Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Оценка сапротрофные discoideum реагирования на острые механической стимуляции

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Здесь мы описываем методы для оценки клеточного ответа на острый механической стимуляции. В основе микроскопии assay осматриваем локализации дневно меченых биодатчиков, после краткого стимуляции с потоком ножниц. Мы также тест активации различных протеинов интереса в ответ на острые механической стимуляции биохимически.

Abstract

Хемотаксис, или миграции вверх градиент хемотаксического, это лучше понимать режим режиссер миграции. Исследования с использованием социальных амебы сапротрофные discoideum показали, что сложный сигнал сети трансдукции параллельных путей усиливает ответ на chemoattractants и приводит к предвзятым актина полимеризации и протрузии pseudopod в направление градиента. В противоположность этому молекулярные механизмы, вождение другие виды миграции направлены, например, из-за воздействия сдвига потока или электрического поля, не известны. Многие регуляторы хемотаксис экспонат локализации на ведущих или отставание края миграции клеток, а также показать временные изменения в локализации или активации после глобальной стимуляции с хемотаксического. Чтобы понять молекулярных механизмов других видов направленного миграции мы разработали метод, который позволяет изучение клеточного ответа на острый механической стимуляции, основанные на краткое (2-5 сек) воздействия сдвига потока. Этот стимуляции могут быть доставлены в канале при визуализации ячеек, выражая дневно меченых биодатчики изучить поведение отдельных клеток. Кроме того можно стимулировать популяции клеток в тарелку, анализироваться и immunoblotted, с использованием антител, которые признают активных версий протеинов интереса. Объединив оба анализов, можно изучать широкий спектр молекул, активированную изменения субцеллюлярные локализации и/или фосфорилирования. С помощью этого метода мы определили, что острый механической стимуляции триггеры активации эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей. Возможность изучения клеточных реакций на острый механической стимуляции имеет важное значение для понимания инициатора события, необходимые для потока индуцированного сдвига подвижности. Этот подход также предоставляет инструмент для изучения сети трансдукции эозинофилов сигнала без смешанных влияние хемотаксического рецептора.

Introduction

Миграции эукариотических клеток является предвзятым, различные химические и физические сигналы в окружающей среде, включая градиенты растворимые или привязанных к подложке chemoattractants, переменной жесткости субстратов, электрические поля, или сдвига потока. Несмотря на многие достижения в наше понимание молекулярных механизмов вождения хемотаксис, меньше известно о других типах режиссер миграции и интеграции этих разнообразных сигналов на клеточном уровне для получения единой мигрирующих ответ.

Режиссер, миграция к растущей концентрации хемотаксического включает три поведенческих компонентов: подвижность, направленного зондирования и полярность1. Подвижность относится к случайное движение клеток достигается pseudopod выступа. Направленного зондирования является способность обнаружить источник хемотаксического ячейки, который может произойти даже в прикол клетки. Полярности относится к более стабильной асимметричные распределения внутриклеточных компонентов между ведущие и отстающие края клетки, что приводит к увеличению сохраняемости в движении.

Клеточный ответ хемотаксического зависит деятельность четырех концептуально определены нормативные сетей: рецептор / белок G, сигнальной трансдукции, Цитоскелет актина и полярность1. Хемотаксического связывание с рецепторами сочетании белок G передаёт сигнал через гетеротримерные G белки α и βγ к течению сигнала трансдукции сеть, которая усиливает сигнал направленности. Несколько путей в рамках сети трансдукции сигнала действовать параллельно и кормить в сеть Цитоскелет актина смещения актина полимеризации, и последующего pseudopod выступа, в направлении градиента. Среди важных регуляторов хемотаксис являются Ras ГТФазы, TorC2, phosphoinositide 3-киназы (PI3K), фосфатазы и натяжение гомолога (PTEN) и что циклазы. Механизмы обратной связи в рамках сети трансдукции сигнала и между сигнала и Цитоскелет актина сетей далее усиливать ответа. Наконец плохо определенной полярности сети получает входные данные из цитоскелет актина и далее отклонений сети трансдукции сигнала для содействия постоянные миграции в направлении градиента.

Большая часть наших механистического понимания хемотаксис стало возможным из-за развития биодатчики дневно тегами для различных компонентов систем регулирования. Многие хемотаксис регуляторы имеют асимметричные распределения, либо самой молекулы регулирования или его деятельности. Например биосенсоры, которые признают активации версии небольших ран GTPases и Rap1 – рас связывания доменов Raf1 (именуемый RBD здесь) и RalGDS, соответственно — локализации до переднего края ячейки2,chemotaxing3. Аналогично, PI3K и ее продукта фосфатидилинозитол (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), признанные pleckstrin гомологии (PH) домена, также показывают локализации в передней части клетки4,5. В отличие от 3-фосфатазы PTEN, который преобразует PIP3 обратно в фосфатидилинозитол (4,5)-Бисфосфат, локализует отстающие края ячейки6. Важно отметить, что эти биодатчики изменить их локализация в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического. Передний край маркеры, которые цитозольной или на советы выступы в ячейке отдых, relocalize кору, тогда как отставание края маркеров, которые корковых локализации и отсутствуют от кончиков выступы в ячейке отдых, стать цитозольной после стимуляция. Анализ распределения биосенсор в ответ на глобальные стимуляции с хемотаксического минимизирует вклад моторики и полярность, которые часто посрамить замечания. Глобальные или единообразных стимуляции суспензию клеток с хемотаксического также используется как инструмент для оценки всего населения изменения в активации белка, часто определяется белка фосфорилирование7,8,9 . Этот assay биохимических используется главным образом для получения временной информации, тогда как микроскопии используется для сбора во временной и пространственной информации о поведении различных компонентов систем регулирования.

