Summary
Dit protocol wordt een techniek beschreven voor observatie van de real-time groen fluorescentie proteïne (GFP) gelabeld Glucose Transporter 4 (GLUT4) eiwit mensenhandel op insuline stimulatie en karakterisering van de biologische rol van CCR5 in de insuline-GLUT4 signalering traject met deconvolutie microscopie.
Abstract
Diabetes mellitus type 2 (T2DM) is een wereldwijde gezondheidscrisis die wordt gekenmerkt door insuline signalering waardevermindering en chronische ontsteking in de perifere weefsels. De hypothalamus in het centrale zenuwstelsel (CNS) is het controlecentrum voor energie en insuline reactie-verordening van een signaal. Chronische ontsteking in de perifere weefsels en onevenwichtigheden van bepaalde chemokines (zoals CCL5, TNFα en IL-6) bijdragen tot diabetes en obesitas. Echter blijven de functionele mechanism(s) aansluiten chemokines en hypothalame insuline signaal verordening nog onduidelijk.
In vitro primaire neuron cultuur modellen zijn handige en eenvoudige modellen die kunnen worden gebruikt voor het onderzoeken van insuline signaal verordening in hypothalame neuronen. In deze studie binnengebracht we exogeneous GLUT4 eiwit geconjugeerd met GFP (GFP-GLUT4) primaire hypothalame neuronen voor het bijhouden van GLUT4 membraan translocatie bij insuline stimulatie. Time-lapse beelden van het GFP-GLUT4 proteïnen handel werden opgenomen door deconvolutie microscopie, waardoor gebruikers voor het genereren van hoge snelheid, high-resolution afbeeldingen zonder beschadiging van de neuronen sterk tijdens de uitvoering van het experiment. De bijdrage van CCR5 in insuline geregeld GLUT4 translocatie werd waargenomen in CCR5 gebrekkig hypothalame neuronen, die werden geïsoleerd en gekweekt van CCR5 knock-out muizen. Onze resultaten aangetoond dat de efficiëntie van GLUT4 membraan translocatie CCR5 gebrekkig hypothalame neuronen was verminderd na stimulatie van de insuline.
Introduction
Diabetes mellitus type 2 (T2DM) is een wereldwijde gezondheidscrisis. T2DM wordt gekenmerkt door insuline signalering waardevermindering en chronische ontsteking in de perifere weefsels. De hypothalamus is het controlecentrum die het lichaam energie homeostase, eetlust en circadiane ritmen regelt. Vooral bemiddelt de hypothalamus ook insuline signaal reactievermogen te reguleren van systemische metabolisme1,2,3,4,5. Verstoren de hypothalamische insuline signalering traject kan induceren insuline resistentie6,7. De hypothalamus coördineert cellulaire energie status en afscheiding van hormonen, zoals insuline en adipokines (b.v., leptine) uit de perifere weefsels, voor het regelen van systemische glucose metabolisme, insuline respons en voedselinname. Insuline binding aan de receptor insuline activeert insuline receptor substraat (IRS) eiwitten, die vervolgens insuline downstream signalering moleculen, zoals PI3K activeren (phosphatidylinositol 3-kinase) en AKT (proteïne kinase B (PKB/AKT)), voor het opwekken van GLUT4 membraan translocatie. Neuronen zijn niet de grote doelstelling voor de opname van glucose in reactie op insuline; echter zijn aanzienlijke niveaus van GLUT4 expressie geïdentificeerd in de regio van de hypothalamische arcuate nucleus (ARC). De regulering van de GLUT4 in de hypothalamische neuronen kan daarom een belangrijke rol spelen in de insuline signalering in de hersenen-randapparaat as.
