Beoordeling van Dictyostelium discoideum reactie op Acute mechanische stimulatie

Summary

Hier beschrijven we methoden voor de beoordeling van de cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie. In de microscopie gebaseerde assay onderzoeken we lokalisatie van fluorescently-geëtiketteerden biosensoren na korte stimulatie met schuintrekken stroom. We testen ook activering van verschillende eiwitten van belang in reactie op acute mechanische stimulatie biochemically.

Abstract

Chemotaxis, of de migratie van een verloop van een chemoattractant, is het best te begrijpen wijze van gestuurde migratie. Studies met behulp van sociale amoeba Dictyostelium discoideum bleek dat een complex signaaltransductie netwerk van parallelle trajecten de respons op chemoattractants versterkt, en leidt tot vooringenomen actine polymerisatie en uitsteeksel van een pseudopod in de richting van een verloop. Moleculaire mechanismen rijden van andere soorten gestuurde migratie, bijvoorbeeld als gevolg van blootstelling aan het schuintrekken stroom of elektrische velden, zijn daarentegen niet bekend. Vele regulatoren van chemotaxis vertonen lokalisatie bij de regelafstand of de achterblijvende hoek van een cel, migreren, evenals tijdelijke wijzigingen worden weergegeven in de lokalisatie of activering na globale stimulatie met een chemoattractant. Om te begrijpen van de moleculaire mechanismen van andere soorten gestuurde migratie ontwikkelden we een methode waarmee onderzoek van cellulaire reactie op acute mechanische stimulatie op basis van korte (2-5 s) blootstelling aan stroom schuintrekken. Deze stimulatie kan geleverd worden in een kanaal terwijl imaging cellen uiten fluorescently-geëtiketteerden biosensoren te onderzoeken van de individuele cel gedrag. Bovendien kan celpopulatie worden gestimuleerd in een plaat, lysed, en immunoblotted met behulp van antilichamen die actieve versies van proteïnen van belang herkent. Door het combineren van beide tests, kan men een breed scala van moleculen geactiveerd door veranderingen in subcellular localisatie en/of fosforylatie onderzoeken. Using zulks werkwijze vastbesloten wij dat acute mechanische stimulatie activering van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken activeert. De mogelijkheid te onderzoeken van cellulaire reacties op acute mechanische stimulatie is belangrijk voor het begrijpen van de initiatiefnemende gebeurtenissen nodig zijn voor de beweeglijkheid van de stroom-geïnduceerde schuintrekken. Deze aanpak biedt een instrument voor de studie van de Chemotactische signaaltransductie netwerk zonder de storende invloed van de chemoattractant receptor.

Introduction

Migratie van eukaryotische cellen is bevooroordeeld door middel van diverse chemische en fysische signalen in het milieu, met inbegrip van gradiënten van oplosbare of substraat-gebonden chemoattractants, variabele stijfheid van de substraten, elektrische velden of schuintrekken stroom. Hoewel er al veel vooruitgang in ons begrip van de moleculaire mechanismen chemotaxis rijden, minder is gekend over andere soorten gestuurde migratie en hoe deze uiteenlopende signalen zijn geïntegreerd op cellulair niveau tot een uniforme trekkende reactie.

Regie migratie naar een toenemende concentratie van een chemoattractant omvat drie gedrags componenten: beweeglijkheid, directionele sensing en polariteit¹. Motility verwijst naar willekeurige verkeer van cellen bereikt door pseudopod uitsteeksel. Directionele sensing is de mogelijkheid van een cel om de oorzaak van een chemoattractant worden opgespoord, die kan optreden zelfs in cellen geïmmobiliseerd. Polariteit verwijst naar de meer stabiele asymmetrische distributie van intracellulaire componenten tussen de leading en lagging rand van een cel, die tot verhoogde persistentie in beweging leidt.

Cellulaire reactie op een chemoattractant hangt af van de activiteit van vier conceptueel gedefinieerde regulerende netwerken: receptor / G eiwit, signaaltransductie, actine cytoskelet en polariteit¹. Chemoattractant binding aan de G eiwit-gekoppelde receptor stuurt het signaal via heterotrimeric G eiwitten α en βγ op het stroomafwaarts signaaltransductie netwerk, dat het signaal directionele versterkt. Meerdere trajecten binnen het netwerk signaaltransductie handelen in parallel en worden meegenomen bij het actine cytoskelet netwerk aan bias actine polymerisatie, en daaruit voortvloeiende pseudopod uitsteeksel, in de richting van het verloop. Belangrijke regulatoren van chemotaxis behoren tot Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K) fosfatase en Tenzin homolog (PTEN) en guanylyl cyclase. Feedbackmechanismen binnen het netwerk signaaltransductie en tussen de signaaltransductie en actine cytoskelet netwerken verder versterken het antwoord. Ten slotte, het slecht gedefinieerde polariteit netwerk ontvangt input van het cytoskelet actine, en verder vooroordelen het signaaltransductie netwerk ter bevordering van permanente migratie in de richting van het verloop.

Veel van onze mechanistische begrip van chemotaxis werd mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescently-tagged biosensoren voor verschillende onderdelen van de regulerende netwerken. Vele chemotaxis toezichthouders hebben een asymmetrische verdeling van de regelgevende molecuul zelf of haar activiteit. Bijvoorbeeld, biosensoren die herkent geactiveerd versies van kleine GTPases Ras en Rap1-Ras-bindende domeinen van Raf1 (hierna aangeduid als RBD hier) en RalGDS, respectievelijk – lokaliseren naar de voorrand van een chemotaxing cel^2,3. Evenzo PI3K en haar product phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), erkend door een pleckstrin-homologie (PH) domein, Toon ook lokalisatie aan de voorzijde van een cel^4,5. In tegenstelling, een 3-fosfatase-PTEN, die worden omgezet in PIP3 terug phosphatidylinositol (4,5)-difosfaat, lokaliseert aan de rand van de achterstand van de cel-⁶. Nog belangrijker is, is deze biosensoren wijzigen hun lokalisatie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant. Leading edge markers, die cytosolische of op de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, relocalize naar de cortex, overwegende dat achtergebleven rand markeringen, die corticale lokalisatie en zijn afwezig vanaf de toppen van de uitsteeksels in een cel rusten, worden cytosolische na stimulatie. Analyse van biosensor distributie in reactie op de wereldwijde stimulatie met een chemoattractant minimaliseert de bijdrage van de motiliteit en polariteit, die vaak de opmerkingen verwarren. Globale of uniforme stimulatie van een celsuspensie met een chemoattractant wordt ook gebruikt als een instrument voor het beoordelen van wijzigingen voor de gehele bevolking in eiwit activering, vaak gedetecteerd door proteïne fosforylatie^7,8,9 . Deze biochemische bepaling wordt voornamelijk gebruikt voor temporele informatie, terwijl microscopie wordt gebruikt om zowel temporele en ruimtelijke informatie verzamelen over het gedrag van verschillende onderdelen van de regulerende netwerken.

