Summary
Этот протокол исследования роли хемокиновых (C-C мотив) лигандом 5 (CCL5) в гипоталамусе, обеспечивая антагонист, встретилCCL5, в мозг мыши, с помощью микро осмотических насосов мозга инфузионные системы. Этот временный ингибирование активности CCL5 прервал гипоталамуса инсулина сигнализации, ведущих к глюкозе и чувствительность периферических системных инсулина.
Abstract
Инсулин регулирует систематические метаболизм в гипоталамусе и реакции периферической инсулина. Воспалительной реакции в периферических тканях жировой способствует развитию сахарного диабета (T2DM) тип 2 и регуляции аппетита в гипоталамусе. Хемокиновых CCL5 и C-C хемокиновых рецепторов типа 5 уровней (CCR5) было предложено выступить посредником атеросклероз и глюкозы нетерпимость в сахарный диабет типа 2 (T2DM). Кроме того CCL5 играет роль нейроэндокринных в гипоталамусе, регулируя питание потребление тела температуры и, таким образом, побудило нас расследовать его функцию гипоталамо инсулина сигнализации и регулирование метаболизма глюкозы периферийных.
Инфузионные системы микро осмотических насосов мозга является быстрый и точный способ манипулировать CCL5 функции и изучить его действие в головном мозге. Он также предоставляет удобный альтернативный подход к генерации нокаут трансгенных животных. В этой системе CCL5 сигнализации был заблокирован intracerebroventricular (ICV) настой его антагониста, встретилCCL5, с использованием микро осмотических насосов. Деятельность периферийных глюкозы метаболизм и инсулина был обнаружен устный тест толерантности глюкозы (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT). Сигнализации активность инсулина затем был проанализирован белка пятно от образцов тканей, полученных от животных.
После 7-14 дней встретилCCL5 вливания, метаболизм глюкозы и инсулина реагирования был поврежден в мышей, как показано в результатах ТТГ и МТС. Фосфорилирование serine302 IRS-1 был увеличен и активность акт был уменьшен в нейронов гипоталамуса мышей после CCL5 ингибирования. Вообще наши данные показывают, что блокирование CCL5 в мозг мыши повышает фосфорилирование S302 IRS-1 и прерывает гипоталамуса инсулина сигнализации, ведущих к снижению функции инсулина в периферических тканях, а также ухудшение глюкозы метаболизм.
Introduction
Инсулин влияет широкий спектр тканей, включая мозг. Инсулин проходит через гематоэнцефалический барьер, входит центральной нервной системы (ЦНС) и связывается с рецепторами инсулина (ИК) в гипоталамусе регулировать потребление пищи, симпатической активности и реакции периферической инсулина. Хроническое воспаление в периферических тканях жировой было предложено вносить типа 2 диабет (T2DM), но как эти воспалительные реакции влияют на инсулин сигналов в гипоталамусе посредничать системных инсулина ответ и глюкозы нетерпимость остается неясным. Некоторые chemokines участвуют в регуляции аппетита и регулирование температуры тела в гипоталамусе1 как фактор некроза опухоли альфа (TNFα), интерлейкина -6, ИЛ 1β, (IL) Моноцит хемотаксического белка-1 (МКП-1) и CCL5 (C-C мотив лигандом 5 ). Кроме того воспаление в гипоталамусе приводит к резистентности к инсулину в T2DM2,3.
Среди этих chemokines, изменения уровни выражения хемокиновых CCL5 и его рецептор CCR5, в жировых тканях был связан с атеросклерозом и глюкозы нетерпимость в T2DM людей, а также животных. CCL5 также имеет нейроэндокринной функции, включая регулирование всасывания и тела температуры пищи, в гипоталамусе. Поэтому важно расследовать ли CCL5 участвует в активации сигнала инсулина в гипоталамусе или периферических тканях.
Инсулин сигнализации жестко регулируется в пределах ячейки. Связывание инсулина в инсулиновых рецепторов (IR) активирует инсулина рецептор белков субстрата (IRS), следуют фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K) и протеин киназы B (PKB/AKT) активации и глюкозы транспортер-4 (GLUT4) мембраны транслокации4 . IRS белки являются ключевые регуляторы в этом сигнальный путь: они имеют несколько остатков тирозина и серина, которые могут быть фосфорилированных в ответ на позитивные или негативные инсулина сигналов5. К примеру фосфорилирование Серина 302 на IRS-1 могут привести к физической разобщенностью IRS-1 от ИК и блокировать инсулина сигнальной трансдукции, ведущих к инсулин сопротивление6. Было показано, что активность обесценения IRS белков в гипоталамусе побудить сопротивление инсулина и глюкозы нетерпимость в мышей7.
