Summary
Ce protocole décrit une technique pour l’observation des temps réel Green Fluorescence Protein (GFP) tag protéines 4 transporteur de Glucose (GLUT4) après stimulation par l’insuline et la caractérisation du rôle biologique de CCR5 dans l’insuline – GLUT4 voie avec la microscopie de déconvolution de signalisation.
Abstract
Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale qui se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus dans le système nerveux central (SNC) est le centre de contrôle de l’énergie et l’insuline signal réponse règlement. Inflammation chronique des tissus périphériques et des déséquilibres de certaines chimiokines (comme CCL5, TNFα et IL-6) contribuent à l’obésité et de diabète. Cependant, les mécanismes fonctionnels reliant chimiokines et règlement de signal insuline hypothalamique encore demeurent incertains.
Modèles de culture in vitro neurone primaires sont modèles simples et pratiques qui peuvent être utilisées pour étudier les règlement de signal de l’insuline dans les neurones hypothalamiques. Dans cette étude, nous avons introduit exogènes GLUT4 protéine conjuguée avec GFP (GFP-GLUT4) dans les neurones hypothalamiques primaires pour suivre la translocation de membrane GLUT4 lors de la stimulation de l’insuline. Time-lapse images du trafic de la protéine GFP-GLUT4 ont été enregistrées par microscopie de déconvolution, qui permettait aux utilisateurs de générer des images à grande vitesse et à haute résolution sans endommager les neurones significativement tandis que mène l’expérience. La contribution de CCR5 dans la translocation de GLUT4 insuline réglementée a été observée chez neurones hypothalamiques déficients CCR5, qui ont été isolées et cultivées de souris knock-out CCR5. Nos résultats démontrent que l’efficacité de la translocation de membrane GLUT4 est réduite dans les neurones hypothalamiques déficients CCR5 après stimulation par l’insuline.
Introduction
Diabète de type 2 (T2DM) est une crise de santé mondiale. T2DM se caractérise par l’insuline signalisation déficience et une inflammation chronique dans les tissus périphériques. L’hypothalamus est le centre de contrôle qui régule l’homéostasie énergétique du corps, l’appétit et les rythmes circadiens. Plus important encore, l’hypothalamus est également le médiateur réactivité de signal de l’insuline pour réguler le métabolisme systémique1,2,3,4,5. Perturber l’insuline hypothalamique signalisation voie pouvait induire l’insuline résistance6,7. L’hypothalamus coordonne le statut d’énergie cellulaire et la sécrétion des hormones, comme l’insuline et les adipokines (p. ex., leptine) dans les tissus périphériques, pour réguler le métabolisme du glucose systémique, la réactivité de l’insuline et la prise alimentaire. Fixation de l’insuline pour le récepteur de l’insuline active l’insuline récepteurs substrat (IRS) des protéines qui puis activent molécules signalisation en aval d’insuline, tels que PI3K (phosphatidylinositol 3-kinase) et AKT (protéine kinase B (PKB/AKT)), pour induire la GLUT4 translocation de la membrane. Les neurones ne sont pas la cible majeure pour la captation du glucose en réponse à l’insuline ; Cependant, des niveaux significatifs d’expression GLUT4 ont été identifiés dans la région de noyau arqué hypothalamique (ARC). Par conséquent, le règlement de GLUT4 dans les neurones hypothalamiques jouerait un rôle important dans la signalisation dans l’axe cerveau-périphérique d’insuline.
De nombreuses études ont suggéré que l’inflammation chronique et des chimiokines inflammatoires dans l’hypothalamus également jouent un rôle important dans le développement du diabète et l’obésité, et l’inhibition de l’inflammation hypothalamique peut inverser la résistance à l’insuline induite par l’alimentation 8 , 9 , 10. en outre, chemokine-CCL5 (ligand de motif C-C 5, également connu sous le nom de RANTES, Regulated-on-Activation-Normal-T-cell-Expressed-and-Secreted) et ses niveaux de récepteurs CCR5 également mettre en corrélation avec le développement de T2DM11,12. Les rôles de CCL5 et CCR5 dans le métabolisme de l’insuline glucose et fonction restent floues. Une étude a signalé que CCR5 carence protégeait les souris de l’inflammation induite par l’obésité, le recrutement de macrophages et insuline résistance11; en revanche, une autre étude indique que la carence CCR5 entrave systémique au glucose, ainsi que l’insuline musculaires et les adipocytes, signalisation12. CCL5 se trouve à augmenter l’absorption du glucose dans les cellules-T et à réduire la prise alimentaire par le biais de son action sur l’hypothalamus13,14, cependant, les deux le mécanisme d’action et les récepteurs impliqués doivent encore être identifiés.