Het signaaltransductie netwerk omvat functies van een prikkelbaar systeem^10,11. Reacties op supra-drempel Chemotactische stimuli zijn "all-or-none" en vuurvaste punten weergegeven. Reacties zijn ook stochastically geactiveerd en oscillerende gedrag kunnen tonen. Signaaltransductie gebeurtenissen zijn gelokaliseerd aan regio's van de cortex die als golven^{12,13,14,15 verspreiden}. Voorste, terug, markeringen worden gerekruteerd voor of distantiëren van, de actieve zones van het teeltmateriaal golven. Als gevolg van de achterstand van de actieve zone vuurvaste regio vernietigen de tegengesteld gerichte golven als ze elkaar ontmoeten. Het teeltmateriaal signaaltransductie golven ten grondslag liggen aan de cellulaire uitsteeksels die cel migratie¹⁰bemiddelen.

Veel van de bovengenoemde informatie over chemotaxis kwam van de studies op de sociale Amoebe Dictyostelium discoideum, hoewel soortgelijke regulerende mechanismen zijn ook van toepassing op de neutrofielen en andere zoogdieren cel typen¹⁶ . Dictyostelium is een reeds lang gevestigde modelorganisme dat een robuuste Chemotactische reactie tijdens hongersnood, heeft wanneer duizenden afzonderlijke cellen naar een aggregatie midden migreren, uiteindelijk de vorming van een meercellig fruiting body met sporen. Chemotaxis is ook essentieel in de fase van de eencellige groei van dit organisme voor het lokaliseren van bacteriële voedselbronnen. Belangrijker, is migratie van afzonderlijke Dictyostelium cellen opvallend vergelijkbaar met de migratie van zoogdieren neutrofielen of metastatische kankercellen, die allemaal zeer snelle Wortelpotigen-type migratie ondergaan. In feite, worden zowel de algemene topologie van de regulerende netwerken, evenals veel van de individuele signaaltransductie trajecten die betrokken zijn bij chemotaxis bewaard tussen Dictyostelium en zoogdieren leukocyten¹⁷. Bovendien andere cellen, zoals fibroblasten, receptor tyrosine kinases (RTK) gebruiken in plaats van GPCRs; RTKs kunnen echter voeden in soortgelijke netwerken.

In tegenstelling tot chemotaxis ontbreekt grondig inzicht in de signalering mechanismen die verschillende andere vervoerswijzen gestuurde migratie rijden. Ook naar cellen migreren in een chemoattractant verloop verscheidene studies hebben gemeld activering en/of de lokalisatie van typische voorrand markers, met inbegrip van actine polymerisatie, PIP3 en/of extracellulaire signaal-gereglementeerde kinase (ERK) 1/2, op de voorkant van cellen ondergaan regisseerde migratie in reactie op stroom of veranderingen in elektrische velden^18,19,20,21schuintrekken. Echter, in deze studies continue blootstelling aan de prikkel ook resulteerde in cel migratie, bloot de vraag, bijvoorbeeld, de toonaangevende markers lokaliseren speciaal in reactie op een prikkel, of als ze gewoon lokaliseren op de voorrand vanwege toegenomen aantal pseudopods aan de voorzijde van een migreren cel.

We ontwikkeld testen die ons toelaten te observeren de reactie van cellen op acute mechanische perturbation geleverd als schuintrekken stroom zowel op het bevolkingsniveau en als afzonderlijke cellen²². Vergelijkbaar met de globale stimulatie met een chemoattractant, acute stimulation met schuintrekken stroom maakt de studie van een cellulaire reactie op een mechanische prikkel zonder de storende bijdrage van beweeglijkheid of polariteit. Deze biochemische en microscopische tests te combineren met genetische of farmacologische verstoringen ons toelaat om te leren over hoe mechanische stimuli worden waargenomen en verzonden. Bovendien biedt deze aanpak ook een nieuwe methode voor te tikken in het systeem stroomafwaarts van de chemoattractant receptor in het ontbreken van een chemoattractant, waardoor het isoleren van de netwerken van de signaal transductie en actine de cytoskelet van de receptor/G eiwit netwerk.

Met behulp van de technieken die hieronder we onlangs aangetoond dat acute shear stress leidt tot activatie van meerdere onderdelen van de Chemotactische signaal transductie en actine cytoskelet netwerken²². Door de acute mechanische stimulus toe te passen op verschillende tijdstippen, we laten zien dat ook aan chemoattractants, reactie op mechanische stimuli ook kenmerken van een prikkelbaar systeem vertoont, met inbegrip van het all-or-none gedrag van de reactie onder verzadigen van de voorwaarden en de aanwezigheid van een refractaire periode. Tot slot, door een combinatie van mechanische en chemische stimulatie we bleek dat de twee prikkels aandeel signaal transductie en actine cytoskelet netwerken, waardoor waarschijnlijk voor de integratie van meerdere stimuli bias cel migratie.

Protocol

1. bereiding van de oplossingen

1. bereiden HL-5 media met behulp van de volgende handelingen uit: 10 g/L dextrose, 10 g/L proteose pepton, gistextract 5 g/L, 0.965 g/L Na ₂ HPO ₄ ·7H ₂ O, 0.485 g/L KH ₂ PO ₄, en, tenzij anders aangegeven, 0,03 g/L streptomycine in gedeïoniseerd water. Autoclaaf het medium en winkel bij kamertemperatuur.
   Opmerking: Als gevolg van verschillen tussen proteose pepton en gist extract verworven van verschillende leveranciers, alsmede tussen individuele partijen, pH van de media dienen te worden aangepast aan de typische aantal 6.4 tot en met 6.7.
2. Bereiden SM platen met behulp van de volgende handelingen uit: 10 g/L dextrose, pepton 10 g/L, 1 g/L gist extract, 2,31 g/L KH ₂ PO ₄, 1 g/L K ₂ HPO ₄ en 20 g/L agar in gedeïoniseerd water. Autoclaaf, cool, en giet 30 mL van de oplossing van de agar per 10-cm petrischaal. Zodra de agar stolt, slaan de platen bij 4 ° C voor maximaal 1 maand.
3. Voorbereiden 10 x fosfaat Buffer (PB) met behulp van 13.4 g/L Na ₂ HPO ₄ ·7H ₂ O en 6,8 g/L KH ₂ PO ₄ in gedeïoniseerd water. De 10 x voorraad bewaren bij 4 ° C. Dilute tot 1 x met gedeïoniseerd water voor gebruik.
4. Bereiden DB Buffer door haar aan te vullen 1 X PB met 2 mM MgSO ₄ en 0,2 mM CaCl ₂.
5. Voorbereiden 100 mM cafeïne in gedeïoniseerd water. Bewaren bij − 20 ° C.
6. Bereiden 100 mM cAMP stockoplossing door ontbinding van cAMP natrium zout monohydraat in gedeïoniseerd water. Bereiden een 1 mM werken voorraad in gedeïoniseerd water. Opslaan van beide stamoplossingen op − 20 ° C. voorbereiden cAMP eindoplossing op de gewenste concentratie in DB op de dag van het experiment.
   Opmerking: Voorraad oplossingen kunnen bevriezen-ontdooid een paar keer.
7. Voorbereiden 25 mM foliumzuur in 1 x PB. Voeg een paar druppels 1 N NaOH tot het poeder volledig oplost. Bewaren bij − 20 ° C.
8. Bereiden 3 x monster buffer met behulp van het volgende: 187,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 6% (m/v) natrium dodecyl sulfaat (SDS), 30% glycerol, 126 mM dithiothreitol en 0,03% (m/v) bromophenol blauw. Aliquot en winkel op − 20 ° C.
   1. Prior te gebruiken, ontdooien in een waterbad 37 ° C en gaat u verder met het bereiden van monster buffer met protease en phosphatase inhibitors door verdunnen 3 x monster buffer tot 1 x, en het toevoegen van 50 mM NaF, 2 mM nb ₃ VO ₄, 25 mM natrium pyrofosfaat en 1 x volledige EDTA-vrije proteaseinhibitor cocktail in gedeïoniseerd water. Voeg de remmers onmiddellijk voordat de procedure in stappen 3.1.2-3.1.3.
9. 5 mM Latrunculin A oplossing in DMSO bereiden. Aliquot en winkel op − 20 ° C.

