Summary
इस प्रोटोकॉल का अवलोकन के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है वास्तविक समय ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन (GFP) टैग ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GLUT4) इंसुलिन उत्तेजना और इंसुलिन में CCR5 की जैविक भूमिका के लक्षण वर्णन पर प्रोटीन तस्करी – GLUT4 Deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ मार्ग संकेतन.
Abstract
टाइप 2 मधुमेह (T2DM) एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट है जो इंसुलिन संकेतन हानि और परिधीय ऊतकों में जीर्ण सूजन की विशेषता है । केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में hypothalamus ऊर्जा और इंसुलिन संकेत प्रतिक्रिया विनियमन के लिए नियंत्रण केंद्र है । परिधीय ऊतकों और कुछ chemokines (जैसे CCL5, TNFα, और IL-6) के असंतुलन में जीर्ण सूजन मधुमेह और मोटापे के लिए योगदान करते हैं । हालांकि, कार्यात्मक तंत्र (ओं) को जोड़ने chemokines और हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेत विनियमन अभी भी अस्पष्ट रहते हैं ।
इन विट्रो में प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृति मॉडल सुविधाजनक और सरल मॉडल है जो हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में इंसुलिन संकेत विनियमन की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस अध्ययन में, हमने इंसुलिन उत्तेजना पर GFP झिल्ली GLUT4 को ट्रैक करने के लिए प्राथमिक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GFP (GLUT4-translocation) के साथ exogeneous GLUT4 प्रोटीन संयुग्मित पेश किया. GFP के समय चूक छवियों-GLUT4 प्रोटीन की तस्करी deconvolution माइक्रोस्कोपी, जो उपयोगकर्ताओं को उच्च गति उत्पंन करने के लिए अनुमति दी द्वारा दर्ज किए गए, उच्च संकल्प छवियों ंयूरॉंस को नुकसान पहुंचाने के दौरान काफी प्रयोग करते हुए । इंसुलिन विनियमित GLUT4 translocation में CCR5 का योगदान CCR5 की कमी हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में मनाया गया था, जो अलग और CCR5 नॉकआउट चूहों से कल्चरित थे. हमारे परिणामों का प्रदर्शन किया है कि GLUT4 झिल्ली translocation दक्षता इंसुलिन उत्तेजना के बाद CCR5 कमी हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में कम हो गया था ।
Introduction
टाइप 2 मधुमेह (T2DM) एक वैश्विक स्वास्थ्य संकट है । T2DM इंसुलिन संकेतन हानि और परिधीय ऊतकों में जीर्ण सूजन की विशेषता है । hypothalamus नियंत्रण केंद्र है जो शरीर की ऊर्जा homeostasis, भूख, और circadian लय नियंत्रित करता है । सबसे महत्वपूर्ण बात, hypothalamus भी इंसुलिन संकेत जवाबदेही प्रणालीगत चयापचय1,2,3,4,5को विनियमित करने के लिए मध्यस्थता । हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेतन मार्ग बाधित इंसुलिन प्रतिरोध6,7प्रेरित कर सकता है. hypothalamus सेलुलर ऊर्जा की स्थिति और हार्मोन के स्राव निर्देशांक, जैसे इंसुलिन और adipokines (उदा, लेप्टिन) परिधीय ऊतकों से, प्रणालीगत ग्लूकोज चयापचय को विनियमित करने के लिए, इंसुलिन जवाबदेही, और भोजन का सेवन. इंसुलिन रिसेप्टर के लिए बाध्यकारी इंसुलिन रिसेप्टर सब्सट्रेट (आईआरएस) प्रोटीन, जो तो इंसुलिन बहाव को सक्रिय अणुओं को सक्रिय करता है, जैसे PI3K (phosphatidylinositol 3-कळेनासे) और एकेटी (प्रोटीन कळेनासे बी (PKB/एकेटी)), प्रेरित करने के लिए GLUT4 झिल्ली translocation. न्यूरॉन्स इंसुलिन के जवाब में ग्लूकोज के लिए बड़ा लक्ष्य नहीं कर रहे हैं; हालांकि, GLUT4 अभिव्यक्ति के महत्वपूर्ण स्तर हाइपोथैलेमस arcuate नाभिक (ARC) क्षेत्र में पहचान की गई है । इसलिए, हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GLUT4 के विनियमन मस्तिष्क परिधीय धुरी में इंसुलिन संकेतन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है.
