Summary
Här presenterar vi ett mikroskopi-baserat protokoll för högupplöst avbildning och en tredimensionell rekonstruktion av musen neurovaskulära enhet och blod - hjärnbarriären använder hjärnan friflytande sektioner. Denna metod tillåter för visualisering, analys och kvantifiering av intracellulära organeller på BBB.
Abstract
På blod - hjärnbarriären (BBB) är en dynamisk flercelliga gränssnitt som reglerar transport av molekyler mellan cirkulationen och hjärnan. Transcytos över BBB reglerar leveransen av hormoner, metaboliter och terapeutiska antikroppar till hjärnparenkymet. Här presenterar vi ett protokoll som kombinerar immunofluorescens friflytande avsnitt med laserscanning konfokalmikroskopi och bildanalys att visualisera subcellulär organeller inom endotelceller på BBB. Att kombinera detta data-set med 3D bild analys programvara möjliggör halvautomatisk segmentering och kvantifiering av kapillär volym och yta, samt antalet och intensiteten av intracellulära organeller på BBB. Påvisande av mus endogena immunglobulin (IgG) inom intracellulära blåsor och deras kvantifiering på BBB används för att illustrera metoden. Detta protokoll kan potentiellt användas till utredningen av de mekanismer som styr BBB transcytos av olika molekyler i vivo.
Introduction
På blod - hjärnbarriären (BBB) är en kontinuerlig cellulära barriär bildas av astrocyter, pericyter, nervceller och endotelceller som separerar det centrala nervsystemet (CNS) från blodcirkulationen1. Reglering av transport över BBB spelar en avgörande roll i att upprätthålla hjärnan homeostas och medieras av specialiserade egenskaper av hjärnan endotelceller (grundstrategi). Förekomsten av snäva intercellulära junctions mellan grundstrategi och låg basal hastighet transcytos begränsa paracellular och transcellular transport av blodburna molekyler, respektive2. Nyligen, transcytos clearanceväg grundstrategi har varit utnyttjas för att förbättra leveransen av terapeutiska stora molekyler i hjärnan3,4. Mekanismerna för transcytos över BBB har dock ännu inte har fullt kännetecknas5,6.
Omfattande arbete har gjorts i vitro att dechiffrera de cellulära och molekylära mekanismer som reglerar intracellulära transport över grundstrategi7,8,9,10, 11, men sådana system misslyckas med att sammanfatta komplexa arkitektur och fysiologi av neurovaskulära enheten (NVU). Däremot, studier i vivo12,13 lämna detaljerade kvantitativa uppgifter om taxor över BBB men ger inte insikter i de intracellulära mekanismerna för transport. Därför förblir undersöker de cellulära och intracellulära komponenterna för NVU i vivo och ex vivo mycket utmanande14. Endast ett begränsat antal tekniker är mottagliga för analysera subcellulära strukturer i cellerna i NVU. De flesta studier använda elektronmikroskopi men denna teknik är begränsad av de komplexa protokoll som krävs för korrekt vävnad förberedelse och provhantering. Därför har vi etablerat en metod baserad på hög upplösning konfokalmikroskopi som skulle underlätta bearbetning av hjärnan prover, analysen och kvantifiering av subcellulär fack inom celler i NVU.
Här beskriver vi ett protokoll som använder mus hjärnan friflytande sektioner för att utföra kvantitativa imaging av BBB och NVU på cellulär och subcellulär nivå. Vi testade och validerade ett antal antikroppar mot bild och rekonstruera NVU i tre dimensioner. Dessutom tillåter detta protokoll imaging med maximal optisk diffraktion begränsad upplösning av organeller inom hjärnan kapillärerna. Tillsammans med bildanalys, kan detta protokoll användas för att undersöka intracellulär transport av makromolekyler över BBB under olika experimentella förhållanden, till exempel i mus sjukdomsmodeller för neurodegeneration.
Protocol
etiskt godkännande för denna studie var tillhandahålls av federala livsmedelssäkerhet och veterinär kontor i Schweiz. Alla djurförsök utfördes i strikt följsamhet till schweiziska federala förordningen om djurskydd och djurs välbefinnande samt enligt reglerna för föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALAC).
1. generation av hjärnan Free-floating avsnitt
- för att säkerställa optimala urvalet kvalitet, förbereda en färsk lösning av 2% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfat buffert saltlösning (PBS) på dagen för perfusionen.
Varning: PFA är måttligt giftigt vid hudkontakt och sannolikt cancerframkallande. Använda nitrilhandskar att hantera PFA och förbereda lösningen under kemiska spiskåpa.- Bereda 60 mL PFA lösning per djur.
- Bring PFA till lösning genom att öka pH-värdet med 180-200 µL av en 5 M KOH-lösning för varje 100 mL PBS och värme lösningen upp till 60 ° C.
Obs: NaOH bör inte användas eftersom det påverkar negativt vävnad bevarande vid fixering. - Låt lösningen svalna till rumstemperatur och ta pH ner till 7,4 använder HCl. Filter lösningen med filterpapper (se Tabell för material).