2. Voorbereiding van D. discoideum cellen

Opmerking: D. discoideum cellen in HL-5 media te handhaven hetzij in weefselkweek platen of een schorsing van de cultuur zoals eerder beschreven ²³. Indien nodig, transformatie cellen met fluorescently-geëtiketteerden biosensoren volgens standaard electroporation protocollen ²⁴. Verschillende stammen van D. discoideum, evenals plasmiden codering biosensoren of andere genen van belang kunnen worden verkregen bij de Dicty voorraad Center (dictybase.org).

1. Groei en verzameling cellen van de vegetatieve D. discoideum
   1. voor analyse van vegetatieve cellen, groeien cellen in aanwezigheid van bacteriën te verminderen van het aantal macropinosomes, die gewoonlijk worden waargenomen in axenically-gekweekte cellen ²⁵.
      1. Voorbereiden een cultuur van Klebsiella aerogenes door het enten van een klein aantal cellen uit een voorraad van glycerol of uit een vorige cultuur in de gewenste omvang van de HL-5 medium zonder antibiotica. Incubeer bacteriecultuur op een roteerschudapparaat op 200 rpm (0,42 x-g) bij kamertemperatuur (20-22 ° C) voor 16-18 h.
         Opmerking: De K. aerogenes stam die hier gebruikt is niet-pathogene (Zie de Tabel van de materialen).
   2. D. discoideum verzamelen in de fase van de exponentiële groei van weefselkweek platen of van een schorsing cultuur, en de cellen met behulp van een hemocytometer volgens fabrikant rekenen ' s instructies. 1 x 10 ⁵ D. discoideum cellen met 260 µL K. aerogenes vering op een SM-plaat verspreid. Zet de plaat opwaartse beneden de volgende dag. Groeien van cellen bij kamertemperatuur totdat de D. discoideum cellen beginnen het bacteriële gazon wissen maar voordat ze beginnen met aggregeren (~ 36-48 h).
   3. Collect D. discoideum cellen in 5 mL DB buffer door hen te schrapen met een glas strooier. Cellen overbrengen in een polypropyleen tube van 50 mL. Spoel de plaat met een andere 5 mL DB buffer en zwembad met de oorspronkelijke schorsing. Vullen van de buis tot 50 mL met DB buffer.
   4. De schorsing van de D. discoideum bij 360 x g centrifuge voor 3-4 min. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 50 mL DB Buffer. Herhaal de stappen wassen totdat het supernatans is duidelijk (~ 3 tot en met 4 wasbeurten). Resuspendeer de pellet van de laatste cel in de buffer van de DB aan een definitieve dichtheid van ~ 5 x 10 ⁶ cellen/mL.
2. Voorbereiding van aggregatie-cellen van de bevoegde D. discoideum
   1. ontwikkelen D. discoideum cellen door 1 h verhongering gevolgd door 4 h van honger en pulserende met 50 nM kamp elke 6 min volgens norm protocollen ²³.
   2. Na ontwikkeling, het meten van het uiteindelijke volume van de celsuspensie.
   3. Op basis van het aantal cellen die worden gebruikt voor ontwikkeling, berekenen celdichtheid van de definitieve opschorting.
      Opmerking: Als kamp wordt geleverd in 100 volume-eenheden µL elke 6 min, cel volume verhoogt met 1 mL voor ieder uur van cAMP pulserende. Dus, voor de standaardvoorwaarden 8 x 10 ⁷ cuvetten in DB 4 mL, na 4 uur van ontwikkeling het eindvolume is 7 mL en de definitieve celdichtheid is ~1.1 x 10 ⁷ cellen/mL.

3. Biochemische analyse van cel reactie op mechanische of chemische stimulatie

1. Acute mechanische stimulatie van cellen gevolgd door Lysis van de cel
   1. plaat 2 x 10 ⁶ aggregatie-bevoegde cellen (uit stap 2.2) na 4 uur van ontwikkeling in 35-mm gerechten met 2 mL DB. De cellen te voegen gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur toestaan. Wassen cellen tweemaal met 1 mL DB. Incubeer de cellen in DB met 2.5 mM cafeïne voor 30 min zonder enige verstoring van de platen.
      Opmerking: Als cellen worden behandeld met een farmacologische remmer moeten, gewenste concentratie van remmer of toevoegen dezelfde hoeveelheid geschikt vehiculum tijdens basalation met cafeïne.
   2. Aanbrengen mechanische stimulatie, plaatst u de plaat (één tegelijk) op een roteerschudapparaat en onmiddellijk het inschakelen bij 150 rpm (0,24 x g) voor 5 s.
      Opmerking: De plaat kan ook handmatig gestimuleerd worden door beweging op een cross-wise wijze voor ongeveer 5 s.
   3. Aspirate de buffer op de aangegeven tijden na het begin van de stimulatie. Onmiddellijk lyse de cellen door toevoeging van 100 µL monster buffer met protease en phosphatase inhibitors.
   4. Plaats van de plaat op ijs, en de lysate verzamelen in een 1.5-mL-buis. Voor ' tijd 0 ', lyse de cellen zonder schudden. De buizen overbrengen in een blok warmte 95 ° C gedurende 10 minuten direct na lysis. Doorgaan met immunoblotting of slaan lysates bij -20 ° C.
2. Stimulatie van cellen met een Chemoattractant
   1. Basalate aggregatie-bevoegde cellen na 4 uur van ontwikkeling door hen snel schudden in het bijzijn van 5 mM cafeïne 200 rpm (0,42 x g) op een roteerschudapparaat gedurende 30 minuten.
      1. Centrifuge de celsuspensie op 360 x g voor 3-4 min. gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet in 10 mL ijskoud DB Buffer. Herhaal de stap wassen.
   2. Resuspendeer de pellet van de laatste cel in ijskoude DB buffer met een definitieve dichtheid van 4 x 10 ⁷ cellen/mL op basis van de oorspronkelijke cel nummer gebruikt voor de ontwikkeling van de cellen (zie stap 2.2). Houden van de celsuspensie op ijs voorafgaand aan stimulatie.
      1. Pipet 50 µL van 10 µM kamp of het voertuig in een polystyreen beker geplaatst op een roteerschudapparaat.
   3. Om te stimuleren van de cellen, voeg 450 µL van de ijskoude celsuspensie in de dezelfde beker en onmiddellijk inschakelen in het roteerapparaat bij 200 rpm (0,42 x g). Op verschillende momenten na het begin van de stimulatie (bijvoorbeeld 10, 30, 45, 60, 120 s), kort stoppen de shaker nemen 50 µL aliquots van celsuspensie en lyse de cellen toevoegen door deze naar 1,5 mL tubes met 25 µL 3 X monster buffer.
      1. Voor ' tijd 0 ', gebruikt de cellen uit de ongestimuleerde ijskoude celsuspensie.
         Opmerking: De eindtemperatuur van de celsuspensie tijdens stimulatie is ~ 9 ° C ²⁶. Onder deze omstandigheden de piek reactie iets later plaatsvindt dan de piek voor stimulatie uitgevoerd bij kamertemperatuur (bijvoorbeeld, chemoattractant stimulatie van het aanhangend cellen op de Microscoop of mechanische stimulatie van het aanhangend cellen).
   4. De buizen overbrengen in een blok warmte 95 ° C gedurende 10 minuten direct na lysis. Doorgaan met immunoblotting of slaan lysates bij -20 ° C.
3. Analyse van de reactie van de cel door Immunoblotting
   1. lysates (vanaf stappen 3.1.3 of 3.2.4) draaien op een 4-15% Tris-HCl polyacrylamidegel, overbrengen naar een Polyvinylideenfluoride fluoride membraan, blok en immunoblot met phospho-PKC Ζ Thr410 (voor het opsporen van phospho-PKBR1 en phospho-PKBA). Het signaal te detecteren door incubatie met horseradish peroxidase-geconjugeerd anti-konijn secundair antilichaam, gevolgd door Chemoluminescentie met behulp van Verbeterde Chemiluminescentie substraat.
   2. Voor de detectie van meerdere eiwitten, strippen de vlek met strippen buffer, en opnieuw sonde met een primair antilichaam tegen phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (te detecteren phospho-ERK2). Bevestigen van gelijke eiwit laden door de Polyvinylideenfluoride fluoride membraan met Coomassie briljant blauw kleuring.

