Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تقييم لاستجابة ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "تحفيز الميكانيكية الحادة"

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

هنا يصف لنا أساليب لتقييم الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة. في التحليل القائم على الفحص المجهري، ندرس تعريب هذه الأجهزة بعد التحفيز مختصرة مع تدفق القص المسمى فلوريسسينتلي. ونحن أيضا اختبار تنشيط البروتينات المختلفة لمصلحة في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة المتحلل.

Abstract

به، أو هجرة يصل تدرج تشيمواتراكتانت، هو أفضل طريقة مفهومة من موجه الهجرة. كشفت دراسات استخدام أميبا الاجتماعية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم أن شبكة توصيل إشارة معقدة من مسارات متوازية يسهب الرد على تشيمواتراكتانتس، ويؤدي إلى بلمرة الأكتين متحيزة ونتوء من بسيودوبود في اتجاه التدرج. وفي المقابل، الآليات الجزيئية القيادة أنواع أخرى من الهجرة الموجهة، على سبيل المثال، بسبب التعرض للقص تدفق أو المجالات الكهربائية، غير معروفة. العديد من المنظمين إنزيمية يحمل التعريب الرائدة أو متخلفة عن حافة خلية المهاجرة، فضلا عن إظهار التغييرات عابر في الترجمة أو التنشيط بعد التحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت. لفهم الآليات الجزيئية لأنواع أخرى من الهجرة الموجهة قمنا بتطوير أسلوب يسمح فحص الاستجابة الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحادة استناداً إلى موجز (2-5 ق) التعرض لإمالة تدفق. يمكن تسليم هذا التحفيز في قناة أثناء التصوير الخلايا معربا عن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المسمى فلوريسسينتلي لدراسة سلوك الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، يمكن حفز السكان خلية في لوحة، وتفكيك، وإيمونوبلوتيد باستخدام الأجسام المضادة التي تعترف بالإصدارات النشطة من البروتينات ذات الاهتمام. من خلال الجمع بين كلا فحوصات، واحدة دراسة مجموعة واسعة من الجزيئات تفعيلها من خلال التغييرات في الترجمة سوبسيلولار و/أو الفسفرة. باستخدام هذا الأسلوب عقدنا العزم أن التحفيز الميكانيكي الحاد يؤدي تنشيط إشارة chemotactic أكتين وتوصيل الشبكات cytoskeleton. القدرة على دراسة الاستجابات الخلوية للتحفيز الميكانيكي الحاد مهم لفهم أحداث المبادرة اللازمة للقص الناجمة عن تدفق الحركة. كما يوفر هذا النهج أداة لدراسة شبكة توصيل الإشارات chemotactic دون التباس تأثير مستقبلات chemoattractant.

Introduction

هجرة خلايا حقيقية النواة متحيزة بمختلف الإشارات الكيميائية والفيزيائية في البيئة، بما في ذلك تدرجات تشيمواتراكتانتس قابلة للذوبان أو الركيزة زمنياً، وصلابة متغيرة من ركائز، المجالات الكهربائية، أو تدفق القص. على الرغم من أن هناك العديد من أوجه التقدم في فهمنا للآليات الجزيئية التي يقود به، يعرف عن الأنواع الأخرى من الهجرة الموجهة وكيف تتكامل هذه الإشارات المتنوعة على المستوى الخلوي لإنتاج موحد المهاجرة استجابة.

موجه الهجرة صوب بتركيز متزايد chemoattractant ينطوي على ثلاثة مكونات السلوكية: حركية والاستشعار اتجاهي والأقطاب1. حركية يشير إلى الحركة العشوائية للخلايا التي حققها نتوء بسيودوبود. الاتجاه الاستشعار هو قدرة الخلية على الكشف عن مصدر تشيمواتراكتانت، التي يمكن أن تحدث حتى في المعطل تداولها الخلايا. قطبية يشير إلى التوزيع غير متناظرة أكثر استقرارا من المكونات داخل الخلايا بين الرائدة ومتخلفة عن حافة الخلية، مما يؤدي إلى استمرار زيادة في الحركة.

الاستجابة الخلوية إلى تشيمواتراكتانت يعتمد على نشاط أربع شبكات المعرفة النظرية التنظيمية: مستقبلات/ز البروتين وتوصيل الإشارة، cytoskeleton أكتين، والأقطاب1. تشيمواتراكتانت ملزم لمستقبلات البروتين-إلى جانب ز ينقل الإشارة عن طريق هيتيروتريميريك ز البروتينات α و βγ بشبكة توصيل الإشارات المصب، التي تضخم إشارة الاتجاه. مسارات متعددة داخل الشبكة توصيل الإشارات تعمل بالتوازي، وتغذي الشبكة cytoskeleton أكتين بلمرة الأكتين التحيز، وبروز ما يترتب عليه من بسيودوبود، في اتجاه التدرج. بين المنظمين هامة من إنزيمية هي رأس جتباسي، TorC2، فوسفوينوسيتيدي 3-كيناز (PI3K)، homolog الفوسفاتيز وتينسين (فتن)، وسيكلاسي جوانيليل. آليات التغذية المرتدة داخل شبكة توصيل الإشارات وبين توصيل الإشارة واكتين المزيد cytoskeleton شبكات تضخيم الاستجابة. أخيرا، شبكة قطبية غير المحددة بوضوح يتلقى الإدخال من cytoskeleton أكتين، وكذلك التحيز شبكة توصيل إشارة لتشجيع الهجرة المستمرة في اتجاه التدرج.

جزء كبير من فهمنا آليا من إنزيمية ممكناً بسبب تطوير أجهزة استشعار العوامل البيولوجية فلوريسسينتلي معلم للمكونات المختلفة للشبكات التنظيمية. يتمتع العديد من إنزيمية المنظمون إلى توزيع غير متناظرة أما الجزيء التنظيمية نفسها أو نشاطها. على سبيل المثال، أجهزة استشعار العوامل البيولوجية التي تعترف بتنشيط إصدارات صغيرة رأس جتباسيس و Rap1 – المجالات الملزمة Ras من Raf1 (المشار إليها ك RBD هنا) وترجمة رالجدس، على التوالي – إلى حافة الرائدة في مجال تشيموتاكسينج الخلية2،3. وبالمثل، PI3K وفي فوسفاتيديلينوسيتول المنتج (3,4,5)-تريسفوسفاتي (PIP3)، المعترف بها مجال التماثل (PH) بليكسترين، كما تظهر الترجمة في الجزء الأمامي من الخلية4،5. وفي المقابل، فتن 3-الفوسفاتيز، الذي يحول PIP3 إلى فوسفاتيديلينوسيتول (4، 5)-بيسفوسفاتي، يموضع إلى حافة الخلية6متخلفة. الأهم من ذلك، تغيير هذه أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على التعريب في الاستجابة للتحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت. علامات الرائدة، التي هي سيتوسوليك أو على نصائح نتوءات في خلية يستريح، ريلوكاليزي للقشرة، بينما تخلف علامات الحافة، التي التعريب القشرية وهي غائبة من نصائح نتوءات في خلية يستريح، أصبح سيتوسوليك بعد التحفيز. تحليل لتوزيع بيوسينسور في الاستجابة للتحفيز العالمي مع تشيمواتراكتانت يقلل مساهمة حركية والاستقطاب، التي كثيرا ما يتيه في الملاحظات. التحفيز العالمية أو موحدة لتعليق خلية مع تشيمواتراكتانت يستخدم أيضا كأداة لتقييم التغيرات السكانية على نطاق المنظومة في تفعيل البروتين، وغالباً ما تكتشف بالبروتين الفسفرة7،،من89 . هذا التحليل الكيميائية الحيوية يستخدم في المقام الأول للحصول على المعلومات الزمنية، بينما يتم استخدام الفحص المجهري لجمع معلومات زمنية ومكانية معا حول السلوك المكونات المختلفة للشبكات التنظيمية.