Один распространенный способ для изучения функции определенного гена является обработка экспрессии генов-мишеней распределены по всему телу организма. Однако, это может иметь несколько недостатков: 1) он может генерировать регулирования или компенсационные эффекты различных обратной связи со временем и 2) Этот метод не поможет нам проиллюстрировать роль целевого белка в регионах конкретных мозга. Кроме того животные Нокаут гена конкретных тканей и клеток занять много времени, чтобы породы и дорогостоящим. Таким образом мы используем краткосрочных мозга инфузионные системы осмотических насосов - относительно быстрый и удобный способ вмешиваться с сигнализацией целевого белка в головном мозге, используя антагонист наркотиков для преодоления вышеупомянутых вопросов. Стереотаксическая инъекции для требуют сложных хирургических навыков и обширные инвестиции в оборудование и время. В этом протоколе мы предоставляем простой и безопасный способ выполнения стереотаксической инъекций и быстрый, менее вредных и мгновенной метод определения концентрации глюкозы в крови и расследовать роль CCL5 в гипоталамо инсулина, сигнализации регулирования.
Protocol
Примечание: Все протоколы и методы, используемые в животных темы были одобрены институциональный уход животных и использование комитетов (IACUC) из Тайбэйского медицинского университета (протокол чисел: Лак-2014-0387)
1. Подготовка микро осмотических насосов инфузионных систем
Примечание: Подготовить насоса, искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) буфер и наркотиков (Met-CCL5/RANTES белка раствора (10 нг/мл в фаго)) в стерильных условиях, использование буферов, отфильтрованных с 0,2 мкм фильтры и проведение всех процедур под капотом культуры с перчатки. Процедур по хирургии проводятся следующим образом:
- Подготовьте микро осмотических насосов один день до операции: заполнить мозга микро осмотических насосов с искусственным спинномозговой жидкости (ФАГО) с 1 мл шприц и игла Блант голова, а также комплект. Погружать микро осмотических насосов в фаго и поместите его на шейкере и осторожно встряхивайте на ночь.
Предупреждение: Насос должен быть заполнен фаго, а пузырьки воздуха следует избегать внутри насоса (рис. 1A). - Перед началом операции, подготовьте рекомбинантных белков Met-CCL5/RANTES решение (10 нг/мл, разбавленных в фаго) для использования в эксперименте. Удаление фаго из насоса и заполните насос раствором препарата медленно до тех пор, пока избыток просачивается.
Примечание: 15 мл фаго или Met-CCL5/RANTES решения достаточно для 5-8 насосов.
Предупреждение: Повторите процедуру, чтобы убедиться, что насос полностью наполнен препарат без пузырьков внутри. - Нарезать нужной длины трубки катетера и прикрепите их с туп конца мозга настой иглы в комплект настой мозга. Заполните Инфузионный комплект и трубки с наркотиками.
- Наконец собрать и придавать микро осмотического насос Инфузионный комплект мозга.
Предупреждение: Не пузыри должны быть сформированы в трубку или насоса (рис. 1A). - Погружайте фьюжн весь осмотических насосов мозг, посреди фаго в стерилизованные 50 мл трубки для предотвращения насос от высыхания. Набор фьюжн осмотических насосов мозг теперь готов к использованию для хирургии.
Примечание: Микро осмотических насосов может использоваться для долгосрочного наркотиками вливания. Это гарантирует безопасный и удобный режим доставки наркотиков в мозг мыши.
2. внутримозговых желудочков хирургии – имплантация микро осмотического насоса
Предупреждение: Стерилизовать хирургические окружающей среды с 75% этанола и убедитесь, что людей, вовлеченных в исследования носят стерильные перчатки и чистой халате. Хирургические инструменты / инструменты должны быть газобетона и сушеные перед использованием и впоследствии стерилизованных с 75% этанола in-between мыши операции.
- Весят мыши и анестезировать его с помощью инъекций внутри брюшной полости (IP) с кетамином/Ксилазина (кетамин 50 мг/кг, Ксилазина 10 мг/кг).
