Summary
Ce protocole étudie le rôle de ligand de chemokine (C-C motif) 5 (CCL5) dans l’hypothalamus en livrant un antagoniste, MetCCL5, dans le cerveau de souris à l’aide d’un système de perfusion de cerveau pompe micro-osmotique. Cette inhibition transitoire de l’activité CCL5 interrompu insuline hypothalamique, signalisation, entraînant une intolérance au glucose et sensibilité à l’insuline systémiques périphériques.
Abstract
L’insuline régule le métabolisme systématique dans l’hypothalamus et la réponse insulinique périphériques. Une réaction inflammatoire dans les tissus adipeux périphériques contribue au développement de type 2 mellitus de diabète (T2DM) et régulation de l’appétit dans l’hypothalamus. Type de récepteur de chimiokine Chemokine CCL5 et C-C 5 niveaux (CCR5) ont été suggérés à la médiation de l’artériosclérose et le glucose intolérance au diabète de type 2 (T2DM). En outre, CCL5 joue un rôle neuroendocrine dans l’hypothalamus en réglant l’alimentation consommation et la température corporelle, ainsi, nous incitant à enquêter sur son rôle dans la signalisation de l’insuline hypothalamique et la régulation du métabolisme périphérique de glucose.
Le système de perfusion de cerveau pompe micro-osmotique est un moyen rapide et précis de manipuler la fonction CCL5 et étudier ses effets dans le cerveau. Il fournit également une approche alternative pratique pour générer un animal transgénique knock-out. Dans ce système, CCL5 de signalisation a été bloquée par une perfusion intracérébroventriculaire (ICV) de son antagoniste, CCL5 Met, à l’aide d’une pompe micro-osmotique. La sensibilité d’insuline et le métabolisme périphérique de glucose a été détectée par le Test Oral de tolérance Glucose (HGPO) et le Test de tolérance de l’insuline (ITT). L’insuline, l’activité de signalisation a été ensuite analysé par protéine tache d’échantillons de tissus provenant d’animaux.
Après 7 à 14 jours de MetCCL5 perfusion, le métabolisme du glucose et d’insuline réactivité a été altérée chez les souris, comme on le voit dans les résultats de l’HPO et ITT. La phosphorylation de serine302 IRS-1 a été augmentée et l’activité de l’Akt a été réduite dans les neurones hypothalamiques souris après inhibition de CCL5. Au total, nos résultats suggèrent que le blocage de CCL5 dans le cerveau de souris augmente la phosphorylation de l’IRS-1 S302 et interrompt la signalisation de l’insuline hypothalamique, conduisant à une diminution en fonction de l’insuline dans les tissus périphériques ainsi que l’altération du glucose métabolisme.
Introduction
L’insuline affecte une grande variété de tissus, y compris le cerveau. L’insuline passe à travers la barrière hémato - encéphalique, pénètre dans le système nerveux central (CNS) et se lie avec le récepteur de l’insuline (IR) dans l’hypothalamus pour réguler la prise alimentaire, l’activité sympathique et la réponse insulinique périphériques. L’inflammation chronique dans les tissus adipeux périphériques a été proposée de contribuer au type 2 mellitus de diabète (T2DM), mais comment ces réactions inflammatoires affectent l’insuline des signaux dans l’hypothalamus à la médiation d’intolérance de glucose et de la réponse systémique de l’insuline reste floue. Certaines chimiokines participent à la régulation de l’appétit et régulation de température du corps dans l' hypothalamus1 comme facteur de nécrose tumorale-alpha (TNFα), interleukine (IL) -6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) et CCL5 (ligand de C-C motif 5 ). En outre, l’inflammation dans l’hypothalamus conduit à la résistance à l’insuline dans le T2DM2,3.
Parmi ces chimiokines, la modification des niveaux d’expression de chimiokine CCL5 et son récepteur, CCR5, dans les tissus adipeux a été associée à l’intolérance, artériosclérose et le glucose, dans le T2DM dans les humains, mais aussi des animaux. CCL5 a également des fonctions neuro-endocrines, notamment la régulation de la température de corps et de l’apport alimentaire, dans l’hypothalamus. Il est donc important d’examiner si CCL5 participe à l’activation de signal de l’insuline au sein de l’hypothalamus ou les tissus périphériques.