شبكة توصيل إشارة يتضمن الميزات نظام منفعل10،11. الاستجابة للمحفزات chemotactic أعلاه العتبة هي "اللورنوني" وعرض فترات صهر. يتم أيضا تشغيل ستوتشاستيكالي الردود ويمكن إظهار سلوك متذبذبة. يتم ترجمة الأحداث توصيل الإشارات إلى مناطق القشرة التي تنتشر كموجات12،13،،من1415. الأمام أو إلى الوراء، علامات يعينون على، أو ننأى عن المناطق النشطة من موجات نشر. بسبب منطقة المقاوم للحرارة الزائدة في منطقة نشطة، إبادة موجات توجه معاكس كما يلتقون. نشر موجات توصيل الإشارات تكمن وراء نتوءات الخلوية التي تتوسط الخلية الهجرة10.

الكثير من المعلومات المذكورة أعلاه على إنزيمية جاءت من الدراسات على الاميبا الاجتماعية ديسكويديوم ديكتيوستيليوم، على الرغم من أن آليات تنظيمية مماثلة تنطبق أيضا على العَدلات وغيرها خلية الثدييات الأنواع16 . ديكتيوستيليوم هو كائن نموذج راسخة لديه ردا قويا من تشيموتاكتيك أثناء المجاعة، عند ترحيل آلاف خلايا مفردة نحو مركز لتجميع، تشكيل هيئة الاثمار متعددة الخلايا التي تحتوي على جراثيم في نهاية المطاف. إنزيمية ضروري أيضا خلال مرحلة نمو الخلايا المفردة لهذا الكائن لتحديد مصادر الغذاء البكتيرية. الأهم من ذلك، هجرة خلايا ديكتيوستيليوم واحد ملحوظ مماثل لهجرة العَدلات الثدييات أو خلايا السرطان المنتشر، كلها تخضع للهجرة أميبية النوع السريع جداً. وفي الواقع، هي حفظت كلا طبولوجيا الشبكات التنظيمية الشاملة، وكذلك العديد من مسارات توصيل الإشارات الفردية المعنية في إنزيمية بين ديكتيوستيليوم والثدييات الكريات البيضاء17. وعلاوة على ذلك، تستخدم الخلايا الأخرى، مثل الخلايا الليفية، مستقبلات تيروسين مؤنزم (راديو وتلفزيون كوسوفو) بدلاً من جبكرس؛ ومع ذلك، رتكس قد تصب في شبكات مماثلة.

وعلى النقيض من إنزيمية، تفتقر إلى فهم دقيق للآليات مما يشير إلى محرك أقراص مختلف الأساليب الأخرى للهجرة الموجهة. وبالمثل للخلايا المهاجرة في تدرج chemoattractant عدة أفادت الدراسات التنشيط و/أو الترجمة من علامات النموذجية الرائدة، بما في ذلك بلمرة الأكتين، PIP3 و/أو خارج الخلية ينظم إشارة كيناز (إيرك) 1/2، على الأمامي خلايا التي تمر بموجة الهجرة استجابة للقص تدفق أو التغييرات في المجالات الكهربائية18،19،،من2021. ومع ذلك، في هذه الدراسات التعرض المستمر للحافز الذي أدى أيضا إلى الهجرة الخلية، ترك مفتوحاً السؤال عما إذا كانت، على سبيل المثال، ترجمة العلامات الرائدة على وجه التحديد في استجابة لحافز، أو إذا كانوا ببساطة المعربة في طليعة بسبب زيادة عدد بسيودوبودس في الجزء الأمامي من خلية ترحيل.

قمنا بتطوير الاختبارات التي تسمح لنا بمراقبة استجابة الخلايا لاضطراب ميكانيكي الحادة تسليمها كتدفق القص على حد سواء على مستوى السكان والخلايا الفردية22. مشابهة لتحفيز عالمية مع تشيمواتراكتانت، ستيمولا الحاديسمح نشوئها مع تدفق القص الدراسة الخلوية استجابة لحافز ميكانيكية دون مساهمة التباس من حركية أو القطبية. الجمع بين هذه الاختبارات الكيميائية الحيوية والمجهرية والاضطرابات الوراثية أو الدوائي يتيح لنا أن نتعلم حول المنبهات الميكانيكية كيف ينظر إليها والمنقولة. وعلاوة على ذلك، يوفر هذا النهج أيضا طريقة جديدة للاستفادة من نظام المصب مستقبلات تشيمواتراكتانت في غياب تشيمواتراكتانت، وبالتالي عزل إشارة أكتين وتوصيل الشبكات cytoskeleton من المستقبلات/ز شبكة البروتين.

باستخدام التقنيات الموضحة أدناه ونحن مؤخرا أظهرت أن الإجهاد القص الحاد يؤدي إلى تنشيط مكونات متعددة إشارة chemotactic تنبيغ واكتين cytoskeleton شبكات22. عن طريق تطبيق حافز الميكانيكية الحادة على فترات متفاوتة، أظهرنا، وبالمثل إلى تشيمواتراكتانتس، الاستجابة للمحفزات الميكانيكية أيضا معارض ميزات نظام منفعل، بما في ذلك سلوك الاستجابة تحت اللورنوني تشبع الظروف ووجود فترة المقاوم للحرارة. وأخيراً، من خلال الجمع بين التحفيز الميكانيكية والكيميائية أظهرنا أن المحفزات هما تشتركان في إشارة توصيل أكتين سيتوسكيليتون شبكات والتي يرجح أن السماح لتكامل محفزات المتعددة للهجرة الخلية التحيز.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-"إعداد الحلول"

  1. HL-5 إعداد الوسائط باستخدام ما يلي: سكر العنب 10 غرام/لتر، ببتون برتوس 10 غرام/لتر، استخراج الخميرة 5 غرام/لتر، 0.965 غ/لتر Na 2 هبو 4 ·7H 2 س، خ 0.485 غرام/لتر 2 ص. ب 4، وكذلك، ما لم يبين خلاف ذلك، ستربتوميسين 0.03 غرام/لتر في المياه. اﻷوتوكﻻف المتوسطة وتخزين في درجة حرارة الغرفة-
    ملاحظة: بسبب الاختلافات بين استخراج ببتون والخميرة بروتيوسي المكتسبة من موردين مختلفين، وكذلك بين المجموعات الفردية، الأس الهيدروجيني لوسائل الإعلام قد تحتاج إلى تعديل لمجموعة نموذجية من 6.4 إلى 6.7.
  2. SM إعداد لوحات باستخدام ما يلي: 10 غرام/لتر سكر العنب، ببتون 10 غرام/لتر، 1 غرام/لتر الخميرة استخراج 2.31 غرام/لتر خ 2 ص 4، 1 غرام/لتر ك 2 هبو 4 واجار 20 غرام/لتر في المياه. اﻷوتوكﻻف، بارد، وصب 30 مل الحل أجار الواحدة 10 سم طبق بيتري. بمجرد أجار يتصلب، تخزين لوحات عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر 1-
  3. تحضير 10 × استخدام المخزن المؤقت للفوسفات (PB) 13.4 غرام/لتر Na 2 هبو 4 ·7H 2 س و 6.8 غرام/لتر خ 2 ص 4 في المياه. تخزين المخزون 10 x في 4 ° ديلوت جيم إلى س 1 مع المياه للاستخدام-
  4. إعداد المخزن المؤقت DB بتكميل 1 X PB مع 2 مم MgSO 4 و 0.2 مم كاكل 2-
  5. تحضير 100 ملم الكافيين في المياه. تخزين في − 20 درجة مئوية.
  6. إعداد 100 مم حل الأسهم المخيم بتذويب مونوهيدرات ملح الصوديوم المخيم في المياه.. إعداد 1 مم العامل المخزون في المياه.. تخزين كل الحلول الأسهم في − 20 ° C. تحضير المخيم الحل النهائي في التركيز المطلوب في DB في يوم التجربة.
    ملاحظة: حلول الأسهم يمكن إذابة تجميد بضع مرات.
  7. تحضير حمض الفوليك 25 مم 1 x في الجريدة الرسمية. إضافة بضع قطرات من هيدروكسيد الصوديوم N 1 حتى يذوب المسحوق تماما. تخزين في − 20 درجة مئوية.
  8. إعداد المخزن المؤقت العينة x 3 باستخدام ما يلي: 187.5 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، 6% (w/v) الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) والغليسيرول 30%، ديثيوثريتول 126 ملم و 0.03% (w/v) بروموفينول الأزرق. قاسمة ومخزن في − 20 ° C.
    1. مسبق استخدام، وذوبان الجليد في حمام مائي 37 درجة مئوية والمضي قدما لإعداد نموذج المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز بإذابة 3 × عينة المخزن المؤقت إلى 1 x، وإضافة 50 مم NaF ومم 2 غ 3 فو 4 بيروفوسفات صوديوم 25 مم 1 x كاملة خالية من يدتا حوزتي المانع كوكتيل في المياه. إضافة مثبطات فورا قبل بدء الإجراء الموضح في الخطوات 3.1.2-3.1.3.
  9. إعداد 5 مم لاترونكولين الحل في [دمس]. قاسمة ومخزن في − 20 ° C.