- Utföra en hela musen fixering via transcardial perfusion som tidigare beskrivits 15 med några ändringar. Först spola blodet från den vaskulatur använder 20 mL PBS sedan BEGJUTA med 40 mL 2% PFA.
- Ta bort hjärnan från skallen som tidigare beskrivits 15.
- Sänk en färsk 2% PFA-perfusion hjärnan i 20 mL 2% PFA för 7 h vid 4 ° C för efter fixering.
Obs: Öka inkubering i PFA rekommenderas inte eftersom det kan förhindra upptäckt av intracellulära strukturer. - Omfattande tvätta hjärnan med iskall PBS.
- Embed fast hjärnor i agaros.
- Förbered en 3% agaros lösning i PBS i mikrovågsugn för uppvärmning. Snurra försiktigt lösningen för att kyla ner men undvika solidifiering.
- Torka bort överskottet av PBS runt hjärnan före nedsänkning i agaros lösningen i en plastbehållare. Rotera hjärnan släpper Agarens ta bort luftbubblor. Tillåta Agarens stelnar genom att kyla det på ice.
- Försiktigt bort agaros blocket från behållaren plast och skär en kub runt hjärnan med hjälp av ett rakblad. Montera hjärnan på en vibratome preparathållaren (se Tabell för material) med cyanoakrylat lim (se Tabell för material). Tillåt tillräckligt med tid för limmet att stelna innan du fortsätter med den snittning.
- Överföring hjärnan i preparathållaren till vibratome buffertbrickan fylld med PBS. Använd vibratome avsnitt 100 µm hjärnan skivor (sagittal eller koronalt). Samla in hjärnan sektioner i en 6-well platta tidigare fylld med PBS.
- Vid efterbehandling hjärnan snittning, försiktigt bort PBS och ersätta med en 1:1 lösning av PBS/glycerol.
- Lagra sektioner i PBS/glycerol på -20 ° C.
2. Cell eller organell märkning av immunofluorescens färgning
- noggrant överföring en hjärna avsnitt i en bra platta som 24-väl tidigare fylld med 500 µL av PBS per brunn. Avsnittet kommer att förbli i samma bra fram till slutet av proceduren.
- Skölj avsnittet två gånger med 500 µL av PBS 5 minuter under försiktig skakning.
- Ta bort PBS och utföra samtidiga blockering och permeabilisering av hjärnan skivor.
- Förbered en blockering och permeabilisering lösning med 0,3% Triton-X och 10% serum åsna i PBS.
Obs: Donkey serum kan ersättas med geten serum att matcha värd arten av specifika sekundära antikroppar används. - Inkubera sektioner med 250 µL blockerande och permeabilisering lösning för 1 h i rumstemperatur under försiktig skakning.
- Förbered en blockering och permeabilisering lösning med 0,3% Triton-X och 10% serum åsna i PBS.
- Bort lösningen och lägga till en PBS lösning som innehåller 5% åsna serum och den primär antikroppen på en lämplig utspädning (t.ex., 1: 100 till 1:1, 000). Inkubera över natten vid 4 ° C under försiktig skakning.
Obs: Se Tabell av material för en lista av antikroppar som framgångsrikt etikett de olika celltyper för NVU med detta protokoll. Optimal utspädning av primära antikroppar måste bestämmas empiriskt. För samtidig märkning av olika antigener, späd alla primära antikroppar i samma lösning. Alla primära antikroppar måste höjas i olika arter. För att förbättra antikropp penetration, prover kan inkuberas i upp till 72 h vid 4 ° C. - Ta bort antikropp lösningen och tvätta avsnitt tre gånger 10 min i PBS under försiktig skakning vid rumstemperatur. Ta bort PBS och tillsätt 250 µL PBS lösning som innehåller 5% åsna serum och lämpliga artspecifika fluorescently märkta sekundära antikroppen. Inkubera sektioner i rumstemperatur i 1 h under försiktig skakning.
- Se Tabell av material för en lista av de sekundära antikroppar som används med detta protokoll.
- Bort antikropp lösning tvätta avsnitten och tre gånger i 10 min i PBS under försiktig skakning i rumstemperatur.
- Ta bort PBS och tillsätt 250 µL av en 4 ', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI) lösning med en slutlig koncentration på 1 µg/mL. Inkubera sektioner i rumstemperatur i 10 minuter under försiktig skakning. Ta bort DAPI lösningen och tvätta avsnitt 3 gånger för 5 min med PBS.
- Montera avsnittet hjärnan på limning mikroskopi diabilder (t.ex. histo-bond glasskivor). Ta försiktigt bort överflödigt PBS runt avsnittet i bilden. Lägg en droppe av monteringsmedium (se tabell för material) på toppen av avsnittet hjärnan och noggrant täcka den med ett 0.17 mm (nr 1,5) borosilikatglas täckglas.
- Lagra prover vid 4 ° C skyddas från ljus tills utför bild förvärv.