Signalisation de l’insuline est étroitement contrôlée dans les cellules. La liaison des récepteurs de l’insuline à l’insuline (IR) active les protéines substrat (IRS) récepteur d’insuline, suivies de phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) et la protéine kinase B (PKB/AKT) activation et glucose transporteur-4 (GLUT4) membrane translocation4 . IRS protéines sont les principaux régulateurs dans cette voie de signalisation : ils ont plusieurs résidus de tyrosine et de la sérine, qui peuvent être phosphorylées en réponse aux résultats positifs ou négatif insuline signaux5. Par exemple, phosphorylation de sérine 302 sur IRS-1 peut conduire à la dissociation physique d’IRS-1 de IR et bloquer la transduction de signal de l’insuline, menant à l’insuline résistance6. L’altération de l’activité des protéines IRS dans l’hypothalamus a été démontrée pour induire la résistance à l’insuline et l’intolérance au glucose dans souris7.
Une façon courante d’étudier la fonction d’un gène spécifique est la manipulation de l’expression des gènes cibles répartis dans l’ensemble de l’organisme. Toutefois, cela peut avoir plusieurs inconvénients : 1) on peut générer différents effets réglementaires ou compensatoire au fil du temps et 2) cette méthode nous aide-t-il pas à illustrer le rôle de la protéine cible dans les régions spécifiques du cerveau. En outre, animaux de knock-out pour le gène spécifiques aux tissus et cellules prendre beaucoup de temps pour se reproduire et est coûteux. Ainsi, nous utilisons un système de pompe osmotique de perfusion cérébrale à court terme - une façon relativement rapide et pratique d’interférer avec la signalisation de la protéine cible dans le cerveau en utilisant le médicament antagoniste pour surmonter les problèmes susmentionnés. Stéréotaxiques injections utilisées d’exiger des compétences chirurgicales complexes et vastes investissements dans le temps et l’instrumentation. Dans ce protocole, nous fournissons un moyen simple et sûr d’effectuer l’injection stéréotaxique et une méthode moins nocif, instantanée et rapide pour détecter la concentration de glucose dans le sang et enquêter sur le rôle de CCL5 en insuline hypothalamique règlement de signalisation.
Protocol
Remarque : Tous les protocoles et les méthodes utilisées dans les matières animales ont été approuvés par animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC) de l’Université de médecine de Taipei (numéros de protocole : LAC-2014-0387)
1. préparation des systèmes de perfusion pompe Micro-osmotique
NOTE : Préparer la pompe, tampon artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) et médicaments (solution de protéine Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL dans l’aCSF)) dans des conditions stériles à l’aide de tampons filtrées avec 0,2 µm filtres et effectuer toutes les procédures sous le capot de la culture avec gants. Les chirurgies sont effectuées comme suit :
- Préparer les pompes osmotiques micro un jour avant l’intervention chirurgicale : remplir la pompe micro-osmotique de cerveau avec artificiel liquide céphalo-rachidien (FSCA) avec une seringue de 1 mL et une aiguille blunt-tête fourni avec le kit. Immerger la pompe micro-osmotique dans FSCA et le placer sur un agitateur et agitez doucement pendant la nuit.
ATTENTION : La pompe doit être remplie avec l’aCSF et bulles d’air doivent être évités à l’intérieur de la pompe (Figure 1 a). - Avant de commencer la chirurgie, préparer la solution de protéines recombinante Met-CCL5/RANTES (10 ng/mL, FSCA dilué dans) à utiliser dans l’expérience. Enlevez le FSCA de la pompe et remplir la pompe avec la solution médicamenteuse lentement jusqu'à ce que l’excédent s’écoule.
NOTE : 15 mL FSCA ou solution Met-CCL5/RANTES est suffisante pour les 5-8 pompes.
ATTENTION : Répéter la procédure pour s’assurer que la pompe est complètement remplie de la drogue sans bulles à l’intérieur. - Couper les tubes de cathéter dans la longueur désirée et attachez-les avec l’aiguille de perfusion de cerveau émoussé-fin dans le kit de perfusion de cerveau. Remplir la trousse de perfusion et les tubes avec la drogue.
- Enfin, assembler et fixer le kit de perfusion de cerveau à la pompe micro-osmotique.