2. إعداد الخلايا ديسكويديوم د

ملاحظة: الحفاظ على الخلايا ديسكويديوم دال- في وسائل الإعلام HL-5 أما في لوحات زراعة الأنسجة أو كما سبق وصف الثقافة في تعليق 23. عند الضرورة، تحويل الخلايا مع أجهزة استشعار العوامل البيولوجية المسمى فلوريسسينتلي وفقا للبروتوكولات القياسية انهانسر 24. ويمكن الحصول على مختلف سلالات ديسكويديوم دال، فضلا عن والبلازميدات ترميز أجهزة استشعار العوامل البيولوجية أو جينات أخرى من الفائدة من مركز الأوراق المالية ديكتي (dictybase.org)-

  1. النمو ومجموعة من الخلايا النباتية ديسكويديوم د
    1. لتحليل الخلايا النباتية، تنمو خلايا البكتيريا الحد من عدد ماكروبينوسوميس، والتي عادة ما يلاحظ في حضور الخلايا المزروعة أكسينيكالي 25.
      1. تحضير ثقافة الكلبسيله الغازية بتطعيم عدد صغير من الخلايا من مخزون والغليسيرول أو من ثقافة سابقة إلى وحدة التخزين المطلوبة للمتوسطة HL-5 دون المضادات الحيوية. احتضان ثقافة البكتيرية في شاكر مداري 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز) في درجة حرارة الغرفة (20-22 درجة مئوية) حاء 16-18
        ملاحظة: ك. السلالة الغازية المستخدمة هنا غير ممرضة (انظر الجدول للمواد)-
    2. جمع ديسكويديوم دال- في مرحلة النمو الأسى من لوحات زراعة الأنسجة أو من ثقافة وقف، وعد الخلايا باستخدام هيموسيتوميتير حسب الشركة المصنعة ' تعليمات s. انتشار الخلايا ديسكويديوم دال- 5 1 × 10 ميليلتر 260 الغازية ك. تعليق على صفيحة SM. قم بتشغيل لوحة رأسا على عقب أسفل اليوم التالي. تنمو الخلايا في درجة حرارة الغرفة حتى تبدأ الخلايا ديسكويديوم دال- تطهير الحديقة البكتيرية ولكن قبل أن تبدأ تجميع (~ 36-48 ح)-
    3. جمع الخلايا ديسكويديوم دال في المخزن المؤقت لمل 5 DB بإلغاء لهم مع الناشرة زجاج. نقل الخلايا إلى أنبوب البولي بروبلين 50 مل. شطف اللوحة مع آخر 5 مل DB العازلة وتجمع مع التعليق الأصلي. ملء الأنبوب إلى 50 مل مع المخزن المؤقت DB.
    4. الطرد المركزي بتعليق ديسكويديوم د في غ س 360 للحد الأدنى 3-4 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 50 مل DB المخزن المؤقت. كرر الخطوات الغسيل حتى المادة طافية واضحة (يغسل ~ 3 إلى 4). ريسوسبيند بيليه الخلية الأخيرة في المخزن المؤقت DB إلى كثافة نهائي ~ 5 × 10 6 خلايا/مل.
  2. إعداد التجميع-الخلايا المختصة دال-ديسكويديوم
    1. وضع ديسكويديوم دال- الخلايا جوعاً ح 1 تليها ح 4 من المجاعة والنبض مع 50 نانومتر معسكر كل دقيقة 6 وفقا للمعيار بروتوكولات 23-
    2. وبعد التنمية، قياس الحجم النهائي لتعليق خلية.
    3. استناداً إلى العدد الأولى للخلايا المستخدمة للتنمية، وحساب كثافة الخلية تعليق نهائي-
      ملاحظة: إذا كان يتم تسليم معسكر في 100 ميليلتر حجم كل دقيقة 6، حجم الخلية زاد 1 مل لكل ساعة من النبض المخيم. وهكذا، الحجم النهائي للشروط القياسية باستخدام خلايا 7 8 × 10 مل 4 ديسيبل، بعد ح 4 التنمية 7 مل وكثافة الخلية النهائي ~1.1 x 10 7 خلايا/مل.

3. تحليل الكيمياء الحيوية "للخلية استجابة" للميكانيكية أو الكيميائية التحفيز

الخلايا
  1. الحادة الميكانيكية التحفيز للخلايا متبوعة تحلل الخلية
    1. لوحة 2 × 10 6 التجميع المختصة (من الخطوة 2، 2) بعد ح 4 من التنمية في الأطباق 35 ملم مع 2 مل DB. السماح للخلايا إرفاق لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تغسل الخلايا مرتين مع 1 مل DB. احتضان خلايا في DB مع الكافيين 2.5 ملم لمدة 30 دقيقة دون أي اضطراب الصفائح.
      ملاحظة: إذا كانت الخلايا تحتاج إلى أن تعامل مع مثبط الدوائي، إضافة المطلوب تركيز مثبط أو نفس الحجم من المركبات المناسبة خلال باساليشن مع الكافيين.
    2. إلى تطبيق التحفيز الميكانيكي، ووضع اللوحة (في وقت واحد) على شاكر مداري وتشغيله فورا 150 لفة في الدقيقة (0.24 س ز) 5 س.
      ملاحظة: اللوحة يمكن أيضا يدوياً حفز الحركة بطريقة كروسويسي لما يقرب من 5 س.
    3. Aspirate المخزن المؤقت في أشير مرات بعد بدء التنشيط. فورا الخلايا بإضافة 100 ميليلتر عينة من المخزن المؤقت مع مثبطات البروتياز والفوسفاتيز.
    4. وضع اللوحة على الجليد، وجمع في في أنبوب 1.5 مل. ل ' الوقت 0 '، الخلايا دون المصافحة. نقل الأنابيب إلى كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد تحلل مباشرة. المضي قدما في إيمونوبلوتينج أو تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
  2. التحفيز من الخلايا التي تحتوي تشيمواتراكتانت
    1. باسالاتي خلايا تجميع المختصة بعد ح 4 التنمية بسرعة الهز لهم حضور الكافيين 5 مم 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز) على شاكر مدارية لمدة 30 دقيقة. ز
      1. أجهزة الطرد المركزي من تعليق خلية في العاشر 360 للحد الأدنى 3-4 نضح المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 10 مل المثلج DB العازلة. كرر الخطوة الغسيل.
    2. ريسوسبيند بيليه الخلية الأخيرة في المخزن المؤقت DB المثلج لكثافة نهائي 4 × 10 7 خلايا/مل استناداً إلى عدد الخلايا الأولية المستخدمة لتطوير الخلايا (راجع الخطوة 2، 2). ستبقى على تعليق خلية في الثلج قبل ستيمولالتعاون.
      1. ميليلتر 50 ماصة 10 ميكرون مخيم أو مركبة في كوب البوليستيرين المفروضة على شاكر مداري.
    3. لتحفيز الخلايا، إضافة 450 ميليلتر من تعليق خلية المثلج في نفس كوب وفورا تشغيل شاكر 200 لفة في الدقيقة (0.42 س ز). وفي أوقات مختلفة بعد بدء التنشيط (مثلاً 10، 30، 45، 60، 120 s)، بإيجاز وقف شاكر وإخراج 50 ميليلتر مختبرين لتعليق خلية والخلايا قبل إضافتها إلى 1.5 مل أنابيب تحتوي على 25 ميليلتر 3 × عينة المخزن المؤقت.
      1. على ' الوقت 0 '، استخدام الخلايا من تعليق خلية المثلج أونستيمولاتيد.
        ملاحظة: هو درجة الحرارة النهائية لتعليق الخلية أثناء التحفيز ~ 9 ° ج 26. في ظل هذه الظروف يحدث استجابة ذروة قليلاً يتجاوز ذروة لاحظ التحفيز التي يؤديها في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال، تشيمواتراكتانت حفز الخلايا ملتصقة على المجهر، أو التحفيز الميكانيكي للخلايا ملتصقة).
    4. نقل الأنابيب إلى كتلة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 10 دقائق بعد تحلل مباشرة. المضي قدما في إيمونوبلوتينج أو تخزين ليساتيس في-20 درجة مئوية.
  3. تحليل استجابة الخلايا من إيمونوبلوتينج
    1. تشغيل ليساتيس (من الخطوات 3.1.3 أو 3.2.4) على جل polyacrylamide تريس-HCl 4-15%، ونقل إلى غشاء فلوريد الفينيليدن، كتلة، وإيمونوبلوت مع PKC والرمات Ζ Thr410 (للكشف عن PKBR1 والرمات وبكبا والرمات). الكشف عن الإشارة بالحضانة مع الفجل البيروكسيديز مترافق أرنب المضادة الثانوي الأجسام المضادة، تليها تشيميلومينيسسينسي باستخدام تشيميلومينيسسينسي تعزيز الركيزة.
    2. لكشف البروتينات متعددة، الشريط وصمة عار مع تجريد المخزن المؤقت، وإعادة التحقيق مع جسم الأولية ضد والرمات-p42/44 MAPK Thr302/304 (للكشف عن والرمات-ERK2). تأكيد المساواة البروتين تحميل تلطيخ الغشاء فلوريد الفينيليدن مع "أخذ الأزرق الرائعة".

4. الحاد التحفيز الميكانيكي ويعيش التصوير من الخلايا المفردة في المجهر

    1. من تقييم لاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحاد باستخدام جهاز تدفق جمع وتمييع الخضري أو تجميع المختصة الخلايا إلى ~ 1 × 10 6 خلايا/مل في قاعدة البيانات كما هو موضح في الخطوات 2-1 و 2-2، على التوالي. تحميل ~ 600 ميليلتر في الشريحة مع قناة (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل). السماح للخلايا إرفاق للحد الأدنى 10 تأكد من أن كافة المداخل في الشريحة تمتلئ تماما. أعلى حتى مع المخزن المؤقت إضافية إذا لزم الأمر.
      ملاحظة: قد الشريحة خاصة تستخدم لتحليل المدخلات الثلاثة التي تصب في قنوات ضيقة، 1 ملم، ولكن الدمج ثم إلى قناة واحدة واسعة، 3 مم. ارتفاع القناة 0.4 مم. على الرغم من أن يتم مطلي الخلايا في جميع أنحاء القناة، فقط الجزء واسعة يتم تصويرها.
    2. تمرير أحد خطوط متصل بخزان 50 مل من خلال صمام حق استقبال وحدة فلويديك (انظر الجدول للمواد للحصول على التفاصيل). باستخدام البرمجيات للمضخة، تأكد من إغلاق الصمام (أي إلى اليسار). ملء الخزان بالديسيبل. تعيين الضغط على 50 [مبر]
      1. وقم بتشغيله. ملء وشطف السطر مع DB بالنقر على صمام لفتحه. قم بالضغط مرة أخرى إلى 0، ثم إغلاق الصمام بعد ~ 30 س.
    3. قم بتوصيل الخط واحد من المداخل الثلاثة على جانب واحد من الشريحة دون تعويض اللون أي فقاعات الهواء. سد مداخل اثنين آخرين. قم بتوصيل الخط من استنزاف لمدخل واحد على الجانب الثاني من الشريحة.
      ملاحظة: الأنابيب المستخدمة للمدخلات واستنزاف الخطوط في هذا الإعداد له قطر داخلي من 1.6 ملم.
    4. مكان الشريحة على المجهر تحت هدف جوي X 20. شطف القناة، تبديل الصمام فتح الخط، وانقر فوق " الضغط على "، والبدء في الضغط العالي ([مبر] ~ 50 أو ~ 40 داين/سم 2) لدفع السائل إلى استنزاف.
      1. عندما يخرج السائل من استنزاف، تقليل الضغط الخارجي إلى الصفر (أي. خطورة تدفق فقط، ~ 15 داين/سم 2)، ويستمر الشطف لتبديل س. ~ 30 الصمام إلى الموقف المعاكس لوقف التدفق.
    5. الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء إضاءة على مجهر مقلوب الأسفار تحت 40 × الهدف النفط فترات s 3. مع الصمام في موقف مغلقة، قم بالضغط في الضغط المطلوب، وعادة ما بين 15 و 40 داين/سم 2 (0-50 [مبر]).
    6. بعد الحصول على 5 إطارات، تقديم الحافز بتبديل الصمام على " فتح " الموقف. إيقاف التدفق بعد s 2-5 بتبديل الصمام إلى الاتجاه المعاكس-
      ملاحظة: لبعض أضعف أجهزة استشعار العوامل البيولوجية (مثل فتن وسينا ورالجدس) قد يكون ضروريا للخلايا الصورة باستخدام مجهر [كنفوكل] مجهزة 40 × الهدف النفط.
  2. اختبار تأثيرات مثبطات الدوائي في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحاد باستخدام جهاز تدفق
    1. لوحة خلايا في الشريحة مع قناة كما هو موضح في الخطوة 4.1.1. إعداد خطين: تمرير سطر واحد عن طريق صمام اليمنى الجبهة كما هو الحال في الخطوة 4.1.2، والثاني عن طريق الظهر غادر صمام. المشبك على الخط الأيسر ووضع الصمام " مغلقة " موقف (يسار). تعبئة خط واحد مع DB التي تحتوي على الأداة المناسبة، والثانية مع الحل الذي يحتوي على مثبط دوائية للفائدة (مثلاً 5 ميكرومتر لاترونكولين A)-
      ملاحظة: من الضروري أن المشبك فعلياً على الخط الأيسر نظراً " مغلقة " الموضع الأيسر فتح الصمام لهذا الخط.
    2. التعبئة وشطف خط الحق بتشغيل الضغط على 50 [مبر] وتبديل الصمام " فتح " موقف (يمين). التبديل الصمام إلى اليسار بعد ~ 30 س. التعبئة وشطف خط اليسار عن طريق إزالة المشبك للاتصال س. ~ 30 كل الخطوط إلى اثنين من مداخل على جانب واحد من الشريحة مع قناة وسد مدخل المتبقية والاتصال استنزاف إلى مدخل واحد على الجانب الثاني.
    3. تغسل الشريحة مع المخزن المؤقت في الخط الصحيح وأداء التحفيز في المخزن المؤقت لنفسه كما هو موضح في الخطوات 4.1.3 و 4.1.4 أعلاه.
      ملاحظة: على الرغم من أن الخط الصحيح الذي اختير كأول واحد في هذا الإعداد، يمكن عكس الترتيب.
    4. عقب التحفيز، وتبديل صمام لفتح الخط الصحيح عند ضغط الصفر (أي خطورة تدفق فقط، ~ 15 داين/سم 2). إزالة المشبك من الخط الأيسر وتبديل الصمام إلى اليسار لفتح هذا الخط. المشبك السطر الأول-
    5. بعد تشغيل 3-5 مل من المخزن المؤقت مع المانع من خلال، تبديل الصمام الحق في وقف التدفق، واحتضان الخلايا مع مثبط لطول الفترة الزمنية المطلوبة (مثلاً 15 دقيقة). تشغيل التدفق بتبديل صمام كل دقيقة ~ 10 ~ 15 ثانية لمنع الحرمان من الأكسجين. كرر التحفيز مع السطر الثاني-
  3. طريقة بديلة لتقييم الاستجابة للتحفيز الميكانيكية الحاد باستخدام ميكروبيبيتي
    1. إعداد ميكروبيبيتي مليئة DB طبقاً لبروتوكول قياسي 23. إبقاء الضغط التعويض في هذه المبادرة 1,500.
      2. جمع
    2. وتمييع الخلايا النباتية كما هو موضح في الخطوة 2، 1. مكان 25 ميليلتر قطرات ~7.5 x 10 5 خلايا/مل في دائرة 1-حسنا، تسمح للالتزام لمدة 10 دقيقة على الأقل، وتغطي مع 3 مل DB.
    3. وضع الدائرة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا نفط X 40. تحديد موقع الخلايا. بلطف أقل في ميكروبيبيتي في منتصف مجال الرؤية حتى أنها تمس أولاً الجزء السفلي من الدائرة.
      ملاحظة: حيث تم تعيين الضغط التعويض في هذه المبادرة 1,500، الخلايا بشكل مستمر ستتعرض لتدفق DB بصورة بطيئة للغاية من ميكروبيبيتي-
    4. بدء الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء إضاءة فترات s 3. تطبيق ' النظيفة ' الدالة على إطلاق سراح بلعه السائل من ميكروبيبيتي. مواصلة التصوير أناn وجود تدفق بسبب ضغط تعويض وحدها.
  4. طريقة بديلة لتقييم الاستجابة للتحفيز الميكانيكية الحاد باستخدام إضافة العازلة السائبة
    1. جمع وتمييع الخلايا النباتية كما هو موضح في الخطوة 2، 1. ضع 20 ميليلتر قطرات من الخلايا في ~ 1 × 10 6 خلايا/مل في DB في وسط بئر من دائرة 8-جيدا. السماح للخلايا الانضمام لمالا يقل عن 10 دقيقة
    2. بدء الحصول على الصور باستخدام طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء محددة الإضاءة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا X 40 فترات s 3. التركيز على منطقة قريبة من حافة الهبوط.
      3. سرعة إضافة
    3. ميليلتر 430 من DB إلى جانب واحد من البئر. مواصلة تصوير.
    4. لتحليل التفاعل بين المنبهات الميكانيكية والكيميائية، إضافة s 12 أو 45 بعد التحفيز الميكانيكي، بلطف 50 ميليلتر من حمض الفوليك (التركيز النهائي 20 نانومتر) أو مركبة (DB) دون تحريض استجابة ميكانيكية. مواصلة تصوير.
  5. القياس الكمي لاستجابة
    1. فتح صورة TIFF 32-بت في "صورة برامج التحليل" (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) 27.
    2. تحت ' تحليل ' التبويب، اذهب إلى " "تعيين قياسات" ". تحقق من المربع ' "قيمة الرمادي يعني" '. تأكد من أن لا يتم التحقق من المربعات الأخرى. انقر فوق " موافق ".
    3. تحت ' عملية '، انقر فوق " "طرح الخلفية" ". الاحتفاظ بنصف قطر الكرة المتداول في 50 بكسل، وعدم التحقق من أي من الخيارات المدرجة في القائمة. التكبير والتصغير استخدام خلية واحدة ' المكبرة ' أداة.
    4. استخدام ' المستطيل ' أداة، رسم مربع (~2.5 x 2.5 ميكرون 2) في سيتوسول، مع التأكد من عدم استدراجه عبر النواة أو غشاء البلازما. الصحافة " Ctrl " + " م " مفاتيح أو الذهاب إلى ' تحليل ' علامة التبويب وانقر فوق " التدبير " لتحديد قيمة المربع رمادي يعني. مقدما للإطارات اللاحقة وتدبير مرة أخرى، مع التأكد من المربع يبقى في سيتوسول-
      ملاحظة: نظراً للخلايا ديسكويديوم دال- التحرك سريعاً للغاية المربع يمكن نقلها من إطار واحد إلى التالي لإبقائه في سيتوسول.
    5. بعد كل من الإطارات قد تم تحليلها، نسخ القيم في جدول بيانات. لحساب التباين خلية إلى خلية في مستويات التعبير من مختلف أجهزة استشعار العوامل البيولوجية، تطبيع القيم عن قيمة الرمادي يعني لاحظ في الوقت 0. حساب معكوس القيم التي تعكس تراكم الإشارة على القشرة.

5. المستمر التحفيز الميكانيكي ويعيش التصوير من الخلايا المفردة في المجهر

  1. إعداد الخلايا بالضبط كما هو موضح أعلاه لتحليل التحفيز الميكانيكي الحادة في خطوات 4.1.1-4.1.3. فتح التوصيل تغطي الخزان مع المخزن المؤقت حيث يمكن تصدرت وحدة التخزين إذا كان يتم تحليل الاستجابة لأكثر من بضع دقائق في كل مرة.
    ملاحظة: نظراً لأن الخزان لا يزال مفتوحاً طوال فترة التجربة، هذا الفحص تتم في غياب الضغوط الخارجية ويعتمد على تدفق الجاذبية وحدها. لزيادة معدل تدفق بالجاذبية، يمكن وضع استنزاف على طاولة تحت المجهر.
  2. بدء التصوير الخلايا مع طلب تقديم العروض أو بروتينات فلورية خضراء محددة الإضاءة على مجهر مقلوب fluorescence مجهزة هدفا X 40 على فترات s 3 لتحليل الردود بيوسينسور. بدلاً من ذلك، صورة مع تباين مرحلة استخدام هدفا X 20 على 10 فترات s للتحليل الشامل الخلية الهجرة-
  3. بدوره على التدفق بعد عدة إطارات في الإعداد صفر-الضغط (أي التدفق بسبب الجاذبية وحدها أو ~ 15 داين/سم 2) عن طريق تبديل الصمام لموقف فتح. عندما يقع مستوى السائل إلى 5-10 مل في الخزان، أعلى بأكثر من المخزن المؤقت. تأكد من إضافة السوائل بعناية حتى لا الحصول على المحاصرين فقاعات الهواء في الخطوط-
    ملاحظة: من المهم إضافة السائل من نفس درجة الحرارة لتفادي صدمة ردها في الخلايا-
  4. قياس سرعة الخلية واستمرار استخدام برمجيات تحليل الهجرة (انظر الجدول للمواد لمزيد من التفاصيل) وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

استجابة الزمانية للمنظمين إنزيمية للتحفيز الميكانيكي الحادة

لتقييم استجابة الخلايا ديسكويديوم د للتحفيز الميكانيكي، تتعرض خلايا تجميع المختصة ملتصقة لنبضه قصيرة من تدفق القص. تجميع المختصة د ديسكويديوم الخلايا تفرز المخيم، التي يمكن أن تكون لمست بالخلايا المجاورة. للتغلب على مساهمة مما يشير إلى خلية خلية، تعامل الخلايا مع الكافيين، الذي يحول دون adenylyl cyclase في ديسكويديوم دال ، وهكذا يمنع إفراز المخيم28. والواقع أن الخلايا قبل التعامل مع الكافيين كان النشاط القاعدي منخفضة جداً من PKBR1 و ERK2، وأظهر زيادة قوية في الفسفرة المخلفات الرئيسية لهذه مؤنزم بعد التحفيز s 5 مع تدفق القص (الشكل 1A). وكانت الاستجابة عابرة وذروة حوالي 10-15 ثانية ل PKBR1، وحوالي 30 s ل ERK2، وبالمثل سابقا نشرت النتائج التي توصلت إليها لتفعيل هذه البروتينات مع تشيمواتراكتانت7.

