di indagare il trasporto intracellulare di macromolecole attraverso la Bee in diverse condizioni sperimentali, ad esempio in modelli murini di malattia di neurodegenerazione.
Protocol
etico approvazione per questo studio è stato fornito dal federale della sicurezza alimentare e veterinaria ufficio della Svizzera. Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti nel rigoroso rispetto dell'ordinanza federale sulla protezione degli animali e il benessere, nonché secondo le regole dell'associazione per la valutazione e l'accreditamento di laboratorio Animal Care International (AAALAC).
1. generazione di sezioni del cervello Free-Floating
- per garantire una qualità ottimale del campione, preparare una soluzione fresca di 2% paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tampone fosfato (PBS) il giorno della perfusione.
Attenzione: PFA è moderatamente tossico per contatto con la pelle e un probabile cancerogeno. Utilizzare guanti in nitrile per maneggiare PFA e preparare la soluzione sotto una cappa chimica.- Preparare 60 mL di soluzione PFA per animale.
- Bring PFA in soluzione aumentando il pH con 180-200 µ l di una soluzione KOH 5m per ogni 100 mL di PBS e riscaldamento la soluzione fino a 60 ° C.
Nota: NaOH non deve essere utilizzato come esso impatti negativamente la conservazione dei tessuti al momento della fissazione. - Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente e portare il pH fino a 7,4 utilizzando HCl. filtro la soluzione utilizzando carta da filtro (Vedi Tabella materiali).
- Eseguire una fissazione del mouse intero tramite aspersione di perfusione come descritto in precedenza 15 con alcune modifiche. In primo luogo, lavare il sangue dal sistema vascolare utilizzando 20 mL di PBS, quindi irrorare con 40 mL di 2% PFA.
- Rimuovere il cervello dal cranio come descritto in precedenza 15.
- Immergere un appena 2% PFA-irrorato cervello in 20 mL di 2% PFA per 7 h a 4 ° C per la post-fissazione.
Nota: Aumentando l'incubazione in PFA non è raccomandato come può impedire il rilevamento di strutture intracellulari. - Ampiamente lavare il cervello con PBS ghiacciata.
- Embed fissata cervelli in agarosio.
Soluzione
- preparare un agarosio al 3% in PBS utilizzando un forno a microonde per il riscaldamento. Agitare delicatamente la soluzione per raffreddarlo, ma evitare solidificazione.
- Asciugare l'eccesso di PBS intorno al cervello prima di immersione nella soluzione di agarosio in un contenitore di plastica. Ruotare il cervello dentro l'agarosio per rimuovere le bolle d'aria. Consentire l'agarosio a solidificare di raffreddarlo su Ice.
- Con attenzione rimuovere il blocco di agarosio dal contenitore di plastica e tagliare un cubo attorno al cervello con una lama di rasoio. Montare il cervello su un portacampioni vibratome (Vedi Tabella materiali) utilizzando la colla del cianoacrilato (Vedi Tabella materiali). Concedere tempo sufficiente per la colla per solidificare prima di procedere con il sezionamento.
- Trasferire il cervello nel portacampioni alla vasca tampone vibratome riempito con PBS. Utilizzare il vibratome per sezione 100 µm fette di cervello (sagittale o coronale). Raccogliere le sezioni di cervello in una piastra a 6 pozzetti precedentemente riempito con PBS.
- Alla finitura cervello sezionamento, attentamente rimuovere PBS e sostituire con una soluzione di 1:1 di PBS/glicerolo.
- Conservare sezioni in PBS/glicerolo da -20 ° C.
2. Cella o organello etichettatura mediante immunofluorescenza colorazione
- attentamente trasferimento una sezione del cervello in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti precedentemente riempito con 500 µ l di PBS. La sezione rimarrà nel pozzo stesso fino alla fine della procedura.
- Sciacquare la sezione due volte con 500 µ l di PBS per 5 min sotto agitazione delicata.
- Rimuovere il PBS ed eseguire blocco simultaneo e permeabilizzazione delle fette del cervello.
- Preparare una soluzione di blocco e permeabilizzazione con 0,3% Triton-X e 10% di siero di asino in PBS.
