Summary
Bu iletişim kuralı bir antagonisti, MetCCL5, bir mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi kullanarak fare beyin içine sunarak Kemokin (C-C motifi) ligand 5 (CCL5) üzerindeki rolünü inceliyor. CCL5 faaliyet geçici bu inhibisyon sinyal, glukoz intoleransı ve periferik sistemik insülin duyarlılık için lider hipotalamik insülin kesildi.
Abstract
İnsülin hipotalamus ve periferik insülin yanıt sistematik metabolizmasını düzenleyen. İnflamatuar reaksiyon periferik yağ dokularında tip 2 diabetes mellitus (T2DM) geliştirme ve iştah yönetmelik üzerindeki katkıda bulunur. Kemokin CCL5 ve C-C Kemokin reseptör tip 5 (CCR5) düzeyleri tip 2 diabetes mellitus (T2DM) damar sertliği ve glikoz intoleransı arabuluculuk önerdi. Buna ek olarak, CCL5 bir nöroendokrin rol içinde hipotalamus gıda alımı ve vücut sıcaklığı, böylece, düzenleyen tarafından bize hipotalamik insülin sinyal de onun işlevi ve periferik glikoz metabolizmasının araştırmak için isteyen oynar.
Mikro-ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi CCL5 işlevi değiştirmek ve etkisi beyin çalışma için hızlı ve hassas bir yoludur. Ayrıca bir transgenik nakavt hayvan üreten uygun alternatif bir yaklaşım sağlar. Bu sistemde CCL5 sinyal bir mikro-ozmotik pompa kullanarak intracerebroventricular (ICV) infüzyonu kendi antagonisti, MetCCL5, tarafından engellendi. Periferik glikoz metabolizması ve insülin yanıt Oral glikoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) tarafından tespit edildi. Etkinlik sinyal insülin sonra Doku örneklerinden hayvanlardan elde edilen protein leke tarafından analiz edildi.
7-14 gün sonra MetCCL5 infüzyon, glikoz metabolizması ve insülin yanıt farelerde, ITT ve OGTT sonuçlarına görüldüğü gibi Engelli. IRS-1 serine302 fosforilasyon yükseltilmiştir ve Akt faaliyet CCL5 inhibisyon takip fareler hipotalamik nöronlarda düşürüldü. Özet olarak, bizim veri CCL5 fare beynindeki engelleme IRS-1 S302 fosforilasyon artırır ve hipotalamik insülin sinyal, glikoz bozulma yanı sıra periferik dokularda insülin işlevinde azalma önde gelen kesmeleri öneririm metabolizma.
Introduction
İnsülin doku beyin de dahil olmak üzere çok çeşitli etkiler. İnsülin kan - beyin bariyerini geçer, merkezi sinir sistemi (MSS) girer ve insülin reseptör (IR) ile hipotalamus gıda alımı, sempatik aktivite ve periferik insülin yanıt düzenleyen bağlar. Periferik yağ dokularında kronik inflamasyon 2 diabetes mellitus (T2DM) yazmak için katkıda bulunmak için teklif edildi ama bu inflamatuar reaksiyonları insülin etkilemesi hipotalamus sistemik insülin yanıt ve glukoz intoleransı arabuluculuk sinyalleri belirsizdir. Bazı kemokinler iştah düzenlemesi ve vücut sıcaklık regülasyonu gibi tümör nekrozis faktör-alfa (TNFα), İnterlökin (Il) -6, IL-1β, hipotalamus1 katılmak monosit chemoattractant protein-1 (MCP-1) ve CCL5 (C-C motifi ligand 5 ). Buna ek olarak, hipotalamus iltihabı insülin direnci T2DM2,3yol açar.
Bu kemokinler, Kemokin CCL5 düzeyde ifade değişiklik ve onun reseptör arasında CCR5, içinde yağ doku T2DM damar sertliği ve glikoz intoleransı insanlar hem de hayvanlar ile ilişkili olduğu düşünülmektedir. CCL5 aynı zamanda gıda alımı ve vücut sıcaklığı, düzenlenmesi hipotalamus dahil nöroendokrin işlevleri vardır. Böylece CCL5 hipotalamus veya periferik dokularda insülin sinyal harekete geçirmek katılan olup olmadığını araştırmak önemlidir.
İnsülin sinyal hücrelerde sıkı bir şekilde düzenlenir. İnsülin-insülin reseptörleri (IR) bağlama insülin reseptör substrat (IRS) proteinler, ardından phosphatidylinositol 3-kinaz (PI3K) ve protein kinaz B (PKB/AKT) etkinleştirme ve glukoz taşıyıcı-4 (GLUT4) membran translocation4 etkinleştirir . IRS proteinlerdir bu sinyal yolu anahtar düzenleyiciler: onlar-si olmak yanıt pozitif olarak fosforile birden çok tirozin ve serin artıkları veya negatif insülin sinyalleri5. Örneğin, serin 302 fosforilasyon IRS-1 IRS-1 fiziksel ayrışma için IR yol ve insülin sinyal iletimi, insülin direnci6için önde gelen blok. IRS proteinler üzerindeki aktivite bozukluğu insülin direnci ve glikoz intoleransı fareler7neden olduğu gösterilmiştir.