Предупреждение: Не мышей веса ниже, чем 24 g рекомендуются для осмотических насосов хирургии и имплантации. - Монтировать и зафиксировать голову мыши на аппарате Стереотаксическая (рис. 1B).
- Используйте пару Ножницы хирургические и клещи для разрезать наружная кожа, охватывающих черепа. Используйте йода для очистки периферийных черепа.
- Отдельный внешний слой кожи от подкожных кожи с помощью пара пинцеты Блант голова вблизи области шеи для осмотических насосов мозг слияние набора имплантации (рис. 1 c).
- Марк точку инфузии со ссылкой на карту мозга (рис. 1 d), с помощью стереотаксических аппарата. В этом эксперименте, игла должна быть имплантированы в регионе желудочка 3rd (Bregma: боковые 0.0 мм, 1,3 мм задняя, 5,7 мм вентральной).
- Сверлить отверстия с помощью сверла ногтей вокруг области, отмеченные на череп (Рисунок 1E).
Предупреждение: Будьте осторожны, чтобы не сломать мыши мозговых оболочек и кровеносных сосудов, тем самым избегая нарушения микро кровеносных сосудов в мозге. - Поместите набор фьюжн микро осмотических насосов мозг, содержащий Фаго (как элемент управления) или наркотиков (Met-CCL5/RANTES раствор белка) под кожу позади шеи и вставки, настой мозг иглы в просверленное отверстие на настаиваться препарата в мозг мыши ( Рисунок 1E). Иглы прорезывают мозговых оболочек и попасть в желудочке. Исправьте иглу в месте на череп, используя десенсибилизирующее поверхности геля (Рисунок 1F) и подождать 1-2 мин, пока клей высохнет. Далее отрезать части проектирования на вершине иглы (рис. 1 g- H).
- Используйте ткани клей клей, чтобы залечить раны на голове операции. Применить 50 мкл клея на вершине рану, сблизить обе части кожи и держитесь за 30 s чтобы позволить кожи для уплотнения (Рисунок 1I).
Предупреждение: Используйте 100% спиртом салфеткой для очистки раны после операции и 100 ul пенициллин с стрептомицина для предотвращения инфекции. Примечание: Мыши кожи формируют рубцовую ткань и исцелить в течение нескольких дней после отправления хирургического клея. Основным преимуществом клей является недопущение хирургических швов, которые могут вызвать раздражение кожи или воспаления. - Место мыши в чистой клетке хранится на теплой плите (нагревают до 37 ° C) и подождать до тех пор, пока мышь восстанавливает обезболивающий эффект.
ВНИМАНИЕ: Очень важно для поддержания температуры тела мыши для повышения шансов на выживание после операции. - После одной недели восстановительный период мышей будет готова для дальнейших экспериментов, как устный тест толерантности глюкозы (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT).
3. устные глюкометра терпимости (ТТГ)
Примечание: Выполните тест на переносимость глюкозы устные через 7 дней после инфузии фаго и встретилCCL5/RANTES (10 нг/мл, 100 мкл). Поддерживать 6 h быстро для мышей до ТТГ с достаточной подачей воды. Держите животных на же рабочем месте, где будет осуществляться эксперименты, так что они может акклиматизироваться к окружающей среды для снижения стресса во время процедуры.
- Приготовления раствора глюкозы: перед проведением эксперимента, приготовляют раствор глюкозы, растворяя 3.75 g глюкозы в 15 мл дистиллированной H2O.
- Настройка графика для записи показаний в ходе экспериментальной процедуры (Таблица 1).
Примечание: Важно настроить таблицу времени с надлежащей интервалы между каждой исследование крови, чтобы позволить точная запись во время эксперимента. - Вес каждой мыши после поста и рассчитать необходимое количество глюкозы для инъекций.
- Глюкометр (нажмите кнопку Пуск для проверить состояние батареи, убедитесь, что он функционирует до испытания.)
- Глюкоза чип
- Инсулин шприц (0,3 мл шприц Инсулин)
- Лезвия бритвы
- Таймер
Примечание: Чип глюкозы требуется только одна капля крови. Когда образец крови необходимо собрать более чем один раз, просто приложите давление, запустив пальцы вдоль хвост мыши несколько раз придерживая конец хвоста непосредственно поверх чип для сбора крови. Это не нужно прорезать в хвосте каждый раз во время сбора образцов крови.