Vele studies hebben gesuggereerd dat chronische ontsteking en inflammatoire chemokines in de hypothalamus ook een belangrijke rol in de ontwikkeling van diabetes en obesitas spelen, en remming van de hypothalamische ontsteking dieet-geïnduceerde insulineresistentie kunt omkeren 8 , 9 , 10. Bovendien, chemokine-CCL5 (C-C motief ligand 5, ook bekend als RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) en de niveaus van de receptor CCR5 ook correleren met de ontwikkeling van T2DM11,12. De rol van CCL5 en CCR5 in insuline-functie en glucose metabolisme blijven onduidelijk. Één studie gemeld dat CCR5-deficiëntie muizen beschermd tegen zwaarlijvigheid-veroorzaakte ontsteking, macrofaag aanwerving en insuline resistentie11; in tegenstelling, een andere studie gemeld dat CCR5-deficiëntie schaadt systemische glucosetolerantie, evenals adipocyte en spier insuline signalering van12. CCL5 is gevonden te verhogen van de opname van glucose in T-cellen en te verminderen voedselinname door haar optreden op de hypothalamus13,14, echter beide het werkingsmechanisme en de receptoren betrokken zijn nog te kunnen identificeren.
Het is moeilijk om te bestuderen van de cellulaire mechanismen die ten grondslag liggen aan het effect van perifere weefsel ontsteking op insuline werking in hypothalame neuronen. Dit is omwille van de cellulaire heterogeniteit en neuron circuit feedback regelgeving. Om deze reden biedt een in vitro -model van het cel-cultuur een schone model voor het onderzoek naar de effecten van de chemokine op hypothalame insuline signaal verordening. Hoewel er dat veel gevestigde vereeuwigd hypothalame neuronale cellijnen voor gebruik in onderzoek, deze cellijnen uitgedrukt verschillende markeringen, en dus verschillende soorten hypothalame neuronen15vertegenwoordigen. Hoewel primaire hypothalame culturen kunnen moeilijk zijn te handhaven, zij kunnen bieden de meest realistische reactie van hypothalame neuronen op insuline stimulatie, en ook de mogelijke onbekende gevolgen die spelen bij het onderhoud van de cellen kunnen storing op lange termijn in een kweekvloeistof met kunstmatige groeifactoren.
Hierin, we gebruiken de primaire hypothalame neuronen van C57BL/6 wildtype (WT) muis zowel CCR5 knock-out (CCR5- / -) muis, en transfect van beide soorten cellen met GFP-GLUT4 constructie. Om te onderzoeken van de bijdrage van CCR5 aan insuline gemedieerde GLUT4 membraan mensenhandel, werden GFP-GLUT4 transfected neuronen behandeld met insuline of recombinant CCL5. We karakteriseren dan het verkeer van GFP-GLUT4 op het plasma-membraan in primaire hypothalame neuronen met deconvolutie microscopie.
Protocol
Alle protocollen en methoden die worden gebruikt in dierlijke onderwerpen zijn goedgekeurd door institutionele Animal Care en gebruik commissies (IACUC) van Taipei Medizinische Universität (Protocol nummers: LAC-2013-0278; LAC-2015-0397)
1. primaire Neuron cultuur
- Voorbereiding voor cultuur
- Coat de cultuur gerechten met poly-D-Lysine (tabel 1) één dag vóór de cultuur. Voor een 6-well schotel, voeg 1,5 mL poly-D-Lysine (0,05 mg/mL) in elk putje. Voor live-imaging, cultuur cellen op een 12 x 12 mm dekglaasje aan in een standaard gecoate 6-well plaat.
- Verwijderen/recycle de poly-D-lysine en de afwas tweemaal met 2 mL ddH2O.
- Voorbereiden van de chirurgische instrumenten: een paar ontrafeling van micro schaar, pincet gebogen-tipped en standaard rechte-tipped pincet. Steriliseren van de chirurgische instrumenten en houd ze in 75% ethanol tijdens de operatie.
- Vullen 10 cm petrischalen met 20 mL wassen medium (tabel 1) en houd op ijs.
- Vullen van een tube van 15 mL test met 15 mL wassen medium en houd de buis op ijs.
- Hersenen weefsel los van verschillende hersengebieden
- 16-19 dagen oude zwangere vrouwelijke muizen met standaard euthanization protocollen door muizen in een kooi niet-geventileerde en vervolgens bedwelmende met CO2offeren. E15.5 ~ E16.5 embryo's worden aanbevolen voor hypothalame neuronale cultuur en E16.5 ~ E17.5 zijn meer geschikt voor hippocampal en corticale neuronale cultuur.