В сети трансдукции сигнала включает в себя черты возбудимых системы10,11. Ответы на выше порогового уровня эозинофилов стимулы «логики» и отображать огнеупорных периодов. Ответы также активируются ковшах и может показать колебательной поведение. События трансдукции сигнала локализованы в регионы коры, которые распространяются как волны12,13,14,15. Спереди назад, маркеры набираются для, или отмежеваться от, активные зоны распространения волн. Благодаря огнеупорных региона трейлинг активной зоны противоположно направленных волн уничтожить как они встречаются. Распространение волн трансдукции сигнала лежат в основе сотовой выступов, которые посредником миграции клеток10.

Большая часть вышеупомянутой информации о хемотаксис пришли из исследований на социальной амеба сапротрофные discoideum, хотя аналогичные механизмы регулирования, также применимы к нейтрофилов и других клеток млекопитающих типы16 . Сапротрофные устоявшиеся модели организм, который имеет надежную эозинофилов ответ во время голодания, когда тысячи одной клетки мигрируют к агрегации центр, сформировав многоклеточные плодовые тела, содержащие споры. Хемотаксис также важно во время стадии одноклеточных роста этого организма для нахождения бактериальных пищевых источников. Важно отметить, что миграция одиночных клеток сапротрофные удивительно похож на миграции млекопитающих нейтрофилов или метастатического рака клеток, все из которых проходят очень быстро Саркодовые типа миграции. В самом деле общая топология регулирования сети, а также многие из отдельных сигнальных путей участвующих в хемотаксис сохраняются между сапротрофные и млекопитающих лейкоциты17. Кроме того другие клетки, такие как фибробластов, используйте рецепторов тирозин киназ (РТК) вместо GPCR; Однако RTKs может учитываться в подобных сетей.

В отличие от хемотаксис отсутствует глубокое понимание сигнальных механизмов, определяющих различные другие виды режиссер миграции. Аналогичным образом клетки мигрируют в градиенте хемотаксического несколько исследований сообщили активации и/или локализация типичных передовые маркеров, в том числе актина полимеризации, PIP3 и/или внеклеточная сигнала регулируется киназы (Эрк) 1/2, в передней части клеток происходят направлены миграции в ответ на сдвиг потока или изменения электрического поля18,19,,2021. Однако в этих исследованиях непрерывного воздействия на раздражитель также привело к миграции клеток, оставляя открытым вопрос ли, например, маркеры передовые локализовать специально в ответ на раздражитель, или если они просто локализовать на переднем крае из-за увеличения числа ложноножки в передней части миграции клеток.

Мы разработали анализов, которые позволяют нам наблюдать ответ клетки на острый механические возмущения, доставлены как сдвиг потока как на уровне всего населения и как отдельные клетки22. Похож на глобальные стимуляции с хемотаксического, острый stimulaции с потоком ножниц позволяет исследование клеточного ответа на механических стимул без вклада со смешанным от подвижности или полярности. Сочетание этих биохимических и микроскопических анализов с генетических или фармакологических возмущений позволяет нам, чтобы узнать о как механические раздражители воспринимаются и половым путем. Кроме того этот подход также обеспечивает новый метод для задействования системы по течению хемотаксического рецептора в отсутствие хемотаксического, тем самым изолируя сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей от рецепторов/G белка сети.

С помощью методов, описанных ниже мы недавно продемонстрировал, что острый сдвига стресс приводит к активации нескольких компонентов эозинофилов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей22. Применяя острый механические стимул различные промежутки времени, мы продемонстрировали, что, аналогично chemoattractants, ответ на механических раздражителей также экспонаты особенности возбудимых системы, включая обновляющие поведение ответ под насыщая условия и наличие рефракторного периода. Наконец сочетанием механических и химических стимуляции мы показали, что два стимула разделяют сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей, которые скорее всего позволит для интеграции нескольких стимулы для защиты клеток миграции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Подготовка решения

  1. подготовку гл-5 средства массовой информации, используя следующее: глюкоза 10 г/Л, 10 г/Л proteose Пептон, 5 г/Л дрожжевой экстракт, 0.965 г/Л Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 г/Л х 2 PO 4 и, если не указано иное, стрептомицина 0,03 г/Л в деионизированной воде. Автоклав среднего и хранить при комнатной температуре.
    Примечание: Из-за различий между proteose Пептон и дрожжевой экстракт, полученных от разных поставщиков, а также между отдельными партиями, рН средства массовой информации может потребоваться корректироваться на типичный спектр 6,4 до 6,7.
  2. Подготовить SM пластины, используя следующее: 10 г/Л декстрозы, Пептон 10 г/Л, 1 г/Л дрожжевой экстракт, 2,31 г/Л х 2 PO 4, 1 г/Л K 2 HPO 4 и 20 г/Л агар в деионизированной воде. Автоклав, охладить и залить 30 мл раствора агар на 10см Петри. После того, как агар затвердевает, хранить пластины на 4 ° C до 1 месяца.
  3. Подготовка 10 x фосфатного буфера (PB) с помощью 13,4 г/Л Na 2 HPO 4 ·7H 2 O и 6,8 г/Л х 2 PO 4 в деионизированной воде. Хранить запас 10 x на 4 ° C. развести 1 x с дейонизированной воды для использования в.
  4. Подготовить DB буфера путем дополнения 1 X PB с 2 мм MgSO 4 и 0,2 мм CaCl 2.
  5. Подготовка 100 мм кофеин в деионизированной воде. Хранить в − 20 ° с.
  6. Подготовить 100 мм лагеря Стоковый раствор путем растворения соли моногидрата лагеря натрия в деионизированной воде. Подготовьте работы Фонда в дейонизированной воде 1 мм. Хранить оба акций решения на − 20 ° C. подготовить окончательный лагеря решение на желаемой концентрации в дБ на день эксперимента.
    Примечание: Фондовая решения могут быть замораживания размораживания в несколько раз.
  7. Подготовка 25 мм фолиевой кислоты в 1 x PB. Добавьте несколько капель 1 N NaOH до тех пор, пока порошок полностью растворяется. Хранить в − 20 ° с.
  8. Подготовить 3 x буфер образца, используя следующее: 187.5 мм трис-HCl pH 6.8, 6% (w/v) лаурилсульфат натрия (SDS), 30% глицерина, 126 мм Дитиотреитол и 0,03% (w/v) бромфеноловый синий. Алиготе и хранить в − 20 ° C.
    1. Предварительного использования, растопить на водяной бане 37 ° C и приступить к подготовке буфер образца с ингибиторы протеазы и фосфатазы, разбавляя 3 x буфер образца до 1 x и добавляя 50 мм NaF, 2 мм Na 3 VO 4, Пирофосфат натрия 25 мм и 1 x Полная Бесплатная ЭДТА ингибитор протеазы коктейль в деионизированной воде. Добавьте ингибиторы непосредственно перед началом процедуры, описанные в шагах 3.1.2-3.1.3.
  9. Подготовить 5 мм A Латрункулин раствор в ДМСО. Алиготе и хранить в − 20 ° C.