ATTENTION : Aucuns bulles ne doivent se former dans le tube ou la pompe (Figure 1 a). - Immerger la fusion de l’ensemble pompe osmotique-cerveau située dans FSCA dans un tube stérile de 50 mL pour éviter la pompe ne se dessèchent pas. L’ensemble de fusion pompe osmotique-cerveau est maintenant prêt à être utilisé pour la chirurgie.
Remarque : Les systèmes de pompe micro-osmotique peuvent être utilisés pour la perfusion de médicaments à long terme. Ceci assure un mode sûr et pratique de la délivrance de médicaments dans le cerveau de souris.
2. intracérébrale ventriculaire chirurgie – implantation de la micro pompe osmotique
ATTENTION : Stériliser le milieu chirurgical avec 75 % d’éthanol et faire en sorte que les personnes impliquées dans l’étude portent des gants stériles et un sarrau propre. Instruments chirurgicaux / instruments doivent être stérilisés à l’autoclave et séchés avant utilisation et ensuite stérilisé avec chirurgies entre-deux souris 75 % d’éthanol.
- Peser la souris et anesthésier en utilisant l’injection intra péritonéale (IP) avec la kétamine/Xylazine (Ketamine 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg).
ATTENTION : Le poids corporel souris inférieur à 24 g ne sont pas recommandé pour la chirurgie d’implantation pompe osmotique. - Montez et fixez la tête de la souris sur l’appareil stéréotaxique (Figure 1 b).
- Utilisez une paire de ciseaux chirurgicaux et tenailles à ciel ouvert de l’épiderme, couvrant le crâne. Iode permet de nettoyer le crâne périphérique.
- Séparer la couche la plus superficielle de la peau la peau sous-cutanée à l’aide d’une paire de tenailles blunt-tête près de la région du cou pour l’implantation de set de fusion de pompe osmotique-cerveau (Figure 1).
- Marquer le point de perfusion se référant à la carte du cerveau (Figure 1) à l’aide de l’appareil stéréotaxique. Dans cette expérience, l’aiguille doit être implanté dans la région de ventricule 3rd (Bregma : latérale 0.0 mm, postérieur de 1,3 mm, 5,7 mm ventrale).
- Percez un trou avec un foret d’ongle autour de la zone marquée sur le crâne (Figure 1E).
ATTENTION : Veillez à ne pas casser les méninges de la souris et les vaisseaux sanguins, afin d’éviter la rupture des vaisseaux micro-sanguins dans le cerveau. - Placer l’ensemble de fusion pompe osmotique-micro-cerveau contenant aCSF (sous contrôle) ou la drogue (solution de protéine Met-CCL5/RANTES) sous la peau derrière la région du cou et insérer l’aiguille dans le trou percé pour infuser le médicament dans le cerveau de souris ( de la cervelle Figure 1E). L’aiguille va pénétrer les méninges et entrer dans le ventricule. Fixer l’aiguille en place sur le crâne à l’aide de gel désensibilisant surface (Figure 1F) et attendre 1-2 min jusqu'à ce que la colle sèche. Ensuite, couper la partie saillante sur le dessus de l’aiguille (Figure 1- H).
- Utilisez une colle à tissu pour soigner l’opération enroulée sur la tête. Déposer 50 µL de la colle sur le dessus de la plaie, rassembler les deux parties de la peau et accrochez-vous pour 30 s pour permettre à la peau assurer l’étanchéité (Figure 1I).
ATTENTION : Utiliser 100 % alcool tampon pour nettoyer la plaie après chirurgie et 100 ul de pénicilline avec la streptomycine pour prévenir l’infection. Remarque : La peau de souris formeront le tissu cicatriciel et guérir en quelques jours après l’administration de la colle chirurgicale. Le principal avantage de la colle est éviter les points de suture chirurgicales qui peut causer des irritations de la peau ou une inflammation. - Place la souris dans une cage propre placée sur une plaque chaude (chauffé à 37 ° C) et attendez que la souris se remet de l’effet anesthésique.
ATTENTION : Il est essentiel de maintenir la température du corps de la souris afin d’améliorer les chances de survie après la chirurgie. - Après une période d’une semaine de récupération, les souris sera prêts pour d’autres expériences, telles que le Test Oral de tolérance Glucose (HGPO) et le Test de tolérance de l’insuline (ITT).
3. Test de tolérance au Glucose par voie orale (HGPO)
Remarque : Effectuer l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale 7 jours après la perfusion de l’aCSF et MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Maintenir un 6 h rapide chez la souris avant de HPO avec l’approvisionnement en eau suffisant. Garder les animaux sur le même banc de travail où les expériences seront dérouleront afin qu’ils peuvent s’acclimater à l’environnement pour réduire le stress au cours de la procédure.
- Préparation de solution de glucose : avant d’effectuer l’expérience, préparer la solution de glucose en dissolvant 3,75 g glucose dans 15 mL eau distillée H2O.
- Mettre en place un calendrier d’enregistrer les lectures au cours de la procédure expérimentale (tableau 1).
Remarque : Il est important de mettre en place un calendrier avec des intervalles adéquats entre chaque examen de sang pour permettre exacte d’enregistrement pendant l’expérience. - Peser chaque souris après avoir jeûné et calculer la quantité appropriée de glucose à doser.
- Glucomètre (appuyez sur le bouton Démarrer pour vérifier l’état de la batterie, assurez-vous qu’il fonctionne avant le test.)
- Puce de glucose
- Seringue à insuline (seringue à insuline 0,3 mL)
- Lames de rasoir
- Minuterie
Remarque : La puce de glucose nécessite seulement une goutte de sang. Lorsque l’échantillon sanguin doit être recueilli plus d’une fois, il suffit d’appliquer la pression en exécutant vos doigts le long de la queue de la souris à plusieurs reprises tout en tenant l’extrémité de la queue directement sur le dessus de la puce pour recueillir le sang. Il n’est pas nécessaire de couper la queue chaque fois tout en collectant des échantillons de sang.
4. épreuve d’hyperglycémie provoquée insuline (contre-la-montre)
Remarque : Le test de tolérance à l’insuline et l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale doivent être planifiées au moins 7 jours d’intervalle pour réduire l’effet de jeûne pour les animaux. Pour le test de tolérance d’insuline (ITT), l’insuline humaine (0,75 UI/Kg) sera administrée par injection Intrapéritonéale.
- Préparation de la solution de l’insuline U 0,25 : diluer l’insuline humaine 100U au ratio de 1 : 400 dans une solution saline.
- Peser chaque souris après un jeûne et calculer le montant injecté de l’insuline en conséquence : le volume (µL) de 0.25 U l’insuline pour être injecté IP = 3 X BW (0.75 U d’insuline/Kg de poids corporel). Par exemple : pour une souris pesant 28,8 g, injecter : 28,8 X 3 = 86,4 µL (insuline de U dilué 0,25) (tableau 2).
ATTENTION : Les mêmes animaux pourraient avoir différents poids après 6 h de jeûne à des jours différents. Ainsi, il est nécessaire de mesurer le poids du corps juste avant et après le jeûne et la conduite d’essai l’HGPO et ITT. Poids corporel souris pourrait diminuer selon les espèces, le sexe et durée de jeûne. Des dosages plus élevés d’insuline peuvent provoquer un choc d’insuline et conduisent à la mort de l’animal. - Établissez un tableau (tableau 2) pour enregistrer les lectures au cours de la procédure expérimentale. Répétez les étapes 3,4. à 3,8. pour les niveaux de glucose de sang de mesure.
Representative Results
Des implantations chirurgicales des pompes à perfusion osmotique contenant soit FSCA sous contrôle ou antagoniste CCL5 MetCCL5 (pour bloquer les effets de CCL5 dans le cerveau) ont été menées sur les souris. À 7 et 14 jours après la chirurgie, la tolérance au glucose périphérique et la réactivité de l’insuline des souris ont été analysées à l’aide HGPO (après 7 jours) et ITT (après 14 jours) comme mentionné dans le protocole. L’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale (HGPO) et le test de tolérance à l’insuline (ITT) de souris ont été réalisées après 6 heures de jeûne. Des souris ont reçu avec le glucose par voie orale, avec le montant basé sur le leurs poids respectif. Les changements dans les niveaux de glucose de sang ont été enregistrées, comme illustré à la Figure 3. Le test de sensibilité à l’insuline a été exécuté par injection intrapéritonéale de l’insuline (IP) à des souris, et le changement de taux de glycémie a été mesuré immédiatement. Les changements du taux de glucose sanguin lors de la stimulation de l’insuline chez des souris avec des médicaments différents de perfusion ont été enregistrées, comme illustré à la Figure 4. Le taux de glycémie a été seulement légèrement réduite après administration de glucose (Figure 3 b) et l’injection d’insuline (Figure 4 b) chez les souris avec infusion d’antagoniste (MetCCL5) CCL5 par rapport aux souris avec infusion fsca. Ces résultats suggèrent une déficience en fonction de l’insuline sur le métabolisme périphérique de glucose chez les souris avec MetCCL5 administré dans le cerveau.