Belirli bir gen işlevini incelemek için bir ortak organizmanın tüm vücutta dağıtılan hedef genlerin ifade manipülasyon yoludur. Ancak, bu çeşitli sakıncaları olabilir: 1) o zaman içinde farklı geribildirim Düzenleyici veya telafi edici etkileri üretebilir ve 2) bu yöntem bize belirli beyin bölgeleri hedef protein rolünü göstermek yardımcı olmuyor. Ayrıca, doku ve hücre özel gen nakavt hayvan üremek için uzun zaman alabilir ve yüksek maliyetlidir. Böylece, bir kısa vadeli beyin infüzyon ozmotik pompa sistemi - bahsedilen sorunların üstesinden gelmek için antagonist ilaç kullanarak beyin hedef protein sinyal ile müdahale için nispeten hızlı ve uygun bir yol kullanın. Stereotaksik enjeksiyonları karmaşık cerrahi beceri ve geniş yatırım araçları ve zaman gerektirir için kullanılır. Bu protokol için biz stereotaksik enjeksiyon ve kan glukoz konsantrasyonu algılamak ve hipotalamik insülin yönetmelik sinyal CCL5 rolünde araştırmak için hızlı, daha az zararlı ve anlık yöntemi gerçekleştirmek için basit ve güvenli bir yöntem sağlar.
Protocol
Not: Tüm iletişim kuralları ve yöntemleri hayvan bireylerde kullanılan kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC), Taipei Tıp Üniversitesi tarafından onaylanmıştır (protokol numaraları: LAC-2014-0387)
1. mikro-ozmotik pompa infüzyon sistemleri hazırlanması
Not: pompa, yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) arabellek ve uyuşturucu (Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL aCSF)) steril koşullarda 0.2 µm filtreleriyle filtre arabellekleri kullanarak hazırlamak ve tüm prosedürleri ile Kültür örtünün altında kuralları eldiven. Cerrahi prosedürler aşağıdaki gibi yapılır:
- Ameliyattan önce bir gün mikro ozmotik pompalar hazırlamak: beyin mikro ozmotik pompa yapay beyin omurilik sıvısı (aCSF) ile 1 mL şırınga ve kit ile birlikte sağlanan künt kafa iğne ile doldurun. ACSF içinde mikro ozmotik pompa bırakın ve bir shaker yerleştirin ve nazikçe gecede sallamak.
Dikkat: Pompa aCSF ile doldurulmalıdır ve pompa (şekil 1A) içinde hava kabarcıkları kaçınılmalıdır. - Ameliyat başlamadan önce rekombinant Met-CCL5/RANTES protein çözüm (10 ng/mL, içinde seyreltilmiş aCSF) denemede kullanılmak üzere hazırlayın. ACSF pompası kaldırmak ve aşırı sızıntıları pompa ile uyuşturucu çözüm yavaş yavaş dolduramazsınız.
Not: 15 mL aCSF veya Met-CCL5/RANTES çözüm 5-8 pompalar için yeterli olur.
Dikkat: pompa tamamen baloncuklar içinde olmadan uyuşturucu dolu emin olmak için yordamı yineleyin. - Kateter tüpler istenilen boy kesme ve künt uçlu beyin infüzyon iğne beyin infüzyon seti ile ekleyebilirsiniz. İnfüzyon seti ve borular ile uyuşturucu doldurun.
- Son olarak, montaj ve beyin infüzyon seti için mikro-ozmotik pompa iliştirin.
Dikkat: Hava kabarcığı yok tüp veya pompa (şekil 1A) oluşmuş olmalıdır. - ACSF steril 50 mL tüp içinde pompa kurumasını önlemek için belirlenen tüm ozmotik pompa-beyinli füzyon bırakın. Ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi Şimdi ameliyat için kullanılmak üzere hazırdır.
Not: Mikro-ozmotik pompa sistemleri uzun süreli ilaç infüzyonu için kullanılabilir. Bu ilaç dağıtım fare beyin içine güvenli ve kolay modu sağlar.
2. intraserebral ventrikül cerrahi-mikro ozmotik pompa implantasyonu
Dikkat: % 75 etanol ile cerrahi çevre Sterilize ve çalışmaya dahil insanlar steril eldiven ve temiz önlük giyiyorsun emin olun. Cerrahi alet / aletler autoclaved ve kurutulmuş kullanmadan önce ve daha sonra % 75 etanol arasında fareler ameliyatları ile sterilize edilmiş olması gerekir.
- Fare tartmak ve intra Periton enjeksiyon (IP) ketamin/Xylazine ile kullanarak anestezi (ketamin 50 mg/kg, Xylazine 10 mg/kg).
Dikkat: Fareler vücut ağırlıkları 24 g alt ozmotik pompa implantasyonu ameliyatı için tavsiye edilmez. - Dağ ve stereotaktik cihaz (şekil 1B) üzerine fare kafa düzeltmek.