2. Подготовка клеток D. discoideum

Примечание: поддерживать D. discoideum клеток HL-5 средства массовой информации либо в культуре ткани пластины или в суспензии культуры как описано ранее 23. При необходимости, преобразование клетки с дневно меченых биодатчики согласно стандартным электропорации протоколы 24. Различные D. discoideum штаммы, а также плазмид кодирования биодатчики или другие гены интереса могут быть получены из центра фондовая Dicty (dictybase.org).

  1. Роста и сбор растительного D. discoideum клеток
    1. для анализа растительной клетки, рост клеток присутствии бактерий, чтобы уменьшить количество macropinosomes, которые обычно наблюдаются в 25 axenically выращенные клетки.
      1. Подготовить культуры нейтрофилов исследовании путем прививки небольшое количество клеток из запаса глицерина или от предыдущей культуры в желаемый объем HL-5 средних без антибиотиков. Инкубировать бактериальной культуры на орбитальный шейкер на 200 об/мин (0,42 x g) при комнатной температуре (20-22 ° C) для 16-18 ч.
        Примечание: K. штамм исследовании использованы здесь является непатогенные (см. Таблицу материалы).
    2. Собирать D. discoideum фазы экспоненциального роста культуры ткани пластины или из подвеска культуры и подсчитать количество ячеек с помощью Горяева согласно данным производителя ' s инструкции. Распространение 1 х 10 5 D. discoideum клетки с 260 мкл K. исследовании подвеска на плите SM. Поверните пластину вверх вниз следующий день. Рост клеток при комнатной температуре до тех пор, пока клетки D. discoideum начать очистку бактериальных газон, но прежде чем они начинают сбор (~ 36-48 h).
    3. Сбор D. discoideum клетки в 5 мл DB буфера соскабливания их с стекла распространитель. Клетки перехода к 50 мл полипропиленовые трубы. Промойте пластины с другой 5 мл DB буфера и бассейн с оригинальной подвеска. Заполнения трубки 50 мл с буфером DB.
    4. Центрифуги D. discoideum подвеска на 360 x g для 3-4 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 50 мл DB буфера. Повторяйте Стиральная шаги до тех пор, пока это супернатант ясно (~ 3-4 автомойки). Ресуспензируйте Пелле окончательный ячейки в буфер DB к окончательной плотности ~ 5 x 10 6 клеток/мл.
  2. Подготовка агрегации-компетентные D. discoideum клетки
    1. Разработка D. discoideum клеток путем голодания 1 h, следуют 4 h голода и пульсирует с 50 Нм лагерь каждые 6 мин согласно стандарту протоколы 23.
    2. После развития, оценить окончательный объем суспензии клеток.
    3. Основе начальное количество ячеек, которые используются для разработки, рассчитать плотность клеток окончательного подвески.
      Примечание: Если лагерь доставляется в 100 томах мкл каждые 6 мин, объем ячейки увеличивается на 1 мл за каждый час лагеря пульсирующей. Таким образом, для стандартных условий, с помощью 8 x 10 7 клеток в 4 мл DB, после 4 h развития окончательный объем-7 мл и плотность окончательный клеток ~1.1 x 10 7 кл/мл.