कई अध्ययनों से सुझाव दिया है कि जीर्ण सूजन और भड़काऊ chemokines hypothalamus में भी मधुमेह और मोटापे के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, और हाइपोथैलेमस सूजन के निषेध आहार-प्रेरित इंसुलिन प्रतिरोध रिवर्स कर सकते हैं 8 , 9 , 10. इसके अलावा, chemokine-CCL5 (सी-सी आकृति ligand 5, भी rants के रूप में जाना जाता है, विनियमित-पर-सक्रियण-सामांय-टी-सेल व्यक्त की और स्रावित) और इसकी रिसेप्टर CCR5 स्तर भी T2DM के विकास के साथ सहसंबंधी बनाना11,12. इंसुलिन फंक्शन और ग्लूकोज़ चयापचय में CCL5 और CCR5 की भूमिकाएँ अस्पष्ट रहती हैं. एक अध्ययन में बताया गया है कि CCR5 की कमी से संरक्षित चूहों मोटापा प्रेरित सूजन, macrophage भर्ती, और इंसुलिन प्रतिरोध11; इसके विपरीत, एक और अध्ययन की रिपोर्ट है कि CCR5 की कमी प्रणालीगत ग्लूकोज सहिष्णुता, साथ ही साथ adipocyte और मांसपेशी इंसुलिन संकेतन12। CCL5 टी कोशिकाओं में ग्लूकोज को बढ़ाने के लिए और hypothalamus13,14पर अपनी कार्रवाई के माध्यम से भोजन का सेवन कम करने के लिए पाया जाता है, तथापि, दोनों कार्रवाई के तंत्र और शामिल रिसेप्टर्स अभी तक की पहचान की जानी है ।
यह हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में इंसुलिन के कार्य पर परिधीय ऊतक सूजन के प्रभाव अंतर्निहित सेलुलर तंत्र का अध्ययन करने के लिए मुश्किल है. यह सेलुलर विविधता और ंयूरॉन सर्किट प्रतिक्रिया विनियमों के कारण है । इस कारण से, एक इन विट्रो सेल संस्कृति मॉडल हाइपोथैलेमस इंसुलिन संकेत विनियमन पर chemokine के प्रभाव की जांच करने के लिए एक स्वच्छ मॉडल प्रदान करता है । हालांकि कई स्थापित कर रहे है अनुसंधान के उपयोग के लिए अमर हाइपोथैलेमस ंयूरॉन सेल लाइनों, इन सेल लाइनों विभिंन मार्करों व्यक्त की है, और इसलिए, हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस के विभिंन प्रकार के15प्रतिनिधित्व करते हैं । भले ही प्राथमिक हाइपोथैलेमस संस्कृतियों को बनाए रखने के लिए मुश्किल हो सकता है, वे इंसुलिन उत्तेजना पर हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस की सबसे यथार्थवादी प्रतिक्रिया प्रदान कर सकते हैं, और भी संभावित अज्ञात प्रभाव है जो खेलने में आने के लिए जब कोशिकाओं को बनाए रखने से बचने कर सकते है कृत्रिम विकास कारकों के साथ संस्कृति माध्यम में दीर्घकालिक ।
इस के साथ साथ, हम दोनों C57BL/6 wildtype (WT) माउस और CCR5 नॉकआउट (CCR5-/) माउस से प्राथमिक हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस का उपयोग, और transfect-GFP के साथ दोनों प्रकार की कोशिकाओं का निर्माण । इंसुलिन मध्यस्थता GLUT4 झिल्ली की तस्करी करने के लिए CCR5 के योगदान की जांच करने के लिए, GFP-GLUT4 transfected न्यूरॉन्स इंसुलिन या संयोजक CCL5 के साथ इलाज किया गया. हम तो Deconvolution माइक्रोस्कोपी के साथ प्राथमिक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में प्लाज्मा झिल्ली पर GFP-GLUT4 के आंदोलन की विशेषता.
Protocol
सभी प्रोटोकॉल और तरीकों पशु विषयों में इस्तेमाल किया संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों ताइपे चिकित्सा विश्वविद्यालय (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गया है (प्रोटोकॉल संख्या: एलएसी-2013-0278; एलएसी-2015-0397)
1. प्राथमिक ंयूरॉन संस्कृति
- संस्कृति से पहले तैयारी
- कोट पाली के साथ संस्कृति व्यंजन-डी-Lysine (तालिका 1) संस्कृति से पहले एक दिन । एक 6-अच्छी डिश के लिए, एक अच्छी तरह से १.५ मिलीलीटर पाली-डी-Lysine (०.०५ मिलीग्राम/एमएल) जोड़ें । लाइव इमेजिंग के लिए, एक मानक लेपित 6 अच्छी प्लेट में एक 12 मिमी x 12 मिमी coverslip पर संस्कृति कोशिकाओं ।
- निकालें/पाली-डी-lysine और 2 मिलीलीटर ddH2O के साथ दो बार बर्तन धोने ।
- शल्य चिकित्सा उपकरण तैयार: सूक्ष्म विदारक कैंची, घुमावदार इत्तला दे दी संदंश, और मानक सीधे इत्तला दे दी संदंश की एक जोड़ी । शल्य चिकित्सा उपकरण निष्फल और उंहें सर्जरी के दौरान ७५% इथेनॉल में रहते हैं ।
- 20 एमएल वॉश मीडियम (Table 1) के साथ 10 सेमी पेट्री डिश भरें और बर्फ पर रखें ।
- 15 मिलीलीटर वाश मीडियम के साथ 15 मिलीलीटर टेस्ट ट्यूब भरें और ट्यूब को बर्फ पर रखें ।
- विभिन्न मस्तिष्क क्षेत्रों से मस्तिष्क ऊतक अलगाव
- एक गैर हवादार पिंजरे में चूहों रखकर मानक euthanization प्रोटोकॉल के साथ बलिदान 16-19 दिन पुरानी गर्भवती महिला चूहों और फिर सह2के साथ नशीला । ई 15.5 ~ ई 16.5 भ्रूण हाइपोथैलेमस ंयूरॉन संस्कृति और e 16.5 ~ ई 17.5 के लिए सिफारिश कर रहे है हिप्पोकैम्पस और cortical ंयूरॉन संस्कृति के लिए अधिक उपयुक्त हैं ।
- मंच, विदारक माइक्रोस्कोप, और शल्य चिकित्सा उपकरण ७५% इथेनॉल के साथ संक्रमण से बचने के लिए निष्फल ।
- गर्भनाल क्षेत्र (डार्क रेड एरिया, चित्रा 1a, 1b डैश रेखा) के आसपास काट उन्हें हानिकारक बिना आसानी से पिल्ले को अलग करने के लिए (चित्रा 1C, 1 डी).