4. Acute mechanische stimulatie en Live Imaging van afzonderlijke cellen op de Microscoop

1. beoordeling van het antwoord op acute mechanische stimulatie met behulp van een apparaat van de stroom
   1. verzamelen en Verdun vegetatieve of aggregatie-bevoegde cellen op ~ 1 x 10 ⁶ cellen/mL in DB zoals beschreven in stap 2.1 en 2.2, respectievelijk. ~ 600 µL laden in de dia. met een kanaal (Zie de Tabel van materiaal voor details). Toestaan dat cellen koppelen voor 10 min. ervoor te zorgen dat alle van de inhammen in de dia zijn volledig gevuld. Op de top met extra buffer zonodig.
      Opmerking: Het bepaalde dia gebruikt voor analyse heeft drie ingangen, die voeden in smalle, 1-mm kanalen, maar vervolgens samen te voegen tot één breed, 3 mm-kanaal. De hoogte van het kanaal is 0,4 mm. Hoewel de cellen zijn verguld in het kanaal, alleen het brede gedeelte is beeld.
   2. Geven een van de lijnen die is gekoppeld aan een 50 mL-reservoir via het voorste juiste ventiel van de fluidic eenheid (Zie de Tabel van materialen voor details). Met behulp van de software voor de pomp, zorg ervoor dat de klep is gesloten (d.w.z. aan de linkerkant). Vul het reservoir met DB.
      1. De druk vastgesteldop 50 mbar en zet hem aan. Vul in en spoel de regel met DB door te klikken op het ventiel om het te openen. Draai de druk terug naar 0 en sluit het ventiel na ~ 30 s.
   3. De lijn aansluit op één van de drie inhammen aan de ene kant van de dia zonder overvulling van alle luchtbellen. Sluit de andere twee baaien. Sluit de lijn van de afvoer aan de inlaat van de één op de tweede zijde van de dia..
      Opmerking: De buis gebruikt voor de input en afvoer lijnen in deze setup heeft een inwendige diameter van 1,6 mm.
   4. Plaats de dia op de Microscoop onder een 20 X lucht doelstelling. Om de spoel het kanaal, schakelen de klep te openen van de regel en klik op " druk op ", startende bij hogere druk (~ 50 mbar of ~ 40 dyn/cm ²) om de vloeistof erdoor tot de drain.
      1. Zodra de vloeistof uit de afvoer komt, externe druk te verminderen tot nul (dwz. zwaartekracht flow alleen, ~ 15 dyn/cm ²), en blijven spoelen voor ~ 30 s. Switch de klep naar de tegenovergestelde positie om te stoppen met de stroom.
   5. Beelden met RFP of GFP verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop onder een 40 X olie doelstelling 3 s tussenpozen te verwerven. Met de klep in de gesloten stand, zet de druk op de gewenste druk, meestal tussen de 15 en 40 dyn/cm ² (0 - 50 mbar).
   6. Na het verwerven van 5 beelden, leveren de stimulans door over te schakelen van de klep aan de " open " positie. De stroom uit te schakelen na 2-5 s door over te schakelen van de klep aan de tegenovergestelde richting.
      Opmerking: Voor bepaalde zwakkere biosensoren (b.v. PTEN, CynA en RalGDS) het kan noodzakelijk zijn naar afbeelding cellen met een confocal microscoop uitgerust met een 40 X olie doelstelling.
2. Testen effecten van farmacologische remmers op reactie op acute mechanische stimulatie met behulp van een apparaat van de stroom
   1. cellen in de dia met een kanaal plaat, zoals beschreven in stap 4.1.1. Twee regels instellen: een paslijn via het voorste juiste ventiel zoals in stap 4.1.2, en de tweede tot en met de rug links ventiel. Klem de lijn links en zet de klep in de " gesloten " positie (links). Vul een regel met DB met het juiste voertuig, en de tweede met de oplossing die een farmacologische inhibitor van belang (b.v. 5 µM Latrunculin A).
      Opmerking: Er moet fysiek klem de linker lijn omdat de " gesloten " linkerpositie opent de klep voor die lijn.
   2. Vulling en spoel het recht lijn door het aanzetten van de druk op 50 mbar en schakelen de klep aan de " open " (rechts) positie. Schakel de klep naar links na ~ 30 s. vulling en de lijn links door het verwijderen van de klem voor ~ 30 s. Connect spoel beide lijnen aan twee van de inhammen aan de ene kant van de dia met een kanaal, sluit de resterende inlaat en sluit de afvoer aan de inlaat van de één op de tweede zijde. < / l Ik >
   3. wassen van de dia met de buffer in de juiste koers en het uitvoeren van stimulatie in de dezelfde buffer zoals beschreven in stappen 4.1.3 en bovenstaande 4.1.4.
      Opmerking: Hoewel de juiste lijn werd gekozen als de eerste in deze opstelling, de volgorde kan worden omgekeerd.
   4. Na stimulatie, schakelen de klep om te openen de juiste lijn op nul druk (dwz de zwaartekracht stroom alleen, ~ 15 dyn/cm ²). Verwijder de klem van de lijn links en schakelt het ventiel naar links om het openen van die lijn. De eerste regel klem.
   5. Na het uitvoeren van 3-5 mL buffer met remmer via, de klep naar het recht om te stoppen met de stroom, en Incubeer de cellen met de Inhibitor van de omwenteling voor de vereiste lengte van tijd (bijvoorbeeld 15 min). De stroom inschakelen door over te schakelen van het ventiel elke ~ 10 min. voor ~ 15 s om te voorkomen dat zuurstof ontbering. Herhaal stimulatie met de tweede lijn.
3. Alternatieve methode voor de beoordeling van de reactie op acute mechanische stimulatie met behulp van een micropipet
   1. de micropipet gevuld met DB volgens standaard protocol ²³ instellen. Compensatie druk blijven uitoefenen op 1.500 psi.
   2. Verzamelen en Verdun vegetatieve cellen zoals beschreven in stap 2.1. Plaats 25 µL druppels ~7.5 x 10 ⁵ cellen/mL in een zaal 1-well laat houden gedurende ten minste 10 minuten, en bedek met 3 mL DB.
   3. Plaats de zaal op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X olie doelstelling. De cellen te zoeken. Zachtjes lager het micropipet in het midden van het gezichtsveld totdat het eerst de bodem van de kamer raakt.
      Opmerking: Aangezien de compensatie druk werd vastgesteld op 1500 Psi, de cellen zal worden voortdurend blootgesteld aan een zeer langzame stroming van DB aan de micropipet.
   4. Beginnen met RFP of GFP verlichting 3 s tussenpozen afbeeldingen ophalen. Passen de ' Clean ' functie vrij te geven een bolus van vloeistof uit de micropipet. Blijven imaging ikn de aanwezigheid van stroom als gevolg van druk van de compensatie alleen.
4. Een alternatieve methode voor de beoordeling van de reactie op acute mechanische stimulatie via bulk buffer toevoeging
   1. verzamelen en Verdun vegetatieve cellen zoals beschreven in stap 2.1. Plaats 20 µL druppels van cellen op ~ 1 x 10 ⁶ cellen/mL in DB in het midden van een goed uit een 8-well-zaal. Toestaan dat cellen te houden voor ten minste 10 min.
   2. Beginnen met RFP - of GFP-specifieke verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X doel 3 s tussenpozen afbeeldingen ophalen. Richten op een gebied dicht bij de rand van de druppel.
   430 µL van DB toevoegen
   3. snel aan de ene kant van de put. Blijven imaging.
   4. Voor analyse van de wisselwerking tussen mechanische en chemische prikkels, 12 of 45 s na mechanische stimulatie, zachtjes toevoegen 50 µL van foliumzuur (eindconcentratie 20 nM) of het voertuig (DB) zonder een mechanische reactie. Blijven imaging.
5. Kwantificering van reactie
   1. de 32-bits TIFF-afbeelding te openen in de Software van de analyse van de afbeelding (Zie Tabel van materialen voor details) ²⁷.
   2. Onder de ' analyseren ' tabblad, ga naar " Set metingen ". Schakel het selectievakje voor ' grijs-waarde betekent '. Zorg ervoor dat de andere selectievakjes niet zijn ingeschakeld. Klik op " OK ".
   3. Onder het ' proces ' tab, klik op " aftrekken achtergrond ". Houd de rolstraal van de bal op 50 pixels, en doe niet controle een van de opties in het menu weergegeven. Zoom in op de cel met behulp van de ' Magnifying Glass ' hulpmiddel.
   4. Gebruiken de ' rechthoek ' tool, tekent u een vak (~2.5 x 2,5 µm ²) in het cytosol, om ervoor te zorgen niet te tekenen over de kern of het plasma-membraan. Druk op " Ctrl " + " M " toetsen of ga naar de ' analyseren ' tab en klik op " maatregel " de gemiddelde grijze waarde van het vak te bepalen. Doorgaan naar de volgende frames en maatregel opnieuw, ervoor te zorgen dat het vak blijft in het cytosol.
      Opmerking: Aangezien D. discoideum cellen zeer snel bewegen het vak kan worden verplaatst van de ene kader naar het volgende te houden in het cytosol.
   5. Immers van de frames hebben geanalyseerd, kopieert u de waarden naar een werkblad. Normaliseren ter verantwoording voor cel-naar-cel variatie in de niveaus van de expressie van verschillende biosensoren, de waarden voor de gemiddelde grijswaarde waargenomen op moment 0. Berekenen van de reciproke van de waarden aan de accumulatie van het signaal op de cortex.

5. Continue mechanische stimulatie en Live Imaging van afzonderlijke cellen op de Microscoop

1. instellen in de cellen precies zoals hierboven beschreven in stappen 4.1.1 - 4.1.3 p.a. acute mechanische stimulatie. Open de stekker die betrekking hebben op het reservoir met de buffer zodat het volume kan worden bijgevuld als reactie is langer dan een paar minuten per keer geanalyseerd.
   Opmerking: Omdat het reservoir open voor de duur van het experiment blijft, deze test wordt uitgevoerd in de afwezigheid van externe druk en zwaartekracht stroom alleen afhankelijk. Het vergroten van het tempo van de stroom door de zwaartekracht, de afvoer kan worden geplaatst op een tafel onder de Microscoop.
2. Beginnen imaging cellen met RFP - of GFP-specifieke verlichting op een omgekeerde fluorescentie Microscoop uitgerust met een 40 X doel 3 s tussenpozen voor analyse van biosensor antwoorden. U kunt ook afbeelding met fase contrast met behulp van een 20 X doelstelling tussenpozen van 10 s voor analyse van totale cel migratie.
3. Inschakelen van de stroom na verschillende frames op de nul-druk-instelling (d.w.z. stroom is als gevolg van zwaartekracht alleen of ~ 15 dyn/cm ²) door de klep over te schakelen naar de open positie. Wanneer het niveau van de vloeistof tot 5-10 mL in het reservoir valt, herladen met meer buffer. Zorg ervoor dat de vloeistof zorgvuldig toevoegen zodat luchtbellen niet krijgen in de regels gevangen doen.
   Opmerking: Het is belangrijk om toe te voegen vloeistof van dezelfde temperatuur om te voorkomen dat een schok reactie in de cellen.
4. Kwantificeren cel snelheid en volharding met behulp van de software van de analyse van de migratie (Zie de Tabel van materialen voor details) volgens fabrikant ' s instructies.

Representative Results

Temporele reactie van chemotaxis regelgevers op acute mechanische stimulatie

Om te beoordelen van de reactie van D. discoideum cellen op mechanische stimulatie, werden aanhangend aggregatie-bevoegde cellen blootgesteld aan een korte puls van shear stroom. Aggregatie-bevoegde D. discoideum cellen afscheiden kamp, dat kan worden gevoeld door naburige cellen. Om te overwinnen de bijdrage van signalering van cel-cel, werden cellen behandeld met cafeïne, die remt adenylyl cyclase in D. discoideum en dus voorkomt cAMP secretie²⁸. Inderdaad, de cellen vooraf behandeld met cafeïne had zeer lage basale activiteit van PKBR1 en ERK2, en liet een robuuste stijging zien in de fosforylering van de belangrijkste residuen van deze kinases na 5 s stimulatie met schuintrekken stroom (figuur 1A). De reactie was voorbijgaande en piek rond 10-15 s voor PKBR1, en rond 30 s voor ERK2, op dezelfde manier eerder gepubliceerde bevindingen voor activering van deze eiwitten met een chemoattractant⁷.