3. Биохимический анализ клеток ответ на механические или химические стимуляции

  1. , Острой механической стимуляции клеток следуют Lysis клетки
    1. пластины 2 x 10 6 агрегации компетентных клеток (от шага 2.2) после 4 h Разработка в 35-мм блюда с 2 мл DB. Позволяют клеткам прикрепить 10 мин при комнатной температуре. Вымойте клетки дважды с 1 мл DB. Инкубировать клетки в БД с кофеином 2,5 мм для 30 мин без каких-либо нарушений плит.
      Примечание: Если клетки нужно относиться с фармакологическими ингибитор, добавьте желаемой концентрации ингибитора или же объем соответствующего транспортного средства во время basalation с кофеином.
    2. Применить механическую стимуляцию, установите пластину (по одному) на орбитальный шейкер и немедленно включите его на 150 об/мин (0.24 x g) для 5 s.
      Примечание: Пластину можно также вручную стимулировать движение в крест-накрест манере для приблизительно 5 s.
    3. Аспирата буфера в указанный раза после начала стимуляции. Сразу же Лизируйте клетки, добавив 100 мкл пример буфера с ингибиторы протеазы и фосфатазы.
    4. Место пластину на льду и собирать lysate в 1,5 мл. Для ' время 0 ', Лизируйте клетки без встряхивания. Передавать трубы блока 95 ° C тепла для 10 мин сразу же после лизиса. Продолжить с immunoblotting или хранить лизатов при -20 ° с.
  2. Стимуляции клеток с хемотаксического
    1. Basalate агрегации компетентных клеток после 4 h развития, быстро встряхивая их присутствии кофеин 5 мм на 200 об/мин (0,42 x g) на орбитальный шейкер для 30 мин.
      1. Центрифуг суспензию клеток на 360 x g для 3-4 мин аспирационная супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 10 мл ледяной DB буфера. Повторите шаг стиральная.
    2. Ресуспензируйте Пелле окончательный клеток в ледяной DB буфер для окончательной плотности 4 x 10 7 кл/мл на основе первоначального ячейки номер, используемый для разработки клетки (см. шаг 2.2). Держите суспензию клеток на льду до стимулдругим опасным последствиям.
      1. Пипеткой 50 мкл 10 мкм лагерь или транспортного средства в чашку полистирола размещены на орбитальный шейкер.
    3. Стимулировать клетки, 450 мкл суспензии ледяной клеток в чашке же и немедленно включите шейкер на 200 об/мин (0,42 x g). В разное время после начала стимуляции (например 10, 30, 45, 60, 120 s), кратко остановить шейкер, взять 50 мкл аликвоты суспензию клеток и лизировать клетки, добавляя их в 1,5 мл пробирки, содержащие 25 мкл 3 X буфер образца.
      1. Для ' время 0 ', используйте клетки из суспензии кератоз ледяной клеток.
        Примечание: Конечная температура суспензию клеток во время стимуляции составляет ~ 9 ° C 26. В этих условиях пик ответ происходит несколько позже, чем пик, наблюдается для стимуляции, выполненных при комнатной температуре (например, стимуляции хемотаксического адэрентных клеток на микроскопе или механической стимуляции адэрентных клеток).
    4. Передачи трубы до 95 ° C тепла блок 10 мин сразу же после лизиса. Продолжить с immunoblotting или хранить лизатов при -20 ° с.
  3. Анализ клеток ответ по Immunoblotting
    1. лизатов (от шагов 3.1.3 или 3.2.4) на геле полиакриламида трис-HCl 4-15%, передать винилидена фторида мембраны, блок и immunoblot с фосфо Петропавловск Ζ Thr410 (для выявления фосфо PKBR1 и фосфо PKBA). Обнаружить сигнал по инкубации с хреном, конъюгированных с пероксидазой анти кролик вторичное антитело, следуют хемилюминесценции с использованием увеличенная хемолюминесценция субстрата.
    2. Для обнаружения нескольких белков, Стрип блот с зачистки буфера и повторно зонд с основного антитела против фосфо p42/44 MAPK Thr302/304 (для выявления фосфо ERK2). Подтвердить равные белка загрузки путем пятнать винилидена фторида мембраны с Кумасси синим.

4. Острый механической стимуляции и жить изображений из одной клетки на микроскопе