Il est difficile d’étudier les mécanismes cellulaires qui sous-tendent l’effet d’une inflammation des tissus périphériques sur l’insuline fonctionne dans les neurones hypothalamiques. C’est en raison des réglementations de rétroaction circuit cellulaires hétérogénéité et neuron. Pour cette raison, un modèle de culture in vitro cellule fournit un modèle propre afin d’étudier les effets de la chimiokine sur règlement signal insuline hypothalamique. Bien qu’il y a que beaucoup à établir des lignes des neurones hypothalamiques immortalisés pour la recherche, ces lignées cellulaires ont exprimé différents marqueurs et représentent donc les différents types de neurones hypothalamiques15. Même si les cultures hypothalamiques primaires peuvent être difficiles à maintenir, ils peuvent fournir la réponse la plus réaliste des neurones hypothalamiques lors de la stimulation de l’insuline et peuvent également éviter le potentiel des effets inconnus qui entrent en jeu lors de la maintenance des cellules à long terme dans le milieu de culture avec des facteurs de croissance artificielles.
Dans les présentes, nous utiliser des neurones hypothalamiques primaires du CCR5 knockout (CCR5- / -) souris C57BL/6 souris de type sauvage (WT) et et transfecter les deux types de cellules avec GFP-GLUT4 construct. Afin d’étudier la contribution du CCR5 à insuline véhiculée par GLUT4 membrane traite, GFP-GLUT4 transfectées neurones ont été traités avec l’insuline ou CCL5 recombinante. Ensuite, nous caractériser le mouvement de GFP-GLUT4 sur la membrane plasmique dans des neurones hypothalamiques primaires avec la microscopie de déconvolution.
Protocol
Tous les protocoles et les méthodes utilisées dans les matières animales ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) de l’Université de médecine de Taipei (numéros de protocole : LAC-2013-0278 ; LAC-2015-0397)
1. premier neurone Culture
- Préparation avant la culture
- Enduisez le Pétri avec poly-D-Lysine (tableau 1) un jour avant la culture. Pour un plat de 6 puits, ajouter 1,5 mL poly-D-Lysine (0,05 mg/mL) dans chaque puits. Pour vivre d’imagerie, les cellules de culture sur une lamelle de 12 x 12 mm en standard une plaque 6 puits.
- Supprimer/recycler la poly-D-lysine et laver la vaisselle deux fois avec 2 mL FD2O.
- Préparer les outils chirurgicaux : une paire de ciseaux micro-dissection, pinces à pointe courbée et pinces de pointe droite standard. Stériliser les instruments chirurgicaux et conservez-les dans de l’éthanol 75 % pendant la chirurgie.
- Remplir les plats de Pétri de 10 cm avec 20 mL de milieu de lavage (tableau 1) et de garder sur la glace.
- Remplir un tube de 15 mL avec 15 mL de milieu de lavage et maintenir le tube sur la glace.
- Isolement de tissu de cerveau de différentes régions du cerveau
- Sacrifier les souris femelles enceintes 16-19 jour vieux avec des protocoles standard euthanasie en plaçant des souris en cage sans aération et puis enivrantes de CO2. E15.5 ~ E16.5 embryons sont recommandés pour la culture de neurones hypothalamique et E16.5 ~ E17.5 sont plus adaptés à la culture neuronale hippocampique et corticale.
- Stérilisez la plate-forme, microscope à dissection et outils de chirurgie avec 75 % d’éthanol pour éviter la contamination.
- Couper autour de la zone du cordon ombilical (zone rouge sombre, Figure 1 a, 1 b ligne du tableau de bord) pour isoler les chiots facilement sans les abîmer (Figure 1, 1D).
- Retirer la tête de chaque chiot avec une paire de ciseaux (Figure 1E, F), puis fixez la partie tête à l’aide de la pince droite pointe fine pour la région de le œil (Figure 1). Utiliser qu'une autre pointe fine courbé pinces pour enlever le revêtement extérieur et le crâne des deux côtés et les décoller de la partie antérieure de la direction de dorsale (Figure 1 H, noir flèche pointe vers la direction). Le cerveau doit être isolé sans aucun dommage (Figure 1I).
Remarque : Il est essentiel de maintenir l’intégrité du cerveau pour assurer l’exactitude lors de l’isolement des différentes régions du cerveau. - Garder cerveau isolé dans une propre Pétri avec support glacé de lavage pour les étapes suivantes.
- Retourner le cerveau et garder la face ventrale vers le haut. L’hypothalamus est une structure ronde au milieu du cerveau (Figure 1J, flèche pointe vers la région hypothalamique). Isoler le tissu hypothalamique avec une pince courbée à pointe fine. Supprimer les méninges (qui ont une couleur rouge-jaunâtre) avec soin.
ATTENTION : L’élimination complète des méninges est une étape cruciale pour éviter la contamination des fibroblastes. - Tenez le lobe olfactif avec la pince forte et décollez les minces méninges entourant le cerveau entier avec la pince courbée (Figure 1, K, L).
- L’hippocampe est une forme de banane qui est incorporée dans la partie inférieure du cortex. Retourner à la partie inférieure du cortex et l’hippocampe séparer le cortex en tirant sur le côté avec la pince courbée (Figure 1, MN et O). N’oubliez pas de supprimer tous les méninges restantes entourant le tissu cérébral.
- Lorsque toutes les régions du cerveau ont été isolées, hacher ces tissus dans les tubes de 15 mL contenant le support de lavage glacé avec l’aide de la pince (étape 1.1.5).
Remarque : Les tissus cérébraux peuvent être maintenus dans le milieu de lavage glacée pendant 2-3 h.
- Culture, de placage et de digestion de tissu
- Rincer les tissus en renversant le tube de 15 mL de tissu contenant 2 ou 3 fois et puis garder le tube de droite pour permettre les tissus se calment (1-3 min).
- Retirez le support supérieur à l’aide de la pipette Pasteur en verre lié à un système de vide. Pour laver les tissus, ajouter 15 mL de milieu de lavage à froid glace et inverser le tube 2 - 3 fois. Répétez les étapes de lavage 3 fois avant l’étape suivante.
ATTENTION : Méfiez-vous des tissus sur le fond lorsque vous retirez le support supérieur à l’aide d’un système déprimogène. - Après le lavage final, retirez le support de lavage à l’aide d’une pipette de 1 mL.
- Incuber les tissus avec tampon de digestion de papaïne-trypsine (tableau 1) dans un bain-marie à 37 ° C pendant 7-14 min. Shake les tubes toutes les deux minutes pour s’assurer que tous les tissus sont correctement exposés vers le tampon de la digestion.
NOTE : Temps d’Incubation et le volume de tampon de digestion peuvent être réglés selon la taille du tissu. Pour tissu hypothalamique prélevé dans 6-8 petits, 300 µL papaïne-trypsine digestion tampon et 7 min temps d’incubation est recommandé. Plus de tissu nécessitera plus tampon de digestion. - Neutraliser l’activité de l’enzyme en ajoutant 1 volume de sérum de veau fœtal. Agiter le tube à essai 3 - 5 fois à la température ambiante.
- Maintenir le tube sur les paniers et attendre 1-2 min permettre les tissus se sédentariser ; Retirez le surnageant soigneusement avec une pipette de 1 mL.
- Ajouter 6 mL d’électrodéposition moyen (tableau 1) dans le tube à essai et pipette le tissu va-et-vient 50 fois avec une pipette de 5 mL doucement (pour une plaque 6 puits, 1,5 mL de milieu de placage / puits est recommandée). La plupart des cellules vont se dissocient en cellules individuelles après plusieurs pipetage.
NOTE : Essayez d’éviter la formation de bulles lors de cette étape. Plupart des laboratoires permet de dissocier le tissu verre flambé pâturage pipettes. Une pipette de 5 mL avec un embout étroit peut être une bonne alternative pour cette étape. - Garder un tube sur la grille et attendre 1-2 min permettre les tissus chunky, non dissociées se sédentariser. Prendre la phase supérieure contenant dissociée des cellules dans un nouveau tube et diluer avec placage medium (5 x médium placage volume par volume 1 x des cellules dissociées. Par exemple, ajouter 5 mL moyen pour les cellules 1 mL dissocié de placage).
- Calculer la densité des cellules à l’aide d’un hémocytomètre et le nombre requis de cellules des graines dans la plaque de culture recouverte de poly-D-lysine comme au point 1.1.1. Nous vous recommandons 2-4 x 105 cellules / puits pour un plat de 6 bien plat/35 mm ont été recommandées pour le neurone études d’imagerie. Une densité plus élevée serait nécessaire pour la collecte de la protéine et l’analyse.
Remarque : N’ajoutez pas trop moyen d’électrodéposition, 1 à 1,5 mL de milieu de placage dans un plat de 6 puits est suffisante pour la fixation. Une quantité excessive de médium prolongera le délai nécessaire à la fixation des cellules appropriées. - Attendez 2-3 h et vérifier les neurones ensemencées au microscope. Neurones commencera à croître névrite quand ils attachent correctement.
- Enlever le support de l’électrodéposition et ajouter 2 mL chauffé lavage moyen (37 ° C) dans le plat à laver le médium placage. Répéter cette étape deux fois.
- Ajouter 2 mL milieu de culture complet (tableau 1) dans chaque puits dans le plat de 6 puits.
- La moitié du milieu change tous les 3-4 jours. Préparer le milieu complet fraîchement chaque fois. Neurones cultivés de régions du cerveau de souris différents auront différente morphologie et caractéristiques (Figure 2).
2. la transfection d’ADN plasmidique dans primaire neurone avec système de Liposome
ATTENTION : Pour la transfection de neurone, un kit de purification d’ADN plasmide exempte d’endotoxine (Table des matières) est recommandé pour la préparation de l’ADN. Précipitation d’éthanol supplémentaire peut supprimer les excès de solvant et améliore la concentration d’ADN.
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Transfection d’ADN axée sur les liposomes dans des neurones primaires.
NOTE : Le temps de transfection dépend de l’état de maturation requis dans les expériences. Les neurones hypothalamiques ont été transfectées à DIV 7-10 (jours in vitroDIV).- L’ADN : Préparation Liposome mélange : diluer GFP-GLUT4 plasmide ADN16 (2 µg) dans une micro-centrifugeuse tube de milieu de culture contenant du 300 µL sérique. Préparer un autre tube de microcentrifuge avec 2 liposome µL de milieu de culture de 300 µL sérique et incuber pendant 5 min à température ambiante.
- Combiner le contenu de deux tubes et incuber pendant 20-30 min à température ambiante.
- Enlever le milieu de culture de neurone de la boîte de Pétri. Ajouter le mélange de l’ADN-liposome 600 µL dans chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 4 à 6 h.
- Après 4 à 6 h, retirez le mélange de l’ADN-liposome et ajouter 2 mL de milieu de culture.
- Des signaux fluorescents, comme seul GFP et protéine GLUT4 conjugué avec étiquette GFP (Figure 3 et Figure 4), peuvent être observées après 18 à 72 heures.
3. enregistrement d’images en direct
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Préparation des cellules pour vivent d’imagerie
- WT et CCR5- / - neurones hypothalamiques cellules exprimant la protéine de fluorescence verte étiquetée transporteur de glucose 4 (GFP-GLUT4) sur le #1.5 (ou 0,17 mm d’épaisseur) la culture lamelle de verre qui ont été recouvert de poly-D-Lysine à l’étape 1.1.1 dans le puits de 6 plaque.
- Soigneusement, enlever le couvre-objet avec les neurones avec une pincette et placez-la sur les lames de verre avec prudence.
- Retirez le médium/le liquide en excès avec la tâche délicate de lingettes. Plier les lingettes deux fois et placez-les délicatement sur le dessus de la lamelle. Appuyer doucement les lingettes sans déplacer la lamelle.
ATTENTION : N’appuyez pas sur la lamelle couvre-objet contre la lame de verre avec force. Cette étape vise à s’assurer que la lamelle ne pas déplacer/dérive lors de l’acquisition d’image causée par la force de flottabilité. - Placez correctement lamelles couvre-objet et glisse sur la platine du microscope déconvolution, avec le couvre-objet face vers le bas et sécurisé. Cette étape consiste à s’assurer que la position reste constante, afin que les utilisateurs peuvent suivre le même ensemble de cellules cibles plus tard.
- Observer les WT et CCR5- / - neurones hypothalamiques cellules avec un x 60 / 1,42 NA huile d’immersion objectif.
- Traiter les échantillons de la cellule sélectionnée avec CCL5 (10 ng/mL) ou de l’insuline (10 U/mL) pour un min. Ajouter 1,5 µL d’insuline dilué sur le bord de la lamelle couvre-objet.
- Visualiser et enregistrer les échantillons de la cellule sélectionnée immédiatement. Programmer le logiciel d’enregistrement vidéo pour enregistrer pendant 30 min.
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Déconvolution microscopie et analyse
Remarque : Cette partie du protocole exige l’utilisation d’un microscope de déconvolution et des logiciels spécialisés pour l’analyse.- Mettre en marche le système d’imagerie, permettre la platine du microscope initialiser correctement, puis tournez sur la source de lumière LED.
- Ajoute huile d’immersion (indice de réfraction 1.520 pour des échantillons vivants à 37 ° C) sur un objectif de 60 x 1,42 NA. Placer la lame de l’échantillon sur le microscope avec la lamelle orienté vers l’objectif et fixer la lame correctement.
- Éclairement lumineux-zone ou la fluorescence permet d’identifier les cellules cibles. Ajuster le focus jusqu'à ce que les cellules cibles sont clairement observables. Ne pas déplacer la lentille de l’objectif en dehors de la zone de la lamelle couvre-objet pour éviter les rayures inutiles.
- Identifier vert protéine fluorescente conjugué 4 transporteur de Glucose (GLUT4-GFP) par le signal GFP. Identifier les cellules cibles souhaitées pour l’acquisition d’images. Position de cellule cible sélectionné peut être mémorisée pour référence ultérieure (Figure 4).
- Configuration des paramètres expérimentaux appropriés (y compris le nombre de pixels, onde d’excitation, pourcentage de transmission, temps d’exposition, pile d’une épaisseur, intervalle de temps et temps d’imagerie total) sur chaque cellule cible. Dans cette expérience, le nombre de pixel d’image était fixé à 512 x 512 (il peut être fixé à 1 024 x 1 024 pour une résolution plus élevée) pour les signaux GFP. Le temps d’exposition a été mis entre 0.025 à 0,05 s pour chaque 5 min. mineur latérale x, y et ajustements z peut être contrôlé par le logiciel recommandé ( Tabledematières ).
- Définissez le paramètre d’exposition à environ 2 000 à 3 000 chefs d’accusation pour atteindre l’intensité des pixels maximum. Pour minimiser le photoblanchiment de fluorescence, réduire le pourcentage de la transmission de lumière d’excitation autant que possible alors que l’exposition de maintien de temps inférieure à 1 s. répéter ces étapes pour chaque canal/canaux fluorescence supplémentaire et chaque zone d’intérêt.
- Fixer la limite supérieure et inférieure de la Z-pile sur chaque cellule cible. Ceci peut être réalisé en déplaçant la platine du microscope jusqu'à ce que le haut et le bas de la cellule cible sont à la fois légèrement floue. Les utilisateurs peuvent ajuster la résolution de l’axe z, en définissant le nombre d’images entre la limite supérieure et inférieure (qui peut être fait en réglant la distance entre chaque image).
- Piles d’images ont été deconvolved et plus tard analysés à l’aide du logiciel respectif – vitesse de PerkinElmer en l’espèce.
Representative Results
Les neurones hypothalamiques cultivés de souris ont été encore identifiés par immunomarquage à protéines associées aux microtubules de hypothalamique protéine spécifique - pro-opiomélanocortine (POMC) anticorps et marqueur neuronal - 2 (MAP2) (Figure 2 a). Nous avons confirmé que les neurones hypothalamiques en culture primaire exprimé hypothalamique protéine POMC. L’expression du récepteur CCR5 et CCL5 dans les neurones hypothalamiques ont été identifiées avec des anticorps spécifiques et étiquetés conjointement avec anticorps POMC (Figure 2 a, 2 b).
Après 3 jours de culture, les neurones ont été transfectées avec GFP ADN (Figure 3) ou GFP conjugué GLUT4 (Figure 4). Expression de la GFP peut habituellement être trouvée partout que la cellule sans un modèle spécifique (Figure 3) mais la GLUT4-GFP exprimera comme une structure ponctuée dans le cytosol (Figure 4). Le kit de transfection utilisé dans cette étude n’est pas la méthode la plus efficace pour la transfection de neurone ; Cependant, c’est une méthode moins rigoureuse pour la survie des cellules mieux après la transfection, qui contribue à mieux vivre-cellule imagerie/enregistrement plus tard. Les images des neurones exprimant GFP-GLUT4 ont été prises avant les films Time-lapse (Figure 4 a-B, supplémentaire 1 vidéo, 2) après stimulation par l’insuline ou la stimulation CCL5 (Figure 4, 3 vidéo supplémentaire). Les signaux de GFP et GFP-GLUT4 sont claires et fortes dans les neurones.
Des neurones hypothalamiques avec transfection GLUT4-GFP ont été plus traités par insuline (40 U) pour caractériser le trafic de GFP-GLUT4. Vidéos représentative du mouvement GLUT4-GFP lors de la stimulation de l’insuline dans les WT et CCR5- / - les neurones hypothalamiques sont montrés comme vidéo 1 et vidéo 2, respectivement.
Figure 1 : isolement des tissus provenant de différentes régions du cerveau de souris au stade embryonnaire (jour 16,5). (A-D) Les étapes de la séparation des petits du placenta. (E, F) La dissection d’une tête de chiot de l’organisme. (G-I) Les étapes de l’isolement de tout le cerveau du crâne. La flèche noire dans le sens d’être tiré tout en retirant le crâne avec une pincette. (J) l’isolement de l’hypothalamus. La flèche noire pointe vers la région hypothalamique entre les pinces. (K-L) Isolement du cortex du cerveau de souris. L’astérisque noir indique la région corticale du cerveau de la souris et la flèche blanche à la séparation du cortex du cerveau entier. (M-O) La séparation de la partie hippocampique du cortex. La flèche blanche du haut marque le tissu hippocampique et la flèche inférieure blanche marque le tissu cortical. Barreaux de l’échelle = 1 cm (A-F), 200 µm (G.-O.). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : caractérisation des hypothalamique marqueur neuronal - POMC et la co-expression de CCL5 et CCR5. (A) des neurones hypothalamiques cultivés primaires sont marquées avec le marqueur neuronal hypothalamique - POMC (rouge), la co-expression de CCR5 (vert) et le neurone marqueur MAP2 (gris). (B), le CCL5 (vert) expression dans les neurones hypothalamiques positives POMC (rouge) (adapté des données supplémentaires de référence17). Ici, le DAPI étiqueté le noyau avec la couleur bleue. Barreaux de l’échelle = 50 µm dans (A) et (B). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : expression de la protéine GFP dans des neurones de souris primaire. L’ADN plasmidique GFP transfectés dans des neurones en culture primaire après culture de 4 jours (DIV4) avec liposome et exprimé pour encore 3 jours (DIV7). (A-B) GFP est exprimée dans les névrites et soma. (C-D) Neurones avec maquette transfection ; DAPI étiqueté le noyau (B, D). Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : les instantanés de GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques. (A, C) Protéine GFP-GLUT4 exprimés dans les neurones hypothalamiques type sauvage (WT) et (B) CCR5- / - neurones hypothalamiques. Neurones ont été stimulés par l’insuline (A, B) ou CCL5 (C). Les flèches pointent vers la GFP-GLUT4 ponctuée dans la névrite avant (-) et après (+) l’insuline ou la stimulation CCL5 et astérisques pointent vers la surface GLUT4-GFP avant (-) et après (+) la stimulation CCL5 en (C). (Adaptée de référence17la figure). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| 5 x tampon boumendil | Compagnie | Numéro de catalogue | Volume |
| Acide borique | Sigma-Aldrich | B6768 | 1,55 g |
| Borax | Sigma-Aldrich | 71997 | 2,375 g |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrée, conserver à 4 ° C | |||
| 20 x stock de Poly-D-Lysine | Compagnie | Numéro de catalogue | Volume |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | 100 mg |
| ddH2O | 100 mL | ||
| Filtrée, conserver à-20 ° C | |||
| 1 x Poly-D-Lysine | Volume | ||
| 20 x Poly-D-Lysine | 5 mL | ||
| 5 x tampon boumendil | 20 mL | ||
| ddH2O | 75 mL | ||
| Total | 100 mL | ||
| Conserver à 4 ° C | |||
| Support de lavage | Compagnie | Numéro de catalogue | Volume |
| DMEM-High glucose | Gibco | 12800-017 | 495 mL |
| Antibiotique-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 mL |
| Total | 500 mL | ||
| Conserver à 4° C | |||
| Tampon de papaïne-trypsine de digestion : | Compagnie | Numéro de catalogue | Concentration du volume/Final |
| Papaïne (10 mg/mL) | Sigma-Aldrich | P4762 | 200 µL (2 mg/mL) |
| La trypsine-EDTA (0,25 %) | Gibco | 25200-072 | 200 ΜL (0,05 %) |
| Support de lavage | 600 ΜL | ||
| Total | 1 000 ΜL | ||
| Conserver à-20 ° C | |||
| Moyen de placage : | Compagnie | Numéro de catalogue | Volume |
| Neurobasal moyen | Gibco | 21103-049 | 176 mL |
| Sérum de veau fœtal | Gibco | 10437-028 | 20 mL |
| L-glutamate (200 mM) | Gibco | 25030 | 2 mL |
| Antibiotique-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 mL |
| Total | 200 mL | ||
| Conserver à 4 ° C | |||
| Milieu de culture complet | Compagnie | Numéro de catalogue | Volume |
| Neurobasal moyen | Gibco | 21103-049 | 95 mL |
| Supplément de N2 (x 100) | Gibco | 17502-048 | 1 mL |
| Supplément de B27 (x 50) | Gibco | 17504-04 | 2 mL |
| L-glutamate (200 mM) | Gibco | 25030 | 1 mL |
| Antibiotique-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 mL |
| Total | 100 mL | ||
| Fraîchement préparés |
Tableau 1 : Digestion tampon et médias composition utilisée dans cette étude.
Vidéo supplémentaire 1 : L’insuline stimulée par le mouvement de GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques WT. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 2 : L’insuline stimule mouvement GFP-GLUT4 CCR5- / - neurones hypothalamiques. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Vidéo supplémentaire 3 : CCL5 a stimulé le mouvement GFP-GLUT4 dans les neurones hypothalamiques WT (Vidéo adapté de référence17). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.
Discussion
La capacité de contrôler des cellules vivantes, par stimulation de CCL5 ou de l’insuline, est extrêmement importante pour l’étude de l’effet rapide du CCL5 ou de l’insuline sur mouvement GLUT4. En fait, il nous permet de visualiser la différence significative entre les versions WT et CCR5 neurones hypothalamiques- / - après stimulation par l’insuline. Nous avons effectué l’étiquetage surface des protéines endogènes GLUT4 WT et CCR5 neurones hypothalamiques- / - à des moments différents après stimulation de l’insuline17. Le marquage des protéines de surface cellulaire nécessite haute spécificité anticorps avec faible bruit de fond. En outre, quantification de la fluorescence de surface peut également être difficile et fastidieux. Ainsi, Time-lapse enregistrement nous permet d’être certain que l’effet de la CCL5 ou l’insuline est un vrai changement physiologique issu des conditions expérimentales, et non une variation statistique. Avec surface de marquage de GLUT4 endogène, nous fournissons des preuves solides et expériences pour démontrer comment CCL5 et CCR5 participent à GLUT4 translocation et signalisation de l’insuline.
En biologie cellulaire moderne et des études de biologie moléculaire, de nombreuses expériences nécessitent l’utilisation de la microscopie de fluorescence. Cette technologie permet aux scientifiques de visualiser les relations spatiales entre les protéines et/ou des organites cellulaires, en plus de la direction du mouvement et vitesse, effets stimulants, des changements morphologiques et traite des protéines. Cependant, cette technologie a encore ses limites : lorsque les fluorophores sont excités, les signaux émis par la protéine cible (ou zone) peuvent être accablé par fluorescence de fond. En conséquence, images de fluorescence peuvent apparaître flous avec signaux attendus enterrés profondément dans les signaux de fond. Ce phénomène est particulièrement évident pour l’observation des protéines membranaires.