3. Högupplösta Confocal avbildning av den blod - hjärnbarriären
- utför bild förvärv med en lämplig-laserskanning confocal Mikroskop (se Tabell för material) med laserlinjer på 405, 488, 561 och 633 nm för excitation av fluorophores i blå, grön, orange och röda regionerna av ljusspektrum. För bild förvärv, använda en 63 X olja mål med en numerisk bländare på 1.4.
- i förvärvet menyn i det program som styr mikroskopet, ange bilden förvärv parametrar. I den nedrullningsbara menyn av ‘ bildstorlek ’, Välj ett värde på 1024 x 1024 pixlar. Ändra bildens bildpunktsstorlek till ett värde mellan 200 och 300 nm genom att justera värdet för den ‘ Zoom ’ menyn. ”
Obs: för analys av intracellulära strukturer, minska pixelstorleken till 75 nm. Detta bildstorlek avsevärt ökar tid som förvärv och kan reduceras till 512 x 512 pixlar för att minska tid som förvärv av imaging ett mindre synfält. - i den ' förvärv hastighet ' nedrullningsbara menyn, Välj ett värde av 400 Hz, dvs 400 rader per sekund. I den ' Systeminställningar & #39; väljer du den ' pixeldjup ' nedrullningsbara menyn och ändra värdet till 12 bitars.
- I Mikroskop mjukvaran, inom det ' förvärvet ' fliken, växla alternativet för sekventiell ram förvärv. Ange ett värde mellan 0,75 och 1 µm för varje kanal optiska snittjockleken genom att ändra värdet i den ' Pinhole ' menyn.
- i panelen för fluorescerande excitation, aktivera lasern krävs att optimalt excitera fluorophores i urvalet, till exempel en 488 nm laserlinje för en grön-emitting fluorophore.
Obs: Använd en fluorophore spectra viewer (se Tabell för material) för att välja lämpliga excitation laser. - i panelen för fluorescerande upptäckt, flytta skjutreglaget för att välja de våglängder som kommer att mätas i varje kanal, till exempel mellan 510 och 550 nm för en grön-emitting fluorophore.
Obs: Använd en fluorophore spectra viewer (se Tabell för material) för att välja lämplig upptäckt våglängder. - Lägg en droppe av nedsänkning olja med brytningsindex 1,52 ovanpå täckglaset med avsnittet hjärnan att matcha brytningsindex av täckglas och syfte. Placera provet i mikroskopet och slå på lampan epifluorescerande att visualisera provet med hjälp av mikroskopet kikaren.
- Med knapparna på mikroskopstativet, ändra filter hjulet att välja ett filter som är lämpliga för att visualisera DAPI-färgade kärnor. Använd grovt fokus för att ta signalen från DAPI-färgade kärnor i fokus.
- Med knapparna på mikroskopstativet, ändra filter för att visualisera signalen från vaskulär markörer (till exempel CollagenIV eller CD31) och centrera synfält på ett enskilt kapillär segment.
- Tryck på knappen för att starta live-skanningsläge. Under avsökningen justera vinst och laser intensitet för varje kanal för att maximera det dynamiska omfånget av bilderna och undvika pixel mättnad.
Obs: Använd en look-up tabell som etiketter mättade pixlar för att visuellt bedöma över mättnad. För att undvika signal över mättnad, justera inställningarna med provet som förväntas ha högsta fluorescerande signalen. - Värdet för raden i genomsnitt till 2.
Obs: När du använder högre förvärv hastigheter, öka detta värde för att minska buller. - Upprätta börjar och slutar sektioner för att utföra optisk z-stackar som spänner över hela volymen av kapillären. Använda en stegstorlek 0,45 µm.
Obs: Om bilder ska användas för efterföljande kvantifiering, hålla samma förvärv inställningar för hela datauppsättningen. - För kvantifiering, förvärva 10 till 20 z-stackar per sektion från minst tre olika möss för statistiska jämförelser.
Obs: Förvärva hela datamängden i samma session att minska variationen uppkommer prov blekning och laser intensitet fluktuationer.
4. Bild bearbetning och 3D rekonstruktion av neurovaskulära enheten
- (tillval) att öka axial upplösningen av de förvärvade z-stackarna, utföra deconvolution av bilden med hjälp av lämplig programvara (se tabellen för material ).
- i deconvolution programvara, ändra inställningarna för att utföra " Blind " deconvolution, (dvs. en adaptiv point-spread-funktionen).
- i deconvolution Programvaruinställningar, växla alternativet för bakgrundsborttagning; detta alternativ kommer att bestämma det minsta intensitetsvärdet i bildstapel och subtrahera det från intensitetsvärdena från alla pixlar i bilden.
- i inställningarna för deconvolution programvara, växla av alternativen för justeringen intensitet och storleksändring till 16-bitars djup; dessa alternativ kommer att hålla den ursprungliga intensitetsvärden och dynamiska omfånget av bilderna.
- i menyn för ' brytningsindex ', värdet till 1,52. I den ' ange våglängd ' menyn, Välj utsläpp värden för varje bild kanal. Välj exempelvis 520 för en grön-emitting fluorophore.
- Öppna bild datauppsättningen med programvara passar för visualisering och analys av 3-dimensionella data set (se Tabell för material). I bild analys programvara, tryck på " överstiga " knappen för att återge 3D-volymen av kapillärer.
- i bild analys programvara pressen den " Lägg till ny yta " knappen Segmentera kapillär ytan. Botten med pilarna flytta mellan stegen i guiden ytan skapandet.
- i den ' skapa ' fliken, ange källkanalen till kanalen med kapillär markör, till exempel CollagenIV, och ange den yta detaljen till ett värde på 0,5 µm.
Obs: Det senare alternativet tillämpar en Gaussiska filtret på bilden och bestämmer ytan jämnhet. - i den ' skapa ' fliken, växla alternativet för absolut intensitet tröskel.
Obs: Detta alternativ kommer att skapa en yta genom att skapa en mask som baseras på absoluta intensiteten för vald kanal i bilden. - På nästa steg i guiden yta, justera tröskeln lägre intensitet för ytan genom att flytta skjutfönstret över intensitet histogrammet tills återgivna masken täcker hela kapillären i bilden. Fastställa värdet för parametern empiriskt för varje datauppsättning.
- På det sista steget i guiden yta, klicka på den nedrullningsbara menyn under " filtertyp " och välj alternativet ' nummer av voxlar '. Ange det minsta antalet voxlar till ett värde mellan 1.0e5 till 2.0e5.
Obs: Detta alternativ kommer att utesluta ytor med ett litet antal voxlar, exempelvis små segment av kapillärer vid kanten av ramen. - Avsluta guiden yta och spara parametrarna skapandet genom att klicka på " minns parametrar " på fliken återskapa i menyn yta.
- Upprepa proceduren för hela imaging datauppsättning genom att ladda den parameter som används för den första bilden. Justera parametrarna för den intensitet, tröskel och minsta antal voxlar för varje bild att ta hänsyn till skillnader i bakgrunden intensitet och kapillär morfologi, respektive.
- i den ' skapa ' fliken, ange källkanalen till kanalen med kapillär markör, till exempel CollagenIV, och ange den yta detaljen till ett värde på 0,5 µm.
- Att segmentera intracellulära vesikulär strukturer (t.ex., immunglobulin-fylld endosomes), först skapa en ny kanal som endast innehåller fluorescerande signal från inom kapillären.
Obs: Denna process kommer att definiera en region av intresse genom att skapa en mask som med hjälp av kapillär ytan skapade i steg 4.3- Välj de ' redigera ' menyn i den ' kapillär yta ' panel. Under ' mask boenden ', klicka på " Mask alla ". Välj den kanal som innehåller den intracellulära vesikler signalen som den ' källkanalen ' och växla alternativet " duplicera kanal innan du applicerar masken ".
- i den ' mask inställningar ' kolumn, Välj " konstant innanför/utanför " och " ställa voxlar utanför ytan till: " och sätta dess värde till 0,00.
Obs: Denna process skapar en ytterligare kanal i bilden där alla voxlar utanför kapillär masken har en intensitetsvärdet 0. Att kvantifiera händelser utanför kapillären (dvs. i hjärnparenkymet), Välj " ange voxlar släpper surface till: " och sätta dess värde till 0,00. - Att segmentera vesikulär strukturer, tryck på knappen för att starta den " lägga till nya ställen " guiden. Botten med pilarna flytta mellan stegen i guiden ytan skapandet.
- i fliken Skapa Använd nedrullningsbara menyn under " källkanalen " Välj intracellulära maskerade kanalen skapade i steg 4.4.4.
- i fliken Skapa under den " Spot detection " avsnitt, ange den uppskattade diametern utan XY till ett värde mellan 0,5 och 1 µm, beroende på den genomsnittliga storleken av blåsor som observerats i experimentet. Det här alternativet avgör den minsta storlek som kommer att upptäckas av segmentering algoritmen.
- i fliken Skapa under den " Spot detection " avsnitt, växla alternativet för " bakgrunden subtraktion ".
Obs: Detta alternativ kommer att jämna bilden med Gaussisk filter för 0,75 spot radius (från det värde som valts i steg 4.4.7) och sedan subtrahera intensiteten i den ursprungliga bilden Gaussisk filtreras av 0,88 spot radie. - i den ' skapa ' fliken, tryck på listmenyn under ' filtertyp ' och välj " kvalitet ". Observera att detta kommer att segmentera bilden genom att tillämpa tröskelvärden baserat på intensiteten i mitten av fläckarna. Justera tröskeln lägre intensitet genom att flytta skjutfönstret över den ' kvalitet ' histogrammet tills flesta identifierbara blåsor är märkta.
Obs: Intervallet för den här parametern måste fastställas empiriskt för varje datauppsättning. - Avsluta guiden plats och spara parametrarna skapandet genom att trycka " minns parametrar " på fliken återskapa i menyn yta.
- Upprepa proceduren för hela imaging datauppsättning genom att ladda den parameter som används för den första bilden. Justera parametrarna för den ' kvalitet intensitet tröskel ' för varje bild att ta hänsyn till skillnader i bakgrunden intensitet.
5. Kvantifiering av intracellulära Transport på BBB
- kvantifiera volym (i µm 3) och området (i µm 2) av kapillär segmentet. I analys programvara, tillgång till statistiken panelen av vaskulär ytan skapade i steg 4,3. Välj den ' detaljerad ' fliken och Använd rullgardinsmenyn för att välja " alla värden " att hitta värdena för volym och område.
- Kvantifiera antalet blåsor inom segmentet kapillär. I analys programvara, tillgång till statistiken panelen av de platserna som skapades i steg 4,4. Välj den ' övergripande ' flik för att hitta värdet av det totala antalet ställen i bilden.
- Att beräkna antalet blåsor per kapillär volym, för varje bild normalisera antalet ställen av volymen beräknades i steg 5.1. Multiplicera detta värde av 1 000 att få antalet blåsor per 1000 µm 3 av kapillär volymen.
- Att kvantifiera den totala intensiteten inom kapillären skapa en ny yta som täcker hela bilden följande instruktionerna beskrivs i steg 4,3 med följande ändringar. Välj den kanal som innehåller den relevanta signalen (t.ex., mIgG) som källa kanal och värdet av yta detaljnivån till 5 µm. För att skapa en yta som täcker hela bilden, värdet av tröskeln för lägre intensitet till 0.
- i programvaran analys, tillgång till statistiken panelen på den ytan som skapades i steg 5,4. Välj den " detaljerad " fliken och Använd rullgardinsmenyn för att välja " alla värden ". Registrera värdena för ' intensitet summan ' för kanaler av intresse. Denna parameter motsvarar summan av individuella intensitetsvärden över alla pixlar.
Obs: För en intracellulära signal, detta motsvarar den duplicerade kanalen med voxlar utanför ytan anges till 0,0. För en signal i hjärnparenkymet, detta motsvarar den duplicerade kanalen med voxlar inuti ytan anges till 0,0. - Att beräkna fluorescensintensiteten per kapillär volym, för varje bild normalisera intensiteten av den volym som beräknades i steg 5.1. Multiplicera detta värde av 1 000 att få fluorescens intensitetsvärdet per 1000 µm 3 av kapillär volymen.
Obs: För fluorescerande signaler i hjärnparenkymet, normalisera värdena av den totala bild volymen minus kapillär volymen och multiplicera med 1 000 att få den totala intensiteten per 1000 µm 3 av hjärnparenkymet. - Upprepa proceduren för hela datauppsättningen och använda lämplig programvara för att utföra statistisk analys av data.
Representative Results
Som representativa exempel på bilder erhålls från det protokoll som beskrivs här, mus hjärnan sektioner var målat med antikroppar som känner igen olika komponenter för den NVU inklusive basalmembranet, astrocyter, pericyter, och endothelial celler (se Tabell för material för specifika antikroppar används) (figur 1A, D, och E). I denna resolution är det möjligt att urskilja de enskilda astrocytic processer och slutet-fötter som är i direkt kontakt med kapillärerna.
För att belysa lämpligheten av detta protokoll för att upptäcka intracellulära strukturer, var hjärnan sektioner från djur perifert injiceras med mänskliga anti Tau mAb86 antikropp16 målat med en fluorescently märkt antihumana antikroppar ( Figur 1B). mAb86 är kända för att specifikt mål nervceller att uttrycka en patologisk form av Tau16. Använder protokollet beskrivs häri, upptäcktes mAb86 med diffraktion begränsad upplösning inom enskilda vesikulär strukturer inom nervceller (figur 1B-C). Dessutom upptäcktes endogena mus-IgG i intracellulära strukturer inom endothelial celler men inte i pericyter (figur 1D-E och figur 2).
Förvärvet av högupplösta confocal z-högar av den hjärnan vaskulatur möjliggör tredimensionella segmentering av kapillärer och intracellulära blåsor på BBB. Figur 2 visar ett exempel på processen för rendering och segmentera en kapillär märkt med CollagenIV och mus IgG-positiva intracellulära blåsor. Kvantifiera en fullständig datauppsättning segmenterade bilder, till exempel genom att mäta antalet blåsor per kapillär volym, är det möjligt att studera förändringar i intracellulära processer under olika förhållanden. Figur 3 B-C visar skillnaderna i mIgG vesikler nummer och fluorescens intensitet motsvarande mIgG på hjärnparenkymet, respektive, vid pericyt utarmning i musmodell pdgf-bret/ret som tidigare rapporterats 17. samma metod användes också nyligen att analysera förändringar i intracellulära transport på BBB mellan olika hjärnan regioner18.
Figur 1: Märkning av flera celltyper och subcellulära strukturer av neurovaskulärt affärsenhet Representativa bilder av neurovaskulära enhet (A och D) och intracellulära blåsor som finns i nervceller (B) eller endotelceller (E) erhålls med detta protokoll. Maximal intensitet projektion bilden i A (överst) visar fördelningen av Fredsgenomförande-positiv astrocyter (röd) omgivande kapillärerna betecknas av CollagenIV (grön). Pilarna pekar på enskilda astrocytic processer. Skalstapeln = 20 µm. På denna resolution syns de enskilda Astrocyten processer och slutet-fötter tydligt, som visas i den zoomade bilden av regionen boxed (nederst). Pilspetsar pekar på astrocytic slutet-fötter. Skalstapeln = 10 µm. Bilden i B visar ansamling av en perifert-injiceras antikropp, mAb86 (grön), inom en Hippocampus neuron. Pilspetsar pekar till enskilda mAb86-positiv blåsor. Skalstapeln = 10 µm. Diagrammet i C visar line profil intensiteten av en enda vesikler. Vesikler storleken uppskattades från full bredd på halva högst en Gaussisk passform (svart heldragen linje) av intensitet kurvan (gröna linjen och cirklar). Bilderna i D visar en tredimensionell rekonstruktion av en endotelceller (grön) omgiven av en pericyt (röd) inom den basala lamina (CollagenIV, grå). De lägsta panelerna visar enskilda fluorescens kanaler. Skalstapeln = 10 µm. Bilderna i E visar localizationen av mIgG (röd) i intracellulära blåsor inom endotelceller (vänster panel, CD31 i grönt) men inte i pericyter (höger panel, CD13 i grönt). I alla bilder, DAPI missfärgade kärnor visas i blått. Skalstapeln = 5 µm. paneler D och E har ändrats från referens17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Tredimensionell rendering av kapillärer och intracellulära blåsor på den blood - brain barriären. Med protokollet beskrivs förvärvade högupplösta confocal bilder av CollagenIV-positiv kapillärer (grön) och mus-IgG intracellulära blåsor (röd) var (A). Den vänstra panelen visar en enda optiska avsnitt med tvärsnitt. Pilarna pekar på enskilda mIgG-positiv blåsor inom hjärnan endotelceller. Panelen till höger visas 3D återuppbyggnaden av den fullständiga z-stack med image processing mjukvara (se Tabell för material). Kapillär volym (B) och enskilda blåsor (C) var utförda i tre dimensioner och kvantifieras med hjälp av programvara bildbehandling (se Tabell för material). I alla bilder, DAPI missfärgade kärnor visas i blått. Skala barer = 5 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3 : Kvantifiering av mIgG intracellulära lokalisering på BBB. Representativa bilder visar (A) tredimensionella rekonstruktioner av kapillärer (märkt med collagenIV, grön) och fördelningen av mIgG (röd) i C57BL/6 möss och pdgf-bret/ret pericyt utarmat möss tidigare beskrivits i19. Skala barer = 10 µm. Bilderna i B visar segmentering av intracellulära blåsor inom CollagenIV masken. The graf i B visar att kvantifiering och jämföra mIgG vesikler antal per volym av kapillär. Varje punkt representerar mätningar från enskilda kapillär segment. Den heldragna linjen visar medelvärdet och felstaplar representera standardavvikelsen för data. Bilderna i C Visa den mIgG fluorescens signal utanför CollagenIV masken. På samma sätt visar grafen i C kvantifiering och jämförelse av mIgG fluorescensintensiteten i hjärnparenkymet mellan C57BL/6 möss och pdgf-bret/ret pericyt utarmat möss. Fluorescens intensitet enheter var normaliserade av genomsnittliga mIgG parenkymet intensitet mäts i alla C57BL/6 möss. Denna siffra har ändrats från referens17. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Protokollet beskrivs ovan beskriver utarbetandet av hjärnan friflytande sektioner, Immunofluorescerande färgning, bild förvärv och analysparametrar för högupplösande mikroskopi av BBB. Denna metod har använts nyligen att undersöka localizationen av antikropp leverans plattformar3transport av endogent IgG över BBB17, BBB på pericyt förlust18heterogenitet. Olika steg i protokollet kan ändras för att anpassa sig till det specifika målet av experimentet. Först, underlättar deras hantering under förfarandena som immunfärgning och montering av tjock (100 µm) sektioner. Det gör också för 3D rekonstruktion av kapillär nätet, neurovaskulära enheten, och för generering av kapillär och NVU tvärsnitt. Dock penetration av antikroppar inom avsnitten vävnad kan variera och vissa antikroppar färgning kan begränsas till det ytliga lagret av vävnad nära täckglaset. Protokollet kan ändras genom att öka koncentrationen av rengöringsmedel under vilket steg eller längden på det permeabilisering steget för att förbättra antikropp penetration in i vävnaden. Bildkvaliteten kan andra äventyras när du försöker hämta bilder djupare i vävnaden (vanligtvis 20 till 30 µm under ytan) på grund av ljusspridning samt optiska avvikelser från brytningsindex mismatch. För att lösa detta problem, kan nya metoder för vävnad clearing och aktiva antikropp penetration20 kombineras med detta protokoll till bilden större volymer av vävnad. Det tredje utförs deconvolution efter bild förvärv att förbättra axiella upplösningen på bilden. Valet av den blinda deconvolution algoritm som används i detta protokoll var baserat på dess användarvänlighet, eftersom ingen före beräkning av funktionen point-spread krävs, (ii) dess robusthet för att förbättra bild kvalitet21, och (iii) avsaknaden av artefakter på mIgG intracellulära strukturer efter genomförandet. Beroende på de intracellulära strukturer som visualiseras i provet, kan andra deconvolution algoritmer resultera i högre bildkvalitet. Följande referenser21,22 ger en omfattande diskussion om fördelar och begränsningar av ytterligare algoritmer för bild deconvolution. Slutligen ett avbildningspaket analys programvara tillåtet segmentering av kapillärer och intracellulära strukturer i tre dimensioner. Tydligt bildanalys är inte begränsad till den programvara som beskrivs i protokollet och alternativa paket, till exempel de som diskuteras i referens23, kan användas till segmentet bilder. Lämpligheten av olika program för analys av intracellulära strukturer över BBB bör verifieras empiriskt genom att bedöma riktigheten av bild segmentering.
Eftersom denna metod är baserad på fasta prover, ger den inte direkt information om dynamiken av transcytos över BBB. Men kan det kombineras med tid-rätters experiment24, till exempel genom intravenöst injicerat molekyl av intresse och mäta dess ackumulation inom grundstrategi vid olika tidpunkter efter injektionen, att rekonstruera kinetiken för intracellulära transport. Fördelen med detta tillvägagångssätt är att det tillåter för analys av djupa hjärnregioner, som visas i18, som är för närvarande otillgänglig till intravital levande bildgivande metoder. Ett avgörande steg under protokollet är noggrann övervakning av vävnad fixering. Fixering med 4% PFA dramatiskt minskar immunogeniciteten av intracellulära organeller och endogen eller perifert administrerade immunglobuliner17 (figur 1B). En begränsning av detta protokoll är dess krav av hög kvalitet antikroppar (dvs, låg icke-specifik färgning, låg korsreaktivitet) lämplig för immunofluorescens. Förutsatt att sådant reagens är tillgängliga, kan metoden användas för att undersöka den intracellulära lokaliseringen av något protein av intresse. Exempelvis användes protokollet att identifiera lysosomer i hjärnan endotelceller17. Det bör också noteras att eftersom detta protokoll baseras på konfokalmikroskopi, laterala resolutionen begränsas av diffraktion och inte kan lösa strukturer mindre än ca 175 till 250 nm (figur 2).
Tidigare studier har utfört detaljerad analys av cellulära sammansättningen av neurovaskulära enheten med konfokalmikroskopi25,26. Dock bygger undersöka intracellulära transport på BBB mestadels på användningen av överföring elektronmikroskopi19,27,28. Denna metod erbjuder den högsta laterala upplösningen av intracellulära strukturer, elektronmikroskopi fortfarande är en utmanande teknik med låg genomströmning. Antalet olika molekylära mål som kan visualiseras av EM är dessutom mycket begränsad. Detta protokoll erbjuder ett tillgängligt alternativ för att undersöka intracellulära transport på BBB. Den fullständiga proceduren, från hjärnan insamling och bildanalys, kan utföras i 5 till 6 dagar. Om det finns lämplig antikroppar kan immunofluorescens samtidiga flera cell typer/molekyler inom samma prov. Detta protokoll kan dessutom kombineras med super-resolution mikroskopi tekniker för att övervinna begränsningarna i rumslig upplösning29. Övergripande, det protokoll som beskrivs ovan möjliggör kvantifiering av förändringar i den intracellulära lokaliseringen av proteiner av intresse inom neurovaskulära enheten. Dess tillämpning för olika genetiska eller farmakologiska störningar kommer att tillåta undersöker de intracellulära struktur och transport funktionerna av BBB i vivo.
Disclosures
Författarna är under anställning av Roche.
Acknowledgments
R.V. arbetet stöddes av en Roche postdoktorsstipendium (2014-2017).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rat monoclonal antibody clone ER-MP12 against CD31/PECAM | Novus Biologicals | MCA2388 | Labels Brain Endothelial Cells Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody against Podocalyxin | R&D Systems | MAB1556 | Labels Lumen of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rabbit polyclonal antibody against CollagenIV | Biotrend | BT21-5014-70 | Labels Basement membrane of capillaries Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rabbit IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Goat polyclonal antibody against CD13 | R&D Systems | AF2335 | Labels pericytes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-goat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Mouse monoclonal antibody clone G-A-5 against GFAP coupled to Cy3 | Abcam | ab49874 | Labels Astrocytes Use at dilution 1:100 |
| Rabbit polyclonal antibody against Iba-1 | Wako | 019-19741 | Labels Microglia Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| Rat monoclonal antibody ABL93 gainst LAMP2 | Fitzgerald | 10R-CD107BBMSP | Labels Lysosomes Use at dilution 1:100 detect with donkey polyclonal anti-rat IgG (H+L) coupled with suitable AlexaFluor dye, used at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor594 | LifeTechnologies | A21203 | Use at dilution 1:400 |
| donkey polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor488 | LifeTechnologies | A21202 | Use at dilution 1:400 |
| goat polyclonal antibody against mouse IgG (H+L) AlexaFluor555 | LifeTechnologies | A21422 | Use at dilution 1:400 |
| Filter paper | Sigma-Aldrich | WHA10334347 | Whatman prepleated qualitative filter paper Grade 0858 1/2, grained |
| Cyanoacrylate glue | Roth Carl | 258.1 | Roti Coll 1 |
| Fluorescent Mounting medium | Dako | S3023 | Dako fluorescent mounting medium |
| Adult mice | The Jackson Laboratory | 000664 | C57BL/6J male or female mice between 9 and 19 months of age |
| Vibratome | Leica Biosystems | 14047235612 | Leica VT100S vibrating blade microtome |
| Laser Scanning Confocal microscope | Leica Microsystems | NA | Leica TCS SP8 X with HyD detectors and White light laser |
| Image processing software | Leica Microsystems | NA | Leica Application Suite AF version 3.1.0 build 8587 |
| Image analysis software | Bitplane scientific software | NA | Imaris version 7.6.5 build 31770 for x64 |
| Fluorescence SpectraViewer | ThermoFisher Scientific | NA | https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html |
References
- Blanchette, M., Daneman, R. Formation and maintenance of the BBB. Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).
- Chow, B. W., Gu, C. The Molecular Constituents of the Blood-Brain Barrier. Trends Neurosci. 38 (10), 598-608 (2015).
- Niewoehner, J., et al. Increased Brain Penetration and Potency of a Therapeutic Antibody Using a Monovalent Molecular Shuttle. Neuron. 81 (1), 49-60 (2014).
- Yu, Y. J., et al. Therapeutic bispecific antibodies cross the blood-brain barrier in nonhuman primates. Sci Transl Med. 6 (261), 154 (2014).
- Preston, J. E., Joan Abbott, N., Begley, D. J. Transcytosis of macromolecules at the blood-brain barrier. Adv Pharmacol. 71, 147-163 (2014).
- De Bock, M., et al. Into rather unexplored terrain-transcellular transport across the blood-brain barrier. Glia. 64 (7), 1097-1123 (2016).
- Bien-Ly, N., et al. Transferrin receptor (TfR) trafficking determines brain uptake of TfR antibody affinity variants. J Exp Med. 211 (2), 233-244 (2014).
- Sade, H., et al. A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding. PLoS One. 9 (4), 96340 (2014).
- Tian, X., et al. LRP-1-mediated intracellular antibody delivery to the Central Nervous System. Sci Rep. 5, 11990 (2015).
- Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier. Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).
- Siupka, P., et al. Bidirectional apical-basal traffic of the cation-independent mannose-6-phosphate receptor in brain endothelial cells. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Zlokovic, B. V., et al. A saturable mechanism for transport of immunoglobulin G across the blood-brain barrier of the guinea pig. Exp Neurol. 107 (3), 263-270 (1990).
- Deane, R., et al. IgG-assisted age-dependent clearance of Alzheimer's amyloid beta peptide by the blood-brain barrier neonatal Fc receptor. J Neurosci. 25 (50), 11495-11503 (2005).
- Cabezon, I., et al. Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier. Histochem Cell Biol. , (2017).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), (2012).
- Collin, L., et al. Neuronal uptake of tau/pS422 antibody and reduced progression of tau pathology in a mouse model of Alzheimer's disease. Brain. 137 (10), 2834-2846 (2014).
- Villasenor, R., et al. Trafficking of Endogenous Immunoglobulins by Endothelial Cells at the Blood-Brain Barrier. Sci Rep. 6, 25658 (2016).
- Villasenor, R., et al. Region-specific permeability of the blood-brain barrier upon pericyte loss. J Cereb Blood Flow Metab. , (2017).
- Armulik, A., et al. Pericytes regulate the blood-brain barrier. Nature. 468 (7323), 557-561 (2010).
- Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
- Sibarita, J. B. Deconvolution Microscopy. 95, 201-243 (2005).
- Shaw, P. J. Comparison of Widefield/Deconvolution and Confocal Microscopy for Three-Dimensional Imaging. , 453-467 (2006).
- Chenouard, N., et al. Objective comparison of particle tracking methods. Nat Methods. 11 (3), 281-289 (2014).
- Foret, L., et al. A general theoretical framework to infer endosomal network dynamics from quantitative image analysis. Curr Biol. 22 (15), 1381-1390 (2012).
- Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for blood-brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), 562-566 (2010).
- Bell, R. D., et al. Pericytes control key neurovascular functions and neuronal phenotype in the adult brain and during brain aging. Neuron. 68 (3), 409-427 (2010).
- Ben-Zvi, A., et al. Mfsd2a is critical for the formation and function of the blood-brain barrier. Nature. 509 (7501), 507-511 (2014).
- Stewart, P. A. Endothelial vesicles in the blood-brain barrier: are they related to permeability. Cell Mol Neurobiol. 20 (2), 149-163 (2000).
- Follain, G., Mercier, L., Osmani, N., Harlepp, S., Goetz, J. G. Seeing is believing - multi-scale spatio-temporal imaging towards in vivo cell biology. J Cell Sci. 130 (1), 23-38 (2017).