- Het steriliseren van het platform, ontleden Microscoop en chirurgie hulpmiddelen met 75% ethanol om verontreiniging te voorkomen.
- Knip rond het gebied van de navelstreng (donker rode gebied, figuur 1A, 1B dash lijn) te isoleren van de pups gemakkelijk zonder beschadiging van hen (Figuur 1 c, 1 D).
- Verwijder de kopsectie van elke pup met een schaar (figuur 1E, F), dan beveiligen de kopsectie in plaats met behulp van de boete getipt rechte pincet voor de oog-regio (figuur 1G). Gebruik die een andere boete-tipped gebogen pincet om te verwijderen van de buitenste huid en de schedel van twee kanten en ze afschilferen van de voorste op de dorsale richting (Figuur 1 H, zwarte pijl wijst naar de richting). De hersenen worden geïsoleerd zonder enige schade (figuur 1I).
Opmerking: Het is essentieel voor het handhaven van de integriteit van de hersenen om nauwkeurigheid te garanderen bij het isoleren van de verschillende regio's van de hersenen. - Geïsoleerde hersenen houden in een schone petrischaal met ijskoude wassen medium voor de volgende stappen.
- Flip de hersenen en houden de ventrale zijde. De hypothalamus is een ronde structuur in het midden van de hersenen (figuur 1J, pijl wijst naar de hypothalamische regio). Isoleren het hypothalame weefsel met een boete-tipped gebogen Tang. Verwijderen van de hersenvliezen (die hebben een geelachtig-rode kleur) zorgvuldig.
Let op: De volledige verwijdering van de hersenvliezen is een cruciale stap om fibroblast verontreiniging te voorkomen. - Houd de bulbus kwab met de scherpe verlostang en afschilferen van de dunne hersenvliezen rond de hele hersenen met de gebogen verlostang (Figuur 1 K, L).
- De hippocampus is een banaan-achtige vorm die is ingesloten in het onderste deel van de cortex. Spiegelen aan de onderkant van de cortex en de hippocampus scheiden van de cortex door te trekken naar de kant met de gebogen verlostang (Figuur 1 MN en O). Zorg ervoor dat alle de resterende hersenvliezen rond de hersenweefsel te verwijderen.
- Wanneer alle regio's van de hersenen geïsoleerd zijn, hak deze weefsels in de 15 mL buisjes met ijskoude wassen medium met de hulp van de verlostang (stap 1.1.5).
Opmerking: Hersenen weefsels kunnen worden bewaard in het ijskoude wassen medium voor 2-3 h.
- Weefsel spijsvertering, beplating en cultuur
- Spoel de weefsels door het omkeren van de buis 15 mL weefsel bevattende 2 - 3 keer, en dan houden de buis rechtstreeks naar het toestaan van de weefsels te settelen (1-3 min).
- Verwijder de bovenste medium gebruik de glazen pipet van Pasteur op een vacuüm systeem is aangesloten. Om te wassen het weefsel, voeg 15 mL ijs koud wassen medium en omkeren van de buis-2 - 3 keer. Wassen-Herhaal 3 keer voor de volgende stap.
Let op: Wees voorzichtig met de weefsels op de bodem, bij het verwijderen van de bovenste medium gebruik een vacuümsysteem. - Na de definitieve wash, verwijder het medium van de wassen met behulp van een pipet 1 mL.
- Incubeer weefsels met papaïne-trypsine spijsvertering buffer (tabel 1) in een waterbad 37 ° C gedurende 7-14 minuten schudden de buizen die iedere twee minuten om ervoor te zorgen alle weefsels zijn goed belicht aan de buffer van de spijsvertering.
Opmerking: Incubatietijd en het volume van de spijsvertering buffer kunnen worden aangepast afhankelijk van de grootte van het weefsel. Voor hypothalame weefsel, verzameld uit 6-8 pups, wordt 300 µL papaïne-trypsine spijsvertering buffer en 7 min incubatietijd aanbevolen. Meer weefsel vergt meer spijsvertering buffer. - Neutraliseren van het enzym activiteit door het toevoegen van 1 volume van foetale runderserum. Schud de reageerbuis 3 - 5 keer bij kamertemperatuur.
- Houd de buis op rekken en wacht tot 1-2 min om de weefsels te vestigen; Verwijder het supernatant zorgvuldig met een pipet 1 mL.
- Voeg 6 mL plating medium (tabel 1) in de reageerbuis en Pipetteer het weefsel en neergaande 50 keer met een 5 mL-pipet zachtjes (voor een 6-well plaat, 1,5 mL plating medium per putje wordt aanbevolen). De meeste cellen zal in afzonderlijke cellen na herhaalde pipetteren distantiëren.
Opmerking: Probeer te vermijden van de vorming van luchtbellen terwijl het uitvoeren van deze stap. De meeste laboratoria gebruiken gevlamd glas grasland pipets te distantiëren van het weefsel. Een 5 mL-pipet met een smalle tip kunnen een goed alternatief voor deze stap. - Houden van een buis op het rek en wacht tot 1-2 min om de stevige, un-gedissocieerde weefsels te settelen. Neem de bovenste fase bevat losgekoppeld van de cellen tot een nieuwe koker en Verdun met plating medium (5 x volume plating medium per 1 x volume van gedissocieerde cellen. Bijvoorbeeld, voeg 5 mL plating medium voor 1 mL losgekoppeld cellen).
- Bereken de celdichtheid met behulp van een hemocytometer en het vereiste aantal cellen in de cultuur-plaat bekleed met poly-D-lysine zoals in stap 1.1.1 zaad. Het is raadzaam om de 2-4 x 105 cellen per putje voor een schotel 6 goed schotel/35 mm werden aanbevolen voor neuron imaging studies. Een hogere dichtheid nodig zou zijn voor eiwit verzamelen en analyseren.
Opmerking: Voeg niet teveel plating medium, 1-1.5 mL plating medium in een 6-well schotel volstaat voor bevestiging. Een overmaat van medium zal de tijd die nodig is voor de bevestiging van de juiste cel verlengen. - Wacht 2-3 h en controleren van de geplaatste neuronen onder de Microscoop. Neuronen zal beginnen te groeien neuritis wanneer zij goed hechten.
- Verwijder het medium van de beplating en voeg toe 2 mL opgewarmd wassen medium (37 ° C) in de schotel aan het medium van de beplating afwassen. Herhaal deze stap tweemaal.
- Voeg 2 mL volledige kweekmedium (tabel 1) in elk putje in de schotel 6-well.
- De helft van het medium elke 3-4 dagen wijzigen. Voorbereiding van het volledige medium vers telkens. Neuronen gekweekt uit verschillende muis hersengebieden zal hebben verschillende morfologie en kenmerken (Figuur 2).
2. de transfectie van plasmide DNA in primaire Neuron met liposoom systeem
Let op: Voor neuron transfectie, een endotoxine-vrije plasmide DNA zuivering kit (Materialen tabel) wordt aanbevolen voor DNA voorbereiding. Extra ethanol neerslag kunt verwijderen overtollige oplosmiddel en verbetert de concentratie van het DNA.
-
Liposoom gebaseerde DNA transfectie in primaire neuronen.
Opmerking: De tijd van de transfectie is afhankelijk van de status van de rijping in experimenten vereist. De hypothalamische neuronen zijn transfected op DIV 7-10 (DIV, dagen in vitro).- DNA: Liposoom mengsel preparaat: Verdun GFP-GLUT4 plasmide DNA16 (2 µg) in een microcentrifuge tube met 300 µL lage serum kweekmedium. Bereiden van een andere microcentrifuge buis met 2 µL liposoom in 300 µL lage serum kweekmedium en incubeer gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- De inhoud van beide buizen combineren en incubeer gedurende 20-30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het kweekmedium neuron uit de cultuur-schotel. Voeg 600 µL DNA-liposoom mengsel in elk putje en Incubeer bij 37 ° C gedurende 4-6 uur.