Hoewel het is moeilijk om de evaluatie van de doeltreffendheid van het antwoord gezien het lage niveau van de basale, voorbereidende studies die tot de ontwikkeling van deze bepaling leidde, ten opzichte van stimulatie met schuintrekken stroom alleen (of met een voertuig) tot schuintrekken stroom in aanwezigheid van een chemoattractant cAMP (figuur 1B). Deze analyse toonde geen verhoging in de reactie met het kamp, wat suggereert dat de reactie van het signaaltransductie netwerk wilt schuintrekken stroom is verzadigd. Hoewel in deze test kamp fosforylering van de PKBR1 niet verhogen, kan cellen reactie op chemoattractant worden waargenomen met behulp van een standaard stimulatie-protocol waar aggregatie-bevoegde cellen worden gehouden in suspensie, gestimuleerd met cAMP en lysed op verschillende tijdstippen na stimulatie. Zoals blijkt uit Figuur 1 c, is er onder deze omstandigheden een tijdelijke toename van de PKBR1 fosforylering in reactie op chemoattractant, maar geen voertuig. De reactie van de piek is waargenomen bij 30 s in deze test omdat de temperatuur van de celsuspensie tijdens de test ~ 9 ° C is, in vergelijking tot ~ 22 ° C voor mechanische stimulatie assay hierboven²⁶beschreven.

Spatio reactie van leiden en achterblijvende rand markeringen aan acute mechanische stimulatie

Aangezien de bevolking van bovenstaande bepaling alleen temporele informatie over het gedrag van chemotaxis regelgevers voorziet, werden cellen ook blootgesteld aan een korte mechanische stimulus terwijl het met een microscoop in acht worden genomen. Deze test kan worden uitgevoerd met aggregatie-bevoegde of vegetatieve D. discoideum cellen uiten diverse fluorescently-geëtiketteerden biosensoren waarvan lokalisatie is gedefinieerd in de cellen gestimuleerd met een chemoattractant. Twee toonaangevende markeringen, PH domein van Crac en kalk_Δcoil, die zijn gerekruteerd door PIP3 of nieuw polymeervorm actine, toonde beide meestal cytosolische lokalisatie in rustende cellen als eerder gemeld (figuur 2A, aanvullende film 1 )^4,29. In cellen die basally actief waren, kon deze biosensoren ook te zien op de toppen van de pseudopods. Volgende stimulatie met schuintrekken stroom voor 2 s, de biosensoren snel relocalized naar de cortex met een piek op ~ 6 tot 10 s, en keerde terug naar het cytosol door ~ 30 s. In tegenstelling, een achterblijvende rand marker PTEN gelokaliseerd op de cortex voordat stimulatie (figuur 2A). Na een korte puls met schuintrekken stroom verhoogd cytosolische PTEN intensiteit, zij het met minder dynamiek dan voor de voorrand biosensoren. Een verandering in de biosensor localization vanuit het cytosol wordt naar de cortex, en vice versa, duidelijk gezien als een verandering in de cytosolische intensiteit waardoor voor eenvoudige kwantificering van de reactie.

Het waargenomen gedrag van de biosensoren in reactie op acute mechanische stimulatie is consistent met de toonaangevende en achterblijvende dynamiek van de lokalisatie van de rand in reactie op de stimulatie met uniforme chemoattractant. Dit probleem was niet uniek is voor de drie biosensoren komt te staan. Zoals eerder gepubliceerde, soortgelijke wijzigingen in lokalisatie ook voor toonaangevende markeringen RBD en RalGDS waargenomen werden, die herkennen geactiveerd Ras- en Rap1, respectievelijk, evenals voor een andere achterblijvende rand marker CynA^22,30.

Een soortgelijke bepaling kan worden gebruikt om te beoordelen van de effecten van verschillende remmers door een eenvoudige wijziging van de experimentele opstelling van een enkele invoerregel naar een dubbele. Met behulp van deze methode, kunnen de cellen worden eerst blootgesteld aan controlevoorwaarden en vervolgens overgeschakeld op de buffer waarin de gewenste test-agent. Bijvoorbeeld, toevoeging van actine-depolymerizing drug LatA geblokkeerd van de reactie van RBD, evenals LimE_Δcoil, aan acute mechanische stimulatie (figuur 2B).

Mondiale respons voorafgaat aan cel migratie onder langdurige stimulatie met schuintrekken stroom

De hier beschreven aanpak kan ook worden aangepast aan het bestuderen van de effecten van shear stroom op D. discoideum migratie. In feite, als de stroom werd niet afgesloten na 2 s maar bleef op de duur van het experiment, vegetatieve cellen toonde geregisseerd migratie tegen de stroom (Figuur 3aanvullende Movie 2). Opgemerkt moet worden dat de shear stroom nodig te verduidelijken met een trekkende antwoord lager dan de druk die meestal gebruikt was werd om een mondiale respons met acute stimulatie in vegetatieve cellen (bijvoorbeeld, zoals in figuur 2B). Echter, zelfs bij de lagere druk, cellen weergegeven een robuuste uniform antwoord, zoals gemeten door een verandering in LimE_Δcoil lokalisatie, dat elke wijziging in de positie van de cel zelf voorafgegaan. Dus, deze experimenten duidelijk aangetoond dat 1) de mondiale reactie is niet afhankelijk van het verkeer van de cel, en 2) de mondiale respons voorafgaat aan gestuurde migratie.

Alternatieve benaderingen van het testen van de antwoord op acute mechanische stimulatie

Hoewel het gebruik van een doorstroomtest kamer duidelijke voordelen voor de studie van de reactie op acute mechanische stimulatie heeft, we ook twee extra tests voor het testen van de reactie van afzonderlijke cellen op acute mechanische stimulatie gevalideerd. Zoals blijkt uit Figuur 4, LimE_Δcoil snel en Transient opnieuw gelokaliseerd uit het cytosol op de cortex wanneer cellen werden gestimuleerd door toevoeging van de bolus van buffer geleverd hetzij door een micropipet (figuur 4A) of handmatig met behulp van bulk de toevoeging van de buffer met een pipet (figuur 4B). Opgemerkt moet worden dat een duidelijk nadeel van beide van deze tests is dat de exacte hoeveelheid schuintrekken kracht geleverd aan de cel onbekend is, en kan niet gemakkelijk worden gevarieerd. Echter voor situaties waar schakelen tussen mechanische en chemische prikkels is gewenst, biedt bulk buffer toevoeging een solide alternatief voor de stimulatie in het apparaat van de stroom.

Figuur 1: vertegenwoordiger resultaten voor biochemische beoordeling van de reactie van D. discoideum cellen aan acute mechanische of chemische stimulatie. Aggregatie-bevoegde cellen werden blootgesteld aan mechanische of chemische prikkels, lysed op de aangegeven tijd punten, en immunoblotted met behulp van antilichamen die herkent phosphorylated PKBR1 of ERK2. (A) aanhanger cellen werden gestimuleerd op een roteerschudapparaat voor 5 s. Het membraan was gekleurd met Coomassie briljant blauw (CBB) zodat gelijke eiwit laden. (B) aanhanger cellen werden gestimuleerd door handmatige beweging van de plaat in een cross-wise wijze voor ongeveer 5 s volgende chemische stimulatie als gevolg van toevoeging van 1 µM kamp of buffer (voertuig), of zonder enige chemische stimulatie (-). De twee immunoblots weergeven de mate van variatie in de basale activering van PKBR1 gezien op moment 0. Af en toe kan PKBA activering ook worden gedetecteerd door deze techniek, zoals wordt weergegeven in het onderste deelvenster. (C) schorsing cellen werden gestimuleerd met 1 µM kamp of buffer (voertuig). Deel A van dit cijfer is gewijzigd van Artemenko et al. (2016) ²². Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 2: vertegenwoordiger resultaten voor acute mechanische stimulatie en live beeldvorming van afzonderlijke cellen op de Microscoop. (A) aggregatie-bevoegde D. discoideum cellen waarin RFP-gelabeld kalk_Δcoilof GFP-gelabeld PH-Crac of PTEN werden gestimuleerd met 15 dyn/cm² unidirectionele laminaire stroming 2 tot en met 5 s. beelden waren verzameld om de 3 s . Representatieve cellen translocatie van de biosensoren in reactie op mechanische stimulatie tonen worden weergegeven. Accumulatie van elke biosensor op de cortex werd gekwantificeerd als de inverse van de gemiddelde cytoplasmatische intensiteit genormaliseerd voor tijd 0. De gemiddelde reactie van 18 (kalk_Δcoil), 20 (PH-Crac) of 6 (PTEN)-cellen wordt weergegeven. Waarden zijn betekenen ± SE. (B) vegetatieve cellen uiten van RFP-gelabeld kalk_Δcoil- RFP en GFP-gelabeld RBD werden behandeld met voertuig of 5 µM LatA gedurende ten minste 15 minuten, en vervolgens gestimuleerd met 41 dyn/cm² voor 2 unidirectionele laminaire stroming s. beelden werden verzameld om de 3 s. RBD-GFP en RFP - ophoping van de_Δcoilvan de kalk onderaan de cortex werd gekwantificeerd zoals in (A). Waarden zijn gemiddelde ± SE. Het aantal cellen geanalyseerd wordt aangegeven naast elke voorwaarde. Schaal bar = 10 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Artemenko et al. (2016) ²². Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 3: Vertegenwoordiger resultaten voor de reactie van D. discoideum cellen aan langdurige stimulatie met stroom. (A) vegetatieve cellen uiten van RFP-gelabeld kalk_Δcoil werden blootgesteld aan voortdurende unidirectionele laminaire flow op 15 dyn/cm² en beeld van elke 3 s. Tracks van 11 cellen worden weergegeven in (B). Schaal bar = 10 µm. Dit cijfer is gewijzigd van Artemenko et al. (2016) ²². Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figuur 4: vertegenwoordiger resultaten voor alternatieve benaderingen voor het testen van de antwoord op acute mechanische stimulatie. (A) vegetatieve D. discoideum cellen waarin RFP-gelabeld kalk_Δcoil werden blootgesteld aan een micropipet (*) basally vrijgeven assay buffer in een traag tempo. Een korte toename van de stroomsnelheid werd bereikt door snelle levering van een bolus van assay buffer op moment 0. Beelden werden verzameld elke 3 s. (B) vegetatieve D. discoideum cellen uiten van RFP-gelabeld kalk_Δcoil verguld als een kleine daling in een kamer microscopie werden mechanisch gestimuleerd door toevoeging van een grote hoeveelheid buffer op de kamer. Beelden werden verzameld om de 3 s. schaal bar = 10 µm. deel (A) van deze afbeelding is gewijzigd van Artemenko et al. (2016) ²². Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Aanvullende Movie 1: Acute mechanische stimulatie activeert snelle en voorbijgaande translocatie van kalk_Δcoilcellen uiten deze biosensoren - RFP of PH-Crac-GFP uit het cytosol aan de cortex in aggregatie-bevoegde D. discoideum . Unidirectionele laminaire flow was ingeschakeld voor 5 s op tijd 0 en cellen werden beeld 3 s tussenpozen. Afspeelsnelheid is 5 frames/sec. Twee voorbeelden voor elke cel regel worden weergegeven. Schaal bar = 10 µm. Deze film komt overeen met figuur 2A en van Artemenko et al. is gewijzigd (2016) ²². Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende Movie 2: Continue mechanische stimulatie activeert snelle en voorbijgaande translocatie van kalk_Δcoil- RFP uit het cytosol aan de cortex vóór de migratie van de cellen tegen de richting van de stroom. Vegetatieve cellen uiten van kalk_Δcoilwaren - RFP blootgesteld aan voortdurende shear stress op 15 dyn/cm² begintijd 0 en beeld 3 s tussenpozen. Afspeelsnelheid is 10 frames/s. schaal bar = 10 µm. Deze film komt overeen met Figuur 3 en is eerder gepubliceerd in Artemenko et al. (2016) ²². Klik hier om dit bestand te downloaden.

Discussion

De hier beschreven methoden bieden een handige manier om te beoordelen van zowel de bevolking als afzonderlijke cel gedrag in antwoord als u wilt schuintrekken van stroom. Nog belangrijker is, terwijl eerdere studies geanalyseerd lokalisatie van leading en lagging rand markeringen tijdens de migratie, laat de huidige aanpak onderzoek van de onmiddellijke effecten door de stroom van de shear acuut toe te passen. Using zulks werkwijze wij aangetoond dat in feite de eerste reactie van cellen wilt schuintrekken stroom niet cel migratie hoeft. In plaats daarvan het snelle en voorbijgaande antwoord op de eerste schuintrekken stroom stimulus voorafgaat aan de directionele migratie gezien met langdurige blootstelling wilt schuintrekken van stroom, ook naar de eerste wereldwijde reactie gezien met een chemoattractant verloop.

De biochemische en microscopische benaderingen opleveren aanvullende gegevens, hoewel elke methode verschillende voordelen en nadelen heeft. Stimulatie gevolgd door lysis van de cel en immunoblotting van PKBs, KrsB en ERK, bijvoorbeeld analyseert een hele bevolking van cellen en dus het gemiddelde van cel naar cel variatie, in tegenstelling tot een bepaling dat het gedrag van de individuele cel onderzoekt. Echter, de bevolking gebaseerde testen neiging om masker subtiele veranderingen in gedrag van de cel dat gemakkelijk kan worden waargenomen door het analyseren van de afzonderlijke cellen. Bovendien, werkt de biochemische bepaling hier beschreven alleen met aggregatie-bevoegde cellen, om redenen die later zullen worden besproken. In tegenstelling, de microscopie gebaseerde bepaling van de Herlokalisatie van RBD, RalGDS, PH-Crac, limoen,_Δcoilen PTEN, bijvoorbeeld tussen de schors en het cytosol is effectief voor zowel de aggregatie-bevoegde als de vegetatieve cellen, en dus zorgt voor opmerkingen dat zijn breed toepasbare op cellen met variërende graden van polarisatie. Wat maakt de twee benaderingen complementaire is het feit dat ze verschillende sets beschikbaar toonaangevende/achterblijvende rand markeringen onderzoeken, dus het uitbreiden van de dekking van het signaal transductie en actine cytoskelet netwerken getest met de bepaling van de stroom schuintrekken.

Het blijft onduidelijk waarom vegetatieve cellen die zeer krachtig in microscopie gebaseerde testen reageren, niet op de stimulatie gevolgd door lysis van de cel en immunoblotting reageren. Een mogelijkheid is dat de hoeveelheid schuintrekken kracht toegepast op cellen wanneer de plaat wordt gedraaid komt niet overeen met de kracht ervaren door de cellen in een flow kamer. Hebben een lagere drempelwaarde voor activering ontwikkelde cellen, in tegenstelling, zou kunnen, en, dus, reageren onder een voorwaarde. Het is onwaarschijnlijk dat de biosensoren waarvan de activiteit wordt gemeten door de biochemische bepaling niet worden uitgedrukt of zijn niet actief in vegetatieve cellen, aangezien stimulatie van vegetatieve cellen met foliumzuur tot robuuste activering van zowel ERK2 als PKBR1/PKBA leidt (gegevens niet Zie afbeelding). Bovendien, vegetatieve cellen vertonen duidelijke werving van PH-Crac, waarin PIP3 accumulatie, de microscopie gebaseerde bepaling. Aangezien PKBA werving hangt ook af van PIP3, lijkt het onwaarschijnlijk dat de PKBA niet op acute mechanische stimulatie reageren zou, tenzij de omstandigheden in de biochemische bepaling niet optimaal zijn zoals hierboven vermeld. Dit blijft een gebied van actief onderzoek.

De biochemische analyse van chemotaxis regelgevers vereist de aanwezigheid van cafeïne gedurende het gehele experiment. Oorspronkelijk is cafeïne toegevoegd ter voorkoming van cel naar cel signalering als gevolg van de secretie van kamp. Het blijkt echter dat cafeïne sinds een andere rol naast remming van adenylyl cyclase (ACA) cafeïne ACA-null cellen nog steeds vereist voor phosphorylation van PKBR1 in reactie op acute mechanische stimulatie. Cafeïne heeft eerder is aangetoond dat het blokkeren van TorC2 activiteit²⁶. Het is mogelijk dat de remming van TorC2 geblokkeerd sommige basale beweeglijkheid van de cellen, en verlaagd dus de basale activering van PKBR1 en andere onderdelen van signaal transductie en actine cytoskelet netwerken. Lage activiteit van de basale was noodzakelijk voor de observatie van de reactie op het schuintrekken van stroom. In feite, wanneer cellen werden verzameld op vroegere tijdstippen tijdens ontwikkeling, weergegeven ze verhoogde activiteit van de basale en een verminderde schuintrekken-stroom veroorzaakte reactie. Interessant, is het bekend dat vegetatieve cellen verhoudingsgewijs meer activiteit van de PKBA hebben en minder PKBR1 in vergelijking met cellen^{31 ontwikkelde}. Het is mogelijk dat de basale staat enigszins verschillend is geregeld in de cellen van de vegetatieve en aggregatie-bevoegde, verder bij te dragen aan het ontbreken van een antwoord van vegetatieve cellen in de biochemische bepaling. Vreemd genoeg, toen cellen werden verzameld op latere tijdstippen van ontwikkeling, hadden ze ook een verminderde reactie, waarschijnlijk te wijten aan de sterke invloed van polariteit op de lokalisatie en de activering van verschillende chemotaxis regelgevers onderzocht in deze test.

Stimulatie van cellen in een microscopie kamer bleek dat zowel de sterkte en de duur van de prikkel maximale reactie^{22 tot}. Met andere woorden, een maximale reactie zelfs met een lage schuintrekken kracht kan worden bereikt als het wordt toegepast voor een langere periode van tijd (10 s versus 2 s). Deze observatie wordt uitgelegd waarom cellen hebben een eerste globale reactie wanneer zij eerst worden blootgesteld aan een continu, maar zwak, stimulans die leidt tot het schuintrekken stroom-geïnduceerde migratie. Met het huidige apparaat konden wij genereren laag genoeg schuintrekken stroom om te onderzoeken van de onderkant van het bereik.

Wellicht is de belangrijkste implicatie van de uitgevoerde onderzoeken met behulp van acute mechanische stimulatie dat zowel mechanische en chemische prikkels lijken te worden meegenomen bij het gemeenschappelijk signaaltransductie en actine cytoskelet netwerken. Hoewel we bleek dat de twee prikkels integreren met behulp van bulk buffer toevoeging voor de mechanische stimulatie, zal toekomstige studies streven naar het ontwikkelen van een systeem waar chemoattractant snel kan worden geleverd in het kanaal van de doorstroming, dat zou een veel veelzijdiger en krachtige manier om te beoordelen van de integratie van mechanische en chemische prikkels. Helaas, toevoeging van de chemoattractant met behulp van de huidige twee-line setup wordt geassocieerd met een tweede schuintrekken stroom stimulans omdat de chemoattractant moet worden geleverd in de aanwezigheid van stroom. Een levensvatbaar alternatief mogelijk laser-gestimuleerd versie van een chemoattractant van een voorloper van de gekooide zoals bleek succesvol voor kamp door Westendorf et al. ³². in de toekomst, het zou ook interessant zijn om te onderzoeken van de integratie van andere stimuli, bijvoorbeeld schuintrekken stroom en variabele elektrische velden of schuintrekken stroom en variabele substraat stijfheid. Het laatste voorbeeld is interessant omdat het gaat om twee soorten mechanische stimulatie, hoewel de eerste signaalontvangst tussen hen verschillen kan. Om te bevestigen dat alle stimuli die gestuurde migratie induceren hetzelfde signaaltransductie netwerk delen en verschillen alleen in hoe de prikkel wordt ervaren zal uitleggen hoe cellen kunnen navigeren in complexe omgevingen. Tot slot, wij reeds aangetoond dat acute stimulatie met schuintrekken stroom leidt tot verspreiding van menselijke neutrofiele-achtige cellen²². Toekomstige werkzaamheden zal verder onderzoeken lokalisatie en activering van verschillende onderdelen van het signaal transductie en actine cytoskelet netwerken met mechanische stimuli in zoogdiercellen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Dextrose	Fisher	D16-1	Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone	Fisher	DF0120-17-6	Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract	Fisher	50-550-445	Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O	Fisher	S373-500	Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4	Fisher	P386-500	Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate)	Fisher	ICN10040525	Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto)	Fisher	DF0118-17-0	Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4	Fisher	P288-100	Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar	Fisher	BP1423-500	Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4	Fisher	M65-500	Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2	Fisher	C79-500	Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine	Fisher	O1728-500	Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt)	Fisher	11-680-1100MG	Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid	Sigma	F7876	Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base	Fisher	BP152-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher	BP166-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol	Fisher	G33-500	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT)	Bio-Rad	1610610	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue	Bio-Rad	1610404	Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF	Fisher	S299-100	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4	Fisher	50-994-911	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate	Fisher	S390-500	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche)	Sigma	11873580001	Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A	Enzo Life Sciences	BML-T119-0100	Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel	Bio-Rad	3450029	Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane	Bio-Rad	1620177	Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody	Cell Signaling	2060	Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody	Cell Signaling	4370	Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey)	GE Healthcare	NA934-100UL	Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate)	Bio-Rad	1705060	Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer)	Pierce	PI46430	Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue	Fisher	PI20278	Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic)	Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative)	New Brunswick Scientific		Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish	Fisher	FB0875712	Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer	Fisher	02-671-51B	Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish)	Fisher	08-772A	Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL)	VWR	13915-985	Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System)	Ibidi	10902	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized)	Ibidi	80316	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit)	Ibidi	10978	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN)	Ibidi	10964	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing)	Ibidi	10842	Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative)	Zeiss		Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative)	Perkin-Elmer	DM 16000	An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan	Eppendorf	5252000021D and 5192000027	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter )	Eppendorf	930000035	Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector)	Eppendorf	5242956.003	Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass)	Fisher	12-565-472	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass)	Fisher	12-565-338	Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji)	NIH	https://fiji.sc/	Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO)	Gradientech	http://gradientech.se/tracking-tool-pro/	Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)