- कैंची (चित्रा 1E, एफ) की एक जोड़ी के साथ एक पिल्ला के सिर भाग निकालें, तो जगह में सिर भाग सुरक्षित ठीक का उपयोग कर आंख क्षेत्र के लिए सीधे संदंश इत्तला दे दी (चित्रा 1G) । दो पक्षों से बाहरी त्वचा और खोपड़ी को दूर करने के लिए एक और बारीक इत्तला दे दी घुमावदार संदंश का प्रयोग करें और पूर्वकाल से पृष्ठीय दिशा (चित्राa, काले तीर की दिशा को इंगित करने के लिए उन्हें छील बंद). ब्रेन को बिना किसी नुकसान (फिगर 1I) के अलग-थलग रखना चाहिए ।
नोट: यह मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों को अलग करते समय सटीकता सुनिश्चित करने के लिए मस्तिष्क की अखंडता को बनाए रखने के लिए आवश्यक है. - निम्न चरणों के लिए आइस-कोल्ड वॉश मीडियम के साथ एक साफ पेट्री डिश में अलग दिमाग रखें ।
- मस्तिष्क फ्लिप और ventral पक्ष रखना । hypothalamus मस्तिष्क के बीच में एक गोल संरचना है (चित्रा 1J, हाइपोथैलेमस क्षेत्र के लिए तीर अंक) । हाइपोथैलेमस ऊतक को बारीक ढोने वाली घुमावदार संदंश से अलग करें । मेनिन्जेस (जो पीले-लाल रंग का हो) को सावधानीपूर्वक निकालें ।
चेतावनी: मेनिन्जेस को पूरा हटाने के fibroblast संदूषण से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है । - तेज संदंश के साथ घ्राण पालि पकड़ो और घुमावदार संदंश के साथ पूरे मस्तिष्क के आसपास पतली मेनिन्जेस को छील (चित्रा १, एल).
- हिप्पोकैंपस एक केले की तरह आकार है जो प्रांतस्था के निचले हिस्से में एंबेडेड है । प्रांतस्था के नीचे से फ़्लिप करें और हिप्पोकैंपस को प्रांतस्था से घुमावदार संदंश (चित्र 1m, N, और O) की ओर खींच कर अलग करें । मस्तिष्क ऊतक आसपास के सभी शेष मेनिन्जेस को दूर करने के लिए सुनिश्चित करें ।
- जब मस्तिष्क के सभी क्षेत्र अलग-थलग पड़ गए हों, तो संदंश (स्टेप 1.1.5) की सहायता से इन ऊतकों को 15 मिलीलीटर बर्फ से युक्त-ठंडा वाश मीडियम में काट लें ।
नोट: मस्तिष्क के ऊतकों को 2-3 एच के लिए आइस-कोल्ड वॉश मीडियम में रखा जा सकता है ।
- ऊतक पाचन, चढ़ाना और संस्कृति
- ऊतक-15 मिलीलीटर ट्यूब 2-3 बार पलटने से ऊतकों कुल्ला, और फिर सीधे ट्यूब ऊतक (1-3 मिनट) बसने के लिए अनुमति देने के लिए रखें ।
- एक वैक्यूम प्रणाली से जुड़ी ग् पाश्चर पिपेट का उपयोग करते हुए ऊपरी माध् यम को निकालें । ऊतक धोने के लिए, 15 मिलीलीटर बर्फ ठंडा धोने मध्यम जोड़ें और ट्यूब 2-3 बार पलटना । अगले चरण से पहले धो चरण 3 बार दोहराएँ ।
सावधानी: नीचे पर ऊतकों के सतर्क हो जब एक निर्वात प्रणाली का उपयोग कर ऊपरी माध्यम को हटाने । - फाइनल वॉश करने के बाद वॉश मीडियम को 1 एमएल पिपेट की मदद से निकाल लें ।
- Papain-Trypsin पाचन बफर (1 टेबल) के साथ एक ३७ डिग्री सेल्सियस पानी में स्नान के ऊतकों के लिए मशीन 7-14 min. शेक ट्यूबों हर दो मिनट के लिए सुनिश्चित करें कि सभी ऊतकों को ठीक से पाचन बफर को उजागर कर रहे हैं ।
नोट: मशीन समय और पाचन बफर की मात्रा ऊतक के आकार के आधार पर समायोजित किया जा सकता है । हाइपोथैलेमस ऊतक 6-8 पिल्ले से एकत्र के लिए, ३०० µ l Papain-Trypsin पाचन बफर और 7 मिन मशीन समय की सिफारिश की है. अधिक ऊतक अधिक पाचन बफर की आवश्यकता होगी । - भ्रूण गोजातीय सीरम की 1 मात्रा जोड़कर एंजाइम की गतिविधि को बेअसर. शेक टेस्ट ट्यूब 3-5 बार कमरे के तापमान पर ।
- रैक पर ट्यूब रखो और 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए ऊतकों को बसने की अनुमति; एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant सावधानी से निकालें ।
- 6 मिलीलीटर चढ़ाना मध्यम (तालिका 1) परीक्षण ट्यूब में जोड़ें और प्लास्टिक ऊतक ऊपर-और नीचे ५० बार एक 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ धीरे (एक 6 के लिए अच्छी तरह से थाली, १.५ मिलीलीटर चढ़ाना माध्यम प्रति अच्छी तरह से सिफारिश की है) । अधिकांश कक्ष दोहराए pipetting के बाद एकल कक्षों में अलग होंगे ।
नोट: इस कदम का संचालन करते हुए बुलबुले के गठन से बचने के लिए प्रयास करें । अधिकांश प्रयोगशालाओं ऊतक अलग करने के लिए लौ कांच चराई pipets का उपयोग करें । एक संकीर्ण टिप के साथ एक 5 मिलीलीटर पिपेट इस कदम के लिए एक अच्छा विकल्प हो सकता है । - रैक पर एक ट्यूब रखें और 1-2 मिनट के लिए प्रतीक्षा करने के लिए chunky, संयुक्त राष्ट्र के असंबद्ध ऊतकों को बसने की अनुमति । एक नई ट्यूब करने के लिए असंबद्ध कोशिकाओं युक्त ऊपरी चरण ले लो और मध्यम चढ़ाना के साथ पतला (असंबद्ध कोशिकाओं के 1x मात्रा प्रति 5x मात्रा चढ़ाना मध्यम । उदाहरण के लिए, 1 मिलीलीटर असंबद्ध कोशिकाओं के लिए 5 मिलीलीटर चढ़ाना मध्यम जोड़ें) ।
- सेल के घनत्व की गणना एक hemocytometer और बीज संस्कृति थाली में अपेक्षित संख्या में कोशिकाओं के पाली के साथ लेपित-D-lysine के रूप में 1.1.1 कदम । हम अनुशंसा करते है 2-4 x 105 कोशिकाओं के लिए अच्छी तरह से एक 6 पकवान/35 मिमी पकवान ंयूरॉन इमेजिंग अध्ययन के लिए सिफारिश की थी । एक उच्च घनत्व प्रोटीन संग्रह और विश्लेषण के लिए आवश्यक होगा ।
नोट: एक 6-अच्छी तरह से पकवान में 1-1.5 मिलीलीटर चढ़ाना मध्यम, बहुत ज्यादा चढ़ाना मध्यम नहीं लगाव के लिए पर्याप्त है । मध्यम की एक अत्यधिक मात्रा में उचित सेल लगाव के लिए आवश्यक समय लम्बा होगा । - 2-3 एच के लिए रुको और माइक्रोस्कोप के नीचे बीज ंयूरॉंस की जांच करें । न्यूरॉन्स न्युरैटिस विकसित करने के लिए जब वे ठीक से संलग्न शुरू कर देंगे.
- चढ़ाना मध्यम निकालें और चढ़ाना माध्यम से धोने के लिए पकवान में 2 मिलीलीटर गर्म धोने मध्यम (३७ डिग्री सेल्सियस) जोड़ें । इस चरण को दो बार दोहराएं ।
- 2 मिलीलीटर पूर्ण संस्कृति मध्यम (तालिका 1) में 6-अच्छी तरह से पकवान में प्रत्येक अच्छी तरह से जोड़ें ।
- परिवर्तन मध्यम हर 3-4 दिन के आधे । हर बार पूरा मीडियम फ्रेश तैयार कर लीजिए. विभिन्न माउस मस्तिष्क क्षेत्रों से प्रसंस्कृत ंयूरॉंस अलग आकृति विज्ञान और विशेषताओं (चित्रा 2) होगा ।
2. Liposome प्रणाली के साथ प्राथमिक ंयूरॉन में प्लाज्मिड डीएनए के अभिकर्मक
चेतावनी: के लिए ंयूरॉन अभिकर्मक, एक endotoxin मुक्त प्लाज्मिड डीएनए शोधन किट (सामग्री तालिका) डीएनए की तैयारी के लिए सिफारिश की है । अतिरिक्त इथेनॉल वर्षा अतिरिक्त विलायक हटा सकते हैं और डीएनए एकाग्रता को बढ़ाता है ।
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प्राथमिक न्यूरॉन्स में Liposome आधारित डीएनए अभिकर्मक ।
नोट: अभिकर्मक समय प्रयोगों में आवश्यक परिपक्वता स्थिति पर निर्भर करता है । हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस div 7-10 (div, दिन इन विट्रो में) पर transfected थे ।- dna: Liposome मिक्सचर वडा: पतला GFP-GLUT4 प्लाज्मिड DNA16 (2 µ g) एक microcentrifuge ट्यूब में ३०० µ l कम सीरम कल्चर मीडियम से युक्त. ३०० µ एल कम सीरम संस्कृति माध्यम में 2 µ l liposome के साथ एक और microcentrifuge ट्यूब तैयार करें, और कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
- दोनों ट्यूबों और 20-30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर गर्मी की सामग्री का मिश्रण ।
- कल्चरल डिश से ंयूरॉन कल्चरल मीडियम निकालें । जोड़ें ६०० µ l डीएनए-liposome मिश्रण में एक अच्छी तरह से और गर्मी में ३७ ° c 4-6 h के लिए
- 4-6 ज के बाद DNA-liposome मिक्सचर को निकालें और इसमें 2 एमएल कल्चरल मीडियम डालें ।
- इस तरह के GFP अकेले और GFP टैग के साथ GLUT4 प्रोटीन संयुग्मित के रूप में फ्लोरोसेंट संकेतों (चित्रा 3 और चित्रा 4), 18-72 एच के बाद मनाया जा सकता है ।
3. लाइव छवि रिकॉर्डिंग
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लाइव इमेजिंग के लिए कक्ष तैयार करना
- संस्कृति WT और CCR5-/- हाइपोथैलेमस ंयूरॉन कोशिकाओं ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन व्यक्त ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GFP-GLUT4) #1 .5 (या 0.17 mm मोटाई) ग्लास coverslip जो पूर्व में किया गया है पाली-डी-6 में 1.1.1 चरण में Lysine के साथ लेपित-अच्छी तरह से प्लेट.
- सावधानीपूर्वक संदंश का उपयोग करके न्यूरॉन्स के साथ coverslips निकालें और सावधानी के साथ काँच की स्लाइड्स पर रखें.
- नाजुक कार्य पोंछे के साथ अतिरिक्त मध्यम/ पोंछे दो बार गुना, और ध्यान से उंहें coverslip के शीर्ष पर जगह है । धीरे coverslip चलती बिना पोंछे नीचे प्रेस ।
चेतावनी: कांच स्लाइड के खिलाफ जबरदस्ती coverslip प्रेस नहीं है । इस कदम का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि coverslip नहीं कदम/छवि बोया बल के कारण अधिग्रहण के दौरान बहाव । - deconvolution माइक्रोस्कोप मंच पर coverslips और स्लाइड प्लेस, नीचे का सामना करना पड़ coverslip के साथ, और ठीक से सुरक्षित । यह चरण यह सुनिश्चित करने के लिए है कि स्लाइड स्थिति स्थिर बनी रहे ताकि उपयोगकर्ता बाद में लक्ष्य कक्षों के समान सेट को ट्रैक कर सकें ।
- एक 60x/1.42 न तेल विसर्जन उद्देश्य लेंस के साथ WT और CCR5-/ हाइपोथैलेमस ंयूरॉन कोशिकाओं का निरीक्षण करें ।
- चयनित कक्ष नमूनों को CCL5 (10 एनजी/एमएल) या एक मिनट के लिए इंसुलिन (10 U/एमएल) के साथ उपचारित करें । coverslip के किनारे पर पतला इंसुलिन का १.५ µ l जोड़ें.
- कल्पना और चयनित सेल नमूने तुरंत रिकॉर्ड । प्रोग्राम वीडियो रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर 30 मिनट के लिए रिकॉर्ड करने के लिए ।
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Deconvolution माइक्रोस्कोपी और विश्लेषण
नोट: प्रोटोकॉल के इस भाग के विश्लेषण के लिए एक deconvolution माइक्रोस्कोप और विशेष सॉफ्टवेयर के उपयोग की आवश्यकता है ।- इमेजिंग सिस्टम की शक्ति को चालू करें, माइक्रोस्कोप चरण ठीक से प्रारंभ करने के लिए अनुमति दें, और उसके बाद एलईडी लाइट स्रोत पर चालू करें ।
- एक 60x १.४२ ना उद्देश्य लेंस पर विसर्जन तेल (अपवर्तन सूचकांक १.५२० ३७ डिग्री सेल्सियस पर रहते नमूनों के लिए) जोड़ें । उद्देश्य लेंस की ओर का सामना करना पड़ coverslip के साथ माइक्रोस्कोप पर नमूना स्लाइड प्लेस, और ठीक से स्लाइड सुरक्षित ।
- लक्ष्य कोशिकाओं की पहचान करने के लिए उज्ज्वल क्षेत्र या प्रतिदीप्ति रोशनी का प्रयोग करें । लक्ष्य कक्षों को स्पष्ट रूप से देखा जा सकता है जब तक फ़ोकस समायोजित करें । अनावश्यक खरोंच के निशान से बचने के लिए coverslip क्षेत्र के बाहर उद्देश्य लेंस हिलना मत ।
- GFP सिग्नल द्वारा ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन संयुग्मित ग्लूकोज ट्रांसपोर्टर 4 (GFP-GLUT4) की पहचान करें । छवि प्राप्ति के लिए इच्छित लक्षित कक्षों की पहचान करें. चयनित लक्ष्य कक्ष स्थिति को भविष्य में संदर्भ (चित्र 4) के लिए कंठस्थ किया जा सकता है ।
- सेटअप उचित प्रायोगिक मापदंडों (पिक्सेल संख्या, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य, संचरण प्रतिशत, जोखिम समय, ढेर मोटाई, समय अंतराल, और कुल इमेजिंग समय सहित) प्रत्येक लक्ष्य सेल पर । इस प्रयोग के लिए, छवि पिक्सेल संख्या ५१२ x ५१२ पर सेट किया गया था (इसे उच्च रिज़ॉल्यूशन के लिए १,०२४ x १,०२४ पर सेट किया जा सकता है) GFP संकेतों के लिए । जोखिम समय ०.०२५ से ०.०५ के बीच हर 5 मिनट के लिए सेट किया गया था । गौण पार्श्व x, y, और z समायोजन अनुशंसित सॉफ़्टवेयर (सामग्री तालिका) द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ।
- अधिकतम पिक्सेल तीव्रता प्राप्त करने के लिए लगभग २,००० ३,००० की गिनती करने के लिए जोखिम पैरामीटर सेट करें । प्रतिदीप्ति photobleaching को कम करने के लिए, जितना संभव हो उतना उत्तेजना लाइट ट्रांसमिशन का प्रतिशत कम करें जबकि एक्सपोज़र समय 1 से कम है । प्रत्येक अतिरिक्त प्रतिदीप्ति चैनल (ओं) के लिए इन चरणों और ब्याज के प्रत्येक व्यक्ति के क्षेत्र को दोहराएँ ।
- प्रत्येक लक्ष्य कक्ष पर Z-स्टैक की ऊपरी और निचली सीमा सेट करें । यह ऊपर और लक्ष्य कोशिका के नीचे दोनों थोड़ा ध्यान से बाहर हैं जब तक माइक्रोस्कोप चरण चलती द्वारा प्राप्त किया जा सकता है । उपयोगकर्ता ऊपरी और निचली सीमा के बीच छवियों की संख्या (जो प्रत्येक छवि के बीच दूरी निर्धारित करके किया जा सकता है) की स्थापना करके Z-अक्ष के संकल्प को समायोजित कर सकते हैं ।
- छवियों के ढेर deconvolved थे और बाद में संबंधित सॉफ्टवेयर की मदद से विश्लेषण-इस मामले में PerkinElmer से वेग ।
Representative Results
चूहों से प्रसंस्कृत हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स आगे हाइपोथैलेमस विशिष्ट प्रोटीन के साथ immunostaining द्वारा पहचाने गए थे-प्रो-opiomelanocortin (POMC) एंटीबॉडी और न्यूरॉन मार्कर-microtubule-जुड़े प्रोटीन 2 (MAP2) (चित्रा 2a). हम प्राथमिक प्रसंस्कृत हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस हाइपोथैलेमस प्रोटीन POMC व्यक्त की पुष्टि की । CCR5 रिसेप्टर और हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में CCL5 की अभिव्यक्ति विशिष्ट एंटीबॉडी और POMC एंटीबॉडी के साथ सह-लेबल के साथ पहचाने गए थे (चित्रा 2a, बी).
संवर्धन के 3 दिनों के बाद, न्यूरॉन्स GFP डीएनए (चित्रा 3) या GFP संयुग्मित GLUT4 (चित्रा 4) के साथ transfected थे. GFP अभिव्यक्ति आमतौर पर सभी सेल पर एक विशिष्ट पैटर्न के बिना पाया जा सकता है (चित्रा 3) लेकिन GLUT4-GFP cytosol (चित्रा 4) में एक कबरा की तरह संरचना के रूप में व्यक्त करेंगे । इस अध्ययन में प्रयुक्त अभिकर्मक किट न्यूरॉन अभिकर्मक के लिए सबसे कारगर विधि नहीं है; हालांकि, यह बेहतर सेल अस्तित्व के लिए एक कम कड़े विधि अभिकर्मक के बाद है, जो बेहतर रहते है सेल इमेजिंग में योगदान/ GFP-GLUT4 एक्सप्रेस न्यूरॉन्स की छवियों समय चूक फिल्मों (चित्रा 4a-बी, अनुपूरक वीडियो 1, 2) इंसुलिन उत्तेजना या CCL5 उत्तेजना (चित्रा 4c, अनुपूरक वीडियो 3) पर पहले ले जाया गया. GFP और GFP-GLUT4 के सिग्नल न्यूरॉन्स में स्पष्ट और मजबूत होते हैं ।
हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स के साथ GLUT4-GFP अभिकर्मक आगे इंसुलिन के साथ इलाज किया गया (४० यू) GFP-GLUT4 की विशेषता के नलए. Reprehensive वीडियो GLUT4-GFP दोनों WT और CCR5 में इंसुलिन उत्तेजना पर आंदोलन-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स वीडियो 1 और वीडियो 2, क्रमशः के रूप में दिखाए जाते हैं.
चित्रा 1: भ्रूण चरण (१६.५ दिन) में माउस मस्तिष्क के विभिन्न क्षेत्रों से ऊतकों का अलगाव. (A-D) अपरा से पिल्ले की जुदाई में शामिल कदम । (E, F) शरीर से एक पिल्ला सिर के विच्छेदन । (G-I) खोपड़ी से पूरे मस्तिष्क के अलगाव में शामिल कदम । इस दिशा में काले तीर बिंदुओं को संदंश का प्रयोग करते हुए खोपड़ी को हटाकर खींचा जाए. (J) hypothalamus का अलगाव । काले तीर संदंश के बीच हाइपोथैलेमस क्षेत्र के लिए अंक । (K-L) माउस मस्तिष्क के प्रांतस्था का अलगाव । काले तारे को इंगित करता है माउस मस्तिष्क के cortical क्षेत्र और सफेद तीर अंक पूरे मस्तिष्क से प्रांतस्था की जुदाई के लिए । (एम-ओ) प्रांतस्था से हिप्पोकैम्पस भाग की जुदाई । ऊपरी सफेद तीर हिप्पोकैम्पस ऊतक के निशान और निचले सफेद तीर cortical ऊतक के निशान । स्केल पट्टियां = 1 सेमी (A-F), २०० µm (G-O) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: हाइपोथैलेमस न्यूरॉन मार्कर के लक्षण वर्णन-POMC और CCL5 और CCR5 की सह-अभिव्यक्ति. (क) प्राथमिक कल्चरल हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स को हाइपोथैलेमस न्यूरॉन मार्कर के साथ लेबल किया गया-POMC (लाल), CCR5 की सह-अभिव्यक्ति (हरा), और न्यूरॉन मार्कर MAP2 (ग्रे). (ख) CCL5 (हरी) अभिव्यक्ति में POMC (लाल) सकारात्मक हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स (संदर्भ17के अनुपूरक डेटा से अनुकूलित). यहां, DAPI नीले रंग के साथ नाभिक लेबल । स्केल पट्टियां = ५० µm (A) और (B) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: माउस प्राथमिक ंयूरॉंस में GFP प्रोटीन अभिव्यक्ति । GFP प्लाज्मिड डीएनए transfected प्राथमिक प्रसंस्कृत न्यूरॉन्स में 4 दिनों के बाद संस्कृति (DIV4) के साथ liposome और एक और 3 दिनों के लिए व्यक्त (DIV7). (A-B) GFP न्युरैटिस और सोमा दोनों में अभिव्यक्त होता है. (C-D) न्यूरॉन्स नकली अभिकर्मक के साथ; DAPI में नाभिक लेबल (B, D) । स्केल बार्स = १०० µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.
चित्रा 4: GFP के स्नैपशॉट-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में GLUT4. (क, ग) GFP-GLUT4 प्रोटीन Wildtype में व्यक्त (WT) हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स और (ख) CCR5-/ हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स. न्यूरॉन्स इंसुलिन (ए, बी) या CCL5 (सी) के साथ उत्तेजित थे. तीर GFP को इंगित करते हैं-GLUT4 कबरा से पहले न्युरैटिस में (-) और उसके बाद (+) इंसुलिन या CCL5 उत्तेजना और तारक बिंदु को सतह GLUT4-GFP से पहले (-) और उसके बाद (+) CCL5 उत्तेजना में (ग)। (आंकड़ा17से अनुकूलित चित्रा) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| 5x बोराडे बफर | कंपनी | कैटलॉग संख्या | वॉल्यूम |
| बोरिक एसिड | सिग्मा-Aldrich | B6768 | १.५५ छ |
| बोरेक्रस | सिग्मा-Aldrich | ७१९९७ | २.३७५ छ |
| ddH2O | १०० एमएल | ||
| फ़िल्टर्ड, 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें | |||
| 20x पाली-डी-Lysine स्टॉक | कंपनी | कैटलॉग संख्या | वॉल्यूम |
| पाली-डी-Lysine | सिग्मा-Aldrich | P6407 | १०० मिलीग्राम |
| ddH2O | १०० एमएल | ||
| फ़िल्टर किया गया, पर रखें-20 ° c | |||
| 1x पाली-डी-Lysine | वॉल्यूम | ||
| 20x पाली-डी-Lysine | 5 मिलीलीटर | ||
| 5x बोराडे बफर | 20 मिलीलीटर | ||
| ddH२हे | ७५ एमएल | ||
| कुल | १०० एमएल | ||
| 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें | |||
| धो मध्यम | कंपनी | कैटलॉग संख्या | वॉल्यूम |
| DMEM-उच्च ग्लूकोज | Gibco | 12800-017 | ४९५ एमएल |
| एंटीबायोटिक-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 5 मिलीलीटर |
| कुल | ५०० एमएल | ||
| 4 ° C पर रखें | |||
| Papain-Trypsin पाचन बफर: | कंपनी | कैटलॉग संख्या | मात्रा अंतिम एकाग्रता/ |
| Papain (10 मिलीग्राम/ | सिग्मा-Aldrich | P4762 | २०० µ l (2 mg/ |
| Trypsin-EDTA (०.२५%) | Gibco | 25200-072 | २०० µ l (०.०५%) |
| धो मध्यम | ६०० µ l | ||
| कुल | १,००० µ l | ||
| -20 डिग्री सेल्सियस पर रखें | |||
| चढ़ाना मध्यम: | कंपनी | कैटलॉग संख्या | वॉल्यूम |
| Neurobasal माध्यम | Gibco | 21103-049 | १७६ एमएल |
| भ्रूण गोजातीय सीरम | Gibco | 10437-028 | 20 मिलीलीटर |
| L-ग्लूटामेट (२०० mM) | Gibco | २५०३० | 2 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 2 मिलीलीटर |
| कुल | २०० एमएल | ||
| 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें | |||
| संपूर्ण संस्कृति माध्यम | कंपनी | कैटलॉग संख्या | वॉल्यूम |
| Neurobasal माध्यम | Gibco | 21103-049 | ९५ एमएल |
| N2 अनुपूरक (100x) | Gibco | 17502-048 | 1 मिलीलीटर |
| B27 अनुपूरक (50x) | Gibco | 17504-04 | 2 मिलीलीटर |
| L-ग्लूटामेट (२०० mM) | Gibco | २५०३० | 1 मिलीलीटर |
| एंटीबायोटिक-Antimyotic | Gibco | 15240-062 | 1 मिलीलीटर |
| कुल | १०० एमएल | ||
| हौसले से तैयार |
तालिका 1: पाचन बफर और मीडिया इस अध्ययन में प्रयुक्त संरचना ।
अनुपूरक वीडियो 1: इंसुलिन उत्तेजित GFP-GLUT4 WT हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस में आंदोलन । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
अनुपूरक वीडियो 2: इंसुलिन उत्तेजित GFP-GLUT4 CCR5 में आंदोलन-हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
अनुपूरक वीडियो 3: CCL5 उत्तेजित GFP-GLUT4 WT हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में आंदोलन (वीडियो संदर्भ17से अनुकूलित) । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.
Discussion
CCL5 या इंसुलिन उत्तेजना पर रहते कोशिकाओं की निगरानी करने की क्षमता, GLUT4 आंदोलन पर CCL5 या इंसुलिन के तेजी से प्रभाव का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है. वास्तव में, यह हमें WT और CCR5 के बीच महत्वपूर्ण अंतर कल्पना करने के लिए अनुमति देता है-/ इंसुलिन उत्तेजना पर हाइपोथैलेमस ंयूरॉंस । हम WT और CCR5-/- हाइपोथैलेमस न्यूरॉन्स में इंसुलिन उत्तेजना17के बाद अलग समय अंक पर अंतर्जात GLUT4 प्रोटीन की सतह लेबलिंग प्रदर्शन किया है । सेल की सतह प्रोटीन के लेबल कम पृष्ठभूमि के साथ उच्च विशिष्टता एंटीबॉडी की आवश्यकता है । इसके अलावा, भूतल प्रतिदीप्ति ठहराव भी चुनौतीपूर्ण हो सकता है और समय लगता है । इस प्रकार, समय चूक रिकॉर्डिंग हमें निश्चित है कि CCL5 या इंसुलिन का प्रभाव प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर एक सच्चे शारीरिक परिवर्तन है, बल्कि एक सांख्यिकीय भिन्नता की अनुमति देता है । अंतर्जात GLUT4 की सतह लेबलिंग के साथ साथ, हम मजबूत सबूत और प्रयोगों को प्रदर्शित करने के लिए कैसे CCL5 और CCR5 GLUT4 translocation और इंसुलिन सिग्नलिंग में भाग लेने प्रदान करते हैं ।
आधुनिक कोशिका जीवविज्ञान और आणविक जीवविज्ञान अध्ययन में, कई प्रयोगों प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के उपयोग की आवश्यकता होती है. यह तकनीक वैज्ञानिकों को आंदोलन की दिशा और गति, stimulatory प्रभाव, रूपात्मक परिवर्तन, और प्रोटीन की तस्करी के अलावा प्रोटीन और/या सेलुलर organelles के बीच के स्थानिक संबंध की कल्पना करने की अनुमति देता है । हालांकि, इस तकनीक अभी भी अपनी सीमा है: जब fluorophores उत्साहित कर रहे हैं, लक्ष्य प्रोटीन से उत्सर्जित संकेत (या क्षेत्र) पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति से अभिभूत किया जा सकता है । नतीजतन, प्रतिदीप्ति छवियों धुंधला पृष्ठभूमि संकेतों में गहरी दफन संकेतों के साथ प्रकट कर सकते हैं । यह घटना झिल्ली से बंधे प्रोटीन के अवलोकन के लिए विशेष रूप से स्पष्ट है ।
इस कठिनाई को दूर करने के लिए कुल आंतरिक परावर्तन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी (TIRFM) विकसित की गई थी. यह वैज्ञानिकों को पृष्ठभूमि fluorophores को प्रभावित किए बिना चयनित सतह बंधे fluorophores के उत्तेजना कल्पना करने के लिए अनुमति देता है । यह वैज्ञानिकों चुनिंदा सुविधाओं और ऐसी एक प्लाज्मा झिल्ली के रूप में एक बहुत पतली सतह क्षेत्र पर घटनाओं की विशेषता के लिए अनुमति देता है । Deconvolution माइक्रोस्कोपी एक अभिकलनीय गहन छवि प्रसंस्करण तकनीक है कि हाल के वर्षों में तकनीकी प्रगति की मदद से संभव बनाया है । यह अक्सर डिजिटल प्रतिदीप्ति छवि संकल्प में सुधार करने के लिए उपयोग किया गया है । जैसा कि पहले उल्लेख किया है, जब fluorophores (जैसे लेजर या एलईडी) रोशनी के किसी भी प्रकार से उत्साहित किया जा रहा है, सभी fluorophores प्रकाश संकेतों का उत्सर्जन होगा चाहे वे ध्यान में है या नहीं, तो छवि हमेशा धुंधला दिखाई देगा । यह धुंधला एक बुलाया घटना के कारण होता है "प्वाइंट फैल समारोह" (पीएसएफ), प्रकाश के रूप में एक छोटे फ्लोरोसेंट स्रोत से आ रहा है (उज्ज्वल स्थान) बाहर फैल जाएगा और ध्यान से बाहर हो (धुंधला) । सिद्धांत रूप में, इस घटना के आकार फ्लोरोसेंट संकेत की तरह एक hourglass का उत्पादन होगा, और एक प्रतिदीप्ति छवि कई ऐसे प्रकाश संकेतों से बनाया जा सकता है । deconvolution प्रक्रिया अपने मूल उज्ज्वल स्पॉट फार्म करने के लिए सभी प्रतिदीप्ति संकेतों को फिर से असाइन कर सकते हैं, और छवि कंट्रास्ट में सुधार करने के लिए आउट-की-फ़ोकस लाइट के अधिकांश को समाप्त ।
हाल के वर्षों में, deconvolution एल्गोरिदम एक फोकल माइक्रोस्कोप की है कि तुलनीय संकल्प के साथ छवियों को उत्पन्न किया है. इसके अलावा, TIRFM, जो बाहर से रोकता है की तुलना में एक सीमित उत्तेजना क्षेत्र द्वारा पता लगाया जा रहा से कलंक, व्यापक क्षेत्र माइक्रोस्कोपी सभी प्रकाश संकेतों का पता लगाया जा करने के लिए अनुमति देता है और उंहें वापस पून deconvolution प्रक्रिया के माध्यम से अपने स्रोत के लिए । इसलिए, व्यवहार में, deconvolution माइक्रोस्कोपी न केवल एक अधिक कुशल छवि अधिग्रहण विधि बन गया है, लेकिन यह भी एक अधिक लागत प्रभावी विधि जब TIRF माइक्रोस्कोपी की तुलना में.
Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय द्वारा प्रदत्त अनुदान के लिए आभारी हैं, ताइवान-MOST105-2628-b-038-005-MY3 (1-3) और तंबाकू उत्पादों के स्वास्थ्य और कल्याण अधिभार-MOHW106-TDU-b-212-144001 to S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DeltaVision deconvolution microscope | Applied Precision Inc./(GE Healthcare Life Science) | equipped with 60x/1.42 NA oil immersion objective lens; used for taking live cell images | |
| SoftWorX application software | Applied Precision Inc. | used to control microscope and camera | |
| VoloCITY software | PerkinElmer | used to analyze the images | |
| Insulin | Actrapid, Denmark | ||
| Liposome | Invitrogen | 11668019 | Lipofectamine® 2000, used for plasmid DNA transfection |
| GFP control plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| GFP-GLUT4 plasmid DNA | provided by Professor Samuel Cushman | ||
| Anti-mouse Alex-488 | Invitrogen | #A-11001 | Secondary anitbody |
| Anti-rabbit IgG -Alex-568 | Invitrogen | #A-11036 | Secondary anitbody |
| CCL5/RANTES | R&D Systems | 478-MR-025 | 10ng/ml |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | #FL42572A | 0.17mm thickness |
| 12 mm Microscope coverglass | Deckglaser | #41001112 | used for immmunstaining study |
| micro-dissecting scissors | Klappenecker | Surgical tool | |
| curved-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| standard straight-tipped forceps | Ideal-tek | Surgical tool | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | QIAGEN | 12362 | Purify Endotoxin free plasmid DNA |
| 5 ml pipette | Corning costar | 4487 | dissociate brain tissue |
References
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