4. инсулин терпимости испытания (ITT)
Примечание: Тест толерантности инсулина и тест на переносимость глюкозы устные следует запланировать по меньшей мере 7 дней врозь уменьшить натощак эффект на животных. Для инсулина терпимости испытания (ITT) человеческого инсулина (0,75 U/кг) будет осуществляться через IP инъекции.
- Подготовка раствора 0,25 инсулина U: разбавить 100У человеческого инсулина в соотношении 1: 400 в солевой раствор.
- Вес каждой мыши после поста и рассчитать вводят количество инсулина соответственно: объем (мкл) 0,25 ед инсулина, чтобы быть введен IP = 3 X BW (0,75 U инсулин/кг веса тела). Например: для мыши весом 28,8 g, придать: 28,8 X 3 = 86,4 мкл (0,25 разбавленный ЕД инсулина) (Таблица 2).
Предупреждение: Же животных может иметь различные веса после 6 h поста в разные дни. Таким образом это необходимо для измерения веса тела прямо перед и после поста и поведения, которыми ОГТТ и ITT теста. Вес тела мыши может упасть в зависимости от видов, гендера и продолжительность голодания. Высшие дозы инсулина может вызвать инсулин шок и приведет к смерти животного. - Настройка таблицы (Таблица 2) для записи показаний в ходе экспериментальной процедуры. Повторите шаги 3.4. до 3,8. для измерения уровня глюкозы в крови.
Representative Results
Хирургической имплантации осмотического инфузионных насосов, содержащие либо фаго как антагонист CCL5 встретилCCL5 (чтобы блокировать эффекты CCL5 в мозге) или управления были проведены на мышей. На 7 и 14 дней после операции периферийных глюкозе и оперативности инсулина мышей были проанализированы с использованием ТТГ (после 7 дней) и МТС (после 14 дней), как указано в протоколе. Тест на переносимость глюкозы в устной (ТТГ) и инсулина терпимости испытания (ITT) мышей были выполнены после 6 часов голодания. Мышей были перорально с глюкозой, с суммой, основанный на их соответствующие веса. Изменения уровня глюкозы в крови были записаны, как показано на рисунке 3. Испытание чувствительности инсулина была исполнена внутрибрюшинной инъекции инсулина (IP) в мышей и изменение уровня глюкозы в крови измерялось немедленно. Изменения уровня глюкозы в крови после стимуляции инсулина в мышах с различных инфузионных препаратов были записаны, как показано на рисунке 4. Уровень глюкозы в крови незначительно сократилось после приема глюкозы (рис. 3B) и инъекций инсулина (рис. 4B) мышей с CCL5 настойка антагонист (МэтCCL5) по сравнению с мышей с фаго вливания. Эти результаты предлагают нарушениями функции инсулина на метаболизм глюкозы периферийных мышей с MetCCL5 осуществляется в головном мозге.
Далее мы проанализировали активации сигнала инсулина путем оценки IRS-1 фосфорилирования и Akt уровни активации гипоталамо тканей. Фосфорилирование Серина на 302 IRS-1 был upregulated у мышей, получавших антагонист (МэтCCL5) (Рисунок 5B-C) когда мышей кормили нормально. В контрольной группе, фаго был администрируемых мышей гипоталамус и инсулина задача активируется течению сигнальной молекулы Akt (Фосфорилированный Серин 473 Akt) (рис. 5 d, F) без увеличения IRS-1 (активации) serine302 Рисунок 5 d -E) и акт serine473 фосфорилирования. В противоположность этому Akt сигнал не был увеличен в мышей, infused с MetCCL5, но там было увеличение фосфорилирование Серина IRS-1 302 вместо. Тем временем блокирование CCL5 сигнал в мозг мыши прервана активность инсулина в гипоталамусе и нарушениями периферической инсулина функции. От наших общих выводов, например результаты от МТС, ТТГ и ex vivo вызов инсулина мы пришли к выводу, что CCL5 в гипоталамусе способствует активации сигнала инсулина и метаболизм глюкозы периферийных после стимуляции инсулина.
Рисунок 1. Осмотических насосов подготовки и имплантации хирургическая процедура в мышь. (A) мозг настой kit и насос подготовка увлажненную раствором препарата. Красные стрелки показывают катетер трубок, заполненных жидкостью. (B) исправить и горе мыши голову на стереотаксической аппарат. (C) отдельный внешний слой кожи от подкожных кожи для имплантации микро осмотических насосов мозг инфузионный набор; тире линии указывают расположение имплантатов осмотических насосов. (D) стрелка указывает сторону, настой. (E) сверло дыру вокруг выделенной области черепа. (F) места инфузии осмотических насосов мозг в задней части мыши и вставить иглу настой мозга в просверленное отверстие (кружил тире). (G) исправить иглы на череп, используя ткани клей клей и отсоединить верхней части иглы (ножницы остроконечные в G), как показано на (H). (я) печать с помощью раны ткань клей клей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Представитель изображения области распространения наркотиков, когда препарат вводят в регионе желудочков, используя осмотических насосов. Evan blue является представитель препарат, который используется в иллюстрации инфузии препарата осмотических насосов в регионе желудочков (A) и диффузии в третьего и боковых желудочков (B). Шкалы бар = 0.5 см. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рис. 3. Метаболизм глюкозы мышей после операции, измеряется устный тест на переносимость глюкозы (ТТГ). Распределение уровня глюкозы в крови изменены следующие перорального введения глюкозы в WT мышей infused с Фаго (A) и антагониста, МCCL5 (B). Данные, отображаемые как среднее ± SE. (рисунок от8). * p < 0,05, путем двустороннего ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Функция инсулина в мышей глюкозы в крови - тест толерантности инсулина (ITT). Распределение уровня глюкозы в крови изменилась после инъекции инсулина в WT мышей, infused с Фаго (A) и infused с антагонист, МCCL5 (B). Данные, представленные как среднее ± SE (рисунок от8). p < 0,001, в двусторонний ANOVA. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Инсулин сигнал активность мышей после хирургии. (A) Западный blotting ингибирующее формы фосфорилирование Серина 302 IRS-1 (инсулин ответ субстрата-1, pIRS1S302) в тканях мышей гипоталамус относились с фаго или CCL5 антагонист, встретилCCL5 (CCL5М) инфузионный насос. (B) соответствующих уровнейS302 фосфора IRS-1 после вливания в гипоталамусе мышей с нормального питания.(C) Западный blotting S302 фосфорилирования IRS-1 и Akt активации (люминофор акт S473, ПактS473) с или без инсулина стимуляции гипоталамуса ткани после фаго или вливание CCL5 встретился. (D-E) Относительные уровниS302Пирс-1, pS6KT421и ПактS473. («2» в каждой гистограммы означает: n = 2 для всех количественной). (Пустые бары в 5D-E, слева: без инсулина; полосы баров в 5D-E, право: с инсулином). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| # | ID мыши | Тело | Глюкоза | Начало | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| Вес | Мкл = 10xBW | время | мин. | мин. | мин. | мин. | мин. | ||
| 1 | 501 | 25.8g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
Таблица 1. Расписание записи устный тест толерантности глюкозы (ТТГ)
| # | ID мыши | Тело | Инсулин 0,25 МЕ | Начало | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| Вес | Мкл = 3xBW | время | мин. | мин. | мин. | мин. | мин. | ||
| 1 | 501 | 28.8g | 86,4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25.3g | 75,9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
Таблица 2. Расписание записи инсулина терпимости испытания (ITT)
Discussion
Механизма хронического воспаления и смежных chemokines как CCL5 и его рецептор-CCR5 в развитии диабета 2 типа остается неясным. Хроническое воспаление вызывает проникновение макрофагов в жировых тканях и влияет на регулирование адипокинов; в то же время она также привлекает β-клеток и препятствует секреции инсулина из островков Лангерганса в ответ на уровень глюкозы в крови. Гипоталамуса в мозге играет важную роль в качестве центра управления в координации инсулина и АдипоКин сигналы от системного периферических тканей в регулировании аппетита, периферической крови метаболизма глюкозы и инсулина ответ. Многие исследования также указывают, что гипоталамуса воспаление приводит к дефектных регулировании энергетического гомеостаза, а также дефектные поджелудочной островок функции печени2,3,9,10. CCL5 в мозге способствует питание потребление и тела регулирования температуры в гипоталамусе11,12; Однако неясно соотношение CCL5 к сигнализации гипоталамуса и системных инсулина. CCL5 всего тела нокаут мышь (CCL5- / -) был создан для решения этого вопроса, который показывает фенотип сопротивление инсулина с более высокие уровни инсулина и уровень глюкозы в крови в крови8. Однако он требует много времени, чтобы развивать T2DM фенотип и трудно расследовать роль и механизм CCL5 сигнала гипоталамуса инсулина из-за возможных долгосрочных компенсационных эффектов. Таким образом прямое манипулирование CCL5 сигнализации в нейронов гипоталамуса является лучшим подходом. Однако, есть несколько типов нейронов гипоталамуса региона, и это довольно дорогим и трудоемким для генерации клеток конкретных нокаут мышей. Используя ICV инфузионные системы может таким образом сэкономить время и обеспечить более конкретный подход для манипулирования CCL5 функции непосредственно в мозг, обходя возможные периферические воспалительные реакции.
Исследования с использованием осмотических насосов уже были опубликованы ранее, предоставляя большие примеры и демонстрации методов участвующих в имплантации осмотических насосов в грызунов13. Однако мы столкнулись с несколько задач, соблюдая эти протоколы в нашем исследовании. Во-первых некоторые из оборудования, используемого в протоколе довольно дорого, в том числе 1 электрические системы для достижения местоположения, рисование и вставляя иглу в мозг мыши, 2) Термо система для поддержания температуры тела мыши и 3 кислорода изофлюрановая Поставка системы администрирования анестезии для мышей. Во-вторых методы, описанные в других статьях были трудно повторить, потому что мы смогли только использовать животных в пределах небольшой диапазон веса тела и в некоторых возрастных группах для нашего исследования. Мы осознаем, что больше мышей больше подходят для хирургии и имплантации. Однако, в нашем исследовании, мы должны были использовать меньшие и более молодых мышей, чтобы избежать избыточного веса и эффекты старения на инсулин и крови глюкозы регулирования: только самцов мышей с телом вес 25 ± 2 g и возраст около 2 месяцев были выбраны в исследовании. Таким образом трудно выполнить операцию и шовные рану на голове мыши. В-третьих воспалительный процесс должен сворачиваться после операции, поскольку воспалительных цитокинов является мишенью в этом исследовании. Мышей и крыс можно удалить шов и легко открыть раны после операции, которая приведет к воспаления и увеличить хемокиновых реакций. Следовательно необходима стратегия достижения местоположение и рисовать и вставить иглу в мозг мыши, что позволяет избежать вторичной инфекции. Таким образом мы изменили ранее описанные протоколы, чтобы сделать этот метод экономически эффективным, легче и менее вредны для животных, как описано в следующем пункте.
Во-первых мы использовали ногтей дрель вручную просверлить отверстие вокруг целевой области, отмеченные на череп, как описано в пункте 2.6. Этот метод является экономически эффективным и позволяет нам контролировать всю процедуру таким образом, чтобы избежать повреждения мозговых оболочек мыши и кровеносных сосудов. Регулирование глюкозы крови ухудшается после острого инсульта, например кровоизлияния в мозг. Острой гипергликемии и диабет как синдромы также наблюдались после инсульта в клинических параметров14,15. Аналогичным образом мы также нашли зрением глюкозы уровня и инсулина ответ у мышей с кровотечением и гной в головном мозге. Мы осознаем, что лучшего контроля на основе ручной хирургии является необходимым для обеспечения согласованности результатов. Во-вторых мы воспользовались недавно разработанные медицинские биоматериала обычно используется в клиниках, ткань клей клей (шаг 2.8), для уплотнения кожи на голове мыши после хирургии, следовательно, избегая швов и ускорению заживления. Это упрощает хирургических процедур для выполнения и уменьшает вероятность вторичного воспаления. В-третьих время, необходимое для выполнения всей хирургическая процедура сравнительно короче, которая увеличивает шансы на выживание для мышей и снижает дозировку обезболивающий препарат, будучи вводили внутрибрюшинно. Мы отметил высокую выживаемость (95%) и получено после этого измененного Протокола относительно точные результаты.
Ограничением этой методики является сравнительно короткие сроки доставки лекарств. Хотя альтернативно осмотических насосов могут быть помещены в тело мыши без повторного открытия мозга, наше исследование только сосредоточена на воспалительные хемокиновых воздействие на мозг регулировать сигнализации периферийных системных инсулина. Дополнительные операции в периферических тканях возможно может вызвать воспалительные реакции в периферических тканях, которые бы затем увеличить экспрессия хемокиновых воспалительных и повлиять на результаты. Во-вторых период полувыведения препарата также ограничивает продолжительность исследования. Рекомбинантных белков например хемокиновых обычно имеют более короткий период полураспада, который теряет свою деятельность с течением времени, хотя это также позволяет нам изучить эффект блокировки CCL5 сигналов в головном мозге в краткосрочной перспективе. Наши предыдущие исследования также описал подход генетической модификации для генерации CCL5 нокаут мышь, которая предоставляет модель с долгосрочные эффекты8.
Есть некоторые новые методы и альтернативные методы для доставки наркотиков в мозг. Нанотехнологии – это мощный метод, который может использоваться для доставки наркотиков в центральной нервной системе. Однако многие препараты являются термочувствительных и могут быть уничтожены при попытке упаковать их в наночастиц16. Кроме того наночастицы могут пройти через BBB и быть освоен клетками, которые подходят для малых интерферирующих РНК или наиболее распространенных лекарств, но это не идеальный метод для привязки рецептор лиганд.CCL5 требует привязки к его рецептор CCR5, в ARC нейронов гипоталамуса принять эффект8, и доставки CCL5 антагонист CCL5 встретилсяв нейроны через наночастиц может привести к потере способности связывать и заблокировать CCR5 на ячейку поверхности.
Уровень глюкозы в крови был значительно выше у мышей, управляемых с CCL5-антагонист встретилCCL5 сравнению с элементами управления (мышей с фаго) в тест на переносимость глюкозы устные. Дополнительные инсулина администрации (тест толерантности инсулина) также смогла снизить уровень глюкозы в крови в MetCCL5 получения мышей (рис. 4B), что свидетельствует о том, что как внутреннего, так и внешние инсулин не может снизить уровень глюкозы в крови При блокировании гипоталамуса CCL5 сигнализации. Мышей стали устойчивыми инсулина без CCL5 активности в гипоталамусе. Увеличение serine302 фосфорилирования IRS-1 был найден в мышей, получающих Met-CCL5 по сравнению с управления мышей, получающих Фаго (Рисунок 5A-B). Фосфорилирование Серина 302 IRS-1 было показано, чтобы побудить физических диссоциации IRS-1 от рецепторов инсулина, который является одной из основных причин инсулин сопротивление6; инсулин не может активировать течению сигналов, таких как PI3K-Akt пути. Ex vivo исследования стимуляции инсулина подтвердил инсулина, которые ниже по течению сигнальной молекулы Akt (p-AktS473) не был активирован инсулина в гипоталамо ткани мыши infused с Met-CCL5 и, вместо этого, фосфорилирование Серина 302 увеличилось. В целом физиологических данных (ТТГ и ITT) и молекулярные исследования демонстрируют, что гипоталамуса CCL5 сигнализации опосредует регулирования сигнала гипоталамуса инсулина, который способствует систематической инсулин сопротивление и глюкозы метаболизма.
Роль и механизм CCL5 и CCR5 в связанных с ожирением диабетом остается неясным. Kitade et al. сообщили, что CCR5 дефицит защищенных мышей от ожирения индуцированной воспаления, макрофагов вербовки и инсулин сопротивление17. Однако другие исследования Кеннеди et al. найти противоположные результаты, указав, что CCR5 дефицит ухудшает системных глюкозе, а также Адипоцит и мышцы инсулина, сигнализации18. Оба исследования применяется высоким содержанием жиров диеты, чтобы вызвать ожирение, что приводит к хроническому воспалению всего тела и компенсаторные реакции. Эти исследования не представила чистые и ясные механизмы CCL5 и CCR5 в инсулине, сигнализации регулирования. С другой стороны метод осмотических насосов позволяет мозга конкретные инфузии и избегает компенсаторные реакции с ее ограниченное по времени доставки.
В заключение, хотя осмотического насос с мозга инфузионные системы, как представляется, «старомодным» техника, он обеспечить дешевле, проще и менее вредными метод доставки лекарств и помогает исследовать функцию лиганд-рецепторов сигналов в мозг.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы благодарны поддерживаемых от министерства науки и технологии, Тайвань – MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) и здравоохранения и социального обеспечения за дополнительную плату табачных изделий - MOHW106-TDU-B-212-144001 с S-Y.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