Nota: Il siero asino può essere sostituito con siero di capra per abbinare la specie ospite di anticorpi secondari specifici utilizzati. - Incubare sezioni con 250 µ l di soluzione di blocco e permeabilizzazione per 1 h a temperatura ambiente sotto agitazione delicata.
- Preparare una soluzione di blocco e permeabilizzazione con 0,3% Triton-X e 10% di siero di asino in PBS.
- Rimuovere la soluzione e aggiungere una soluzione di PBS contenente 5% di siero di asino e l'anticorpo primario a una diluizione appropriata (ad esempio, 1: 100 a 1:1, 000). Incubare per una notte a 4 ° C sotto agitazione delicata.
Nota: Vedere la Tabella materiali per un elenco degli anticorpi che etichettare correttamente i tipi differenti delle cellule di NVU con questo protocollo. La diluizione ottima di anticorpi primari deve essere determinata empiricamente. Per l'etichettatura simultanea di diversi antigeni, diluire tutti gli anticorpi primari nella stessa soluzione. Tutti gli anticorpi primari devono essere sollevati in specie diverse. Per migliorare la penetrazione dell'anticorpo, i campioni possono essere incubati per fino a 72 h a 4 ° C. - Rimuovi anticorpo soluzione lavaggio sezioni e tre volte per 10 min in PBS sotto leggera agitazione a temperatura ambiente. Rimuovere PBS e aggiungere 250 µ l PBS soluzione contenente 5% asino siero e l'anticorpo secondario fluorescente etichettato specie-specifica appropriata. Incubare le sezioni a temperatura ambiente per 1 h sotto agitazione delicata.
- Per un elenco degli anticorpi secondari utilizzati con questo protocollo, vedere Tabella materiali.
- Rimuovere le sezioni dell'anticorpo di soluzione e lavare tre volte per 10 min in PBS sotto leggera agitazione a temperatura ambiente.
- Rimuovere PBS e aggiungere 250 µ l di una 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) soluzione con una concentrazione finale di 1 µ g/mL. Incubare sezioni a temperatura ambiente per 10 minuti sotto agitazione delicata. Rimuovere le sezioni di soluzione e lavare DAPI 3 volte per 5 min con PBS.
- Montare la sezione del cervello su vetrini microscopia (ad es. lastre di vetro di histo-bond) di legame. Rimuovere delicatamente l'eccesso di PBS intorno alla sezione sulla diapositiva. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio (Vedi tabella materiali) sulla parte superiore della sezione di cervello e attentamente coprire con un vetrino coprioggetto in vetro borosilicato di 0,17 mm (n. 1.5).
- Conservare i campioni a 4 ° C al riparo dalla luce fino a eseguire l'acquisizione dell'immagine.
3. Imaging confocale ad alta risoluzione della barriera sangue - cervello
- acquisizione di immagini di eseguire con un laser-scanner adatto al microscopio confocale (Vedi Tabella materiali) con linee laser a 405, 488, 561 e 633 nm per l'eccitazione di fluorofori nelle regioni dello spettro della luce blue, verde, arancione e rosse. Per acquisizione di immagini, utilizzare un 63 X obiettivo olio con un'apertura numerica di 1.4.
- Nell'acquisizione menu del software che controlla il microscopio, impostare l'immagine parametri di acquisizione. Nel menu a discesa di ‘ dimensione della battuta ’, selezionare un valore di 1024 x 1024 pixel. Modificare la dimensione in pixel di un valore compreso tra 200 e 300 nm regolando il valore della ‘ Zoom ’ menu. ”
Nota: per l'analisi di strutture intracellulari, ridurre la dimensione in pixel a 75 nm. Questa impostazione di dimensione di immagine sostanzialmente aumenta il tempo di acquisizione e può essere ridotta a 512 x 512 pixel per diminuire il tempo di acquisizione da imaging un campo visivo ridotto. - Nella ' velocità di acquisizione ' menu a discesa, selezionare un valore di 400 Hz, cioè 400 linee al secondo. Nella ' impostazioni di sistemi & n. 39; menu, selezionare il ' profondità Pixel ' menu a discesa e modificare il valore a 12 bit.
- Del software di microscopio, entro il ' acquisizione ' scheda, attiva/disattiva l'opzione per l'acquisizione di frame sequential. Impostare lo spessore di sezione ottica su un valore compreso tra 0,75 e 1 µm per ogni canale modificando il valore nella ' Pinhole ' menu.
- Nel pannello per eccitazione fluorescente, attivare il laser per eccitare in modo ottimale i fluorophores nel campione, ad esempio una linea di laser nm 488 per un fluoroforo che emette verde necessaria.
Nota: Utilizzare un visualizzatore di spettri fluoroforo (Vedi Tabella materiali) per selezionare il laser adeguata eccitazione. - Nel pannello per rilevazione fluorescente, spostare il dispositivo di scorrimento per selezionare le lunghezze d'onda che saranno misurate in ogni canale, ad esempio tra 510 e 550 nm per un fluoroforo che emette verde.
Nota: Utilizzare un visualizzatore di spettri fluoroforo (Vedi Tabella materiali) per selezionare le lunghezze d'onda adeguata rilevazione. - Aggiungere una goccia di olio per immersione con un indice di rifrazione di 1,52 in cima il coprioggetto con la sezione del cervello che corrispondono l'indice di rifrazione del vetrino coprioggetti e obiettivo. Posizionare il campione al microscopio e accendere la lampada epifluorescente per visualizzare l'esempio utilizzando il binocolo microscopio.
- Utilizzando i pulsanti sul basamento, cambiare la ruota di filtro per selezionare un filtro appropriato per la visualizzazione di DAPI-ha macchiato i nuclei. Utilizzare la messa a fuoco macrometrica per portare il segnale da DAPI-ha macchiato i nuclei a fuoco.
- Utilizzando i pulsanti sul basamento, cambiare i filtri per visualizzare il segnale da marcatori vascolari (per esempio, CollagenIV o CD31) e centrare la visuale su un singolo segmento capillare.
- Premere il pulsante per avviare la modalità di scansione live. Durante la scansione regolare l'intensità del laser e di guadagno per ogni canale massimizzare la gamma dinamica delle immagini ed evitare saturazione pixel.
Nota: Utilizzare una tabella di look-up che etichette saturi pixel per valutare visivamente la sovrasaturazione. Per evitare sovra-saturazione del segnale, regolate le impostazioni con il campione che si prevede di avere il più alto segnale fluorescente. - Impostare il valore per la linea in media a 2.
Nota: Quando si utilizza la più alta velocità di acquisizione, aumentare questo valore per ridurre il rumore. - Stabilire iniziano e finiscono le sezioni per l'esecuzione di ottico z-stack che si estendono su tutto il volume del vaso capillare. Utilizzare una dimensione di passaggio di 0,45 µm.
Nota: Se immagini verranno utilizzati per la successiva quantificazione, mantenere le stesse impostazioni di acquisizione per il set di dati completo. - Per la quantificazione, acquisire 10-20 z-stack per ogni sezione da almeno tre diversi topi per i confronti statistici.
Nota: Acquistare il set completo di dati nella stessa sessione per ridurre la variabilità derivanti dalle fluttuazioni di intensità di candeggio e laser campione.
4. Image Processing e 3D ricostruzione dell'unità neurovascolare
- (facoltativo) per aumentare la risoluzione assiale degli z-stack acquisite, eseguire deconvoluzione del set di dati di immagine usando il software adatto (Vedi tabella materiali ).
- Del software di deconvoluzione, modificare le impostazioni per eseguire " cieco " deconvoluzione, (cioè, utilizzando una funzione di punto di diffusione adattiva).
- Nelle impostazioni del software di deconvoluzione, attiva/disattiva l'opzione per la rimozione dello sfondo; questa opzione determinerà il valore di intensità più piccolo nello stack di immagine e sottrarre i valori di intensità da tutti i pixel nell'immagine.
- Nelle impostazioni del software di deconvoluzione, disattivare le opzioni per il ridimensionamento di intensità e ridimensionamento in profondità di 16 bit; queste opzioni manterrà i valori originali di intensità e gamma dinamica delle immagini.
- Nel menu del ' indice di rifrazione ', impostare il valore di 1,52. Nella ' impostare lunghezza d'onda ' menu, selezionare l'emissione valori per ciascun canale dell'immagine. Ad esempio, selezionare 520 per un fluoroforo che emette verde.
- Aprire il set di dati di immagine utilizzando un software per la visualizzazione e l'analisi di insiemi di dati 3-dimensionale (Vedi Tabella materiali). Nel software di analisi di immagine, premere il " Surpass " pulsante per eseguire il rendering il volume 3D di capillari.
- Dalla stampa di software di analisi immagine il " Aggiungi nuova superficie " pulsante per segmentare la superficie capillare. Utilizzare le frecce verso il basso per spostarsi tra i passaggi della procedura guidata di creazione della superficie.
- Alla ' crea ' scheda, impostare il canale sorgente al canale con capillare marcatore, ad esempio CollagenIV e impostare il dettaglio di superficie per un valore di 0,5 µm.
Nota: L'opzione di quest'ultima si applica un filtro gaussiano all'immagine e determina la levigatezza della superficie. - Nel ' creare ' scheda, attiva/disattiva l'opzione per soglia di intensità assoluta.
Nota: Questa opzione creerà una superficie generando una maschera in base all'intensità assoluta del canale selezionato nell'immagine. - Il passaggio successivo della procedura guidata di creazione della superficie, regolare la soglia di intensità più bassa per la superficie spostando la finestra scorrevole attraverso l'istogramma di intensità fino a quando la maschera rendering copre l'intero capillare nell'immagine. Determinare l'intervallo di valori per questo parametro empiricamente per ogni set di dati.
- Durante il passaggio finale della procedura guidata di creazione della superficie, fare clic sul menu a discesa sotto " filtro tipo " e selezionare l'opzione ' numero di voxel '. Impostare il numero minimo di voxel su un valore compreso tra 1.0e5 a 2.0e5.
Nota: Questa opzione escluderà le superfici con un piccolo numero di voxel, ad esempio, piccoli segmenti di capillari al bordo del telaio. - Completare la procedura guidata di creazione di superfici e salvare i parametri di creazione facendo " ricordare i parametri " nella scheda di ricostruzione del menu superficie.
- Ripetere la procedura per l'intero set di dati di immagini da caricare il set di parametro utilizzato per la prima immagine. Regolare i parametri per l'intensità, soglia e numero minimo di voxel per ciascuna immagine da conto le differenze di intensità di sfondo e morfologia capillare, rispettivamente.
- Alla ' crea ' scheda, impostare il canale sorgente al canale con capillare marcatore, ad esempio CollagenIV e impostare il dettaglio di superficie per un valore di 0,5 µm.
- Al segmento strutture vescicolari intracellulari (ad es., gli endosomi immunoglobulina-riempito), innanzitutto creare un nuovo canale che include solo il segnale fluorescente all'interno del capillare.
Nota: Questo processo definisce una regione di interesse creando una maschera utilizzando la superficie capillare creata nel passaggio 4.3- selezionare il ' modifica ' menu nella ' superficie capillare ' pannello. Sotto ' maschera proprietà ', fare clic su " maschera tutti ". Selezionare il canale che contiene il segnale delle vescicole intracellulari come il ' canale sorgente ' e attiva/disattiva l'opzione " Duplica canale prima di applicare la maschera ".
- Nella ' maschera Impostazioni ' colonna, seleziona " costante all'interno/esterno " e " impostare voxel superficie a esterna: " e impostarne il valore su 0.00.
Nota: Questo processo creerà un canale aggiuntivo nell'immagine dove tutti i voxels fuori la maschera capillare avrà un valore di intensità pari a 0. Per quantificare gli eventi di fuori del capillare (cioè, nel parenchima del cervello), scegliere " impostare voxel all'interno superficie a: " e impostarne il valore su 0.00. - Al segmento strutture vescicolari, premere il pulsante per avviare la " aggiungere nuovi spot " guidata. Utilizzare le frecce verso il basso per spostarsi tra i passaggi della procedura guidata di creazione della superficie.
- Nella scheda Crea, utilizzare l'elenco a discesa sotto " canale sorgente " per selezionare il canale mascherato intracellulare creato nel passaggio 4.4.4.
- Nella scheda Crea, sotto la " Spot rilevamento " sezione, impostare il diametro stimato di XY su un valore compreso tra 0,5 e 1 µm, a seconda della dimensione media delle vescicole osservata in l'esperimento. Questa opzione determina la dimensione più piccola che verrà rilevata dall'algoritmo di segmentazione.
- Nella scheda Crea, sotto la " Spot rilevamento " sezione, attiva/disattiva l'opzione per " sfondo sottrazione ".
Nota: Questa opzione sarà liscio l'immagine con un filtro gaussiano di 0,75 raggio (dal valore selezionato nel passaggio 4.4.7) e sottraendo l'intensità dell'immagine originale gaussiana filtrati da 0,88 raggio. - Nel ' creare ' scheda, premere il menu a discesa sotto ' filtro tipo ' e selezionare " qualità ". Si noti che questo verrà segmentare l'immagine applicando le soglie in base all'intensità al centro delle macchie. Regolare la soglia di intensità inferiore spostando la finestra scorrevole attraverso la ' qualità ' istogramma finché la maggior parte delle vescicole identificabili è etichettata.
Nota: L'intervallo di valori per questo parametro deve essere determinata empiricamente per ogni set di dati. - Completare la procedura guidata di creazione di spot e salvare i parametri di creazione premendo il pulsante " ricordare i parametri " nella scheda di ricostruzione del menu superficie.
- Ripetere la procedura per l'intero set di dati di immagini da caricare il set di parametro utilizzato per la prima immagine. Regolare i parametri per il ' soglia di intensità di qualità ' per ciascuna immagine da tenere conto delle differenze nell'intensità di sfondo.
5. Quantificazione del trasporto intracellulare a BBB
- quantificare il volume (in µm 3) e la zona (in µm 2) del segmento capillare. Nel software di analisi, è necessario accedere al pannello di statistiche della superficie vascolare creato al punto 4.3. Selezionare il ' Detailed ' scheda e utilizzare il menu a discesa per selezionare " tutti i valori " per trovare i valori per volume e area.
- Quantificare il numero delle vescicole all'interno del segmento capillare. Nel software di analisi, è necessario accedere al pannello di statistiche dei punti creati al punto 4.4. Selezionare il ' generale ' scheda per trovare il valore del numero totale dei punti dell'immagine.
- Per calcolare il numero delle vescicole per capillare di volume, per ogni immagine normalizzare il numero di spot per il volume calcolato al punto 5.1. Moltiplicare questo valore per 1.000 per ottenere il numero di vescicole a 1.000 µm 3 del volume capillare.
- Per quantificare l'intensità totale all'interno del capillare crea una nuova superficie che copre i seguenti intera immagine le istruzioni descritte nei passaggi 4.3 con le seguenti modifiche. Selezionare il canale che contiene il segnale pertinente (ad es., mIgG) come canale sorgente e impostare il valore del livello di dettaglio di superficie a 5 µm. Per creare una superficie che copre l'intera immagine, impostare il valore della soglia di intensità inferiore a 0.
- Del software di analisi, accedere al pannello di statistiche della superficie creata al punto 5.4. Selezionare il " Detailed " scheda e utilizzare il menu a discesa per selezionare " tutti i valori ". Registrare i valori per ' intensità somma ' per i canali di interesse; Questo parametro corrisponde alla somma dei valori di intensità individuale sopra tutti i pixel.
Nota: Per un segnale intracellulare, ciò corrisponde al canale duplicato con voxel fuori superficie impostato a 0.0. Per un segnale nel parenchima del cervello, ciò corrisponde al canale duplicato con voxel all'interno superficie impostata su 0.0. - Per calcolare l'intensità di fluorescenza per capillare di volume, per ogni immagine normalizzare l'intensità di volume calcolato al punto 5.1. Moltiplicare questo valore per 1.000 per ottenere il valore di intensità di fluorescenza per 1.000 µm 3 del volume capillare.
Nota: Per i segnali fluorescenti nel parenchima del cervello, normalizzare i valori per il volume di immagine totale meno il volume capillare e moltiplicare per 1.000 per ottenere l'intensità totale per 1.000 µm 3 del parenchima del cervello. - Ripetere la procedura per l'intero set di dati e utilizzare il software appropriato per eseguire l'analisi statistica dei dati.
Representative Results
Come esempi rappresentativi delle immagini ottenute dal protocollo descritto qui, sezioni di cervello di topo sono stati macchiati con anticorpi che riconoscono diverse componenti di NVU compreso della membrana dello scantinato, astrociti, periciti e cellule endoteliali (Vedi Tabella materiali per anticorpi specifici utilizzati) (Figura 1A, D ed E). A questa risoluzione è possibile distinguere i singoli processi astrocitari e fine-piedi che sono a diretto contatto con i vasi capillari.
Per evidenziare l'idoneità di questo protocollo per la rilevazione di strutture intracellulari, sezioni di cervello da animali iniettati perifericamente con l' anticorpo umano anti-Tau mAb8616 sono state macchiate con un anticorpo anti-umano fluorescente etichettato ( Figura 1B). mAb86 è noto in particolare i neuroni bersaglio che esprimono una forma patologica di Tau16. Mediante il protocollo descritto nel presente documento, mAb86 è stato rilevato con diffrazione limitata risoluzione all'interno di singole strutture vescicolari all'interno dei neuroni (Figura 1B-C). Inoltre, IgG di topo endogeno è stato rilevato in strutture intracellulari all'interno delle cellule endoteliali ma non nei periciti (D-E diFigura 1e Figura 2).
L'acquisizione di z-stack confocale ad alta risoluzione del vasculature cerebrale permette per la segmentazione tridimensionale dei vasi capillari e vescicole intracellulari a BBB. La figura 2 Mostra un esempio del processo di rendering e segmentare un capillare etichettato con CollagenIV e mouse IgG positivi intracellulare vescicole. Quantificando un set di dati completo di immagini segmentate, ad esempio misurando il numero di vescicole per capillare di volume, è possibile studiare i cambiamenti nei processi di trasporto intracellulare in condizioni diverse. Figura 3 B-C Mostra le differenze d'intensità di fluorescenza e numero vescicola di mIgG corrispondente mIgG al parenchima del cervello, rispettivamente, su Pericita svuotamento nel modello del topo di pdgf-bret/ret come precedentemente segnalato 17. lo stesso approccio è stato anche recentemente utilizzato per analizzare i cambiamenti nel trasporto intracellulare al BBB tra differenti del cervello regioni18.
Figura 1: Etichettatura di più tipi di cellule e strutture subcellulari del neurovascolare Unit Immagini rappresentative dell'unità neurovascolare (A e D) e vescicole intracellulari contenute all'interno dei neuroni (B) o cellule endoteliali (E) ottenute con questo protocollo. L'immagine di proiezione massima intensità in A (in alto) Mostra la distribuzione degli astrociti GFAP-positivo (rossi) che circondano capillari etichettati da CollagenIV (verdi). Frecce puntano ai singoli processi astrocytic. Barra della scala = 20 µm. A questa risoluzione, i singoli Astrocita processi e puntali sono chiaramente visibili, come mostrato nell'immagine ingrandita della regione "in box" (in basso). Punte di freccia indicano puntali astrocytic. Barra della scala = 10 µm. L'immagine in B Mostra l'accumulo di un anticorpo iniettato perifericamente, mAb86 (verde), all'interno di un neurone hippocampal. Le punte delle frecce scegliere singole mAb86-positivi vescicole. Barra della scala = 10 µm. Il grafico c Mostra l'intensità del profilo di linea di una singola vescicola. La dimensione della vescicola è stata stimata da tutta la larghezza a metà altezza di una misura gaussiana (linea nera continua) della curva di intensità (linea verde e cerchi). Le immagini d mostrano una ricostruzione tridimensionale di una cellula endoteliale (verde) circondata da un Pericita (rosso) all'interno della lamina basale (CollagenIV, grigio). I pannelli inferiori mostrano i canali individuali di fluorescenza. Barra della scala = 10 µm. Le immagini in E mostrano la localizzazione di mIgG (rosso) in vescicole intracellulari all'interno delle cellule endoteliali (pannello, CD31 in verde a sinistra) ma non in periciti (pannello di destra, CD13 in verde). In tutte le immagini, DAPI macchiato i nuclei sono mostrati in blu. Barra della scala = 5 µm. pannelli D ed E sono stati modificati dal riferimento17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Rendering tridimensionale dei vasi capillari e vescicole intracellulari presso la barriera sangue - cervello. Con il protocollo descritto, immagini ad alta risoluzione confocal di capillari CollagenIV-positivo (verdi) e mouse IgG vescicole intracellulari (rosso) sono state acquisiti (A). Il pannello di sinistra mostra una singola sezione ottica con sezioni trasversali. Le frecce puntano ai singole mIgG-positivi vescicole all'interno delle cellule endoteliali del cervello. Il pannello sulla destra mostra il 3D ricostruzione del z-stack completo utilizzando software elaborazione immagini (Vedi Tabella materiali). Il volume capillare (B) e vescicole individuali (C) sono stati resi in tre dimensioni e quantificati tramite software di elaborazione immagine (Vedi Tabella materiali). In tutte le immagini, DAPI macchiato i nuclei sono mostrati in blu. Scala bar = 5 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Quantificazione di mIgG localizzazione intracellulare al BBB. Immagini rappresentative, mostrando (A) ricostruzioni tridimensionali dei capillari (etichettati con collagenIV, verde) e la distribuzione di mIgG (rosso) in topi C57BL/6 e pdgf-bret/ret Pericita impoverito topi precedentemente descritto in19. Barre di scala = 10 µm. Le immagini in B mostrano la segmentazione delle vescicole intracellulari all'interno della maschera di CollagenIV. THe grafico in B , la quantificazione e il confronto del numero delle vescicole mIgG per volume di capillare. Ogni punto rappresenta misure da singoli segmenti capillari. La linea continua indica la media e le barre di errore rappresentano la deviazione standard dei dati. Le immagini in C Visualizza la segnale di fluorescenza mIgG fuori la maschera di CollagenIV. Allo stesso modo, il grafico c Mostra la quantificazione e il confronto di intensità di fluorescenza mIgG nel parenchima del cervello fra i topi C57BL/6 e pdgf-bret/ret Pericita impoverito topi. Unità di intensità di fluorescenza sono stati normalizzati dall'intensità del parenchima mIgG medio misurato in tutti i topi C57BL/6. Questa figura è stata modificata dal riferimento17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Discussion
Il protocollo di cui sopra descrive la preparazione di sezioni digalleggiante del cervello, macchiatura immunofluorescente, acquisizione di immagini e parametri di analisi per microscopia ad alta risoluzione della BBB. Questo metodo è stato recentemente utilizzato per studiare la localizzazione di anticorpo consegna piattaforme3, il trasporto di IgG endogeno attraverso la BBB17e l'eterogeneità della BBB su Pericita perdita18. Diverse fasi del protocollo possono essere modificati per adattarsi all'obiettivo specifico dell'esperimento. In primo luogo, l'uso di sezioni spesse (100 µm) facilita la loro manipolazione durante le procedure di montaggio e di immunostaining. Permette anche per la ricostruzione 3D della rete capillare, l'unità neurovascolare e per la generazione di sezioni trasversali NVU e capillare. Tuttavia, penetrazione di anticorpi all'interno delle sezioni del tessuto può variare e alcuni macchiatura dell'anticorpo può essere limitata allo strato superficiale del tessuto vicino il vetrino coprioggetti. Il protocollo può essere modificato aumentando la concentrazione di detersivo durante il passaggio di permeabilizzazione e/o la lunghezza del passo permeabilizzazione per migliorare la penetrazione dell'anticorpo nel tessuto. In secondo luogo, la qualità dell'immagine può essere compromessa quando si tenta di acquisire immagini più profonde all'interno del tessuto (di solito 20-30 µm sotto la superficie) a causa di dispersione della luce così come aberrazioni ottiche dalla mancata corrispondenza di indice di rifrazione. Per ovviare a questo problema, nuovi metodi per schiarimento del tessuto e dell'anticorpo attivo penetrazione20 possono essere combinati con questo protocollo per grandi volumi di immagini del tessuto. In terzo luogo, deconvoluzione viene eseguita dopo l'acquisizione di immagini per migliorare la risoluzione assiale dell'immagine. La scelta dell'algoritmo di deconvoluzione cieco utilizzato in questo protocollo si basava su (i) la sua facilità d'uso, come richiesto, nessun pre-calcolo della funzione di diffusione del punto (ii) la sua robustezza per il miglioramento della qualità di immagine21e (iii) la mancanza di manufatti su mIgG strutture intracellulari dopo l'implementazione. A seconda delle strutture intracellulari visualizzate nell'esempio, altri algoritmi di deconvoluzione potrebbero causare immagini di qualità superiore. I seguenti riferimenti21,22 forniscono un ampio dibattito sui vantaggi e limitazioni degli ulteriori algoritmi di deconvoluzione di immagine. Infine, l'uso di un pacchetto di software di analisi di immagine ha permesso la segmentazione dei capillari e strutture intracellulari in tre dimensioni. Chiaramente l'analisi dell'immagine non è limitato al software descritto nel protocollo e pacchetti alternativi, ad esempio quelli discussi in riferimento23, può essere utilizzato per immagini del segmento. L'idoneità dei programmi software diversi per l'analisi delle strutture intracellulari attraverso la Bee deve essere verificata empiricamente valutando la precisione di segmentazione di immagini.
Poiché questo metodo si basa su campioni fissati, non fornisce informazioni dirette sulle dinamiche di transcitosi attraverso la Bee. Tuttavia, si può abbinare con esperimenti di tempo-corso24, ad esempio per via endovenosa iniettando la molecola di interesse e misurando il suo accumulo all'interno di BECs in diversi momenti dopo l'iniezione, per ricostruire la cinetica di trasporto intracellulare. Il vantaggio di questo approccio è che permette l'analisi delle regioni profonde del cervello, come mostrato in18, che sono attualmente inaccessibile al videomicroscopia approcci di imaging dal vivo. Un passaggio fondamentale durante il protocollo è l'attento monitoraggio della fissazione del tessuto. Fissaggio con 4% PFA riduce drasticamente l'immunogenicità degli organelli intracellulari e di immunoglobuline endogena o marginalmente amministrato17 (Figura 1B). Una limitazione di questo protocollo è relativo requisito degli anticorpi di alta qualità (cioè, bassa colorazione aspecifica, bassa reattività crociata) adatti a immunofluorescenza. Purché tali reagenti sono disponibili, il metodo può essere applicato per studiare la localizzazione intracellulare di tutta la proteina di interesse. Ad esempio, il protocollo è stato utilizzato per identificare i lisosomi nel cervello cellule endoteliali17. Si deve inoltre osservare che, poiché questo protocollo si basa su microscopia confocal, la risoluzione laterale è limitata dalla diffrazione e non è possibile risolvere strutture più piccoli di circa 175 a 250 nm (Figura 2).
Gli studi precedenti hanno effettuato analisi dettagliata della composizione cellulare dell'unità neurovascolare usando microscopia confocale25,26. Tuttavia, indagando il trasporto intracellulare a BBB si basa principalmente sull'uso di microscopia elettronica di trasmissione19,27,28. Mentre questo metodo offre la massima risoluzione laterale di strutture intracellulari, microscopia elettronica rimane una tecnica impegnativa con bassa velocità effettiva. Inoltre, il numero di bersagli molecolari differenti che possono essere visualizzate da EM è molto limitato. Questo protocollo offre un'alternativa accessibile per studiare il trasporto intracellulare a BBB. La procedura completa, dall'accumulazione del cervello all'analisi di immagine, può essere eseguita in 5 o 6 giorni. Se gli anticorpi adatti sono disponibili, immunofluorescenza consente la rilevazione simultanea di più tipi/molecole delle cellule all'interno del campione stesso. Inoltre questo protocollo potrebbe essere combinato con tecniche di microscopia di Super-risoluzione per superare i limiti nella risoluzione spaziale29. Nel complesso, il protocollo sopra descritto consente la quantificazione dei cambiamenti nella localizzazione intracellulare di proteine di interesse all'interno dell'unità neurovascolare. Sua applicazione per diverse perturbazioni genetiche o farmacologiche permetterà di indagare le funzioni struttura e trasporto intracellulare di BBB in vivo.
Disclosures
Gli autori sono sotto lavoro retribuito da Roche.
Acknowledgments
R.V. lavoro è stato supportato da una borsa di studio post-dottorato Roche (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
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