Ensuite, nous avons analysé l’activation du signal de l’insuline en évaluant la phosphorylation de l’IRS-1 et les niveaux d’activation Akt dans les tissus hypothalamiques. La phosphorylation de la sérine sur 302 d’IRS-1 a augmenté chez les souris traitées avec l’antagoniste (MetCCL5) (Figure 5 b-C) quand les souris ont été nourries normalement. Dans le groupe témoin, le FSCA a été administré à l’hypothalamus de souris et le défi de l’insuline active la molécule signal en aval Akt (473 de sérine phosphorylée Akt) (Figure 5, F) sans augmenter () activation serine302 IRS-1 Figure 5 -E) et la phosphorylation de serine473 Akt. En revanche, le signal de l’Akt n’augmentait pas chez les souris imprégnés de MetCCL5, mais il y avait une augmentation de la phosphorylation de la sérine IRS-1 302 à la place. Pendant ce temps, bloque le signal de CCL5 dans le cerveau de souris interrompu les activité de l’insuline dans l’hypothalamus et la fonction de l’insuline périphérique avec facultés affaiblies. De nos constatations globales, telles que les résultats de l’ITT, HGPO et ex vivo le défi de l’insuline, nous avons conclu que CCL5 dans l’hypothalamus contribue à l’activation de signal de l’insuline et le métabolisme du glucose périphérique lors de la stimulation de l’insuline.
Figure 1. Intervention chirurgicale préparation et implantation de pompe osmotique chez souris. (A) la cervelle préparation kit et pompe perfusée avec la solution médicamenteuse. Les flèches rouges indiquent les tubes cathéter remplis de liquide. (B) Fix et monter la tête de la souris sur l’appareil stéréotaxique. (C) de séparer la couche la plus superficielle de la peau contre la peau sous-cutanée pour l’implantation de l’ensemble de perfusion de cerveau-pompe micro-osmotique ; lignes de tableau de bord indiquent l’emplacement des implants pompe osmotique. (D), la flèche indique le côté de la perfusion. (E), percer un trou autour de la zone marquée sur le crâne. (F) Place la pompe osmotique-cervelle mis à l’arrière de la souris et insérez l’aiguille de perfusion de cerveau dans le trou percé (tiret cerclé). (G) fixer l’aiguille sur le crâne à l’aide de tissu adhésif colle et détacher la partie supérieure de l’aiguille (ciseaux pointus dans G) comme indiqué dans (H). (j’ai) joint la plaie à l’aide de tissus colle adhésive. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2. Images représentatives de la zone de diffusion de drogue lorsque le médicament est administré dans la région ventriculaire à l’aide de la pompe osmotique. Bleu d’Evan est le médicament représentatif utilisé dans l’illustration de perfusion de médicaments de pompe osmotique dans la région ventriculaire (A) et de la diffusion dans les ventricules latéraux et troisième (B). Echelle = 0,5 cm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3. Métabolisme du glucose des souris après la chirurgie, mesurée par le test de tolérance au glucose par voie orale (HGPO). La distribution des niveaux de glucose de sang changé suivant l’administration orale de glucose chez les souris WT imprégnée de FSCA (A) et antagoniste, MCCL5 (B). Données présentées comme moyenne ± SE. (Figure modifiée par rapport à8). * p < 0,05, par ANOVA bidirectionnelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4. Fonction de l’insuline en glucose sanguin de souris - le test de tolérance de l’insuline (ITT). La distribution des niveaux de glucose de sang changé suite à l’injection d’insuline chez les souris WT infusé avec l’aCSF (A) et imprégné d’antagoniste, MCCL5 (B). Données présentées comme moyenne ± écart type (Figure modifiée par rapport à8). p < 0,001, par ANOVA bidirectionnelle. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5. Activité de signal de l’insuline chez des souris après chirurgie. Éponger occidental (A) de la forme inhibiteur de sérine 302 phosphorylation d’IRS-1 (insuline réponse substrat-1, pIRS1S302) dans les tissus de hypothalamus souris traitées avec FSCA ou antagoniste de la CCL5, MetCCL5 (CCL5M) pompe à perfusion. (B) des niveaux de phosphore-IRS-1S302 après injection dans l’hypothalamus de souris avec une alimentation normale.(C) Éponger occidental de la phosphorylation S302 d’IRS-1 et Akt activation (phosphore-Akt S473, pAktS473) avec ou sans stimulation par l’insuline dans le tissu hypothalamique après FSCA ou infusion de METCCL5. (D-E) Niveaux relatifs des détecteurs infrarouge passifs-1S302, pS6KT421et pAktS473. (« 2 » dans chaque graphique à barres est synonyme de : n = 2 pour toutes les analyses quantitatives). (Les barres blancs 5D-e, à gauche : sans insuline ; les barres de bandes en 5D-E, à droite : avec l’insuline). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| # | ID de la souris | Corps | Glucose | Début | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| poids | ΜL = 10xBW | temps | mins | mins | mins | mins | mins | ||
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 09:00 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 253 | 09:07 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 |
Table 1. Horaire pour l’enregistrement du Test de tolérance du Glucose par voie orale (HGPO)
| # | ID de la souris | Corps | Insuline 0,25 UI | Début | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| poids | ΜL = 3xBW | temps | mins | mins | mins | mins | mins | ||
| 1 | 501 | 28,8 g | 86,4 | 09:00 | 09:00 | 09:15 | 09:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25,3 g | 75,9 | 09:07 | 09:07 | 09:22 | 09:37 | 10:07 | 10:37 |
Le tableau 2. Horaire pour l’enregistrement du Test de tolérance de l’insuline (ITT)
Discussion
Le mécanisme de l’inflammation chronique et des chimiokines connexes, comme la CCL5 et son récepteur – CCR5 dans le développement du diabète de type 2 ne sait pas. L’inflammation chronique provoque l’infiltration de macrophages dans les tissus adipeux et influe sur la réglementation des adipokines ; dans l’intervalle, elle aussi attire les cellules β et altère la sécrétion d’insuline des îlots de Langerhans en réponse au glucose dans le sang. Hypothalamus dans le cerveau joue un rôle important comme un centre de contrôle dans la coordination de l’insuline et adipokine signaux provenant des tissus périphériques systémiques dans la régulation de l’appétit, métabolisme du glucose du sang périphérique et la réponse insulinique. De nombreuses études indiquent également que l’inflammation hypothalamique mène à défectueuse régulation de l’homéostasie énergétique ainsi que des îlots pancréatiques défectueux et la fonction hépatique2,3,9,10. CCL5 dans le cerveau contribue à la régulation de température alimentaire l’apport et le corps dans l’hypothalamus11,,12; Cependant, la corrélation entre les CCL5 pour la signalisation de l’insuline hypothalamique et systémique n’est pas claire. Une souris de coup de grâce de tout le corps CCL5 (CCL5- / -) a été générée pour répondre à cette question, qui présente un phénotype de résistance d’insuline avec des niveaux plus élevés d’insuline et de glucose sanguin élevé dans le sang,8. Toutefois, elle nécessite beaucoup de temps pour développer le phénotype T2DM et il est difficile d’examiner le rôle et le mécanisme de CCL5 en insuline hypothalamique signal en raison de possibles effets compensatoires à long terme. Par conséquent, une manipulation directe des CCL5 la signalisation dans les neurones hypothalamiques est la meilleure approche. Il y a, cependant, plusieurs types de neurones dans la région hypothalamique et c’est assez long et coûteux de générer chez des souris knockout spécifique cellulaire. Système de perfusion, utilisant un ICV peut ainsi gagner du temps et offrent une approche plus spécifique pour manipuler la fonction CCL5 directement dans le cerveau, sans passer par des réactions inflammatoires périphériques possibles.
Des études utilisant les pompes osmotiques ont déjà été publiés auparavant, fournissant de bons exemples et des démonstrations de techniques impliqués dans l’implantation des pompes osmotiques dans rongeurs13. Cependant, nous fait face à quelques difficultés en suivant ces protocoles dans notre étude. Tout d’abord, l’équipement utilisé dans le protocole est assez cher, y compris 1) le système électrique pour atteindre l’emplacement, de dessin et d’insérer l’aiguille dans le cerveau de souris, 2) le système thermo pour maintenir la température corporelle de souris et 3) l’oxygène-isoflurane alimentation système à administrer l’anesthésie de souris. En second lieu, les techniques décrites dans d’autres articles ont été difficiles à reproduire parce que nous n’avons pu utiliser des animaux à l’intérieur une petite gamme de poids et à un certain âge pour notre étude. Nous sommes conscients que les souris plus gros sont plus adaptés pour la chirurgie et l’implantation. Cependant, dans notre étude, nous avons dû utiliser la souris plus petites et plus jeunes pour éviter la surcharge pondérale et les effets du vieillissement sur la régulation glycémique insuline et sang : seulement des souris mâles avec corps poids 25 ± 2 g et l’âge environ de 2 mois ont été choisis dans l’étude. Ainsi, il est difficile de pratiquer une intervention chirurgicale et suture de la plaie sur la tête de souris. En troisième lieu, la réponse inflammatoire doit être réduite au minimum après la chirurgie une cytokine inflammatoire étant la cible dans cette étude. Souris et les rats peuvent retirer la suture et plaies ouvertes facilement après la chirurgie, qui va entraîner une inflammation et augmenter les réactions de chimiokine. Par conséquent, une stratégie pour atteindre l’emplacement et de dessiner et d’introduire l’aiguille dans le cerveau de souris qui permet d’éviter une infection secondaire est nécessaire. Par conséquent, nous avons modifié les protocoles décrites précédemment pour faire cette technique rentable, plus facile et moins dangereux pour les animaux, tel que décrit dans le paragraphe suivant.
Tout d’abord, nous avons utilisé un foret d’ongle pour faire manuellement un trou autour de la zone cible marquée sur le crâne, comme indiqué au point 2.6. Cette méthode est efficace et permet de surveiller l’ensemble de la procédure afin d’éviter d’endommager les méninges de la souris et les vaisseaux sanguins. Régulation du glucose sanguin est altérée après accident vasculaire cérébral aigu, comme une hémorragie dans le cerveau. L’hyperglycémie aiguë et des syndromes de type diabète ont également observés après un AVC dans les milieux cliniques14,15. De même, nous avons également trouvé réponse insuline et niveau d’intolérance au glucose chez les souris présentant une hémorragie et pus dans le cerveau. Nous sommes conscients que mieux contrôler axée sur le manuel de la chirurgie est nécessaire pour assurer la cohérence des résultats. Deuxièmement, nous avons profité d’un biomatériau médical nouvellement mis au point, couramment utilisé dans les cliniques, colle tissu (étape 2.8), pour sceller la peau sur la tête de souris suivant la chirurgie, donc, en évitant les points de suture et à accélérer le taux de guérison. Cela rend les interventions chirurgicales plus facile à réaliser et réduit le risque d’inflammation secondaire. Troisièmement, le temps requis pour exécuter l’ensemble de la procédure chirurgicale est relativement court, qui augmente les chances de survie pour les souris et abaisse la posologie du médicament anesthésique est injecté par voie intrapéritonéale. Nous avons observé un taux de survie élevé (95 %) et a obtenu des résultats relativement précis en suivant ce protocole modifié.
La limitation de cette technique est le laps de temps relativement court de délivrance de médicaments. Même si une pompe osmotique peut être placée dans le corps de la souris vous pouvez également sans réouverture du cerveau, notre étude seulement porte sur les effets de chimiokines inflammatoires sur le cerveau pour réguler l’insuline systémique périphérique de signalisation. Une chirurgie additionnelle dans les tissus périphériques puisse éventuellement induire une réaction inflammatoire dans les tissus périphériques, qui serait ensuite augmenter l’expression de chimiokines inflammatoires et influe sur les résultats. Deuxièmement, la demi-vie du médicament limite également la durée de l’étude. Protéines recombinantes comme chemokine ont généralement une demi-vie plus courte, qui perd de son efficacité au fil du temps, bien qu’il nous permet également d’étudier l’effet de blocage CCL5 de signalisation dans le cerveau à court terme. Nos études précédentes ont également décrit une approche de modifications génétiques pour générer une souris knockout CCL5, qui fournit un modèle d’effets à long terme8.
Il y a quelques nouvelles techniques et des méthodes alternatives pour livrer des médicaments dans le cerveau. La nanotechnologie est une technique puissante, qui peut être utilisée pour livrer la drogue dans le système nerveux central. Cependant, de nombreux médicaments sont thermosensibles et peuvent être détruits en essayant de les emballer dans des nanoparticules16. En outre, des nanoparticules peuvent passer par BBB et être absorbée par les cellules qui conviennent aux siARN ou médicaments plus fréquemment, mais il n’est pas une méthode idéale pour la liaison ligand-récepteur.CCL5 requiert la liaison à son récepteur, CCR5, dans les neurones d’ARC hypothalamus pour prendre effet,8, et la livraison d’antagoniste CCL5 MetCCL5 en neurones grâce à des nanoparticules pourrait entraîner une perte de la capacité de lier et de bloquer le CCR5 sur la cellule surface.
Le taux de glycémie était significativement plus élevée chez les souris ayant reçu avec l’antagoniste CCL5 MetCCL5 contre les contrôles (souris administrés avec aCSF) dans l’épreuve d’hyperglycémie provoquée par voie orale. L’administration d’insuline supplémentaire (test de tolérance à l’insuline) n’a pu réduire la glycémie en MetCCL5 recevoir souris (Figure 4 b), ce qui suggère que l’insuline endogène et à l’externe ne peut pas réduire la glycémie lors du blocage de CCL5 de signalisation hypothalamique. Souris sont devenus résistants à l’insuline sans activité CCL5 dans l’hypothalamus. Serine302 accrue la phosphorylation de l’IRS-1 a été trouvée chez les souris recevant Met-CCL5 par rapport aux souris témoins recevant le FSCA (Figure 5 a-B). Phosphorylation de sérine 302 d’IRS-1 a été montrée pour induire une dissociation physique de l’IRS-1 depuis le récepteur de l’insuline, qui est une cause importante d’insuline résistance6; l’insuline ne peut pas activer les signaux en aval comme la voie PI3K-Akt. Une étude de stimulation ex vivo l’insuline a confirmé l’insuline molécule de signalisation en aval Akt (p-AktS473) n’était pas activé par l’insuline dans le tissu hypothalamique souris imprégné de Met-CCL5 et, au lieu de cela, la phosphorylation de la sérine 302 a augmenté. Au total, les données physiologiques (HGPO et ITT) et étude moléculaire montrent que CCL5 de signalisation hypothalamique intervient dans le règlement de signal insuline hypothalamique, qui contribue au métabolisme de glucose et de résistance systématique de l’insuline.
Le rôle et le mécanisme de CCL5 et CCR5 dans associées à l’obésité diabète reste floue. Kitade et coll. ont signalé que CCR5 carence protégeait les souris de l’inflammation induite par l’obésité, le recrutement de macrophages et insuline résistance17. Toutefois, autres études par Kennedy et coll. ont trouvé des résultats opposés indiquant que CCR5 lacune entrave au glucose systémique ainsi que musculaires et les adipocytes insuline signalisation18. Les deux études appliquent à une alimentation riche en graisses pour provoquer l’obésité, ce qui conduit à une inflammation chronique tout le corps et réaction compensatoire. Ces études ne fournissent pas de mécanismes propres et claires de CCL5 et CCR5 dans Règlement de signalisation d’insuline. En revanche, la technique de pompe osmotique permet une cervelle spécifique et permet d’éviter une réaction compensatoire avec sa livraison limitée dans le temps.
En conclusion, même si la pompe osmotique avec le système de perfusion de cerveau semble être une technique « démodée », il fournit une méthode moins cher, plus facile et moins dangereux de medicaments et contribue à étudier la fonction du ligand-récepteur de signalisation dans le cerveau.
Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous remercions la prise en charge du ministère de la Science et technologie, Taiwan – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3), santé et bien-être en supplément des produits du tabac - MOHW106-SAB-B-212-144001 à S-Y C.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
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