على الرغم من أنه من الصعب تقييم كفاءة الاستجابة عند النظر في مستوى منخفض القاعدية، الدراسات الأولية التي أدت إلى وضع هذه المقايسة، مقارنة مع التحفيز مع تدفق القص وحدها (أو بسيارة) القص التدفق في حضور كل من معسكر تشيمواتراكتانت (الشكل 1B). هذا التحليل لم تظهر زيادة في الاستجابة مع المخيم، مما يوحي بأن الاستجابة لشبكة توصيل إشارة تدفق للقص مشبعة. على الرغم من أن في هذا التحليل لم يزد مخيم الفسفرة PKBR1، ويمكن ملاحظة استجابة الخلايا ل chemoattractant استخدام بروتوكول قياسي تحفيز حيث تحفظ الخلايا المختصة التجميع في التعليق، وحفز مع معسكر، وتفكيك في مختلف بعد تنشيط النقاط الزمنية. كما هو مبين في الشكل 1، في ظل هذه الظروف هناك بزيادة عابرة في الفسفرة PKBR1 ردا على تشيمواتراكتانت، ولكن ليس من المركبات. لوحظ استجابة الذروة في 30 ثانية في هذا التحليل لأن درجة حرارة تعليق خلية أثناء الفحص ~ 9 درجة مئوية، مقارنة ب ~ 22 درجة مئوية للتحفيز الميكانيكي الفحص المذكورة أعلاه26.

استجابة الزمانية المكانية الرائدة ومتخلفة عن علامات الحافة للتحفيز الميكانيكي الحادة

منذ المقايسة السكان أعلاه توفر فقط معلومات الزمانية حول السلوك المنظمين إنزيمية، الخلايا أيضا تعرضوا لحافز ميكانيكية قصيرة بينما يحتفل مجهر. يمكن إجراء هذا التحليل بتجميع المختصة أو الخضري خلايا ديسكويديوم دال- الإعراب عن مختلف أجهزة الاستشعار المسمى فلوريسسينتلي التعريب التي تم تعريفها في خلايا حفز مع تشيمواتراكتانت. الرائدة العلمين، المجال PH من قلعة والجيرΔcoil، الذي يتم تعيينهم من قبل PIP3 أو أكتين بلمرة حديثا، سواء أظهرت معظمهم سيتوسوليك التعريب في الخلايا يستريح كما ذكر سابقا (الشكل 2A، تكميلية الفيلم 1 )4،29. في الخلايا التي كانت بأسالي النشطة، يمكن أيضا أن ينظر هذه أجهزة استشعار العوامل البيولوجية على نصائح بسيودوبودس. بعد تنشيط مع تدفق القص 2 s، وأجهزة استشعار العوامل البيولوجية سرعة ريلوكاليزيد للقشرة مع ذروة في ~ 6 إلى 10 ق، وعاد إلى سيتوسول واسطة ~ 30 s. وفي المقابل، المترجمة علامة متخلفة عن حافة فتن في القشرة قبل التحفيز (الشكل 2A). بعد نبضة قصيرة مع تدفق القص، زيادة كثافة فتن سيتوسوليك، أن كان ذلك مع ديناميات أبطأ مما لهذه الأجهزة الرائدة. تغيير في التعريب بيوسينسور من سيتوسول القشرة، والعكس بالعكس، وضوح يعتبر تغييرا في كثافة سيتوسوليك السماح للقياس الكمي بسيطة للاستجابة.

السلوك الملاحظ من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة يتسق مع كبريات ومتخلفة عن حافة التعريب ديناميات استجابة للتحفيز مع chemoattractant موحدة. هذا السلوك لم يكن فريداً لهذه الأجهزة الثلاثة سيظهر. كما أيضا لوحظت تغييرات مماثلة سبق نشرها، وفي الترجمة لعلامات الرائدة RBD ورالجدس، التي تعترف المنشط Ras و Rap1، على التوالي، وكذلك فيما يتعلق بآخر متخلفة عن حافة علامة سينا22،30.

تحليل مماثل يمكن أن يستخدمها لتقييم آثار مختلف مثبطات بسيطة تعديل الإعداد التجريبية من سطر إدخال واحد إلى واحد مزدوج. باستخدام هذا الأسلوب، الخلايا يمكن أولاً تتعرض لظروف السيطرة، وتحولت بعد ذلك إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على وكيل الاختبار المطلوب. على سبيل المثال، إضافة للمخدرات ديبوليميريزينج أكتين ﻻتا حظر رد RBD، فضلا عن الجير،Δcoilلتحفيز الميكانيكية الحادة (الشكل 2).

استجابة عالمية تسبق الهجرة الخلية تحت التحفيز طويلة مع تدفق القص

ويمكن أيضا تكييف لدراسة آثار تدفق القص على الهجرة ديسكويديوم دال- النهج المذكور هنا. وفي الواقع، إذا لم تم إيقاف التدفق بعد 2 s لكنها ظلت طوال فترة التجربة، والخلايا النباتية وأظهرت موجه الهجرة ضد التدفق (الشكل 3، 2 فيلم تكميلية). تجدر الإشارة إلى أن تدفق القص اللازم للحصول على رد هجرة كان أقل من الضغط الذي كان يستخدم عادة لتحقيق استجابة عالمية مع تحفيز الحادة في الخلايا النباتية (على سبيل المثال، كما يتضح في الشكل 2). ومع ذلك، حتى عند ضغط أقل، عرض الخلايا ردا موحدا قويا، مقيسة بتغيير الجيرΔcoil التعريب، التي سبقت أي تغيير في موقف الخلية نفسها. وهكذا، هذه التجارب أظهرت بوضوح أن 1) الاستجابة العالمية لا يعتمد على حركة الخلية، وتسبق 2) الاستجابة العالمية موجه الهجرة.

نهج بديل لاختبار استجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة

على الرغم من أن استخدام الدائرة من خلال تدفق على مزايا واضحة لهذه الدراسة استجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة، ونحن أيضا التحقق من صحة اثنان فحوصات إضافية لاختبار استجابة الخلايا الفردية للتحفيز الميكانيكي الحادة. كما هو موضح في الشكل 4، الجيرΔcoil عابر وسرعة إعادة ترجمة من سيتوسول للقشرة عند حفز الخلايا بإضافة بولوس من المخزن المؤقت لتسليمها أما بواسطة ميكروبيبيتي (الشكل 4A) أو يدوياً باستخدام الجزء الأكبر إضافة المخزن المؤقت مع ماصة (الشكل 4 باء). تجدر الإشارة إلى أن عيب واضح لكل من هذه الاختبارات هو أن المبلغ المحدد لقوة القص تسليمها إلى الخلية غير معروف، ولا يمكن تغييرها بسهولة. ومع ذلك، لحالات حيث التبديل بين المنبهات الميكانيكية والكيميائية هو المطلوب، العازلة السائبة بالإضافة يقدم بديلاً صلبة للتحفيز في الجهاز تدفق.

Figure 1

رقم 1: الممثل نتائج تقييم البيوكيميائية لاستجابة الخلايا ديسكويديوم دال- إلى تحفيز الميكانيكية أو الكيميائية الحادة- تعرضت خلايا تجميع المختصة بالمنبهات الميكانيكية أو الكيميائية، تفكيك في النقاط الزمنية المشار إليها، واستخدام الأجسام المضادة التي تعترف إيمونوبلوتيد فوسفوريلاتيد PKBR1 أو ERK2. (أ) حفز الخلايا ملتصقة على شاكر مداري 5 s. كان الغشاء الملون مع أخذ الرائعة الأزرق (مصرف البحرين المركزي) لإظهار بروتين تساوي تحميل. (ب) حفز الخلايا ملتصقة بالحركة اليدوي من اللوحة بطريقة كروسويسي لحوالي 5 s بعد التحفيز الكيميائي بسبب إضافة لمعسكر 1 ميكرومتر أو المخزن المؤقت (المركبات)، أو بدون أي التحفيز الكيميائي (-). إيمونوبلوتس اثنين تظهر مدى الاختلاف في تفعيل القاعدية PKBR1 رأيت في الوقت 0. في بعض الأحيان، التنشيط بكبا يمكن أيضا يمكن كشفها بواسطة هذا الأسلوب، كما هو مبين في اللوحة السفلي. (ج) تعليق حفز الخلايا مع معسكر 1 ميكرومتر أو المخزن المؤقت (المركبات). تم تعديل الجزء (أ) من هذا العدد من أرتيمينكو وآخرون. (2016) 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: الممثل نتائج التحفيز الميكانيكي الحادة وتصوير مباشر للخلايا المفردة في المجهر. (أ) تجميع-الخلايا المختصة ديسكويديوم دال- إذ يعرب عن معلم RFP الجيرΔcoil، أو حفز الأس الهيدروجيني-قلعة معلم بروتينات فلورية خضراء أو فتن مع الاندفاق الصفحي أحادي الاتجاه في 15 داين/سم2 لجمع كل 3 من 2 إلى 5 س. الصور كانت s . تظهر الخلايا الممثل عرض إزفاء من أجهزة استشعار العوامل البيولوجية استجابة للتحفيز الميكانيكي. وكان كمياً تراكم كل بيوسينسور في القشرة معكوس كثافة هيولى يعني تطبيع للوقت 0. ويبين متوسط استجابة 18 (جيرΔcoil) أو 20 (PH-قلعة) 6 (فتن) الخلايا. القيم هي يعني ± سراج الدين-(ب) الإعراب عن معلم RFP الجيرΔcoilالخلايا النباتية-طلب تقديم العروض ومعلم بروتينات فلورية خضراء RBD يعاملون بالسيارة أو 5 ميكرومتر الساري لمدة 15 دقيقة على الأقل، ومن ثم حفز مع الاندفاق الصفحي أحادي الاتجاه في 41 داين/سم2 2 س. صور وقد جمعت كل 3 س. RBD-التجارة والنقل، والجيرΔcoil-RFP تراكم في القشرة كان كمياً كما هو الحال في (A). تكون القيم يعني ± سراج الدين. تتم الإشارة إلى العدد الخلايا التي تم تحليلها بجانب كل شرط. شريط المقياس = 10 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرتيمينكو et al. (2016) 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: الممثل النتائج لاستجابة الخلايا ديسكويديوم دال- إلى تحفيز المطولة مع تدفق- وتظهر الخلايا النباتية (A) التعبير عن معلم RFP الجيرΔcoil قد تعرضت لاستمرار تدفق الصفحي أحادي الاتجاه في 15 داين/سم2 وتصويرها كل المسارات س. 3 خلايا 11 في (ب). شريط المقياس = 10 ميكرون. وقد تم تعديل هذا الرقم من أرتيمينكو et al. (2016) 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: يؤدي الممثل للنهج البديلة لاختبار استجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة- (A) الخضري ديسكويديوم دال- الخلايا الجير معلم العروض إذ تعرب عنΔcoil تعرضوا ميكروبيبيتي (*) بسالي الإفراج عن المخزن المؤقت المقايسة بمعدل بطيء. قد تحقق زيادة قصيرة في معدل التدفق بالتسليم السريع بلعه لفحص المخزن المؤقت في الوقت 0. وجمعت الصور ميكانيكيا حفز كل 3 خلايا الخضري ديسكويديوم د س. (ب) الإعراب عن معلم RFP الجيرΔcoil مطلي كقطرة صغيرة في غرفة الفحص المجهري بإضافة كمية كبيرة من المخزن المؤقت إلى الدائرة. صور جمعت كل 3 س مقياس بار = 10 ميكرون. الجزء (أ) من هذا الرقم تم تعديله من أرتيمينكو et al. (2016) 22- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

فيلم تكميلية 1: التحفيز الميكانيكي الحادة مشغلات إزفاء سريعة وعابرة من الجيرΔcoil-طلب تقديم العروض أو الأس الهيدروجيني-قلعة-التجارة والنقل من سيتوسول للقشرة في تجميع المختصة ديسكويديوم دال- الخلايا الإعراب عن هذه أجهزة استشعار العوامل البيولوجية- تم تشغيله الاندفاق الصفحي أحادي الاتجاه ل 5 s في الوقت 0 وخلايا تم تصويرها فترات s 3. سرعة التشغيل 5 إطارات/ثانية. وترد أمثلة اثنين لكل خط الخلية. شريط المقياس = 10 ميكرون. هذا الفيلم يتوافق مع الشكل 2A وتم تعديله من أرتيمينكو et al. (2016) 22- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

فيلم تكميلية 2: التحفيز الميكانيكي المستمر مشغلات إزفاء سريعة وعابرة من الجيرΔcoil-طلب تقديم العروض من سيتوسول للقشرة قبل هجرة خلايا ضد اتجاه التدفق. الخلايا النباتية معربا عن الجيرΔcoilكانت تتعرض لإجهاد القص مستمرة في 15 داين/سم2 ابتداء من الساعة 0-طلب تقديم العروض وتصويرها على فترات s 3. سرعة التشغيل 10 إطارات/س. مقياس بار = 10 ميكرون. هذا الفيلم يتوافق مع الرقم 3 وقد نشرت سابقا في أرتيمينكو et al. (2016) 22- اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الأساليب الموصوفة هنا توفر طريقة مناسبة لتقدير كل من السكان وسلوك خلايا فردية في الاستجابة تدفق للقص. الأهم من ذلك، بينما تحليل الدراسات السابقة التعريب الرائدة ومتخلفة عن علامات الحافة أثناء الترحيل، يسمح النهج الحالي التحقيق في الآثار المباشرة بتطبيق تدفق القص حادة. باستخدام هذا الأسلوب أثبتنا أنه، في الواقع، الاستجابة الأولية للخلايا لإمالة تدفق لا تتطلب الهجرة الخلية. بدلاً من ذلك، يسبق الاستجابة السريعة وعابر لتحفيز تدفق القص الأولية هجرة اتجاهي ينظر مع التعرض المطول القص التدفق، وبالمثل للاستجابة العالمية الأولى ينظر إليها بتدرج تشيمواتراكتانت.

النهج البيوكيميائية والمجهرية التي تسفر عن بيانات تكميلية على الرغم من أن كل أسلوب له متميزة من مزايا وعيوب. على سبيل المثال، تحفيز تليها تحلل الخلايا وإيمونوبلوتينج بكبس وكرسب إيرك، يحلل جميع سكان من الخلايا والمتوسطات وهكذا تباين خلية إلى خلية، وخلافا الإنزيم الذي يدرس سلوك الخلية الفردية. ومع ذلك، الاختبارات المستندة إلى السكان تميل إلى قناع بعض التغييرات الطفيفة في سلوك الخلية التي يمكن ملاحظتها بسهولة عن طريق تحليل الخلايا الفردية. بالإضافة إلى ذلك، فحص البيوكيميائية الموضحة هنا الوحيد الفعال مع خلايا تجميع المختصة، للأسباب التي سيتم بحثها في وقت لاحق. على النقيض من ذلك، التحليل القائم على الفحص المجهري ريلوكاليزيشن RBD، رالجدس، ودرجة الحموضة-قلعة، والجيرΔcoilوفتن، على سبيل المثال، بين القشرة وسيتوسول فعالة للخلايا الخضري وتجميع المختصة على حد سواء، ويسمح بالتالي للملاحظات أن تطبق على نطاق واسع للخلايا بدرجات متفاوتة من الاستقطاب. ما الذي يجعل هذين النهجين التكميلية هو حقيقة أنها دراسة مجموعات مختلفة من علامات المتاحة الرائدة/متخلفة عن الحافة، وبالتالي توسيع نطاق تغطية الإشارات تنبيغ أكتين cytoskeleton شبكات واختبارها مع تحليل تدفق القص.

فإنه يظل من غير الواضح لماذا الخلايا النباتية، التي تستجيب قويا جداً في الاختبارات المستندة إلى الفحص المجهري، لا تستجيب للتحفيز تليها تحلل الخلايا وإيمونوبلوتينج. كما أن أحد الاحتمالات أن مقدار قوة القص المطبقة على الخلايا عند إجراء استدارة اللوحة لا يتطابق مع القوة من ذوي الخبرة بالخلايا الموجودة في دائرة تدفق. الخلايا المتقدمة، على النقيض من ذلك، قد يكون عتبة أدنى للتنشيط، والرد التالي، تحت أي ظرف من الظروف. من غير المرجح أن أجهزة استشعار العوامل البيولوجية ويقاس نشاطها بمقايسة البيوكيميائية لا يعبر عنها أو لا يتم تنشيط في الخلايا النباتية، حيث حفز الخلايا النباتية مع حمض الفوليك يؤدي إلى تنشيط قوي من PKBR1/بكبا و ERK2 (البيانات لا سيظهر). وعلاوة على ذلك، تظهر الخلايا النباتية توظيف واضحة لدرجة الحموضة-قلعة، الذي يعبر عن تراكم PIP3، في التحليل القائم على الفحص المجهري. منذ التعيين بكبا يعتمد أيضا على PIP3، يبدو من غير المحتمل أن بكبا لا تستجيب للتحفيز الميكانيكي الحادة، ما لم تكن الشروط الواردة في المقايسة الحيوية ليست الأمثل كما هو مذكور أعلاه. ويبقى هذا مجالاً من مجالات التحقيق النشط.

تحليل الكيمياء الحيوية من المنظمين إنزيمية يتطلب وجود الكافيين طوال التجربة. أصلاً تمت إضافة الكافيين إلى منع مما يشير إلى خلية إلى سبب إفراز مخيم. ومع ذلك، يبدو أن الكافيين قد دور آخر بالإضافة إلى تثبيط adenylyl cyclase (ACA) منذ خلايا فارغة هيئة مكافحة الفساد لا تزال مطلوبة الكافيين الفسفرة PKBR1 في الاستجابة للتحفيز الميكانيكي الحادة. الكافيين ثبت سابقا لمنع نشاط TorC226. فمن الممكن أن تثبيط TorC2 حظر بعض الحركة القاعدية للخلايا، وهكذا خفضت تفعيل PKBR1 القاعدية والمكونات الأخرى للشبكات cytoskeleton أكتين وتوصيل الإشارات. انخفاض النشاط القاعدي أمر حتمي لمراقبة استجابة لتدفق للقص. في الواقع، عندما تم جمع الخلايا في نقاط زمنية سابقة أثناء التطوير، أظهروا تزايد النشاط القاعدي واستجابة انخفاض تدفق قص التي يسببها. من المثير للاهتمام، ومن المعروف أن الخلايا النباتية نشاط بكبا أكثر نسبيا وأقل PKBR1 بالمقارنة مع البلدان المتقدمة النمو الخلايا31. فمن الممكن أن تنظم الدولة القاعدية بشكل مختلف إلى حد ما في الخلايا النباتية وتجميع المختصة، مما ساهم في عدم وجود استجابة خلايا النباتية في مقايسة البيوكيميائية. والغريب عندما تم جمع الخلايا عند نقطة لاحق للتنمية، كما كان استجابة مخفضة، احتمالاً بسبب التأثير القوى للأقطاب في التعريب وتفعيل مختلف المنظمين إنزيمية التي درست في هذا التحليل.

وكشفت تحفيز الخلايا في غرفة الفحص المجهري أن يسهم كل من القوة ومدة التحفيز الاستجابة القصوى22. وبعبارة أخرى، يمكن أن يتحقق استجابة قصوى حتى مع قوة قص منخفض إذا كان تطبيقه لفترة طويلة من الزمن (10 s مقابل 2 s). وهذه الملاحظة يفسر لماذا يكون الخلايا استجابة عالمية أولية عندما تعرضوا أولاً لحافز مستمر، ولكنها ضعيفة، أن يؤدي إلى القص الناجمة عن تدفق الهجرة. مع الجهاز الحالي، وكنا غير قادر على توليد تدفق القص منخفضة بما يكفي للتحقيق في الطرف الأدنى من النطاق.

ربما، أهم الآثار المترتبة على الدراسات التي أجريت باستخدام التحفيز الميكانيكي الحادة ظهور المحفزات كل الميكانيكية والكيميائية لتغذية شبكات cytoskeleton أكتين وتوصيل الإشارة المشتركة. على الرغم من أن أظهرنا أن المحفزات هما إدماج استخدام إضافة المخزن الأكبر لتحفيز الميكانيكية، الدراسات المستقبلية سوف تهدف إلى تطوير نظام حيث يمكن أن يتم تسليم تشيمواتراكتانت سرعة في التدفق من خلال القناة، التي ستكون أكثر تنوعاً ووسيلة قوية لتقييم التكامل للمنبهات الميكانيكية والكيميائية. ولسوء الحظ، إضافة تشيمواتراكتانت باستخدام الإعداد الحالي سطرين يرتبط بحافز تدفق قص ثاني نظراً تشيمواتراكتانت يجب أن يتم تسليمها حضور التدفق. قد يكون بديلاً صالحاً الليزر حفز الإفراج عن تشيمواتراكتانت من سليفة محبوس كما يتضح بنجاح للمعسكر من ويستيندورف وآخرون. 32-في المستقبل، وسيكون أيضا مثيرة للاهتمام دراسة تكامل محفزات الأخرى، على سبيل المثال، القص تدفق والمجالات الكهربائية المتغيرة، أو إمالة تدفق وصلابة الركازة متغير. المثال الأخير مثيرة للاهتمام لأنها تنطوي على نوعين من التحفيز الميكانيكي، وعلى الرغم من استقبال إشارة أولية قد تختلف فيما بينها. يؤكد أن جميع المحفزات التي تحفز الهجرة الموجهة تتقاسم نفس إشارة توصيل الشبكة وتختلف فقط في كيف ينظر إلى الحافز الذي سوف اشرح كيف يمكن التنقل الخلايا في البيئات المعقدة. وأخيراً، نحن أثبتت بالفعل أن التحفيز الحاد مع تدفق القص ويؤدي إلى انتشار الخلايا العَدلات مثل البشرية22. سوف تواصل دراسة العمل في المستقبل التعريب وتفعيل مختلف مكونات إشارة أكتين وتوصيل الشبكات سيتوسكيليتون بالمنبهات الميكانيكية في خلايا الثدييات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل المعاهد الوطنية للصحة منحة R35 GM118177 للحزب الوطني الديمقراطي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

البيولوجيا الخلوية، 129 قضية، توصيل الإشارة، ميتشانوترانسدوكشن، إجهاد القص، إنزيمية، رهيوتاكسيس، والقص الناجمة عن تدفق الهجرة، والهجرة الموجهة، التعريب biosensor، التحفيز الحادة
تقييم لاستجابة <em>ديسكويديوم ديكتيوستيليوم</em> "تحفيز الميكانيكية الحادة"
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter