Summary
Здесь мы представляем это протокол на основе микроскопии высокого разрешения изображений и трехмерной реконструкции мыши блок нервно-сосудистого и blood - brain барьер мозга свободно плавающего секций. Этот метод позволяет для визуализации, анализа и количественной оценки внутриклеточных органелл в BBB.
Abstract
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) — это динамический многоклеточных интерфейс, который регулирует транспорт молекул между распространением и мозг. Трансцитоз через BBB регулирует доставку гормонов, метаболитов и терапевтических антител к паренхимы мозга. Здесь мы представляем протокол, который сочетает в себе иммунофлюоресценции свободно плавающего секций с лазерного сканирования конфокальная микроскопия и анализ изображений для визуализации внутриклеточных органелл в эндотелиальных клеток на уровне BBB. Сочетание этого набора данных с 3D изображений программное обеспечение для анализа позволяет для полуавтоматических сегментации и количественной оценки капиллярного объема и площади поверхности, а также числа и интенсивности внутриклеточных органелл в BBB. Чтобы проиллюстрировать метод используется обнаружение мыши эндогенного иммуноглобулина (IgG) в пределах внутриклеточных везикулы и их количественная оценка на уровне BBB. Этот протокол потенциально могут применяться к исследованию механизмов, контролирующих BBB Трансцитоз различных молекул в естественных условиях.
Introduction
Гематоэнцефалический барьер (ГЭБ) является непрерывной сотовой барьер формируется астроциты, pericytes, нейроны и эндотелиальных клеток, отделяющий центральной нервной системы (ЦНС) от циркуляции крови1. Правила транспорта через BBB играет решающую роль в поддержании гомеостаза головного мозга и опосредовано специализированные свойства эндотелиальных клеток мозга (ящики). Присутствие плотные межклеточные соединения между ящики и низкий уровень базальной Трансцитоз ограничить перевозки кровь молекул, соответственно2в параклеточный и transcellular. Недавно Трансцитоз путь в ящики были использованы для улучшения доставки терапевтического больших молекул до мозга3,4. Однако механизмы Трансцитоз через BBB еще не были полностью характеризуется5,6.
Была проделана обширная работа в vitro расшифровать молекулярных и клеточных механизмов, регулирующих внутриклеточного транспорта через ящики7,8,9,10, 11, но таких систем не повторить сложные архитектуры и физиологии нервно-сосудистого подразделения (NVU). С другой стороны исследования в vivo12,13 представить подробную количественную информацию о транспортных ставок через BBB, но не обеспечивают понимание внутриклеточных механизмов транспорта. Таким образом расследование сотовой и внутриклеточных компонентов NVU in vivo и ex vivo остается весьма сложной14. Только ограниченное количество методов для анализа внутриклеточных структур внутри клетки NVU. Большинство исследований использования электронной микроскопии, но эта техника ограничивается сложные протоколы, необходимые для подготовки надлежащего ткани и пробами. Таким образом мы создали методологию, основанную на конфокальная микроскопия высокого разрешения, которая облегчит обработку образцов мозга, анализа и количественной оценки субцеллюлярные отсеков в ячейках NVU.
Здесь мы описываем протокол, который использует свободно плавающего секции мозга мыши для выполнения количественных изображений BBB и NVU на клеточном и субклеточном уровнях. Мы протестировали и проверить количество антител к изображения и реконструировать NVU в трех измерениях. Кроме того этот протокол позволяет изображений на Максимальное оптическое разрешение дифракционный органелл в пределах капилляров мозга. Вместе с анализа изображений этот протокол может использоваться для изучения внутриклеточного транспорта макромолекул через BBB в различных экспериментальных условиях, например в мыши нейродегенеративные болезни модели.
Protocol
этические утверждения для этого исследования была оказана федеральной безопасности пищевых продуктов и ветеринарное управления Швейцарии. Всех животных эксперименты проводились в строгом соответствии с швейцарским федеральным постановлением по защите животных и благосостояния, а также в соответствии с правилами ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных международного (AAALAC).
1. поколение мозга Free-floating секции
- для обеспечения оптимального образец качества, готовить свежий раствор 2% параформальдегида (PFA) в фосфатный буфер (PBS) в день перфузии.