- Na 4-6 uur, verwijderen van DNA-liposoom mengsel en voeg toe 2 mL gestolde voedingsbodem.
- Fluorescerende signalen, zoals GFP alleen en GLUT4 eiwit geconjugeerd met GFP tag ( Figuur 4enFiguur 3 ) kunnen worden waargenomen na 18-72 uur.
3. live beeldopname
-
Voorbereiding cellen voor Live Imaging
- Cultuur WT en CCR5- / - hypothalame neuron cellen uiten van groene fluorescentie eiwit label glucose transporter 4 (GFP-GLUT4) op de #1.5 (of dikte 0,17 mm) glas dekglaasje aan die al vooraf gecoat met poly-D-Lysine in stap 1.1.1 in de 6-well plaat.
- Zorgvuldig verwijderen van de coverslips met neuronen met pincet en plaats deze op de dia's van glas met de nodige voorzichtigheid.
- Verwijder overtollige normaal/vloeistof met delicate taak doekjes. Vouw de doekjes tweemaal, en zorgvuldig plaats ze op de top van het dekglaasje aan. Zachtjes druk naar beneden veegt zonder te bewegen het dekglaasje aan.
Let op: Druk niet op het dekglaasje aan tegen het glasplaatje krachtig. Het doel van deze stap is om ervoor te zorgen dat het dekglaasje aan doet niet verplaatsen/drift tijdens Beeldacquisitie veroorzaakt door uitbundige kracht. - Plaats coverslips en dia's het werkgebied deconvolutie Microscoop, met de dekglaasje aan naar beneden naar beneden, en beveiligde goed. Deze stap is om ervoor te zorgen dat de positie van de dia constant blijft, zodat gebruikers dezelfde set doelcellen later kunnen bijhouden.
- Observeren van WT en CCR5- / - hypothalame neuron cellen met een 60 x / 1.42 nb olie-immersie objectief.
- Behandeling van de monsters van de geselecteerde cel met CCL5 (10 ng/mL) of insuline (10 U/mL) voor één min. 1,5 toevoegen µL van verdunde insuline aan de rand van het dekglaasje aan.
- Visualiseer en de geselecteerde celsteekproeven onmiddellijk opnemen. Programma voor de video-opname-software om vast te leggen voor 30 min.
-
Deconvolutie microscopie en analyse
Opmerking: Dit deel van het protocol vereist het gebruik van een deconvolutie Microscoop en gespecialiseerde software voor analyse.- De kracht van de imaging systeem inschakelen, Microscoop fase te initiëren op gepaste wijze, en vervolgens zet op de LED-lichtbron.
- Voeg onderdompeling olie (brekingsindex 1.520 voor live monsters bij 37 ° C) op een 60 x 1.42 nb objectief. Plaats de voorbeelddia op de microscoop met het dekglaasje aan naar de richting van het objectief en de dia goed beveiligen.
- Gebruik heldere-veld of fluorescentie verlichting te identificeren van de doelcellen. Pas de focus totdat doelcellen duidelijk waarneembaar. Verplaats het objectief niet buiten het dekglaasje aan gebied om te voorkomen dat geen onnodige kras merken.
- Identificeren van groene fluorescentie eiwit geconjugeerd Glucose Transporter 4 (GFP-GLUT4) door het GFP-signaal. Het identificeren van gewenste doelcellen voor Beeldacquisitie. De positie van de cel van het geselecteerde doel kan worden opgeslagen voor toekomstig gebruik (Figuur 4).
- Goede experimentele parameters (waaronder aantal pixels, excitatie golflengte transmissie percentage, belichtingstijd, stapel dikte, tijdsinterval en totale imaging tijd) op elke cel instellen. Voor dit experiment, werd het nummer van de pixel van de afbeelding vastgesteld op 512 x 512 (kan worden ingesteld op 1024 x 1024 voor hogere resolutie) voor GFP signalen. De belichtingstijd is ingesteld tussen 0,025 naar 0,05 s voor elke 5 min. kleine laterale x-, y- en z-aanpassingen kan worden gecontroleerd door de aanbevolen software (materialen tabel).