Total interne réflexion Fluorescence Microscopy (TIRFM) a été mis au point pour surmonter cette difficulté. Il permet aux scientifiques de visualiser l’excitation des fluorophores sélectionnés de surface-bondissent sans affecter les fluorophores de fond. Il permet aux scientifiques caractériser sélectivement les fonctionnalités et les événements sur une région de surface très mince comme une membrane plasmique. La microscopie de déconvolution est une technique qui est rendue possible grâce aux avancées technologiques ces dernières années de traitement d’image par le calcul intensive. Il a été fréquemment utilisé pour améliorer la résolution des images numériques de fluorescence. Tel que mentionné précédemment, lorsque fluorophores sont été excitées par n’importe quel type d’éclairage (par exemple, laser ou LED), fluorochromes émet signaux lumineux sans se soucier si elles sont en discussion, ou non, donc l’image apparaîtra toujours floue. Ce flou est causée par un phénomène appelé « Point Spread Function » (PSF), comme la lumière provenant d’une petite source fluorescente (lueur d’espoir) sera étalé plus loin et devenir flou (blur). En principe, cet événement va produire un signal fluorescent en forme de sablier-like, et une image de fluorescence peut être composée de nombreux ces signaux lumineux. Le processus de déconvolution peut réattribuer tous les signaux de fluorescence à sa forme originale de spot lumineux et éliminer la plupart de la lumière d’out-of-focus pour améliorer le contraste de l’image.
Ces dernières années, les algorithmes de déconvolution ont généré des images avec une résolution comparable à celle d’un microscope confocal. En outre, par rapport à TIRFM, qui empêche out-of-focus flou d’être détecté par une région limitée excitation, microscopie à champ large permet de lumière tous les signaux pour être détectée et réaffecte leur retour à leur source à travers le processus de déconvolution. Par conséquent, dans la pratique, microscopie de déconvolution est devenu non seulement une méthode d’acquisition image plus efficace, mais aussi une méthode plus rentable par rapport à la microscopie FRBR.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants pour les subventions accordées par le ministère de la Science et la technologie, Taiwan - MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), de santé et de bien-être en supplément des produits du tabac - MOHW106-SAB-B-212-144001 à S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
- Levin, B. E., Sherwin, R. S. Peripheral glucose homeostasis: does brain insulin matter? J Clin Invest. 121 (9), 3392-3395 (2011).
- Kleinridders, A., Ferris, H. A., Cai, W., Kahn, C. R. Insulin action in brain regulates systemic metabolism and brain function. Diabetes. 63 (7), 2232-2243 (2014).
- Duarte, A. I., Moreira, P. I., Oliveira, C. R. Insulin in central nervous system: more than just a peripheral hormone. J Aging Res. 2012, 384017 (2012).
- Vogt, M. C., Bruning, J. C. CNS insulin signaling in the control of energy homeostasis and glucose metabolism - from embryo to old age. Trends Endocrinol Metab. 24 (2), 76-84 (2013).
- Plum, L., Schubert, M., Bruning, J. C. The role of insulin receptor signaling in the brain. Trends Endocrinol Metab. 16 (2), 59-65 (2005).
- Lin, X., et al. Dysregulation of insulin receptor substrate 2 in beta cells and brain causes obesity and diabetes. J Clin Invest. 114 (7), 908-916 (2004).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. J Biol Chem. 279 (34), 35298-35305 (2004).
- Thaler, J. P., Guyenet, S. J., Dorfman, M. D., Wisse, B. E., Schwartz, M. W. Hypothalamic inflammation: marker or mechanism of obesity pathogenesis? Diabetes. 62 (8), 2629-2634 (2013).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61 (6), 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Exp Diabetes Res. 2012, 847246 (2012).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61 (7), 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305 (7), E897-E906 (2013).
- Chan, O., Burke, J. D., Gao, D. F., Fish, E. N. The chemokine CCL5 regulates glucose uptake and AMP kinase signaling in activated T cells to facilitate chemotaxis. J Biol Chem. 287 (35), 29406-29416 (2012).
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266 (5 Pt 2), R1711-R1715 (1994).
- Mayer, C. M., Fick, L. J., Gingerich, S., Belsham, D. D. Hypothalamic cell lines to investigate neuroendocrine control mechanisms. Front Neuroendocrinol. 30 (3), 405-423 (2009).
- Lizunov, V. A., et al. Insulin stimulates fusion, but not tethering, of GLUT4 vesicles in skeletal muscle of HA-GLUT4-GFP transgenic mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 302 (8), E950-E960 (2012).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