- Bir çift Cerrahi makas ve kerpeten kafatası kapsayan dış deri açık kesmek için kullanın. İyot periferik kafatası temizlemek için kullanın.
- Derinin en dış tabakası subkutan deri boyun bölgesi yakınındaki künt kafa kerpeten ozmotik pompa-beyinli füzyon set implantasyon (şekil 1 c) için bir çift yardımı ile ayırın.
- İnfüzyon noktası ile referans için stereotaktik cihaz kullanarak beyin Haritası (şekil 1 d) işaretleyin. Bu deneyde, iğne 3rd ventrikül bölgede implante olması gerekiyor (Bregma: 0.0 mm lateral, 1.3 mm arka, 5.7 mm ventral).
- Kafatasında (şekil 1E) işaretli alanı çevresinde bir çivi matkap kullanarak bir delik.
Dikkat: fare meninkslerde ve kan damarları, böylece bozulma beyindeki mikro-kan damarlarının kaçınarak kırmak dikkatli olun. - ACSF (kontrol) olarak ya da ilaç (Met-CCL5/RANTES protein çözüm) beyin infüzyon iğne ilaç fare beyin ( demleyin delinmiş deliğe boyun bölgesi ve INSERT arkasındaki deri altında bulunduğu mikro ozmotik pompa-beyinli füzyon kümesi yerleştirin Rakam 1E). İğne meninkslerde nüfuz ve ventrikül almak. İğneyi yerinde yüzey desensitizing jel (şekil 1F) kullanarak kafatasında düzeltmek ve tutkal kurur kadar 1-2 dakika bekleyin. Daha sonra iğne (şekil 1G- H) üstünde çıkıntılı bölüm kesti.
- Bir doku yapıştırıcı tutkal işleminin başında yara iyileşmesi için kullanın. Yaranın üstüne tutkal 50 µL uygulamak, her iki cilt birlikte çekin ve 30'dur (şekil 1I) imzalamaya cilt izin için s.
Dikkat: %100 alkol takımını cerrahi ve 100 ul penisilin enfeksiyonu önlemek için streptomisin ile sonra yara temizlemek için kullanın. Not: Fare cilt skar dokusu oluştururlar ve cerrahi tutkal yönetimini takiben birkaç gün içinde iyileşir. Ana tutkal cilt tahriş veya iltihap neden olabilecek cerrahi dikiş kaçınma avantajdır. - Fareyi temiz bir kafeste tuttu sıcak bir tabağa yer (37 ° C'ye kadar ısıtılır) ve anestezik etkisi fare normale dönene kadar bekle.
Dikkat: Bu ameliyattan sonra hayatta kalma şansını artırmak için fare vücut ısısını korumak için önemlidir. - Bir haftalık iyileşme süresi sonra farelerin Oral glikoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) gibi daha fazla deneyler için hazır olacak.
3. oral glukoz tolerans testi (OGTT)
Not: oral glukoz tolerans testi 7 gün sonra aCSF ve MetCCL5/RANTES (10 ng/mL, 100 µL) infüzyonu gerçekleştirin. 6 h OGTT önce fareler ile yeterli su temini için hızlı korumak. Hayvanlar işlem sırasında stresi azaltmak için çevreye parkenizin böylece nerede deneyler yapılır aynı tezgah üzerinde tutun.
- Glikoz eriyik Hazırlığı: deneme gerçekleştirmeden önce glikoz çözüm 3.75 g çözülerek 15 mL distile H2o glikoz hazırlamak
- Okumalar deneysel işlem sırasında (Tablo 1) kaydetmek için bir takvim kadar ayarla.
Not: Saatleri arasında her kan sınav deneme sırasında kayıt doğru izin vermek için uygun aralıklarla ayarlamak önemlidir. - Oruç sonra her fare tartmak ve glikoz enjekte edilir uygun miktarını hesaplamak.
- Şeker Ölçüm (pil durumunu denetlemek için önce test çalıştığından emin olun Başlat düğmesine basın.)
- Glikoz çip
- İnsülin şırınga (0.3 mL insülin şırınga)
- Jilet
- Zamanlayıcı
Not: Sadece bir damla kan glikoz çip gerekir. Kan örneği birden çok kez toplanması gereken zaman, sadece doğrudan kan toplamak için küçük parça üzerine kuyruk sonuna tutarken parmaklarını fare kuyruk boyunca birkaç kez çalıştırarak basınç uygulayın. Kan örnekleri toplarken her zaman arka uç kesmek gerekli değildir.
4. insülin tolerans testi (ITT)
Not: İnsülin tolerans testi ve oral glukoz tolerans testi en az 7 gün arayla hayvanlar üzerinde açlık etkisini azaltmak için zamanlanması gerekir. İnsülin tolerans testi için (ITT) insan insülin (0,75 U/Kg) IP sızdırma yoluyla yönetilen.
- 0,25 U insülin çözüm hazırlanması: seyreltik 100U insan insülin 1: 400 tuzlu çözüm oranı.
- Oruç sonra her fare tartmak ve buna göre insülin enjekte miktarı hesaplamak: IP için 0,25 U insülin hacmi (µL) enjekte = 3 X BW (0,75 U insülin/Kg vücut ağırlığı). Örneğin: 28,8 g ağırlığında bir fare için enjekte: 28,8 X 3 = 86,4 µL (0,25 seyreltilmiş U insülin) (Tablo 2).
Dikkat: 6 farklı günlerde oruç h sonra farklı vücut ağırlıkları aynı hayvanlar olabilir. Böylece, önce ve sonra oruç ve OGTT ve ITT test kuralları vücut ağırlığı ölçmek gereklidir. Fare vücut ağırlığı tür, cinsiyet ve açlık süresi bağlı olarak bırakın. Daha yüksek dozlarda insülin, insülin şok neden olabilir ve hayvanın ölümüne yol açacak. - Okuma sırasında deneysel bir işlem kaydetmek için bir tablo (Tablo 2) ayarlayın. 3.4 adımları yineleyin. 3.8 için. Ölçüm kan şekeri düzeyleri için.
Representative Results
Denetim veya (CCL5 etkileri beyin engellemek için) CCL5 antagonisti MetCCL5 olarak her iki aCSF içeren ozmotik infüzyon pompa cerrahi takılan fareler üzerinde yapılmıştır. Ameliyat sonrası 7 ila 14 gün periferik glukoz ve insülin yanıt farelerin OGTT (7 gün sonra) ve ITT (14 gün sonra) iletişim kuralında belirtildiği gibi kullanarak analiz edildi. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) ve insülin tolerans testi (ITT) farelerin oruç 6 saat sonra yapıldı. Fareler glikoz ile sözlü, onların anılan sıraya göre vücut ağırlıkları üzerinde temel alan tutarı ile yönetilen. Şekil 3' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri değişiklikleri kaydedildi. İnsülin duyarlılık testi fareler içine mayi (IP) insülin enjeksiyon tarafından gerçekleştirilmiş ve kan şekeri düzeyini Değiştir hemen ölçüldü. Şekil 4' te gösterildiği gibi kan şekeri düzeyleri insülin stimülasyon farklı infüzyon ilaçlarla farelerde üzerine değişiklikler kaydedildi. Kan glikoz düzeyi sadece biraz glikoz Yönetim (şekil 3B) ve insülin enjeksiyon (şekil 4B) farelerde aCSF infüzyon ile fareler karşılaştırıldığında CCL5 antagonisti (MetCCL5) infüzyon ile sonra düşürüldü. Bu sonuçlar ile MetCCL5 beyinde yönetilen insülin işlevini farelerde periferik glikoz metabolizması bozuklukları öneririz.
Daha sonra analiz ettik insülin sinyal aktivasyonu IRS-1 fosforilasyon ve Akt harekete geçirmek düzeyleri hipotalamik dokularda değerlendirerek. 302 üzerinde serin fosforilasyonu IRS-1'in upregulated antagonisti (MetCCL5) ile tedavi farelerde yapıldı (şekil 5B-C) ne zaman fare beslenen normalde. Kontrol grubunda aCSF fareler hipotalamus idare ve insülin meydan aşağı akım sinyal molekülü Akt (fosforile Akt serin 473) aktif (şekil 5 d, F) artan IRS-1 serine302 harekete geçirmek () olmadan Şekil 5 d -E) ve Akt serine473 fosforilasyon. Buna ek olarak, Akt sinyal MetCCL5 ile infüzyon farelerde artmış değil, ama bunun yerine IRS-1 serin 302 fosforilasyon bir artış oldu. Bu arada, fare beynindeki CCL5 sinyali engelliyor insülin aktivitesi hipotalamus ve zayıflatmak periferik insülin fonksiyon kesildi. Bizim genel bulgular, ITT, OGTT ve ex vivo insülin meydan, sonuçlarından gibi gelen CCL5 üzerindeki insülin sinyal harekete geçirmek ve periferik glikoz metabolizması insülin stimülasyon üzerine yaptığı katkının sonucuna vardı.