- Stel de parameter van de blootstelling aan ongeveer 2.000 tot 3.000 graven om maximale pixel intensiteit. U wilt minimaliseren fluorescentie photobleaching, door het percentage van excitatie lichttransmissie zoveel mogelijk te verminderen, terwijl houden blootstelling tijd minder dan 1 s. Herhaal deze stappen voor elke extra fluorescentie zender (s) en elk afzonderlijk gebied van belang.
- De bovenste en onderste grenswaarden voor de Z-stack aangezet in elke cel. Dit kan worden bereikt door het bewegen van de Microscoop fase tot de boven- en onderkant van de doelcel beide beetje onscherp zijn. De gebruikers kunnen aanpassen van de resolutie van de z-as door het instellen van het aantal afbeeldingen tussen de bovenste en onderste grenswaarden (die kan worden gedaan door het instellen van de afstand tussen elke afbeelding).
- Stapels van beelden waren deconvolved en later geanalyseerd met behulp van de respectievelijke software-snelheid van PerkinElmer in dit geval.
Representative Results
De hypothalamische neuronen gekweekt van muizen werden verder geïdentificeerd door immunokleuring met hypothalame specifieke proteïne - pro-opiomelanocortin (POMC) antilichaam en neuronale marker - microtubulus-geassocieerde proteïne 2 (MAP2) (figuur 2A). We hebben bevestigd dat de primaire gekweekte hypothalame neuronen uitgedrukt hypothalame eiwit POMC. De expressie van de CCR5-receptor en de CCL5 in de hypothalamische neuronen werden geïdentificeerd met specifieke antilichamen en co gemarkeerd met POMC antilichaam (figuur 2A, 2B).
Na 3 dagen van kweken, neuronen zijn transfected met GFP DNA (Figuur 3) of GFP geconjugeerd GLUT4 (Figuur 4). GFP expressie kan meestal worden gevonden helemaal over dat de cel zonder een specifiek patroon (Figuur 3) maar de GLUT4-GFP zal uitdrukken als een punctate-achtige structuur in het cytosol (Figuur 4). De transfectie kit die wordt gebruikt in deze studie is niet de meest efficiënte methode voor neuron transfectie; het is echter een minder strenge methode voor betere overleving van de cel na transfectie, die aan het beter leven-cel imaging bijdraagt/opname later. De beelden van GFP-GLUT4 waarin neuronen waren opgelegd voor time-lapse films (figuur 4A-B, aanvullende video 1, 2) insuline stimulatie of de stimulatie van de CCL5 (figuur 4C, aanvullende video 3). De signalen van GFP en GFP-GLUT4 zijn helder en sterk in neuronen.
Hypothalame neuronen met GLUT4-GFP transfectie werden verder behandeld met insuline (40 U) te karakteriseren GFP-GLUT4 handel. Vertegenwoordiger video's GLUT4-GFP verkeer op insuline stimulatie in WT zowel CCR5- / - hypothalame neuronen worden getoond als Video 1 en Video 2, respectievelijk.
Figuur 1: isolatie van weefsels uit verschillende regio's van de hersenen van de muis in het embryonale stadium (dag 16,5). (A-D) De stappen die betrokken zijn bij de scheiding van de pups van de placenta. (E, F) De dissectie van de kop van een pup uit het lichaam. (G-ik) De stappen die betrokken zijn bij het isolement van de hele hersenen van de schedel. De zwarte pijl wijst in de richting worden getrokken tijdens het verwijderen van de schedel met pincet. (J) het isolement van de hypothalamus. De zwarte pijl wijst naar de hypothalamische regio tussen pincet. (K-L) Isolatie van de cortex van de hersenen van de muis. Het zwarte sterretje geeft de corticale regio van de hersenen van de muis en de witte pijl wijst naar de scheiding van de cortex van de hele hersenen. (M-O) De scheiding van het hippocampal gedeelte van de cortex. De bovenste witte pijl markeert het hippocampal weefsel en de lagere witte pijl markeert de corticale weefsel. Schaal bars = 1 cm (A-F), 200 µm (G-O). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: karakterisering van hypothalame neuronale marker - POMC en de co uitdrukking van CCL5 en CCR5. (A) primaire gekweekte hypothalame neuronen waren gelabeld met de hypothalamische neuronale markeerdraad - POMC (rood), de co expressie van de CCR5 (groen) en neuron markeerdraad MAP2 (grijs). (B) de CCL5 (groene) expressie in POMC (rood) positieve hypothalame neuronen (aangepast uit de aanvullende gegevens van referentie17). DAPI label hier de kern met blauwe kleur. Schaal bars = 50 µm in (A) en (B). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: GFP eiwituitdrukking in muis primaire neuronen. GFP plasmide DNA transfected in primaire gekweekte neuronen na 4 dagen cultuur (DIV4) met liposoom en uitgedrukt voor nog eens 3 dagen (DIV7). (A-B) GFP wordt uitgedrukt in neuritis zowel soma. (C-D) Neuronen met mock transfectie; DAPI label de kern in (B, D). Schaal bars = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4: de snapshots van GFP-GLUT4 in de hypothalamische neuronen. (A, C) GFP-GLUT4 eiwit uitgedrukt in de hypothalamische neuronen Wildtype (WT) en (B) CCR5- / - hypothalame neuronen. Neuronen werden gestimuleerd met insuline (A, B) of CCL5 (C). De pijlen wijzen naar het GFP-GLUT4-punctate in de neuritis vóór (-) en na (+) insuline of CCL5 stimulatie en sterretjes wijzen op de oppervlakte GLUT4-GFP vóór (-) en na (+) CCL5 stimulatie in (C). (Figuur aangepast van referentie17). Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| 5 x Borade Buffer | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume |
| Boorzuur | Sigma-Aldrich | B6768 | 1.55 g |
| Borax | Sigma-Aldrich | 71997 | 2.375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Gefilterd, houden bij 4 ° C | |||
| 20 x Poly-D-Lysine voorraad | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Gefilterd, houden bij-20 ° C | |||
| 1 x Poly-D-Lysine | Volume | ||
| 20 x Poly-D-Lysine | 5 mL | ||
| 5 x Borade Buffer | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| Totaal | 100 mL | ||
| Bewaren bij 4 ° C | |||
| Wassen van Medium | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume |
| DMEM-hoge glucose | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibioticum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Totaal | 500 mL | ||
| Bewaren bij 4° C | |||
| Papaïne-trypsine spijsvertering buffer: | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume/finale concentratie |
| Papaïne (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| Trypsine-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0,05%) |
| Wassen van Medium | 600 ΜL | ||
| Totaal | 1.000 ΜL | ||
| Houd bij-20 ° C | |||
| Beplating medium: | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Foetale runderserum | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamaat (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibioticum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Totaal | 200 mL | ||
| Bewaren bij 4 ° C | |||
| Volledige kweekmedium | Bedrijf | Catalogusnummer | Volume |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| N2 supplement (100 x) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| B27 supplement (50 x) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamaat (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibioticum-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Totaal | 100 mL | ||
| Vers bereid |
Tabel 1: Spijsvertering buffer en media samenstelling gebruikt in deze studie.
Aanvullende Video 1: Insuline gestimuleerd GFP-GLUT4 beweging in WT hypothalame neuronen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Video 2: Insuline gestimuleerd GFP-GLUT4 beweging in CCR5- / - hypothalame neuronen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende Video 3: CCL5 gestimuleerd GFP-GLUT4 beweging in WT hypothalame neuronen (Video aangepast van referentie17). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De mogelijkheid om te controleren van levende cellen, bij CCL5 of insuline stimulatie, is uitermate belangrijk voor het bestuderen van het snelle effect van CCL5 of insuline op GLUT4 beweging. In feite, het stelt ons in staat om te visualiseren het belangrijke verschil tussen WT en CCR5- / - hypothalame neuronen op insuline stimulatie. Wij hebben verricht de oppervlakte labeling van endogene GLUT4 eiwitten in WT en CCR5- / - hypothalame neuronen op verschillende tijdstippen na insuline stimulatie17. De etikettering van cel oppervlakte eiwitten vereist hoge-specificiteit antilichaam met lage achtergrond. Oppervlakte fluorescentie kwantificering kan daarnaast ook uitdagende en tijdrovend zijn. Aldus, time-lapse opname laat ons toe om bepaalde dat het effect van CCL5 of insuline is een ware fysiologische verandering gebaseerd op experimentele omstandigheden, in plaats van een statistische variatie. Samen met oppervlakte labeling van endogene GLUT4, bieden we sterk bewijs en experimenten om aan te tonen hoe CCL5 en CCR5 deelnemen aan GLUT4 translocatie en insuline signalering.
In moderne celbiologie en moleculaire biologie studies vereisen vele experimenten het gebruik van de fluorescentie microscopie. Deze technologie maakt het mogelijk wetenschappers te visualiseren de ruimtelijke relatie tussen eiwitten en/of cellulaire organellen, naast bewegings richting en snelheid, stimulerende effecten, morfologische veranderingen en handel van proteïne. Deze technologie heeft echter nog de beperking: wanneer fluorophores zijn enthousiast, signalen die van de target eiwit (of ruimte) kunnen worden overweldigd door de achtergrond fluorescentie. Dientengevolge, fluorescentie beelden kunnen onscherp worden weergegeven met de verwachte signalen begraven diep in achtergrond signalen. Dit verschijnsel is vooral duidelijk voor de waarneming van membraan-gebonden eiwitten.
Totale interne reflectie fluorescentie microscopie (TIRFM) werd ontwikkeld om dit probleem te overwinnen. Het staat de wetenschappers te visualiseren de excitatie van geselecteerde oppervlak-gebonden fluorophores zonder de achtergrond fluorophores. Het staat de wetenschappers te selectief karakteriseren functies en gebeurtenissen op een zeer dunne oppervlakte regio zoals een plasma-membraan. Deconvolutie microscopie is een computationeel intensief beeld processing techniek die mogelijk met behulp van technologische vooruitgang in de afgelopen jaren gemaakt is. Het is vaak gebruikt ter verbetering van de resolutie van de afbeelding van de digitale fluorescentie. Zoals gezegd, wanneer fluorophores zijn wordt opgewekt door een type verlichting (zoals laser of LED), zal alle fluorophores uitstoten lichtsignalen ongeacht als ze in focus of niet zijn, zodat de afbeelding zal altijd onscherp worden weergegeven. Deze vervaging wordt veroorzaakt door een verschijnsel genaamd "Punt verspreiden Function" (PSV), zoals licht vanuit een kleine TL bron (lichtpuntje) zal verder verspreid en onscherp (blur worden). In principe, deze gebeurtenis zal produceren een zandloper-achtige gevormde fluorescent signaal en een fluorescentie-beeld kan worden samengesteld uit talrijke dergelijke lichtsignalen. De deconvolutie proces kunt toewijzen van alle fluorescentie signalen naar zijn oorspronkelijke lichte plek vorm, en elimineren allermeest naar de out-of-focus licht afbeeldingscontrast te verbeteren.
In de afgelopen jaren hebben deconvolutie algoritmen afbeeldingen met een resolutie van de vergelijkbaar met die van een confocal microscoop gegenereerd. Bovendien, in vergelijking met TIRFM waardoor out-of-focus vervagen worden gedetecteerd door een regio beperkt excitatie microscopie van het breed-gebied kan alle licht signalen worden ontdekt en wordt hen terug naar hun bron via het deconvolutie proces. Daarom, in de praktijk deconvolutie microscopie is geworden niet alleen een meer efficiënte afbeelding overname methode, maar ook een meer voordelige methode in vergelijking met TIRF microscopie.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We zijn dankbaar voor de subsidies verstrekt door het ministerie van wetenschap en technologie, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) en gezondheid en het welzijn toeslag van tabaksproducten - MOHW106-TDU-B-212-144001 tot S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