    1. оценки реагирования на острые механической стимуляции, с помощью потока устройства собирают и разбавить растительного или агрегирования компетентным клетки для ~ 1 х 10 6 клеток/мл в DB, как описано в шагах 2.1 и 2.2, соответственно. Загрузить ~ 600 мкл в слайд с каналом (см. Таблицу материал для деталей). Позволяют клеткам для присоединения 10 мин убедитесь, что все входы в слайд полностью заполнены. Пополнить с дополнительный буфер при необходимости.
      Примечание: Особое слайд, используемый для анализа имеет трех входов, которые питаются в узких, 1 мм каналы, но затем слить в один канал широкий, 3 мм. Высота канала составляет 0,4 мм. Хотя клетки покрыты всей канал, только часть широкого отображаемого.
    2. Пройти одну из линий, которые прикреплены к 50 мл водохранилища через фронт правый клапан аэрогидродинамических подразделения (см. Таблицу материалов для деталей). Используя программное обеспечение для насоса, убедитесь, что клапан закрыт (т.е. слева). Заполните резервуар с DB.
      1. Установить давление на 50 мбар и включите его. Заполните и промойте линии с DB путем нажатия на клапан, чтобы открыть его. Давление до 0 и закрыть клапан после ~ 30 s.
    3. Подключения линии к одному из трех входов на одной стороне слайда без захвата воздушные пузыри. Подключите два отверстия. Подключите линии из умов в спиральном на второй стороне слайда.
      Примечание: Труб, используемых для ввода и сливной линии в этой установки имеет внутренний диаметр 1.6 mm.
    4. Место слайда на Микроскоп 20 X воздушные цели. Для полоскания канал, переключатель клапана, чтобы открыть строку и нажмите " давление на ", начиная при высоком давлении (~ 50 мбар или ~ 40 дин/см 2), чтобы протолкнуть жидкости в канализацию.
      1. После того, как жидкость выходит из умов, уменьшить внешнее давление к нулю (т.е. тяжести потока только, ~ 15 Дин/см 2) и продолжать полоскание для ~ 30 s. переключатель клапан в противоположное положение, чтобы остановить поток.
    5. Получить изображения с ППП или GFP подсветки на Перевернутый флуоресцентным микроскопом под 40 X нефти цель интервалом 3 s. Клапана в закрытом положении, включите давление на требуемое давление, как правило, между 15 и 40 дин/см 2 (0 - 50 мбар).
    6. После приобретения 5 кадров, доставить стимул, переключающий клапан для " открыть " позиции. Отключить поток после 2-5 сек, переключающий клапан в противоположном направлении.
      Примечание: Для некоторых слабее биодатчики (например PTEN, CynA и RalGDS) оно может быть необходимо изображение клетки используя Конфокальный микроскоп оснащен 40 X нефти цель.
  2. Тестирования эффекты ингибиторов фармакологических на ответ на острый механической стимуляции с помощью потока устройства
    1. плиты клетки в слайд с каналом, как описано в пункте 4.1.1. Созданы две линии: пройти одну линию через фронт правый клапан как шаг 4.1.2, и второй через заднюю покинул клапан. Зажмите левую линию и поставьте клапан " закрытой " (левой) позиции. Заполнить одну строку с DB, содержащий соответствующие транспортного средства и второй с раствор, содержащий ингибитор фармакологический интерес (например 5 мкм Латрункулин A).
      Примечание: Это необходимо физически зажать левую линию, потому что " закрытой " левое положение открывает клапан для этой линии.
    2. Заполнения и промыть право линии путем включения давление на 50 мбар и переключающий клапан для " открыть " (справа) положение. Переключитесь в клапан слева после ~ 30 s. заливки и промойте левой линии, удалив зажим для ~ 30 s. Connect обе линии до двух вводов на одной стороне слайда с каналом, подключите остальные входе и подключить утечка в спиральном на второй стороне. < / л я >
    3. мыть слайд с буфером в правой линии и выполнять стимуляции в тот же буфер, как описано в шагах 4.1.3 и выше 4.1.4.
      Примечание: Хотя правой линии был выбран как первый в этой установки, можно поменять местами.
    4. После стимуляции, переключатель клапана, чтобы открыть правой линии при нулевом давлении (т.е. самотечный поток только, ~ 15 Дин/см 2). Удаление Клещи от левой линии и переключения клапан слева, чтобы открыть эту линию. Зажим первой строки.
    5. После запуска с ингибитором через 3-5 мл буфера, переключение клапан справа, чтобы остановить поток и инкубировать клетки с ингибитором за требуемый период времени (например 15 мин). Включите поток, переключающий клапан каждые ~ 10 мин ~ 15 s, чтобы предотвратить дефицит кислорода. Повторите стимуляции с второй линии.
  3. Альтернативный метод оценить ответ на острый механической стимуляции с помощью микропипеткой
    1. создана микропипеткой, заполнены с DB согласно стандартным протоколом 23. Держите компенсации давления на 1,500 собаки.
    2. Собирать и разбавить растительной клетки, как описано в шаге 2.1. Место 25 мкл капель ~7.5 x 10 5 клеток/мл в 1-ну камере, позволяют присоединиться по крайней мере 10 минут, и крышка с 3 мл DB.
    3. Место камеры на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X нефти цели. Найдите клетки. Аккуратно опустите микропипеткой в середине поля зрения до тех пор, пока он впервые касается нижней палаты.
      Примечание: Поскольку компенсации давления был установлен на 1,500 собаки, клетки будут постоянно подвергаться очень медленным потоком DB от микропипеткой.
    4. Начать импорт изображений с ППП или GFP подсветкой интервалы 3 s. Применить ' чистый ' функцию для освобождения струйное вливание жидкости из микропипеткой. Далее я изображенийn наличие потока за счет компенсации давления одиночку.
  4. Альтернативный метод оценить ответ острой механической стимуляции с помощью массового добавления буфера
    1. собирать и разбавленных растительной клетки, как описано в шаге 2.1. Место 20 мкл капель клеток на ~ 1 х 10 6 клеток/мл в DB в середине колодец из камеры 8-хорошо. Позволяют клеткам присоединиться для по крайней мере 10 мин
    2. Начать импорт изображений с освещением конкретных предложений или GFP на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X цель интервалом 3 s. Сосредоточиться на области ближе к краю падение.
    3. Быстро мкл 430 DB в одну сторону скважины. Продолжить томографии.
    4. Для анализа взаимодействия между механических и химических раздражителей, 12 или 45 s после механической стимуляции, аккуратно 50 мкл фолиевой кислоты (конечная концентрация 20 Нм) или транспортного средства (DB) не вызывая механических ответ. Продолжить томографии.
  5. Количественная оценка ответ
    1. открыть 32-битный TIFF изображений в программное обеспечение для анализа изображений (см. Таблицу материалов) 27.
    2. Под ' анализ ' вкладку, перейти к " набор измерений ". Установите флажок в поле ' значение означает серый '. Убедитесь, что другие коробки не проверяются. Нажмите кнопку " ОК ".
    3. Под ' процесс ' щелкните " вычесть фон ". Держите мяч радиусу качения на 50 пикселей и сделать не проверить любой из вариантов, перечисленных в меню. Увеличить на одну ячейку с помощью ' увеличительного стекла ' инструмент.
    4. Использование ' прямоугольник ' инструмента, нарисуйте рамку (~2.5 x 2,5 мкм 2) в цитозоле, убедившись, что не нарисовать его над ядром или плазматической мембраны. Пресс " Ctrl " + " М " ключи или перейдите на ' анализ ' вкладке и нажмите на " мера " чтобы определить среднее значение серого окна. Аванс для последующих кадрах и мера снова, убедившись, что поле остается в цитозоль.
      Примечание: Так как D. discoideum клетки движутся очень быстро поле могут быть перемещены из одного кадра к следующему держать его в цитозоль.
    5. После всех фреймов были проанализированы, скопировать значения в таблицу. Для учета в ячейке изменения в уровнях выражения различных биодатчиков, нормализовать значения для среднее значение серого, наблюдается в момент времени 0. Вычислить обратную величину значения, чтобы отразить накопление сигнала на коре.

5. Непрерывная механической стимуляции и жить изображений из одной клетки на микроскопе

  1. точно так, как описано выше для анализа острого механических раздражений в шагах 4.1.1 - 4.1.3 Настройка клетки. Откройте вилку покрытия резервуара с буфером, так что объем могут пополняться если ответ анализируется дольше, чем несколько минут за один раз.
    Примечание: Потому что водохранилище остается открытым в течение всего эксперимента, этот assay проводится в отсутствие внешнего давления и опирается на самотечные потоки только. Чтобы увеличить скорость потока на гравитации, сливной могут быть размещены на столе под микроскопом.
  2. Начать визуализации ячейки с освещением конкретных предложений или GFP на Перевернутый флуоресценции микроскоп оснащен 40 X цель интервалом 3 s для анализа ответов биодатчик. Кроме того, изображение с Фазовый контраст с помощью объектив 20 X 10 s интервалом для анализа миграции клеток в.
  3. Включите потока после нескольких кадров в параметре нулевого давления (т.е. поток является из-за тяжести одиночку или ~ 15 Дин/см 2) путем переключения клапана в открытое положение. Когда уровень жидкости падает на 5-10 мл в водохранилище, Топ с более буфера. Убедитесь в том добавить жидкость тщательно, чтобы пузырьки воздуха не попасть в ловушку в строках.
    Примечание: Важно добавить жидкость той же температуре, чтобы избежать удара ответ в клетках.
  4. Подсчитать ячейки скорость и сохраняемости с помощью программного обеспечения для анализа миграции (см. Таблицу материалов для деталей) согласно данным производителя ' s инструкции.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Височной ответ регуляторов хемотаксис острой механической стимуляции