Şekil 1. Ozmotik pompa hazırlık ve implantasyon cerrahi prosedürde fare. Uyuşturucu Çözümle periosteum (A) beyin infüzyon seti ve pompa hazırlık. Kırmızı oklar, sıvı kristal ile kateter tüpler gösterir. (B) düzeltmesi ve mount stereotaktik cihaz üzerine fare kafa. (C) ayrı mikro ozmotik pompa-beyinli infüzyon seti implantasyonu için subkutan deri derinin en dış katmanı; Dash çizgiler ozmotik pompa implantlar konumunu gösterir. (D) oku infüzyon yan gösterir. (E) matkap kafatası üzerinde işaretli çevresinde bir delik. (F) yer ozmotik pompa-beyinli infüzyon fare arkasına ayarla ve beyin infüzyon iğne delinmiş deliğe (Daire içinde çizgi) ekleyin. (G) doku yapıştırıcı tutkal kullanarak kafatası üzerine iğne düzeltmek ve (H) gösterildiği gibi (sivri uçlu makas G) iğne üst ayır. (ben) mühür yara kullanarak doku yapıştırıcı tutkal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2. İlaç ozmotik pompa kullanarak ventrikül bölgede yönetilen zaman uyuşturucu Difüzyon alanında temsilcisi görüntüler. Evan'ın mavi ozmotik pompa uyuşturucu infüzyon illüstrasyon ventrikül bölgeye(a)ve (B) yan ve üçüncü ventrikül içine Difüzyon kullanılan temsilcisi ilaçtır. Ölçek çubuğu 0.5 cm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3. Oral glukoz tolerans testi (OGTT) tarafından ölçülen ameliyattan sonra farelerin glikoz metabolizması. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi glikoz WT farelerde sözlü yönetim infüzyon aCSF(a)ve antagonisti, MCCL5 ile aşağıdaki (B). Ortalama ± SE. (şekil8değişiklik) olarak gösterilen veriler. * p < 0,05, iki yönlü ANOVA tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4. İnsülin fareler kan glikoz - insülin tolerans testi (ITT) işlevinde. Kan şekeri düzeyleri dağılımı değiştirildi insülin enjeksiyon aCSF(a)ile infüzyon WT farelerde takip ve antagonisti ile MCCL5 infüzyon (B). Ortalama ± SE (şekil8değişiklik) olarak sunulan veri. p < 0,001, iki yönlü ANOVA tarafından. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5. İnsülin sinyal etkinliğinde ameliyat sonrası fareler. (A)şeklinde inhibitör serin 302 fosforilasyon IRS-1 (insülin yanıt substrat-1, pIRS1S302) fareler hipotalamus dokularda Western Blot tedavi aCSF veya CCL5 antagonisti, MetCCL5 ile (MCCL5) infüzyon pompası. (B) fosfor-IRS-1S302 normal beslenme ile fareler hipotalamus infüzyon sonra ilgili düzeyde.(C) IRS-1 ve Akt etkinleştirme (fosfor-Akt S473, pAktS473) veya aCSF veya METCCL5 infüzyon sonra hipotalamik dokusunda insülin stimülasyon olmadan S302 fosforilasyon Western Blot. (D-E) PIRS-1S302, pS6KT421ve pAktS473göreli düzeyde. ("2" yapılan her çubuk grafik açılımı: n = 2 tüm quantifications için). (5D-E, boş barlarda yaptı: insülin; 5D-E, şeritler barlarda sağ: insülin ile). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| # | Fare kimliği | Vücut | Glikoz | Başlat | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| ağırlık | μl 10xBW = | zaman | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ||
| 1 | 501 | 25,8 g | 258 | 9:00 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 |
| 2 | 502 | 25.3g | 253 | 9:07 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 |
Tablo 1. Oral glikoz tolerans testi (OGTT) kayıt için takvim
| # | Fare kimliği | Vücut | İnsülin 0,25 IU | Başlat | 0 | 15 | 30 | 60 | 90 |
| ağırlık | μl 3xBW = | zaman | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ortaçağ halk ozanı | ||
| 1 | 501 | 28,8 g | 86,4 | 9:00 | 9:00 | 9:15 | 9:30 | 10:00 | 10:30 |
| 2 | 502 | 25.3g | 75.9 | 9:07 | 9:07 | 9:22 | 9:37 | 10:07 | 10:37 |
Tablo 2. İnsülin tolerans testi (ITT) kayıt için takvim
Discussion
Kronik inflamasyon ve CCL5 ve onun reseptör-gibi ilgili kemokinler mekanizmasının CCR5 tip-2 diyabet gelişiminde belirsizdir. Kronik inflamasyon makrofaj infiltrasyonu yağ dokuları içine neden olur ve adipokines Yönetmeliği etkiler; Bu arada, aynı zamanda β-hücreleri çekiyor ve insülin salgılanması adacıkları of Langerhans kan şekeri yanıt olarak gelen bozar. Beyindeki hipotalamus iştah, periferik kan glikoz metabolizması ve insülin yanıt düzenlenmesinde sistemik periferik dokularda insülin ve adipokine sinyalleri yönetiminde bir kontrol merkezi olarak önemli bir rol oynar. Birçok çalışma da hipotalamik iltihap enerji homeostasis gibi arızalı pankreas adacık ve karaciğer fonksiyon2,3,9,10kusurlu düzenlenmesi için yol gösterir. CCL5 beyindeki hipotalamus11,12gıda alımı ve vücut sıcaklık regülasyonu katkıda bulunur; Ancak, hipotalamik ve sistemik insülin sinyal için CCL5 korelasyon belli değildir. Bir CCL5 tüm vücut nakavt fare (CCL5- / -) daha yüksek insülin seviyeleri ve yüksek kan şekeri düzeyleri ile bir insülin direnci fenotip kan8' gösterir bu soru adresi üretti. Ancak, T2DM fenotip geliştirmek için uzun zaman gerektirir ve rol ve CCL5 mekanizma olası uzun vadeli telafi edici etkileri nedeniyle hipotalamik insülin sinyalinde araştırmak zordur. Bu nedenle, hipotalamik nöronlarda sinyal doğrudan manipülasyonu CCL5 en iyi yaklaşımdır. Var, ancak, hipotalamik bölge neurons birden çok tür ve oldukça pahalı ve zaman alıcı hücre belirli nakavt fareler oluşturmak. Bir ICV kullanan infüzyon sistemi böylece zamandan tasarruf ve olası çevresel iltihabi reaksiyonlar atlayarak CCL5 işlevi doğrudan beyindeki işlemek için daha açık bir yaklaşım sağlayın.
Ozmotik pompalar kullanan çalışmalar zaten daha önce büyük örnekler ve gösteriler teknikleri kemirgenler13' te ozmotik pompalar implantasyonu dahil sağlayan yayınlanmıştır. Ancak, bu iletişim kuralları çalışma aşağıdaki sırada birkaç zorlukla karşılaştı. İlk olarak, bazı iletişim kuralında kullanılan ekipman oldukça pahalı, çizim ve fare beyin, fare vücut ısısı ve 3) oksijen isoflurane korumak için 2) termo sistemi içine iğne ekleme konuma ulaşmak için 1) elektrik sistemi dahil Anestezi fareler için yönetmek için sistem kaynağı. İkinci olarak, diğer makalelerinde açıklanan teknikleri biz sadece bizim çalışma için hayvanların vücut ağırlıkları ve belirli yaş küçük bir aralık içinde kullanmak başardık çünkü çoğaltmak zordu. Daha büyük fareler cerrahi ve implantasyon için daha uygun olduğu. Ancak, bizim çalışmada, daha genç ve daha küçük fareler kilolu ve insülin ve kan glikoz yönetmelik yaşlanma etkileri önlemek için kullandık: 25 ± 2 g ve yaş erkek fare ile vücut ağırlığı sadece yaklaşık 2 ay eski çalışma odasında seçilmiştir. Böylece, ameliyat ve yara fare kafasına dikiş zordur. Üçüncü olarak, inflamatuar yanıt bir inflamatuar sitokin bu çalışmada hedef olduğu için ameliyattan sonra en aza vardır. Fare ve sıçanlar dikiş çıkarın ve açık yaralar kolayca iltihap neden ve Kemokin reaksiyonlar artışı ameliyattan sonra. Bu nedenle, bir strateji konumu ulaşmak ve çizmek ve iğne ikincil enfeksiyonu önler fare beyin eklemek için gereklidir. Bu nedenle, bu tekniği maliyet etkin, daha kolay ve daha az aşağıdaki paragrafta açıklandığı gibi hayvanlar için zararlı hale getirmek için yukarıda açıklanan iletişim kuralları değiştiren.
İlk olarak, biz el ile bir kafatası üzerinde işaretlenmiş hedef alan çevresinde 2.6 adımda anlatıldığı gibi delik için bir çivi matkap kullanılır. Bu yöntem, uygun maliyetli ve fare meninkslerde ve kan damarları zarar görmesini önlemek için tüm yordamı izlemek için bize izin verir. Kan glikoz yönetmelik akut inme, beyin kanaması gibi sonra bozulmuş. Akut hiperglisemi ve şeker hastalığı benzeri sendromlar da klinik ayarları14,15vuruş sonra tespit edildi. Benzer şekilde, ayrıca bozulmuş glikoz düzeyi ve insülin yanıt kanama ve irin ile farelerde beyin bulduk. Biz daha iyi kontrol el kitabı tabanlı cerrahi sonuçları tutarlılığını sağlamak için gerekli farkındayız. İkinci olarak, biz yeni geliştirilmiş bir tıbbi biomaterial cilt mühür için klinikler, doku yapıştırıcı tutkal (Adım 2.8), yaygın olarak kullanılan fare kafasına ameliyatı takiben, bu nedenle, dikiş kaçınarak ve iyileşme hızı hızlandırılması kullandı. Bu cerrahi işlemler gerçekleştirmek kolaylaştırır ve ikincil iltihap riskini azaltır. Üçüncü olarak, hangi fareler için hayatta kalma şansını artırır ve intraperitoneally enjekte anestezik ilaç dozu düşürür nispeten daha kısa, tüm cerrahi işlem gerçekleştirmek için gereken zamanı geldi. Biz yüksek sağkalım oranı (% 95) gözlenen ve değiştirilmiş bu iletişim kuralı takip ederek nispeten doğru sonuçlar elde.
Bu teknik oldukça kısa süre ilaç dağıtım kısıtlamasıdır. Her ne kadar beyin, bizim çalışma sadece yeniden açılması periferik sistemik insülin sinyal düzenleyen beyin inflamatuar Kemokin etkisi üzerinde duruluyor olmadan bir ozmotik pompa fare vücuda alternatif olarak yerleştirilebilir. Ek cerrahi periferik dokularda muhtemelen sonra inflamatuar Kemokin ifade artırmak ve sonuçları etkileyebilecek periferik dokularda iltihabi bir tepki neden. İkinci olarak, ilaç half-life de çalışma süresini sınırlar. Kemokin gibi rekombinant proteinler genellikle aynı zamanda beyin ve kısa vadede sinyal engelleme CCL5 etkisini incelemek için bize izin verir ama hangi faaliyete zaman içinde kaybeder bir daha kısa yarılanma ömrü var. Önceki çalışmalarımız da uzun vadeli etkileri8ile bir modelini sağlayan bir CCL5 nakavt fare oluşturmak için bir genetik değişiklik yaklaşım anlatmıştık.
Bazı yeni teknikleri ve uyuşturucu beyine sunmak için alternatif yöntemler vardır. Nanoteknoloji olan merkezi sinir sistemi uyuşturucu dağıtmak için kullanılan güçlü bir tekniktir. Ancak, birçok ilaç thermosensitive ve onları nano tanecikleri16paketlemek çalışırken yok edilebilir. Buna ek olarak, nano tanecikleri BBB geçmek ve siRNA veya en yaygın uyuşturucu için uygun olan hücreler tarafından uptaken olabilir, ama ligand-reseptör bağlamak için ideal bir yöntem değildir.CCL5 etkisi8, almaya hipotalamus ARC nöronlar içinde onun reseptör CCR5, bağlama gerektirir ve CCL5 antagonisti MetCCL5 nöronlar nano tanecikleri ile içine teslimini yeteneği bağlamak ve CCR5 hücre block kaybına neden olabilir yüzey.
Kan şekeri düzeyini önemli ölçüde daha yüksek oral glukoz tolerans testi CCL5-antagonist MetCCL5 denetimleri (aCSF ile yönetilen fareler) karşılaştırıldığında ile yönetilen farelerde. Ek insülin Yönetim (insülin tolerans testi) da fareler (şekil 4B), alma endojen ve dış insülin kan şekeri düzeylerini azaltmak olamaz öneriyor kan şekeri düzeyini MetCCL5 içinde alt edemedi hipotalamik CCL5 sinyal engelleme zaman. Fareler üzerindeki CCL5 etkinliği olmayan insülin dayanıklı oldu. Artan serine302 fosforilasyon IRS-1 Met-CCL5 aCSF (şekil 5A-B) alma kontrol fareler için karşılaştırıldığında alma farelerde bulundu. Serin 302 fosforilasyon IRS-1 IRS-1 bir fiziksel ayrışma insülin direnci6önemli bir nedeni insülin reseptör üzerinden neden olduğu gösterilmiştir; insülin PI3K-Akt yolu gibi aşağı akım sinyalleri etkinleştirmek değiştiremiyor. Bir ex vivo insülin stimülasyon çalışma aşağı akım sinyal molekülü Akt (p-AktS473) fare hipotalamik dokusunda insülin tarafından etkinleştirilemedi insülin Met-CCL5 ile infüzyon ve bunun yerine, serin 302 fosforilasyon arttı doğruladı. Özet olarak, fizyolojik veri (OGTT ve ITT) ve moleküler çalışma hipotalamik CCL5 sinyal sistematik insülin direnci ve glikoz metabolizması için katkıda hipotalamik insülin sinyal yönetmelik aracılık eder göstermektedir.
Rol ve CCL5 ve CCR5 mekanizmasının diyabet obezite ile ilişkili kalır belirsiz. Kitade vd CCR5 eksikliği obezite kaynaklı iltihabı, makrofaj işe alım ve insülin direnci17fare korumalı bildirdi. Ancak, diğer çalışmalar Kennedy ve ark. tarafından ters sonuçlar CCR5 eksikliği sistemik glukoz tolerans yanı sıra adipocyte ve kas insülin18sinyal bozar gösteren bulundu. Her iki çalışmaları tüm vücut kronik inflamasyon ve telafi edici yanıt yol açan obezite ikna etmek için bir yüksek yağlı diyet uygulanır. Bu çalışmalar insülin yönetmelik sinyal temiz ve berrak mekanizmalar CCL5 ve CCR5 sağlamadı. Öte yandan, ozmotik Pompa Teknik bir beyin belirli infüzyon sağlar ve telafi edici yanıt zaman-mahdut teslimat ile önler.
Sonuç olarak, ozmotik pompa beyin infüzyon sistemi ile "eski moda" bir tekniği gibi görünüyor olsa da, daha ucuz, daha kolay ve daha az zararlı ilaç dağıtım yöntemi sağlamamaktadır ve yardımcı olur araştırmak ligand-reseptör içinde sinyal işlevi beyin.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Minnettarız S-Y c desteklenen Bakanlığı bilim ve teknoloji, Tayvan-MOST105-2628-B-038-005-MY3(1-3) ve sağlık ve refah ücretli tütün ürünleri - MOHW106-TDU-B-212-144001
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vetbond Tissue Adhesive | 3M | #1049SB | The glue used to seal the lesion site on the mouse head |
| LOCTITE 454 instant adhesive | Durect Corporation | #8670 | The glue used to fix the needle on the mouse skull |
| Alzet Micro- Osmotic Pump | Durect Corporation | #9922 | 0.11 μl per hour, 28 days |
| Brain infusion system | Durect Corporation | #8851 | 1-3 mm, used to perfuse the drug in to the mice brain |
| Glucometer | Roche | #06870244001 | Used to measure the blood glucose level |
| Glucose chip | Roche | #06454011020 | Used to load the blood sample |
| Evan's blue | Sigma | #MKBK0523V | To demonstrate the drug infusion area |
| Insulin syringe | Becton, Dickinson and Company | #3232145 C | Used to administer insulin intraperitoneally |
| MIO NE116 CONTROL UNIT (nail drill) |
Mio System | #E235-015 | To drill a hole in the skull of the mouse |
| CCL5/Met-RANTES Protein | R&D | #ADB0111081 | Recombinant Human CCL5, E-coli derived |
| aCSF formula | 119 mM NaCl 26.2 mM NaHCO3 2.5 mM KCl 1 mM NaH2PO4 1.3 mM MgCl2 10 mM glucose |
Filter sterilize with a 0.22 μm filter apparatus, and store at 4°C. aCSF is stable for 3-4 weeks |
|
| Phospho-IRS-1 Serine302 antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| IRS-1 (D23G12) antibody | Cell Signaling | #12879 | 1:1000 dilution |
| Phospho-Akt Serine 473 antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:2000 dilution |
| Akt (pan) (C67E7) antibody | Cell Signaling | #9916 | 1:1000 dilution |
| Animals: C57BL/6 | NAR Labs | Wild type mice strain used in the study |
References
- Plata-Salaman, C. R., Borkoski, J. P. Chemokines/intercrines and central regulation of feeding. Am J Physiol. 266, R1711-R1715 (1994).
- Milanski, M., et al. Inhibition of hypothalamic inflammation reverses diet-induced insulin resistance in the liver. Diabetes. 61, 1455-1462 (2012).
- Wang, X., et al. Increased hypothalamic inflammation associated with the susceptibility to obesity in rats exposed to high-fat diet. Experimental diabetes research. 2012, 847246 (2012).
- Benomar, Y., et al. Insulin and leptin induce Glut4 plasma membrane translocation and glucose uptake in a human neuronal cell line by a phosphatidylinositol 3-kinase- dependent mechanism. Endocrinology. 147, 2550-2556 (2006).
- Gual, P., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. Positive and negative regulation of insulin signaling through IRS-1 phosphorylation. Biochimie. 87, 99-109 (2005).
- Werner, E. D., Lee, J., Hansen, L., Yuan, M., Shoelson, S. E. Insulin resistance due to phosphorylation of insulin receptor substrate-1 at serine 302. The Journal of biological chemistry. 279, 35298-35305 (2004).
- Boura-Halfon, S., Zick, Y. Phosphorylation of IRS proteins, insulin action, and insulin resistance. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism. 296, E581-E591 (2009).
- Chou, S. Y., et al. CCL5/RANTES contributes to hypothalamic insulin signaling for systemic insulin responsiveness through CCR5. Sci Rep. 6, 37659 (2016).
- Calegari, V. C., et al. Inflammation of the hypothalamus leads to defective pancreatic islet function. J Biol Chem. 286, 12870-12880 (2011).
- Mighiu, P. I., Filippi, B. M., Lam, T. K. Linking inflammation to the brain-liver axis. Diabetes. 61, 1350-1352 (2012).
- Tavares, E., Minano, F. J. RANTES: a new prostaglandin dependent endogenous pyrogen in the rat. Neuropharmacology. 39, 2505-2513 (2000).
- Appay, V., Rowland-Jones, S. L. RANTES: a versatile and controversial chemokine. Trends in immunology. 22, 83-87 (2001).
- DeVos, S. L., Miller, T. M. Direct intraventricular delivery of drugs to the rodent central nervous system. J Vis Exp. , e50326 (2013).
- Wang, N., et al. Admission blood glucose and in-hospital clinical outcome among patients with acute stroke in Inner Mongolia, China. Clin Invest Med. 32, E151-E157 (2009).
- Olsen, T. S. Blood glucose in acute stroke. Expert Rev Neurother. 9, 409-419 (2009).
- De Jong, W. H., Borm, P. J. Drug delivery and nanoparticles:applications and hazards. Int J Nanomedicine. 3, 133-149 (2008).
- Kitade, H., et al. CCR5 plays a critical role in obesity-induced adipose tissue inflammation and insulin resistance by regulating both macrophage recruitment and M1/M2 status. Diabetes. 61, 1680-1690 (2012).
- Kennedy, A., et al. Loss of CCR5 results in glucose intolerance in diet-induced obese mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 305, E897-E906 (2013).