Предупреждение: PFA умеренно токсичен, путем контакта с кожей и вероятный канцероген. Используйте перчатки нитриловые для обработки ППД и подготовить решение под химических зонта.- Подготовить 60 мл раствора ПФА в животное.
- Принесите ПФА в раствор, увеличивая рН с 180-200 мкл раствора KOH 5 M на каждые 100 мл PBS и Отопление раствора до 60 ° C.
Примечание: NaOH не должны использоваться как это отрицательно влияет на сохранение ткани после фиксации. - Дайте решение остыть до комнатной температуры и довести рН до 7,4, с использованием HCl. фильтра решения с помощью фильтровальной бумаги (см. Таблицу материалы).
- Выполнить фиксацию весь мыши через transcardial перфузии как описано 15 с некоторыми изменениями. Во-первых, очистить кровь от сосудистую, с использованием 20 мл PBS, то perfuse с 40 мл 2% PFA.
- Удаление мозга от черепа как описано 15.
- Погрузиться свежезаваренным 2% PFA-увлажненную мозга в 20 мл 2% PFA для 7 ч при температуре 4 ° C для после фиксации.
Примечание: Увеличение инкубации в PFA не рекомендуется, поскольку это может предотвратить обнаружение внутриклеточных структур. - Широко мыть мозга с ледяной PBS.
- Вставлять фиксированной мозги в агарозы.
- Подготовить 3% агарозном раствор в PBS с помощью микроволновую печь для отопления. Аккуратно водоворот решение чтобы охладить его, но избежать затвердевания.
- Высушить избыток PBS вокруг мозга до погружения в раствор агарозы в пластиковый контейнер. Вращайте мозг внутри агарозы для удаления пузырьков воздуха. Разрешить агарозы закрепить путем охлаждения на льду
- Тщательно удалить блок агарозы из пластикового контейнера и отрезать куб вокруг мозга с помощью лезвия бритвы. Смонтировать мозг на держатель образца vibratome (см. Таблицу материалы) с использованием Цианакрилатный клей (см. Таблицу материалы). Достаточно времени для клея закрепить, прежде чем продолжить с резании.
- Передачи мозг в держатель образца в лоток vibratome буфер заполнен с PBS. Используйте vibratome чтобы раздел 100 мкм мозга ломтиками (Сагиттальная или корональных). Собирать мозга разделы 6-ну тарелку ранее заполнены с PBS.
- После окончания мозга секционирование, тщательно удалить PBS и заменить раствором 1:1 PBS/глицерола.
- Хранить разделы в PBS/глицерин при -20 ° с.
2. Клетки или органеллы, маркировки, иммунофлюоресценции окрашивание
- тщательно передачи Секции мозга в колодец 24-ну плиты ранее заполнены с 500 мкл PBS в колодец. Секция будет оставаться в том же хорошо до конца процедуры.
- Промойте разделе дважды с 500 мкл PBS для 5 мин под нежным агитации.
- Удалить PBS и выполнения синхронного блокирования и permeabilization срезы мозга.
- Подготовить блокировки и permeabilization раствор 0,3% Тритон-X и 10% сыворотки осел в PBS.
Примечание: Осел сыворотки могут быть заменены козьего сыворотки для сопоставления узла видов конкретных вторичные антитела, которые используются. - Инкубировать секции с 250 мкл блокировки и permeabilization решения для 1 ч при комнатной температуре под нежным агитации.
- Подготовить блокировки и permeabilization раствор 0,3% Тритон-X и 10% сыворотки осел в PBS.
- Удалить решение и добавить PBS раствора, содержащего 5% осла сыворотки и основное антитело на соответствующие разрежения (например, 1: 100 до 1:1, 000). Инкубируйте на ночь при 4 ° C под нежным агитации.
Примечание: См. Таблицу материалов для списка антител, которые успешно этикетки различных клеточных типов NVU с настоящим Протоколом. Оптимальное разведение первичного антитела должны определяться эмпирически. Для одновременного маркировки различных антигенов, разбавляют всех первичных антител в том же решении. Все первичного антитела должны быть повышены в разных видов. Для улучшения проникновения антитела, образцы можно инкубированы для до 72 ч в 4 ° C. - Удалить антитела решения и мыть секции три раза по 10 мин в PBS под нежным агитации при комнатной температуре. Удаление PBS и добавить 250 мкл раствора PBS содержащий осла 5% сыворотки и соответствующие вегетационных дневно помечены вторичное антитело. Инкубировать секций при комнатной температуре 1 h под нежным агитации.
- Смотрите Таблицу материалы список вторичные антитела, которые используются с настоящим Протоколом.
- Удалить разделы решения и мыть антитела три раза по 10 мин в PBS под нежным агитации при комнатной температуре.
- Удаление PBS и 250 мкл 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) раствор с конечной концентрации 1 мкг/мл. Инкубируйте секций при комнатной температуре на 10 минут под нежным агитации. Удалять DAPI решения и мыть разделы 3 раза за 5 мин с PBS.
- Смонтировать раздел мозга на склеивание микроскопии слайдов (например, стеклянных скольжениях гисто Бонд). Осторожно удалите избыток PBS вокруг раздела на слайде. Добавить каплю монтажа средних (см. таблицу материалы) на верхней части мозга и тщательно покрыть ее с coverslip боросиликатного стекла 0,17 мм (№ 1,5).
- Хранить образцы на 4 ° C, защищенном от света до выполнения захвата изображений.
3. Высоким разрешением конфокальный Imaging Blood - brain барьер
- выполнение захвата изображений с подходящей лазерное сканирование конфокального микроскопа (см. Таблицу материалы) с лазерной линии на 405, 488, 561 и 633 нм для возбуждения флуорофоров в синий, зеленый, оранжевый и красный регионах светового спектра. Для захвата изображений, используйте 63 X нефти цель с числовой апертуры 1.4.
- В приобретении меню программного обеспечения, которое контролирует микроскопом, задать изображение приобретения параметры. В раскрывающемся меню ‘ размер изображения ’, выберите значение 1024 x 1024 пикселей. Изменить размер пикселя в значение между 200 и 300 Нм, регулируя значение ‘ Zoom ’ меню. ”
Примечание: для анализа внутриклеточных структур, уменьшить размер пиксела до 75 Нм. Этот параметр Размер изображения существенно увеличивает время приобретения и может быть сокращена до 512 x 512 пикселов для уменьшения времени приобретения изображения меньшее поле зрения. - В ' скорость приобретения ' раскрывающегося меню, выберите значение 400 Гц, то есть 400 линий в секунду. В ' системах параметры & #39; меню, выберите ' Глубина ' выпадающего меню и измените его значение на 12 бит.
- Микроскоп программного обеспечения, в рамках ' приобретения ' вкладку, переключение на опцию на приобретение последовательных кадров. Задать толщину оптически разделе значение в диапазоне от 0,75 и 1 мкм, для каждого канала, изменив значение в ' отверстие ' меню.
- В панели для возбуждения флуоресцентных, активировать лазер для оптимально возбуждают флуорофоров в образце, например 488 нм лазер линию для Грин излучающих Флюорофор.
Примечание: Используйте средство просмотра спектров Флюорофор (см. Таблицу материалы) для выбора надлежащего возбуждения лазер. - В панели для флуоресцентного обнаружения, переместите ползунок для выбора длины волн, которые будут оцениваться в каждом канале, например между 510 и 550 Нм для Грин излучающих Флюорофор.
Примечание: Используйте средство просмотра спектров Флюорофор (см. Таблицу материалы) для выбора адекватного выявления длинах волн. - Добавить каплю масла погружения с преломления 1.52 поверх coverslip с Секцией мозга соответствует преломления стекла coverslip и цель. Поместите образец в микроскоп и включите epifluorescent лампа для визуализации образца с помощью микроскопа бинокль.
- С помощью кнопок на стенде Микроскоп, изменить фильтра колесо, чтобы выбрать фильтр, подходящий для визуализации DAPI-окрашенных ядер. Используйте грубый фокус довести сигнал от DAPI-окрашенных ядер в фокус.
- С помощью кнопок на стенде Микроскоп, изменить фильтры для визуализации сигнала от сосудистых маркеров (например, CollagenIV или CD31) и центру поля зрения на сегмент отдельных капилляров.
- Нажмите на кнопку, чтобы начать режим live сканирования. В процессе сканирования настроить выгоды и лазерной интенсивности для каждого канала, чтобы увеличить динамический диапазон изображений и избежать насыщения пикселей.
Примечание: Используйте таблица, которая этикетки насыщенных пикселей визуально оценить перенасыщенности. Чтобы избежать сигнал перенасыщенности, настройки с образцом, который, как ожидается, имеют высокие флуоресцентного сигнала. - Значение для строки, в среднем 2.
Примечание: При использовании более высоких скоростях приобретения, увеличить это значение, чтобы уменьшить шум. - Создать начинаются и заканчиваются секции для выполнения оптических z стеки, которые охватывают весь объем капилляра. Использовать размер шага 0,45 мкм.
Примечание: Если изображения будут использоваться для количественной оценки последующих, сохранить те же параметры приобретения для полного набора данных. - Для количественной оценки, приобрести 10-20 z стеки каждой секции от по крайней мере три различных мышей для статистических сопоставлений.
Примечание: Приобретение полного набора данных в той же сессии, чтобы снизить изменчивость выборки отбеливания и лазерной интенсивности колебаний.
4. Изображения обработки и 3D реконструкции нервно-сосудистого
- (необязательно) для увеличения осевой резолюции приобретенных z стеки, выполняют деконволюция изображений набора данных с использованием соответствующего программного обеспечения (см. таблицу материалы ).
- В деконволюция программное обеспечение, изменить настройки для выполнения " слепых " свёртки, (т.е., с использованием адаптивного точки распространения функция).
- В настройках программного обеспечения Деконволюция, переключение на опцию для удаления фона; этот параметр определяет наименьшее значение интенсивности в стек изображений и вычесть его из значения интенсивности от всех пикселов в изображении.
- В настройках программного обеспечения Деконволюция, отключить варианты для дефлирования интенсивности и размера с глубиной 16 бит; эти варианты будут держать оригинальные значения интенсивности и динамический диапазон изображений.
- В меню ' преломления ', установите значение 1.52. В ' набор волны ' меню, выберите значения выбросов для каждого канала изображения. Например, выберите 520 для Грин излучающих Флюорофор.
- Открыть набор данных изображений с помощью программного обеспечения для визуализации и анализа 3-мерных наборов данных (см. Таблицу материалы). В программное обеспечение анализа изображения, нажмите " Surpass " кнопку для отображения 3D-объем капилляров.
- В прессе программное обеспечение анализа изображения " добавить новую поверхность " кнопку сегментировать поверхностью капилляра. Используйте стрелки вниз для перемещения между шаги в мастере создания поверхности.
- В ' создание ' вкладке, установите источник канала в канал с капиллярной маркера, например CollagenIV и площадь поверхности детали присвоено значение 0,5 мкм.
Примечание: Последний вариант применяется фильтр Гаусса к изображению и определяет гладкость поверхности. - В ' создание ' вкладку, переключение на параметр порога абсолютной интенсивности.
Примечание: Этот параметр создаст поверхности путем создания на основе абсолютной интенсивности выбранного канала в изображении маски. - На следующем шаге в мастере создания поверхности, отрегулируйте нижнего порога интенсивности для поверхности путем перемещения скользящего окна через гистограмму интенсивности до тех пор, пока визуализированного маска охватывает весь капилляров в изображении. Определить диапазон значений для этого параметра эмпирически для каждого набора данных.
- На последнем шаге мастера создания поверхности, выберите в раскрывающемся меню под " фильтр типа " и выберите опцию ' число вокселей '. Установить минимальное количество вокселей значение в диапазоне от 1.0e5 до 2.0e5.
Примечание: Этот вариант будет исключать поверхности с небольшим количеством вокселей, например, в небольших сегментов капилляров на краю кадра. - Завершения мастера создания поверхности и нажав сохранить параметры создания " помнить параметры " на вкладке Восстановление поверхности меню.
- Повторить процедуру для всего изображений набора данных путем загрузки набор параметров, используемых для первого изображения. Отрегулировать значения параметров интенсивности, порог и минимальное количество воксели для каждого изображения для учета различий в интенсивности фон и капиллярной морфологии, соответственно.
- В ' создание ' вкладке, установите источник канала в канал с капиллярной маркера, например CollagenIV и площадь поверхности детали присвоено значение 0,5 мкм.
- Сегмент внутриклеточных везикулярного структур (например, заполненные иммуноглобулина endosomes), сначала создайте новый канал, который включает в себя только флуоресцентного сигнала от внутри капилляра.
Примечание: Этот процесс будет определять область интереса путем создания маски с использованием капиллярной поверхности, созданный на шаге 4.3- выберите ' редактирования ' меню в ' капиллярной поверхность ' группа. Под ' маска свойства ', нажмите " маска все ". Выберите канал, который содержит внутриклеточных везикул сигнал как ' источник ' и переключения на варианте " дублировать канал перед нанесением маски ".
- В ' маска параметров ' столбец, выберите " постоянной внутри/вне " и " задать вокселей вне поверхности: " и установите его значение 0,00.
Примечание: Этот процесс создаст дополнительный канал на изображении, где все вокселей снаружи Капиллярная маска будет иметь значение 0 для интенсивности. Количественную оценку событий за пределами капиллярные (т.е., в паренхиме мозга), выбрать " задать вокселей внутри поверхности: " и установите его значение 0,00. - Сегмент везикулярного структуры, нажмите кнопку, чтобы начать " добавить новые пятна " мастера. Используйте стрелки вниз для перемещения между шаги в мастере создания поверхности.
- На вкладке создать в раскрывающемся меню под " источник " выбрать внутриклеточных масках канал, созданный на шаге 4.4.4.
- На вкладке создать в " месте обнаружения " раздел, присвоено значение от 0,5 до 1 мкм, в зависимости от средний размер пузырьков в примерно диаметр XY Этот эксперимент. Этот параметр определяет самый маленький размер, который будет обнаружен алгоритм сегментации.
- На вкладке создать в " месте обнаружения " секции, переключение на опцию для " вычитание фона ".
Примечание: Этот вариант будет сгладить изображение с фильтром Gaussian 0,75 пятно радиуса (от значения, выбранного в шаге 4.4.7) и затем вычитанием интенсивность исходного изображения Гаусса фильтруется 0,88 пятно радиус. - В ' создание ' вкладку, нажмите в раскрывающемся меню под ' фильтр типа ' и выберите " качество ". Обратите внимание, что это будет сегмента изображения, применив пороговые значения, основанные на интенсивность в центре пятна. Отрегулируйте нижнего порога интенсивности, перемещение окна раздвижные через ' качество ' Гистограмма до тех пор, пока большинство идентифицируемой везикулы маркированы.
Примечание: Диапазон значений для этого параметра необходимо определить эмпирически для каждого набора данных. - Завершения мастера месте создания и сохранить параметры создания, нажав на кнопку " помнить параметры " на вкладке Восстановление поверхности меню.
- Повторить процедуру для всего изображений набора данных путем загрузки набор параметров, используемых для первого изображения. Отрегулировать значения параметров ' порога интенсивности качества ' для каждого изображения для учета различий в интенсивности фонового.
5. Количественная оценка внутриклеточного транспорта на уровне BBB
- количественно определить объем (в 3 мкм) и области (в мкм 2) капиллярной сегмента. В анализ программного обеспечения доступ к панели статистики поверхности сосудов, созданный на шаге 4.3. Выберите ' подробный ' вкладку и используйте выпадающее меню для выбора " все значения " чтобы найти значения для объема и площади.
- Подсчитать количество пузырьков в сегменте капилляров. В анализ программного обеспечения доступ к панели статистики пятен, созданный на шаге 4.4. Выберите ' общая ' вкладку, чтобы найти значение общего количества точек на изображении.
- Вычислить количество пузырьков на капиллярной объема, для каждого изображения нормализует количество мест по объему рассчитываются на шаге 5.1. Умножьте это значение на 1000, чтобы получить количество пузырьков на 1000 мкм 3 капилляров тома.
- Для количественного определения общая интенсивность внутри капилляра создать новую поверхность, которая охватывает весь образ следующие инструкции, описанные в шагах 4.3 со следующими изменениями. Выберите канал, который содержит соответствующие сигнал (например, mIgG) как источник и задайте значение уровня детализации поверхности до 5 мкм. Для создания поверхности, которая охватывает все изображение, установите значение нижнего порога интенсивности 0.
- Анализ программного обеспечения, доступ к панели статистики поверхности, созданный на шаге 5.4. Выберите " подробный " вкладку и используйте выпадающее меню для выбора " все значения ". Запись значения для ' интенсивности сумма ' для каналов интерес; Этот параметр соответствует сумме значений отдельных интенсивности над все пиксели.
Примечание: Для внутриклеточного сигнала, это соответствует дубликат канала с вокселей наружной поверхности, равным 0,0. Для сигнала в паренхимы мозга, это соответствует дубликат канала с вокселей внутри поверхности, равным 0,0. - Для расчета интенсивности флуоресценции в капиллярной объем, для каждого изображения нормализовать интенсивность по объему рассчитываются на шаге 5.1. Умножьте это значение на 1000, чтобы получить значение интенсивности флуоресценции в 1000 мкм 3 капилляров тома.
Примечание: Для флуоресцентных сигналов в паренхимы мозга, нормализовать значения по объему всего изображения минус объем капиллярного и умножить на 1000, чтобы получить общая интенсивность на 1000 мкм 3 паренхимы мозга. - Повторить процедуру для всего набора данных и использовать соответствующее программное обеспечение для выполнения статистический анализ данных о.
Representative Results
Как представитель примеры изображений, полученный из протокола, описанные здесь, секции мозга мыши были окрашенных с антителами, признавая различные компоненты NVU включая базальной мембраны, астроциты, pericytes, и эндотелиальных клеток (см. Таблица материалов для специфических антител используемых) (рис . 1A, D и E). В этой резолюции можно выделить отдельные Астроцитарная процессы и конец ноги, которые находятся в непосредственном контакте с капиллярами.
Чтобы выделить пригодность этого протокола для обнаружения внутриклеточных структур, секции мозга от животных, периферийно вводят человека анти Тау mAb86 антитела16 окрашивали дневно помечены анти человека антител ( Рисунок 1B). mAb86 как известно специально целевой нейронов, выражая патологические формы Тау16. Используя протокол, описанные здесь, mAb86 был обнаружен с дифракционный резолюции в рамках отдельных везикулярного структур в рамках нейронов (Рисунок 1-B-C). Кроме того эндогенного мыши IgG был обнаружен в внутриклеточных структур в эндотелиальных клеток, но не в pericytes (рис. 1D-E и рис. 2).
Приобретение высокого разрешения конфокальный z стеки сосудистую мозга позволяет трехмерной сегментации капилляров и внутриклеточных везикулы на BBB. На рисунке 2 показан пример процесса рендеринга и сегментации капилляр помечены CollagenIV и мыши IgG позитивных внутриклеточных везикулы. Путем количественной оценки полного набора данных сегментирована изображений, например, измеряя количество пузырьков на капиллярной объема, это возможно для изучения изменений в процессах внутриклеточного транспорта в различных условиях. Рисунок 3 B-C показывает различия в mIgG везикул номер и флуоресценции интенсивности соответствует mIgG на паренхимы мозга, соответственно, после перицит истощения в модель мыши pdgf-b,сход/сход как сообщалось ранее 17. тот же подход был также недавно используется для анализа изменений в внутриклеточного транспорта на уровне BBB между различными мозга регионов18.
Рисунок 1: Маркировка несколько типов клеток и внутриклеточных структур нервно-сосудистого исполнимых Представитель образы нервно-сосудистого аппарата (A и D) и внутриклеточных везикулы, содержащихся в нейроны (B) или эндотелиальных клеток (E), полученных с настоящим Протоколом. Максимальная интенсивность проекции изображения в A (вверху) показывает распределение СВМС позитивных астроциты (красный) окружающих капилляры, сторонниками CollagenIV (зеленый). Стрелки указывают на отдельных Астроцитарная процессов. Шкалы бар = 20 мкм. В этой резолюции отдельные экзоцитоз процессы и конец ноги хорошо видны, как показано в увеличенном изображении в штучной упаковке региона (внизу). Стрелки указывают на Астроцитарная конце ноги. Шкалы бар = 10 мкм. Изображения в B показано накопление периферически вводят антител, mAb86 (зеленый), в пределах гиппокампа нейрона. Стрелки указывают на отдельные mAb86-положительных везикулы. Шкалы бар = 10 мкм. На диаграмме в C линия профиля интенсивности одного пузырьков. Размер пузырьков оценивалась от полной ширины в половину максимум Гаусса fit (черная сплошная линия) кривой интенсивности (зеленой линии и круги). Изображения в D показывают трехмерная реконструкция эндотелиальных клеток (зеленый), окруженный перицит (красный) в пределах базальной пластинки (CollagenIV, серый). Нижней панели показывают флуоресценции отдельных каналов. Шкалы бар = 10 мкм. E снимках локализации mIgG (красный) в внутриклеточного везикулы в эндотелиальных клеток (левая панель, CD31 зеленым) но не в pericytes (правая панель, CD13 зеленым). Во всех изображениях DAPI окрашенных ядер отображаются синим цветом. Шкалы бар = 5 мкм. панели D и E были изменены ссылка17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Трёхмерный рендеринг капилляров и внутриклеточных везикулы в blood - brain барьер. С протоколом описал конфокальная изображения с высоким разрешением CollagenIV положительных капилляров (зеленый) и мыши IgG, внутриклеточный везикулы (красный) были приобретены (A). Левая панель показывает один оптический раздел с поперечным сечением. Стрелки указывают на отдельные mIgG позитивных везикулы в эндотелиальных клеток мозга. Программное обеспечение для обработки изображений панели справа показывает 3D реконструкции с использованием полного z стека (см. Таблицу материалы). Капиллярные тома (B) и отдельные пузырьки (C) были вынесены в трех измерениях и количественно с помощью программного обеспечения для обработки изображений (см. Таблицу материалы). Во всех изображениях DAPI окрашенных ядер отображаются синим цветом. Масштаб баров = 5 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Количественная оценка mIgG внутриклеточной локализации на уровне BBB. Представитель изображения показаны (A) трехмерной реконструкциями капилляров (помечены collagenIV, зеленый) и распределение mIgG (красный) в мышей C57BL/6 и pdgf-b,сход/сход перицит истощены мышей описано в19. Масштаб баров = 10 мкм. B снимках сегментации внутриклеточных везикулы в пределах маски CollagenIV. THe график в B показывает, количественная оценка и сравнение mIgG везикул число на количество капилляров. Каждая точка представляет измерения от отдельных капилляров сегментов. Сплошная линия показывает среднее и погрешностей представляют собой стандартное отклонение данных. Изображения в шоу C mIgG флуоресценции сигнал вне CollagenIV маска. Аналогично график в C показывает количественной оценки и сравнения интенсивности флуоресценции mIgG в паренхиме мозга мышей C57BL/6 и pdgf-b,сход/сход перицит истощены мышей. Интенсивность флуоресценции единиц были нормализованы по интенсивности паренхимы средняя mIgG, измеряется в всех мышей C57BL/6. Эта цифра была изменена ссылка17. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Discussion
Протокол, изложенные выше описывается подготовка мозга свободно плавающего секций, immunofluorescent окрашивание, захвата изображений и анализа параметров для высокого разрешения микроскопии BBB. Расследовать локализации антитела доставки платформы3, транспорт эндогенных IgG через BBB17и неоднородность BBB по перицит потери18недавно использовался этот метод. Различные шаги в протоколе могут быть изменены для адаптации к конкретной цели эксперимента. Во-первых использование толстые разделов (100 мкм) облегчает их обработки во время процедуры иммуноокрашивания и монтаж. Она также позволяет для 3D-реконструкции капиллярной сети, блок нервно-сосудистого и для поколения капилляров и сечения NVU. Однако проникновение антител в разделах ткани могут различаться и некоторые Пятнать антитела могут быть ограничены в поверхностный слой ткани, недалеко от coverslip. Протокол может быть изменен путем увеличения концентрации моющего средства на этапе permeabilization и/или длина permeabilization шагом для улучшения антитела проникновения в ткани. Во-вторых качество изображения может быть нарушена при попытке получить изображения глубже в ткани (обычно 20-30 мкм ниже поверхности) из-за рассеяния света, а также оптические аберрации от преломления несоответствие. Для преодоления этой проблемы, новые методы для очистки тканей и активные антитела проникновения20 может сочетаться с настоящим Протоколом для изображения больших объемов ткани. В-третьих деконволюции выполняется после захвата изображений для повышения осевой разрешение изображения. Выбор алгоритма слепой Деконволюция, используемые в настоящем протоколе был основан на (i) ее простота в использовании, как не предварительный расчет точки распространения функция требуется, (ii) его надежности для улучшения качества изображения21и (iii) отсутствие артефактов на mIgG внутриклеточные структуры после осуществления. В зависимости от внутриклеточных структур, визуализируется в образце другие алгоритмы деконволюция может привести к более высокое качество изображения. Следующие ссылки21,22 обеспечивают широкое обсуждение на преимущества и ограничения дополнительных алгоритмов для изображения деконволюции. Наконец использование пакет программного обеспечения анализа изображений допускается сегментации капилляров и внутриклеточных структур в трех измерениях. Явно анализ изображений не ограничивается программное обеспечение, описанное в протокол и альтернативных пакетов, например те, которые обсуждаются в ссылку23, может использоваться для сегмента изображения. Пригодности различных программ для анализа внутриклеточных структур через BBB должны быть проверены эмпирически оценки точности сегментации изображений.
Поскольку этот метод основан на фиксированных выборок, он не предоставляет прямую информацию о динамике Трансцитоз через BBB. Однако она может сочетаться с24-курс экспериментов, например внутривенно инъекционных молекулы интерес и оценки его накопления в ящики в разных временных точках после инъекции, чтобы реконструировать кинетика внутриклеточный транспорт. Преимуществом этого подхода является, что он позволяет для анализа глубоких мозга регионов, как показано в18, в которой в настоящее время недоступны для прижизненной визуализации живой подходов. Важнейшим шагом в ходе протокол является тщательный контроль фиксации ткани. Фиксация с 4% PFA резко уменьшает иммуногенности внутриклеточных органелл и эндогенного или периферийно управляемых иммуноглобулины17 (рис. 1B). Ограничением данного протокола является его требование высокого качества антител (то есть, низкий неспецифичный пятнать, низкий перекрестной реактивности) подходит для иммунофлюоресценции. Условии, что такие реагенты доступны, метод может применяться для расследования внутриклеточной локализации любого протеина интереса. Например протокол использовался для выявления лизосом в эндотелиальных клеток мозга17. Следует также отметить, что, поскольку этот протокол основан на confocal микроскопии, латеральное разрешение ограничены дифракцией и не удается разрешить структур меньше приблизительно 175 до 250 Нм (рис. 2).
Предыдущие исследования провели подробный анализ клеточного состава нервно-сосудистого блока с помощью конфокальной микроскопии25,26. Однако расследование внутриклеточного транспорта на уровне BBB опирается главным образом на использование передачи электронной микроскопии19,27,28. Хотя этот метод предлагает высокое разрешение боковых внутриклеточных структур, электронной микроскопии остается сложной техники с низкой пропускной способностью. Кроме того количество различных молекулярных целей, которые могут быть визуализированы EM является весьма ограниченным. Этот протокол предлагает альтернативу доступной расследовать внутриклеточного транспорта на уровне BBB. Полная процедура, от мозга коллекции для анализа изображений, может быть выполнена в 5-6 дней. Если имеются подходящие антитела, иммунофлюоресценции позволяет одновременное обнаружение нескольких клеток типы/молекул в пределах того же образца. Кроме того этот протокол может сочетаться с суперразрешением микроскопии методов для преодоления ограничений в пространственное разрешение29. В целом описанные выше протокол позволяет количественная оценка изменения внутриклеточной локализации протеинов интереса в блоке нервно-сосудистых. Его применение для различных генетических или фармакологических возмущений позволит расследовать внутриклеточные структуры и транспортные функции BBB в естественных условиях.
Disclosures
Авторы являются по найму Рош.
Acknowledgments
Работа р.в. был поддержан Roche докторантура стипендий (2014-2017 годы).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