Для оценки реакции клеток D. discoideum механическим раздражением, сторонником агрегации компетентных клеток были подвержены краткий импульс потока сдвига. Агрегата компетентных D. discoideum клетки секретируют лагерь, который может быть почувствовал соседних клеток. Чтобы преодолеть вклад ячеек сигнализации, клетки лечили кофеин, который подавляет adenylyl циклазы в D. discoideum и таким образом предотвращает лагеря секрецию28. Действительно, клетки предварительно обработанных с кофеина очень низкими базальный деятельность PKBR1 и ERK2 и показал надежную увеличение фосфорилирование ключевых остатки этих киназы, после 5 s стимуляции с потоком ножниц (Рисунок 1A). Ответ был временным и остроконечное вокруг 10-15 s для PKBR1 и около 30 s для ERK2, аналогично ранее опубликованных результатов для активации этих белков с хемотаксического7.

Хотя трудно оценить эффективность реагирования, учитывая низкий уровень базальной, предварительные исследования, которые привели к развитию этот assay, по сравнению стимуляции с потоком ножниц самостоятельно (или с транспортного средства) для сдвига потока в присутствии Лагерь хемотаксического (рис. 1B). Этот анализ не сделал свидетельствуют об увеличении в ответ с лагерем, предполагая, что ответ сети трансдукции сигнала для сдвига поток насыщения. Хотя в этот assay лагерь не увеличили фосфорилирование PKBR1, реакция клеток хемотаксического можно наблюдать с помощью протокола Стандартный стимуляции, где хранятся агрегации компетентных клеток в суспензии, стимулировали с лагерем и анализироваться на различных Указывает время, после стимуляции. Как показано на рисунке 1 c, в этих условиях существует преходящее повышение в PKBR1 фосфорилирования в ответ хемотаксического, но не автомобиль. На 30 наблюдается пик ответ s в этот assay, потому что температура суспензию клеток во время assay ~ 9 ° C, по сравнению с ~ 22 ° C для механической стимуляции assay описанных выше26.

Пространственно-временных ответ ведущих и отставание края маркеров острого механической стимуляции

Поскольку население assay выше предоставляет только временной информации о поведении хемотаксис регуляторов, клетки также подвергаются краткий механические стимул пока соблюдается с помощью микроскопа. Этот assay может быть выполнена с агрегации компетентным или растительных клеток D. discoideum , выражая различные дневно меченых биодатчики, чьи локализации был определен в клетках стимулируется с хемотаксического. Две передовые маркеры, PH домен Крак и известьΔcoil, которые набираются по PIP3 или недавно полимеризуется актина, оба показали основном цитозольной локализации в клетках отдых как сообщалось ранее (рисунок 2A, Дополнительные фильм 1 )4,29. В клетках, которые были basally активны эти Биодатчики можно также увидеть на советы ложноножки. После стимуляции с потоком ножниц для 2 s, биосенсоров, быстро relocalized в кору с пика в ~ 6-10 s и вернулся в цитозоле ~ 30 s. В отличие от этого отстающие края маркер PTEN локализован в коре до стимуляции (рис. 2A). После краткого импульса с потоком ножниц цитозольной PTEN интенсивности увеличилось, хотя и медленнее динамика чем биодатчики переднего края. Изменения в биосенсор локализации от цитозоль в кору и наоборот, четко рассматривается как изменения в цитозольной интенсивности, позволяя простой количественной оценки ответа.

Наблюдаемое поведение биодатчиков в ответ на острые механической стимуляции согласуется с ведущими и отставание края локализации динамика в ответ на стимуляцию с единой хемотаксического. Это поведение не был уникальным для трех биодатчики показано. Как ранее опубликованные, аналогичные изменения в локализации были отмечены передовые маркеров RBD и RalGDS, которые признают активирован ран и Rap1, соответственно, а также для другой маркер отстающие края CynA22,30.

Аналогичный анализ может использоваться для оценки воздействия различных ингибиторов простой модификации экспериментальной установки из одной входной строки в один двойной. С помощью этого метода, клетки может быть сначала подвергается контролю условий и затем переключился на буфер, содержащий нужный тестовый агент. Например добавление актин depolymerizing препарата LatA заблокирован ответ RBD, а также лаймΔcoil, острой механической стимуляции (рис. 2B).

Глобальный ответ предшествует миграции клеток под пролонгированной стимуляции с потоком ножниц

Подход, описанный здесь также могут быть адаптированы для изучения воздействия сдвига потока на D. discoideum миграции. В самом деле, если поток не был отключен после 2 s но оставалась на протяжении эксперимента, растительных клеток показали, направленных миграции против потока (рис. 3Дополнительные фильм 2). Следует отметить, что наклон потока необходимо выявить миграционные ответ был ниже, чем давление, которое обычно используется для достижения глобального ответа с острой стимуляции в растительных клеток (например, как показано на Рисунок 2B). Однако даже при низком давлении, ячеек надежный единый ответ, измеряемый изменения в известьΔcoil локализации, которая предшествовала каких-либо изменений в позиции самой клетки. Таким образом эти эксперименты ясно показали, что 1) Глобальный ответ не зависит от движения ячейки, и 2) глобального реагирования предшествует режиссер миграции.

Альтернативные подходы тестирования ответ на острые механической стимуляции

Хотя использование потока через камеры имеет явные преимущества для изучения реакции на острый механической стимуляции, мы также проверяются два дополнительных анализов для проверки реакции отдельных ячеек на острый механической стимуляции. Как показано на рисунке 4, известьΔcoil быстро и временно повторно локализован от цитозоль к коре когда клетки были простимулированы добавлением болюсным буфера доставлены либо микропипеткой (Рисунок 4A) или вручную с помощью массовых Добавление в буфер с пипеткой (рис. 4B). Следует отметить, что четкий недостаток обоих этих анализов, что точное количество поперечной силы, доставлены в ячейку неизвестна и не может быть легко изменены. Однако для ситуаций, где желательно переключение между механических и химических раздражителей, массового добавления буфер предлагает твердых альтернативой для стимуляции в устройства потока.

Figure 1

Рисунок 1: представитель результатов оценки биохимической реакции клеток D. discoideum острый механические или химические стимуляции. Агрегата компетентных клеток были подвержены механическим или химическим воздействиям, анализироваться в назначенное время точках, и immunoblotted, с использованием антител, которые признают фосфорилированных PKBR1 или ERK2. (A) сторонник клетки были стимулировала на орбитальный шейкер для 5 s. Мембрана был окрашенных с Кумасси блестящий синий (НБР) Показать равные белка загрузки. (B) сторонник клетки были простимулированы ручное перемещение пластины в крест-накрест манере для примерно 5 s после химического стимуляции из-за добавления 1 мкм лагерь или буфер (транспортного средства), или без каких-либо химических стимуляции (-). Два иммуноблотов показывают степень вариации в базальных активации PKBR1, видели в момент времени 0. Иногда PKBA активации может быть также обнаружен, этот метод, как показано в нижней панели. (C) подвеска клетки были стимулируется с 1 мкм лагерь или буфер (транспортного средства). Часть (A) этот показатель был изменен от Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: представитель результаты для острой механической стимуляции и живой изображений одной клетки на микроскопе. (A) агрегации-компетентные D. discoideum клетки выражая ППП меткой ЛаймаΔcoil, или GFP-тегами PH-Крак или PTEN были стимулируется с однонаправленным ламинарного потока на 15 Дин/см2 , для 2-5, s. изображения были собраны все 3 s . Представитель клетки показаны транслокации биодатчиков в ответ на механической стимуляции отображаются. Накопление каждого биодатчик в коре была количественно оценена как обратное означает цитоплазматических интенсивности, нормированный время 0. Отображается средняя ответ 18 (Δcoilизвести), 20 (PH-Крак) или 6 (PTEN) клетки. Значения являются средний ± SE. (B) растительных клеток, выражая ППП меткой ЛаймаΔcoil- ЗП и GFP-тегами RBD относились с транспортного средства или 5 мкм лата для по крайней мере 15 минут, а затем стимулируется с однонаправленным ламинарного потока на 41 Дин/см2 для 2 s. изображения были собраны все 3 s. RBD-GFP и известьΔcoil- ЗП накопление в коре головного мозга была количественно оценена как (A). Значения среднее ± SE. Количество клеток проанализирована указывается рядом с каждого условия. Шкалы бар = 10 мкм. Эта цифра была изменена от Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: Представитель результаты для ответа D. discoideum клеток для пролонгированной стимуляции с потоком. (A) растительных клеток, выражая ППП тегами известьΔcoil были подвержены непрерывной однонаправленный ламинарного потока на 15 Дин/см2 и образы каждые 3 s. треки 11 ячеек указаны в пункте (B). Шкалы бар = 10 мкм. Эта цифра была изменена от Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 4
Рисунок 4: представитель результаты для альтернативных подходов для тестирования ответ на острые механической стимуляции. (A) вегетативного D. discoideum клетки выражая ППП меткой ЛаймаΔcoil были подвержены микропипеткой (*) basally выпускать аналитического буфера медленными темпами. Увеличение скорости потока на краткий было достигнуто путем быстрой доставки болюс аналитического буфера в момент времени 0. Изображения были собраны каждые 3 клетки растительного D. discoideum s. (B), выражая ППП меткой ЛаймаΔcoil покрытием как небольшое падение в камере микроскопии механически были простимулированы добавлением большого объема буфера камеры. Изображения были собраны каждые 3 s. шкалы бар = 10 мкм. часть (A) этот показатель был изменен от Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Дополнительные фильм 1: Острый механическая стимуляция вызывает быстрое и переходных транслокации известьΔcoil- ППП или PH-Крак-GFP от цитозоль кору в агрегации компетентных D. discoideum клеток выразить эти биодатчиков. Однонаправленный ламинарного потока был включен для 5 s в момент времени 0 и клетки были образы интервалом 3 s. Скорость воспроизведения — 5 кадров/сек. Показаны два примера для каждой ячейки строки. Шкалы бар = 10 мкм. Этот фильм соответствует рисунок 2A и был изменен от Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительные фильм 2: Непрерывное механической стимуляции вызывает быстрое и переходных транслокации известьΔcoil- ЗП от цитозоль в кору до миграции клеток против направления потока. Растительных клеток, выражая известьΔcoil- RFP были подвержены непрерывной касательное напряжение в 15 Дин/см2 , начиная в момент времени 0 и образы интервалом 3 s. Скорость воспроизведения-10 кадров в секунду шкалы бар = 10 мкм. Этот фильм соответствует рис и был ранее опубликован в Артеменко и др. (2016) 22. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Методы, описанные здесь предлагают удобный способ оценить как населения, так и поведение отдельных клеток в ответ для наклона потока. Важно отметить, что в то время как предыдущие исследования анализируются локализации ведущих и отставание края маркеры во время миграции, нынешний подход позволяет исследование непосредственных эффектов, применяя сдвига поток остро. С помощью этого метода мы продемонстрировали, что, в самом деле, первоначальная реакция клеток для наклона потока не требует миграции клеток. Вместо этого быстрое и переходных ответ на раздражитель первоначальный наклон потока предшествует направления миграции, видели с длительным воздействием сдвига потока, аналогично глобального отклика, видели с градиентом хемотаксического.

Биохимические и микроскопический подходы дают дополнительных данных, даже несмотря на то, что каждый метод имеет свои преимущества и недостатки. Стимуляция, следуют лизис клеток и immunoblotting PKBs, KrsB и «Эрк», например, анализирует все население клеток и таким образом в среднем к ячейке вариации, в отличие от assay который исследует поведение отдельной ячейки. Однако демографических анализов склонны маска тонкие изменения в ячейке поведение, которое может быть легко наблюдается путем анализа отдельных ячеек. Кроме того Биохимические пробы, описанные здесь действует только с агрегации компетентных клеток, по причинам, которые будут обсуждаться позднее. В противоположность этому на основе микроскопии пробу relocalization RBD, RalGDS, PH-Крак, известьΔcoilи PTEN, например, между коры и цитозоле эффективна для вегетативного и агрегации компетентных клеток и таким образом позволяет для наблюдения широко применимы к клеткам с различной поляризации. Что делает эти два подхода взаимодополняющих является тот факт, что они рассматривают различные наборы доступных ведущих/отставание края маркеров, таким образом, расширяя охват сигнала трансдукции актина цитоскелета сетей и протестированы с assay потока сдвига.

Остается неясным, почему растительных клеток, которые очень отпор в микроскопии основе анализов, не реагировать на стимуляции, а затем лизиса клеток и immunoblotting. Одним из возможных вариантов является, что количество поперечной силы применяется к ячейкам, когда пластина вращается не соответствует силы сталкиваются клетки в камере потока. Развитые клетки, напротив, возможно имеют более низкий порог для активации и, таким образом, отвечать либо условиях. Маловероятно, что биодатчики, деятельность которого измеряется биохимического анализа не выражены или не активирован в растительных клеток, поскольку стимуляция растительных клеток с фолиевой кислотой приводит к надежной активации PKBR1/PKBA и ERK2 (данные не показано). Кроме того растительных клеток показывают четкий набор PH-Крак, который отражает PIP3 накопление, в основе микроскопии assay. Поскольку PKBA набора зависит также от PIP3, представляется маловероятным, что PKBA не будет реагировать на острые механической стимуляции, если условия в биохимических assay не являются оптимальными, как упоминалось выше. Это остается зоной активного расследования.

Биохимический анализ регуляторов хемотаксис требуется присутствие кофеина на протяжении всего эксперимента. Первоначально кофеин был добавлен для предотвращения к ячейке сигнализации за секрецию лагеря. Однако как представляется, что кофеин обладает другой роли помимо ингибирование циклазы adenylyl (ACA) поскольку ACA непустых ячеек по-прежнему требуется кофеин для фосфорилирование PKBR1 в ответ острой механической стимуляции. Кофеин ранее показал блокировать активность TorC226. Вполне возможно, что ингибирование TorC2 заблокированы некоторые базальной моторики клеток и таким образом снижение базальной активации PKBR1 и других компонентов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей. Низкая активность базальных крайне необходимо для наблюдения за ответ для наклона потока. В самом деле когда клетки были собраны на более ранние моменты времени во время разработки, они отображаются, повышение базальной активности и снижение индуцированного сдвига потока ответа. Интересно как известно, что растительной клетки имеют пропорционально больше PKBA активности и менее PKBR1 по сравнению с развитыми клетки31. Вполне возможно, что состояние базальной несколько по-разному регулируется вегетативной и агрегации компетентных клеток, дополнительный вклад отсутствием реакции вегетативной клетки в биохимических assay. Любопытно когда клетки были собраны в более поздних точек развития, они также имели снижение ответ, вероятно, из-за сильное влияние полярности на локализации и активации различных регуляторов хемотаксис, рассмотрены в этом assay.

Стимуляция клеток в камере микроскопия показала, что сила и продолжительность стимула содействовать максимальной ответ22. Другими словами, максимальной реакции может быть достигнуто даже с низкой поперечной силы, если он применяется для длительного периода времени (10 против 2 s s). Это наблюдение объясняет, почему клетки имеют глобального отклика, когда сначала они подвергаются постоянной, но слабых, стимул, что приводит к сдвига потока индуцированной миграции. С текущей аппарат мы были способны генерировать достаточно низкий наклон потока расследовать нижнем конце диапазона.

Возможно наиболее важные исследования, проведенные с помощью острого механической стимуляции подразумевается что механических и химических раздражителей, как представляется, кормить в общей передачи сигнала и Цитоскелет актина сетей. Хотя мы показали, что два стимула интегрировать с помощью массового добавления буфера для механической стимуляции, будущие исследования будут направлены на развитие системы где хемотаксического могут быть доставлены быстро в поток через канал, который будет гораздо более универсальный и мощный способ для оценки интеграции механических и химических раздражителей. К сожалению хемотаксического сложения, с использованием текущей настройки две линии ассоциируется с второй стимул потока сдвига, потому что хемотаксического должен быть доставлен в присутствии потока. Жизнеспособной альтернативой может быть лазер стимулирует высвобождение хемотаксического из предвестником клетке, как успешно было показано для лагеря Вестендорфа и др. 32. в будущем, было бы также интересно для изучения интеграции других стимулов, например, сдвига потока и переменных электрических полей или сдвига потока и жесткость переменной субстрата. Последний пример интересен, потому что она включает в себя два типа механической стимуляции, хотя первоначальный сигнал могут отличаться между ними. Подтверждая, что все раздражители, которые индуцируют режиссер миграции поделиться той же сети трансдукции сигнала и различаются только в том, как воспринимается раздражитель будет объяснить, как клетки могут перемещаться в сложных средах. Наконец мы уже показали, что острый стимуляции с потоком ножниц приводит к распространению человеческих нейтрофилов подобных клеток22. Будущая работа будет продолжать изучать локализации и активации различных компонентов сигнала трансдукция и актина цитоскелета сетей с механическим воздействиям в mammalian клетках.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана национальными институтами здравоохранения грант R35 GM118177 НПР.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

Клеточная биология 129 выпуск сигнальной трансдукции mechanotransduction касательное напряжение хемотаксис Реотаксис миграции потока индуцированного сдвига режиссер миграции биосенсор локализации острый стимуляции
Оценка <em>сапротрофные discoideum</em> реагирования на острые механической стимуляции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter