Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Medicine

Studere hypothalamus Insulin Signal perifere glukose intoleranse med kontinuerlig narkotika Infusjonssystem inn i musen hjernen

Published: January 4, 2018 doi: 10.3791/56410

Summary

Denne protokollen studier rollen chemokine (C-C motiv) ligand 5 (CCL5) i hypotalamus ved å levere en antagonist, MetCCL5, inn i musen hjernen ved hjelp av en mikro-osmotisk pumpe hjernen infusjonssystemet. Denne forbigående hemming av CCL5 aktivitet avbrutt hypothalamus insulin signalnettverk, som fører til glukose intoleranse og eksterne systemisk insulinfølsomhet.

Abstract

Insulin regulerer systematisk metabolismen i hypotalamus og eksterne insulin respons. En inflammatorisk reaksjon i perifere liggende under adipose vev bidrar til utvikling av type 2-diabetes mellitus (T2DM) og appetitt regulering i hypothalamus. Chemokine CCL5 og C-C chemokine reseptor type 5 (CCR5) nivåer har blitt foreslått for å megle arteriosklerose og glukose intoleranse i type 2 diabetes mellitus (T2DM). I tillegg spiller CCL5 en neuroendocrine rolle i hypotalamus ved å regulere maten inntaket og kroppstemperatur, derfor bedt oss å undersøke dens funksjon hypothalamus insulin signalering og regulering av eksterne glukose metabolisme.

Mikro-osmotisk pumpe hjernen infusjonssystemet er en rask og presis måte å manipulere CCL5 funksjon og studere dens effekt i hjernen. Det gir også et praktisk alternativ tilnærming til å generere en transgene knockout dyr. I dette systemet, ble CCL5 signalering blokkert av intracerebroventricular (ICV) infusjon av sin motstander, MetCCL5, bruke en mikro-osmotisk pumpe. Den eksterne glukose metabolisme og insulin responsen ble oppdaget av Oral glukose toleranse Test (OGTT) og Insulin toleranse Test (ITT). Insulin signalering aktivitet ble deretter analyseres av protein blot fra vevsprøver avledet fra dyrene.

Etter 7-14 dager av MetCCL5 infusjon, glukose metabolisme og insulin ble respons nedsatt i mus, sett i resultatene av OGTT og ITT. IRS-1 serine302 fosforylering ble økt og Akt aktiviteten ble redusert i mus hypothalamus nevroner etter CCL5 hemming. Helt, våre data tyder på at blokkering CCL5 i musen hjernen øker fosforylering av IRS-1 S302 og avbryter hypothalamus insulin signalnettverk, fører til en reduksjon i insulin-funksjonen i perifere vev samt svekkelse av glukose metabolisme.

Introduction

Insulin påvirker en rekke tissues inkluderer hjernen. Insulin passerer blod - hjerne barrieren, angir sentralnervesystemet (CNS) og binder med insulin receptor (IR) i hypothalamus å regulere matinntaket, sympatisk aktivitet og eksterne insulin respons. Kronisk betennelse i perifere liggende under adipose vev har blitt foreslått å bidra til å type 2 diabetes mellitus (T2DM), men hvordan disse inflammatoriske reaksjoner påvirker insulin signaler i hypotalamus å megle systemisk insulin respons og glukose intoleranse uklar. Noen chemokines delta i appetitt regulering og kropp temperaturregulering i hypothalamus1 som tumor nekrose faktor-alpha (TNFα), interleukin (IL) -6, IL-1β, monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) og CCL5 (C-C motiv ligand 5 ). I tillegg fører betennelse i hypotalamus til insulinresistens i T2DM2,3.

Blant disse chemokines, endring av uttrykket chemokine CCL5 og dens reseptor, har CCR5, liggende under adipose vev blitt assosiert med arteriosclerosis og glukose intoleranse i T2DM i mennesker og dyr. CCL5 har neuroendocrine funksjoner, inkludert regulering av mat inntak og kroppstemperatur, i hypothalamus. Derfor er det viktig å undersøke om CCL5 deltar i insulin signal aktivisering i hypothalamus eller perifere vev.

Insulin signalnettverk er strengt regulert i celler. Binding av insulin til insulin reseptorer (IR) aktiverer insulin receptor substrat (IRS) proteiner, etterfulgt av phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og protein kinase B (PKB/AKT) aktivisering og glukose transporter-4 (GLUT4) membran translokasjon4 . IRS proteiner er viktige regulatorer i denne signalveien: de har flere tyrosin og serine rester, som kan bli fosforylert Grunna positive eller negative insulin signaler5. For eksempel kan serine 302 fosforylering på IRS-1 føre til fysiske dissosiasjon IRS-1 fra IR og blokkere insulin signaltransduksjon, fører til insulin resistens6. Aktivitet svekkelse av IRS proteiner i hypotalamus har vist å indusere insulinresistens og glukose intoleranse i mus7.

En vanlig måte å studere funksjonen til et bestemt gen er manipulasjon av uttrykket av målet gener distribuert i hele kroppen av organismen. Dette kan imidlertid ha flere ulemper: 1) det kunne generere forskjellige regulatoriske eller kompenserende effektsimuleringen over tid og 2) denne metoden hjelper ikke oss illustrere rollen av målet protein i bestemte hjernen regioner. Også vev - og celle-spesifikk genet knockout dyr tar tid å avle og kostbart. Derfor bruker vi et kortsiktig hjernen infusjon osmotisk pumpesystem - en relativt rask og praktisk måte å forstyrre signalering av målet protein i hjernen narkotikabruken motstander for å overvinne de nevnte problemene. Stereotactic injeksjoner brukes til å kreve intrikate kirurgiske ferdigheter og omfattende investeringer i instrumentering og tid. I denne protokollen gir vi en enkel og sikker måte å utføre stereotactic injeksjon og en rask, mindre skadelige og øyeblikkelig metode å oppdage konsentrasjonen av blodsukker og undersøke rollen CCL5 i hypothalamus insulin signalering regulering.

Protocol

Merk: Alle protokollene og metodene som brukes i dyr fag er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komiteer (IACUC) i Taipei medisinske universitet (protokoll tall: LAC-2014-0387)

1. utarbeidelse av mikro-osmotisk pumpe infusjonssystemer

Merk: Forberede pumpe, kunstige cerebrospinalvæske (aCSF) buffer, og narkotika (Met-CCL5/RANTES protein løsning (10 ng/mL i aCSF)) under sterile forhold med buffere filtrert med 0,2 µm filtre og utføre alle prosedyrer under panseret kultur med hansker. Kirurgi prosedyrer er gjennomført som følger:

  1. Forberede mikro-osmotisk pumpene en dag før operasjonen: fylle hjernen mikro-osmotisk pumpen med kunstig cerebrospinalvæske (aCSF) med 1 mL sprøyte og Butt-head nål leveres med pakken. Fordype mikro-osmotisk pumpen i aCSF og plassere den på en shaker og rist forsiktig over natten.
    FORSIKTIG: Pumpen skal fylles med aCSF, og bør unngå luftbobler i pumpen (figur 1A).
  2. Før du starter operasjonen, forberede rekombinant Met-CCL5/RANTES protein løsningen (10 ng/mL, utvannet i aCSF) brukes i eksperimentet. Fjern aCSF fra pumpen og fyll pumpen med narkotika løsningen sakte til overflødig lekker ut.
    Merk: 15 mL aCSF eller Met-CCL5/RANTES løsning er tilstrekkelig for 5-8 pumper.
    FORSIKTIG: Gjenta for å sikre at pumpen er helt fylt med stoffet uten bobler på innsiden.
  3. Skjær kateter rør i ønsket lengde og fest dem med butt-end hjernen infusjon nålen i hjernen infusjon kit. Fyll infusjon kit og rør med stoffet.
  4. Til slutt, samle og fest hjernen infusjon kit på mikro-osmotisk pumpen.
    Advarsel: Noen bobler skal dannes i røret eller pumpen (figur 1A).
  5. Legg hele osmotisk pumpe-hjerne fusion satt i aCSF i en sterilisert 50 mL tube å hindre pumpen tørker. Osmotisk pumpe-hjerne fusion settet er nå klar til å brukes for kirurgi.
    Merk: De mikro-osmotisk pumpesystemer kan brukes for langsiktig narkotika infusjon. Dette sikrer en trygg og praktisk leveringsmåte narkotika inn i musen hjernen.

2. intracerebral ventrikkel kirurgi-implantasjon av mikro osmotisk pumpen

FORSIKTIG: Sterilisere kirurgisk miljøet med 75% etanol og sikre at folk involvert i studien er iført sterilt hansker og en ren labfrakk. Kirurgiske verktøy / instrumenter må autoklaveres og tørket før bruk, og senere steriliserte med 75% etanol mellom mus operasjoner.

  1. Veie musen og bedøve det intra peritoneal injeksjon (IP) med ketamin/Xylazine (ketamin 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg).
    FORSIKTIG: Mus kroppen vekter lavere enn 24 g anbefales ikke for osmotisk pumpe implantasjon kirurgi.
  2. Montere og fikse mus hodet på stereotactic apparatet (figur 1B).
  3. Bruk et par kirurgisk saks og knipetang for å klippe åpne den ytre huden dekker skallen. Bruk jod for å rengjøre perifere skallen.
  4. Skille det ytterste laget av huden fra subkutan huden ved hjelp av et par Butt-head knipetang i nakken regionen for osmotisk pumpe-hjerne fusion angi implantation (figur 1 c).
  5. Merk infusjon punktet med hjernen kart (figur 1 d) benytter stereotactic apparatet. I dette eksperimentet, nålen må bli implantert i 3rd ventrikkel regionen (Bregma: 0.0 mm lateral, 1,3 mm bakre, 5.7 mm ventrale).
  6. Bore hull med en spiker drill rundt i området på skallen (figur 1E).
    FORSIKTIG: Vær forsiktig med å bryte musen meninges og blodkar, dermed unngå avbrudd i mikro-blodårer i hjernen.
  7. Plass mikro-osmotisk pumpe-hjerne fusion settet som inneholder aCSF (som kontroll) eller narkotika (Met-CCL5/RANTES protein løsning) under huden bak nakken regionen og sett inn hjernen infusjonen pinne inn i boret hull å sette mot stoffet inn i musen hjernen ( Finne 1E). Nålen vil trenge meninges og få i ventrikkel. Fastsette nålen på plass på skallen bruker overflate desensitizing gel (figur 1F) og vent 1-2 min til limet tørker. Deretter kuttes delen prosjektering på nålen (figur 1G- H).
  8. Bruk en vev selvklebende lim for å helbrede operasjonen sår på hodet. Bruke 50 µL lim på såret, trekke begge sider av huden sammen og holde på for 30 s slik at huden til å forsegle (figur 1I).
    FORSIKTIG: Bruk 100% spritpute til å rense såret etter kirurgi og 100 ul penicillin med streptomycin å hindre infeksjon. Merk: Mus huden vil danne arrvev og helbrede noen dager etter administrasjon av kirurgiske limet. Den største fordelen med limet er unngåelse av kirurgiske masker som kan forårsake hudirritasjon eller betennelse.
  9. Sted musen i en ren bur holdt på en varm plate (oppvarmet opptil 37 ° C) og vent til musen gjenoppretter bedøvende effekten.
    Advarsel: Det er viktig å opprettholde musen er kroppstemperatur for å øke sjansen for overlevelse etter operasjonen.
  10. Etter en ukes restitusjonsperiode være mus klar for videre studier, som muntlig glukose toleranse Test (OGTT) og Insulin toleranse Test (ITT).

3. muntlig glukose toleranse Test (OGTT)

Merk: Utføre oral glukose toleranse test 7 dager etter tilførsel av aCSF og MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL). Opprettholde en 6 h raskt for mus før OGTT med tilstrekkelig vannforsyning. Holde dyr på den samme arbeidsbenk der eksperimenter utføres slik at de kan acclimatize til miljøet å redusere stress under prosedyren.

  1. Glukose løsning Tilberedning: før gjennomfører eksperimentet, forberede glukose løsningen ved oppløsning 3.75 g glukose i 15 mL destillert H2O.
  2. Definere en tidsplan for å registrere målingene under den eksperimentelle prosedyren (tabell 1).
    Merk: Det er viktig å konfigurere en rutetabell med riktig mellomrom mellom hver blod undersøkelse tillate nøyaktig opptak under eksperimentet.
  3. Veie hver musen etter faste og beregne riktig mengde glukose skal injiseres.
For eksempel hvis musen veier 30 g, bør mengden av glukose løsning gis være 300 µL.
  • Klargjør følgende instrumenter på arbeidsbenk:
    1. Glukosemåler (Trykk på Start kontrollere batteristatus, kontroller at det er fungerende før testen.)
    2. Glukose chip
    3. Insulinsprøyte (0,3 mL insulinsprøyte)
    4. Barberblader
    5. Timer
  • Når benken er satt opp, måle og registrere blodsukkernivå slik: Sett en ren og ny glukose chip i glukosemåler og trykker på startknappen til null det.
  • Plukke opp musen ved baksiden av halsen og hjerneslag halen noen ganger å sikre tilstrekkelig blodtilførsel til regionen halen.
  • Bruke en ny barberblad kuttet av et lite stykke halen og presse ut en liten dråpe blod (ca 10-20 µL) til glukose chip. Blod skal fylle chip å tillate nøyaktig måling. Glukosemåler vises glukose nivå umiddelbart. Hvis maskinen viser "feil", gjenta med en ny glukose chip.
    Merk: Glukose chip krever bare en dråpe av blod. Når blodprøve må samles flere ganger, bare bruke press ved å kjøre fingrene langs musen er halen flere ganger mens du holder slutten av halen direkte på chip å samle blod. Det er ikke nødvendig å klippe halen slutten hver gang mens samle blodprøver.
  • Deretter mate musene glukose (0,25 g/mL) muntlig ved hjelp av intragastric gavage teknikken. Mengden glukose gis skal beregnes ved hjelp av formelen: 10 X kropp vekt (BW) µL glukose løsning (for eksempel hvis musen veier 30 g, mengden av glukose løsning gis vil være 300 µL). Starte tidtakeren umiddelbart etter administrasjon av oral glukose.
  • Gjenta målingen glukose på 15, 30, 60, 90 og 120 min.
  • Når alle glukose nivå målingene er spilt, forkaste barberblad og glukose chips i en biohazard beholder. Sette maten tilbake i mus merdene og returnere dem til dyr rommet.
  • 4. insulin toleranse Test (ITT)

    Merk: Insulin toleranse test og muntlig glukose toleranse test skal planlegges minst 7 dager fra hverandre å redusere faste effekten på dyr. For insulin toleranse test (ITT), vil menneskelige insulin (0,75 U/Kg) bli administrert gjennom IP injeksjon.

    1. Utarbeidelse av 0,25 U insulin løsning: fortynne 100U menneskelige insulin til forholdet mellom 1:400 i saltvann.
    2. Veie hver musen etter faste og beregne injisert mengden insulin tilsvarende: volumet (µL) av 0,25 U insulin skal injiseres IP = 3 X BW (0,75 U insulin/Kg kroppsvekt). For eksempel: en mus veiing 28,8 g, injisere: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 U utvannet insulin) (tabell 2).
      FORSIKTIG: De samme dyrene kan ha ulike kroppens vekter etter 6 h faste på ulike dager. Derfor er det nødvendig å måle kroppsvekten rett før og etter faste og gjennomføre OGTT og ITT test. Musen kroppsvekt kunne slippe avhengig av arter, kjønn, og faste varighet. Høyere doser av insulin kan føre til insulin sjokk og vil føre til døden av dyret.
    3. Definere en tabell (tabell 2) for å registrere målingene under den eksperimentelle prosedyren. Gjenta trinnene 3.4. til 3.8. for måling blodsukkernivået.

    Representative Results

    Kirurgisk implantations osmotisk infusjon pumper som inneholder enten aCSF som kontroll eller CCL5 antagonist MetCCL5 (for å blokkere CCL5 effekter i hjernen) ble utført på mus. 7 og 14 dager etter operasjonen, ble den perifere glukosetoleranse og insulin respons til mus analysert ved hjelp av OGTT (etter 7 dager) og ITT (etter 14 dager) som nevnt i protokollen. Den muntlige glukose toleranse test (OGTT) og insulin toleranse test (ITT) av mus ble utført etter 6 timer faste. Mus ble administrert med glukose muntlig, med hvor basert på deres respektive kroppen vekter. Endringer i blodsukkernivået ble registrert, som vist i Figur 3. Insulin sensitivitet testen ble utført ved intraperitoneal (IP) insulininjeksjon i mus og endring av blodsukkernivå ble målt umiddelbart. Endringene av blodsukker på insulin stimulering i mus med annen infusjon narkotika ble registrert, som vist i Figur 4. Blodsukkernivå var bare litt redusert etter glukose administrasjon (figur 3B) og insulininjeksjon (figur 4B) i mus med CCL5 antagonist (MetCCL5) infusjon sammenlignet med mus med aCSF infusjon. Disse resultatene tyder impairments i insulin funksjon på eksterne glukose metabolisme i mus med MetCCL5 administreres i hjernen.

    Neste, vi analyserte aktivering av insulin signalet ved å evaluere den IRS-1 fosforylering og Akt aktivisering nivåer i hypothalamus vev. Serine fosforylering på 302 IRS-1 ble upregulated i mus behandlet med antagonist (MetCCL5) (figur 5B-C) når mus ble matet normalt. I kontrollgruppen, aCSF ble administrert til mus hypothalamus og insulin utfordringen aktivert nedstrøms signal molekylet Akt (fosforylert Akt Serine 473) (figur 5 d, F) uten å øke IRS-1 serine302 Aktivisering ( Figur 5 d -E) og Akt serine473 fosforylering. Derimot Akt signalet var ikke økt i mus tilført MetCCL5, men det var en økning i fosforylering av IRS-1 serine 302 i stedet. I mellomtiden avbrutt blokkerer CCL5 signalet i musen hjernen insulin aktivitet i hypotalamus og svekket perifere insulin. Fra vår samlede funn som resultatene fra ITT, OGTT og ex vivo insulin utfordring, vi konkluderte med at CCL5 i hypotalamus bidrar til insulin signal aktivisering og eksterne glukose metabolisme på insulin stimulering.

    Figure 1
    Figur 1. Osmotisk pumpe forberedelse og implantasjon kirurgisk prosedyre i mus. (A) hjernen infusjonen kit og pumpe forberedelse parfyme med narkotika løsning. Røde piler indikerer kateter rør fylt med væske. (B) fastsette og mount mus hodet på stereotactic apparatet. (C) separat det ytterste laget av huden fra subkutan huden for implantering av mikro-osmotisk pumpe-hjerne infusjon sett; Dash linjer angir plasseringen av osmotisk pumpe implantater. (D) pilen viser siden infusjon. (E) bore et hull rundt det markerte området på skallen. (F) stedet osmotisk pumpe-hjerne infusjonen satt inn på baksiden av musen og hjernen infusjon nålen inn boret hullet (skvett sirkel). (G) rett nålen på skallen ved hjelp av vev-selvklebende lim og koble fra toppen av nålen (Scissor pekte i G) som vist i (H). (jeg) segl i såret ved hjelp av vev selvklebende lim. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 2
    Figur 2. Representant bilder av narkotika diffusjon området når stoffet administreres i regionen ventrikkel bruker osmotisk pumpen. Evan's blue er representativt stoffet brukes i illustrasjonen osmotisk pumpe narkotika infusjon i regionen ventrikkel (A) og spredning i laterale og tredje ventriklene (B). Skala bar = 0,5 cm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 3
    Figur 3. Glukose metabolisme av mus etter operasjonen målt ved muntlig glukose toleranse test (OGTT). Fordelingen av blodsukker endret følgende peroral administrering av glukose i WT mus tilført aCSF (A) og antagonist, MCCL5 (B). Dataene som gjennomsnittlig ± SE. (figur endret fra8). * p < 0,05, ved toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 4
    Figur 4. Insulin funksjon i mus blodsukker - insulin toleranse test (ITT). Fordelingen av blodsukker endret etter insulininjeksjon i WT mus tilført aCSF (A), og tilført antagonist, MCCL5 (B). Data som gjennomsnittlig ± SE (figur endret fra8). p < 0,001, ved toveis VARIANSANALYSE. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    Figure 5
    Figur 5. Insulin signal aktivitet i mus etter kirurgi. (A) vestlige blotting hemmende Serine 302 fosforylering form av IRS-1 (insulin respons substrat-1, pIRS1S302) i mus hypothalamus vev behandlet med aCSF eller CCL5 antagonist, MetCCL5 (CCL5M) infusjon pumpe. (B) relaterte nivåer av fosfor-IRS-1S302 etter infusjon i mus hypothalamus med normal fôring.(C) vestlige blotting av S302 fosforylering IRS-1 og Akt Aktivisering (fosfor-Akt S473, pAktS473) med eller uten insulin stimulering i hypothalamus vev etter aCSF eller METCCL5 infusjon. (D-E) Relativ nivåer av pIRS-1S302, pS6KT421og pAktS473. ("2" i hver stolpediagram står for: n = 2 for alle quantifications). (Tom barene i 5D-E, venstre: uten insulin, strimler barene i 5D-E, rett: med insulin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

    # Mus-ID Kroppen Glukose Start 0 15 30 60 90
    vekt ΜL = 10xBW tid min min min min min
    1 501 25,8 g 258 9:00 9:00 9:00 9:15 9:30 10:00
    2 502 25.3g 253 9:07 9:07 9:07 9:22 9:37 10:07

    Tabell 1. Timeplan for Oral glukose toleranse Test (OGTT)-opptak

    # Mus-ID Kroppen Insulin 0,25 IU Start 0 15 30 60 90
    vekt ΜL = 3xBW tid min min min min min
    1 501 28,8 g 86,4 9:00 9:00 9:15 9:30 10:00 10:30
    2 502 25.3g 75.9 9:07 9:07 9:22 9:37 10:07 10:37

    Tabell 2. Timeplan for Insulin toleranse Test (ITT) opptak

    Discussion

    Mekanismen av kroniske betennelser og relaterte chemokines som CCL5 og dens reseptor-CCR5 i utviklingen av type 2-diabetes er fortsatt uklart. Kronisk betennelse forårsaker macrophage infiltrasjon i liggende under adipose vev og påvirker regulering av endotelial; i mellomtiden, det også tiltrekker β-celler og svekker insulinsekresjon fra holmer Langerhans svar blodsukker. Hypotalamus i hjernen spiller en viktig rolle som et control center i koordinere insulin og adipokine signaler fra systemisk perifere vev i å regulere appetitten, perifert blod glukose metabolisme og insulin respons. Mange studier viser også at hypothalamus betennelse fører til mangelfulle regulering av energi homeostase samt defekt bukspyttkjertelen Holme og leverfunksjon2,3,9,10. CCL5 i hjernen bidrar til mat inntak og kropp temperaturregulering i hypothalamus11,12; korrelasjon av CCL5 til hypothalamus og systemisk insulin signalnettverk er imidlertid uklart. CCL5 hele kroppen knockout mus (CCL5- / -) har blitt generert for å løse dette spørsmålet, som viser en insulin resistens fenotypen med høyere insulin nivåer og høyt blodsukker i blod8. Men det krever en lang tid å utvikle T2DM fenotypen og det er vanskelig å undersøke rollen og mekanismen av CCL5 i hypothalamus insulin tapsfrie mulig langsiktige kompenserende virkninger. En direkte manipulering av CCL5 signalering i hypothalamus nevroner er derfor den beste tilnærmingen. Det er imidlertid flere typer nerveceller i hypothalamus regionen og det er ganske dyrt og tidkrevende å generere celle bestemt knockout mus. Utnytte en ICVEN kan infusjonssystemet dermed spare tid og gi en mer konkret tilnærming for å manipulere CCL5 funksjonen direkte i hjernen, omgåelsen mulige eksterne inflammatoriske reaksjoner.

    Studier utnytte osmotisk pumper har allerede blitt publisert tidligere gir gode eksempler og demonstrasjoner av teknikker involvert i implantering av osmotisk pumper i gnagere13. Men møtt vi noen utfordringer selv etter disse protokollene i vår undersøkelse. Først noen av utstyret brukes i protokollen er ganske dyre, inkludert 1) det elektriske systemet kommer til stedet, tegning og sette inn nålen inn musen hjernen, 2) thermo systemet for å opprettholde musen kroppstemperatur og 3) på oksygen-isoflurane PartnerSystem for administrasjon anestesi til mus. Andre var teknikkene i andre artikler vanskelig å gjenskape fordi vi var bare bruke dyr innenfor et lite område av kroppen vekter og på visse aldre i vår studie. Vi er klar over at større mus er mer egnet for kirurgi og implantasjon. Imidlertid i vår undersøkelse, måtte vi bruke mindre og yngre mus for å unngå overvekt og aging virkninger på insulin og blod glukose regulering: bare mannlige mus med kroppen vekt 25 ± 2 g og alder rundt 2 måneder gammel ble valgt i studien. Dermed er det vanskelig å utføre kirurgi og Sutur såret på mus hodet. Tredje har betennelsesreaksjon minimeres etter kirurgi siden en inflammatorisk cytokin er målet i denne studien. Mus og rotter kan fjerne Sutur og åpne sår lett etter kirurgi, som vil føre til betennelse og øke chemokine reaksjoner. Derfor er en strategi for å nå plasseringen og trekke og sette inn nålen inn musen hjernen som unngår sekundær infeksjon nødvendig. Derfor endret vi beskrevet tidligere protokoller for å gjøre denne teknikken kostnadseffektive, enklere og mindre skadelig for dyrene, som beskrevet i følgende avsnitt.

    Først brukte vi en spiker drill manuelt bore et hull rundt målområdet på skallen, som beskrevet i trinn 2.6. Denne metoden er kostnadseffektivt og tillater oss å overvåke hele prosedyren for å unngå skade på musen meninges og blodkar. Blod glukose regulering er svekket etter akutt slag, for eksempel en blødning i hjernen. Akutt hyperglykemi og diabetes-lignende syndromer ble også observert etter hjerneslag i klinisk innstillinger14,15. Tilsvarende funnet vi også svekket glukose nivå og insulin respons i mus med blødning og pus i hjernen. Vi er klar over at bedre kontroll over håndbok kirurgi er nødvendig for å sikre konsistens av resultatene. Dernest tok vi fordel av en nyutviklet medisinsk biomateriale vanligvis brukes i klinikker, vev selvklebende lim (trinn 2.8), for å forsegle huden på mus hodet etter operasjonen, derfor unngå masker og akselererende frekvensen av helbredelse. Dette gjør det enklere å utføre kirurgiske prosedyrer og reduserer sjansen for sekundær betennelse. For det tredje, tiden det tar å utføre hele kirurgiske prosedyren er relativt kortere, som øker sjansen for overlevelse for mus og senker dosering av bedøvende narkotika tilværelse innsprøytet intraperitoneally. Vi observert en høy overlevelse (95%) og fått relativt nøyaktige resultater ved å følge denne endret protokollen.

    Begrensning av denne teknikken er relativt kort tidsramme på narkotika-leveranser. Selv om en osmotisk pumpe kan plasseres i kroppen av mus alternativt uten å åpne hjernen, vår studie bare fokuserer på inflammatorisk chemokine effekten på hjernen til å regulere perifere systemisk insulin signalene. Ytterligere surgery i perifere vev kan muligens indusere en inflammatorisk reaksjon i perifere vev, som deretter vil øke provoserende chemokine uttrykk og påvirke resultatene. Dernest begrenser halveringstiden av stoffet også varigheten av studien. Rekombinante proteinene som chemokine har vanligvis en kortere half-life, som mister sin aktivitet over tid, selv om den gjør det også mulig for oss å studere effekten av blokkering CCL5 signalering i hjernen på kort sikt. Våre tidligere studier har også beskrevet en genetisk modifisering tilnærming for å generere en CCL5 knockout mus, som gir en modell med langsiktige effekter8.

    Det er noen nye teknikker og alternative metoder for å levere narkotika inn i hjernen. Nanoteknologi er en kraftfull teknikk, som kan brukes til å levere narkotika i sentralnervesystemet. Men mange legemidler er thermosensitive og kan bli ødelagt når jeg prøver å pakke dem i nanopartikler16. I tillegg nanopartikler kan passere gjennom BBB og uptaken av celler som er egnet for siRNA eller mest vanlige legemidler, men det er ikke en ideell måte ligand-reseptor bindende.CCL5 krever binding til sin reseptoren, CCR5, i hypothalamus ARC neurons å ta effekt8, og levering av CCL5 antagonist MetCCL5 i neurons gjennom nanopartikler kan forårsake tap av evnen til å binde og blokkere CCR5 på cellen overflaten.

    Blodsukkernivå var signifikant høyere i mus administreres med CCL5-antagonist MetCCL5 sammenlignet med kontrollene (mus administreres med aCSF) i muntlig glukose toleranse test. Ekstra insulin administrasjon (insulin toleranse test) kunne også lavere blod glukose nivå i MetCCL5 mottar mus (figur 4B), noe som tyder på at både endogene og eksterne insulin ikke kan redusere blodsukker Når blokkerer hypothalamus CCL5 signalering. Mus ble insulin resistente uten CCL5 aktivitet i hypothalamus. Økt serine302 fosforylering IRS-1 ble funnet i mus mottar Met-CCL5 forhold til kontroll mus mottar aCSF (figur 5A-B). Serine 302 fosforylering IRS-1 har vist seg å indusere en fysisk dissosiasjon IRS-1 fra insulin reseptoren, som er en viktig årsak til insulin resistens6; insulin er kan ikke aktivere nedstrøms signaler som PI3K-Akt veien. En ex vivo insulin stimulering-studie bekreftet insulin nedstrøms signalnettverk molekyl Akt (p-AktS473) ikke ble aktivert av insulin i musen hypothalamus vev tilført Met-CCL5, og i stedet serine 302 fosforylering økt. Helt, både fysiologiske data (OGTT og ITT) og molekylære studier viser at hypothalamus CCL5 signalering formidler hypothalamus insulin signal regulering, noe som bidrar til systematisk insulin resistens og glukose metabolisme.

    Rolle og mekanismen av CCL5 og CCR5 i fedme-assosiert diabetes er fortsatt uklart. Kitade et al. rapporterte at CCR5 mangel beskyttet mus fra fedme-indusert betennelser, macrophage rekruttering og insulin resistens17. Men andre studier ved Kennedy et al. funnet motsatte resultatet indikerer at CCR5 mangel svekker systemisk glukosetoleranse samt adipocyte og muskel insulin signalering18. Både studier brukt et fettrikt kosthold å indusere fedme, som fører til hele kroppen kronisk betennelse og kompenserende respons. Disse studiene gir ikke ren og klar mekanismer CCL5 og CCR5 i insulin signalering regulering. Derimot, osmotisk pumpe teknikken kan en hjerne bestemt infusjon og unngår kompenserende svar med sin tid-begrenset levering.

    I konklusjonen, selv om osmotisk pumpen med hjernen infusjonssystemet synes å være en "gammeldags" teknikk, det gir en billigere, enklere og mindre skadelig metode for narkotika-leveranser og hjelper undersøke funksjon ligand-reseptor signalering i den hjernen.

    Disclosures

    Forfatterne ikke avsløre.

    Acknowledgments

    Vi er takknemlige de støttede fra departementet for vitenskap og teknologi, Taiwan-MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) og helse og velferd tillegg av tobakksvarer - MOHW106-TDU-B-212-144001 til S-Y C.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Vetbond Tissue Adhesive 3M #1049SB The glue used to seal the lesion site on the mouse head
    LOCTITE 454 instant adhesive Durect Corporation #8670 The glue used to fix the needle on the mouse skull
    Alzet Micro- Osmotic Pump Durect Corporation #9922 0.11 μl per hour, 28 days
    Brain infusion system Durect Corporation #8851 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain
    Glucometer Roche #06870244001 Used to measure the blood glucose level
    Glucose chip Roche #06454011020 Used to load the blood sample
    Evan's blue Sigma #MKBK0523V To demonstrate the drug infusion area
    Insulin syringe Becton, Dickinson and Company #3232145 C Used to administer insulin intraperitoneally
    MIO NE116 CONTROL UNIT
    (nail drill)
    Mio System #E235-015 To drill a hole in the skull of the mouse
    CCL5/Met-RANTES Protein R&D #ADB0111081 Recombinant Human CCL5, E-coli derived
    aCSF formula 119 mM NaCl
    26.2 mM NaHCO3
    2.5 mM KCl
    1 mM NaH2PO4
    1.3 mM MgCl2
    10 mM glucose
    Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C.
    aCSF is stable for 3-4 weeks
    Phospho-IRS-1 Serine302 antibody Cell Signaling #12879 1:1000 dilution
    IRS-1 (D23G12) antibody Cell Signaling #12879 1:1000 dilution
    Phospho-Akt Serine 473 antibody Cell Signaling #9916 1:2000 dilution
    Akt (pan) (C67E7) antibody Cell Signaling #9916 1:1000 dilution
    Animals: C57BL/6 NAR Labs Wild type mice strain used in the study

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
    2. Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
    3. Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
    4. Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
    5. Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
    6. Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
    7. Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
    8. Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
    9. Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
    10. Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
    11. Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
    12. Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
    13. DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
    14. Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
    15. Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
    16. De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
    17. Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
    18. Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).

    Tags

    Medisin problemet 131 hjernen narkotika-leveranser mikro-osmotisk pumpe insulin toleranse glukose metabolisme chemokine (C-C motiv) ligand 5 (CCL5) type 2 diabetes mellitus (T2DM)
    Studere hypothalamus Insulin Signal perifere glukose intoleranse med kontinuerlig narkotika Infusjonssystem inn i musen hjernen
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Ajoy, R., Chou, S. Y. Studying theMore

    Ajoy, R., Chou, S. Y. Studying the Hypothalamic Insulin Signal to Peripheral Glucose Intolerance with a Continuous Drug Infusion System into the Mouse Brain. J. Vis. Exp. (131), e56410, doi:10.3791/56410 (2018).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter