Summary
Aquí describimos los métodos para evaluar la respuesta celular al estímulo mecánico agudo. En el análisis de microscopía, examinamos localización de biosensores marcada con fluorescencia Tras estimulación breve con esquileo del flujo. También probamos la activación de diversas proteínas de interés en respuesta a la estimulación mecánica aguda bioquímicamente.
Abstract
Quimiotaxis, o migración a un gradiente de quimioatractiva, es el mejor modo de entender de migración dirigida. Estudios social ameba Dictyostelium discoideum reveló que una red de transducción de la señal compleja de caminos paralelos amplifica la respuesta a atrayentes y lleva a la polimerización de la actina sesgada y saliente de un seudópodo en la Dirección de un degradado. En cambio, no se conocen mecanismos moleculares conducir otros tipos de migración dirigida, por ejemplo, debido a la exposición a flujo o campos eléctricos, de cizalla. Muchos reguladores de quimiotaxis exhiben localización en el revestimiento de borde o de una migración de la célula, así como mostraron cambios transitorios en la localización o la activación después del estímulo global con un chemoattractant. Para entender los mecanismos moleculares de otros tipos de migración dirigida se desarrolló un método que permite la examinación de la respuesta celular al estímulo mecánico agudo basado en la exposición breve (2-5 s) a flujo del esquileo. Esta estimulación se puede entregar en un canal mientras que las células con marcada con fluorescencia biosensores para examinar el comportamiento de células individuales de la proyección de imagen. Además, la población celular puede ser estimulado en una placa, lisis y immunoblotted utilizando anticuerpos que reconocen las versiones activadas de proteínas de interés. Mediante la combinación de ambos ensayos, uno puede examinar una amplia gama de moléculas activadas por cambios en la localización subcelular o fosforilación. Con este método determinamos que la estimulación mecánica aguda desencadena la activación de las redes de citoesqueleto de actinia y transducción de señal quimiotáctica. La capacidad de examinar las respuestas celulares a la estimulación mecánica aguda es importante para comprender los eventos Inicio necesarios para motilidad inducida por el flujo del esquileo. Este enfoque también proporciona una herramienta para el estudio de la red de transducción de señal quimiotáctica sin la influencia de la confusión del receptor chemoattractant.
Introduction
Migración de las células eucariotas está sesgada por diversas señales químicas y físicas en el medio ambiente, incluyendo gradientes de atrayentes solubles o sustrato enlazado, rigidez variable de los sustratos, campos eléctricos o flujo del esquileo. Aunque ha habido muchos avances en nuestra comprensión de los mecanismos moleculares conduce chemotaxis, menos se sabe acerca de otros tipos de migración dirigida y cómo se integran estas diversas señales a nivel celular para producir un migratorias respuesta.
Dirigido la migración hacia un aumento de la concentración de un chemoattractant implica tres componentes conductuales: motilidad, detección direccional y polaridad1. La motilidad se refiere al movimiento aleatorio de las células mediante protrusión de pseudópodos. Es la capacidad de una célula para detectar la fuente de quimioatractiva de detección direccional, que puede ocurrir incluso en inmovilizado células. La polaridad se refiere a la distribución asimétrica más estable de componentes intracelulares entre el líder y el revestimiento de borde de una célula, que conduce a mayor persistencia en movimiento.
Respuesta celular a un chemoattractant depende de la actividad de redes reguladoras expresiones definidas cuatro: receptor / G proteína, transduction de la señal, citoesqueleto de actina y polaridad1. Chemoattractant atascamiento al receptor acoplado a proteínas G transmite la señal vía heterotriméricas G proteínas α y βγ a la red de transducción de la señal descendente, que amplifica la señal direccional. Múltiples vías dentro de la red de transducción de señal actúan en paralelo y alimentan la red del citoesqueleto de actina y polimerización de la actina sesgo, protrusión de seudópodo consecuente, en la dirección del gradiente. Importantes reguladores de la quimiotaxis son Ras GTPase, TorC2, fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), homólogo de fosfatasa y tensina (PTEN) y ciclasa guanylyl. Mecanismos de retroalimentación dentro de la red de transducción de señal y la transducción de señales y redes de citoesqueleto de actina más amplifican la respuesta. Finalmente, la red de polaridad mal definida recibe entrada desde el citoesqueleto de actina y sesgos aún más la red de transducción de señal para promover la migración persistente en la dirección del gradiente.
Gran parte de nuestra comprensión mecanicista de la quimiotaxis fue posible debido al desarrollo de biosensores con etiqueta fluorescente para diversos componentes de las redes reguladoras. Muchos reguladores de quimiotaxis tienen una distribución asimétrica de la molécula reguladora de sí mismo o de su actividad. Por ejemplo, biosensores que reconocen activación versiones de pequeño GTPases Ras y Rap1 – dominios de unión a Ras de Raf1 (denominado RBD aquí) y RalGDS, respectivamente-localizar a la vanguardia de una célula chemotaxing2,3. Del mismo modo, PI3K y su producto fosfatidilinositol (3,4,5)-trifosfato (PIP3), reconocido por un dominio de homología (PH) pleckstrin, también Mostrar localización en el frente de una célula4,5. Por el contrario, una 3-fosfatasa PTEN, que convierte PIP3 a fosfatidilinositol (4,5)-bifosfato, se localiza en el borde del revestimiento de la célula6. Lo importante, estos biosensores cambian su localización en la respuesta a la estimulación global con un chemoattractant. Marcadores de vanguardia, citosólico o en las extremidades de salientes en una celda de reclinación, relocalizar a la corteza, mientras que quedándose marcadores del borde, localización cortical y están ausentes de las puntas de salientes en una reclinación de la célula, se convierten en citosol después de estimulación. Análisis de la distribución de biosensor en respuesta a la estimulación global con un chemoattractant minimiza la contribución de motilidad y polaridad, que a menudo confundir las observaciones. Estimulación global o uniforme de una suspensión con un chemoattractant también se utiliza como una herramienta para evaluar los cambios de toda la población en la activación de la proteína, a menudo detectada por fosforilación de proteínas7,8,9 . Este análisis bioquímico se utilizan principalmente para obtener información temporal, mientras que la microscopia se utiliza para recopilar información temporal y espacial sobre el comportamiento de los diversos componentes de las redes reguladoras.
La red de transducción de señal incorpora características de un sistema excitable10,11. Respuestas a los estímulos quimiotácticos supra umbral son "escogiendo" y mostrar períodos refractarios. Las respuestas se desencadenan también estocástico y pueden mostrar comportamiento oscilatorio. Eventos de transducción de señal se localizan en las regiones de la corteza que se propagan como ondas12,13,14,15. Frente, detrás, marcadores son reclutados a o disocian de las zonas activas de las ondas de propagación. Debido a la región refractaria que se arrastra la zona activa, las olas opuesto dirigidas aniquilan como se encuentran. Las olas de transducción de señal propagación subyacen las protuberancias celulares que median la migración de la célula10.
Mucha de la información mencionada en la quimiotaxis vino de los estudios sobre la ameba social discoideum de Dictyostelium, aunque mecanismos regulatorios similares también son aplicables a los neutrófilos y otros tipos de células de mamífero16 . Dictyostelium es un organismo modelo bien establecido que cuenta con una robusta respuesta quimiotáctica durante hambre, cuando miles de células migran hacia un centro de agregación, eventualmente formando un cuerpo fructífero multicelular que contiene esporas. Chemotaxis es también esencial durante la etapa de crecimiento de la célula solo de este organismo para la localización de fuentes de alimentación bacteriana. Lo importante, migración de células de Dictyostelium solo es notable similar a la migración de neutrófilos mamíferos o de las células de cáncer metastásico, que sufren migración ameboides tipo muy rápida. De hecho, tanto la topología global de las redes de regulación, así como muchas de las vías de transducción de señal individuales implicadas en la quimiotaxis se conservan entre Dictyostelium y leucocitos mamíferos17. Además, otras células, como fibroblastos, usan quinasas de tirosina del receptor (RTK) en lugar de GPCRs; sin embargo, RTKs pueden alimentar redes similares.
En contraste con la quimiotaxis, carece de comprensión de los mecanismos de señalización que conducen a otros modos de la migración dirigida. De manera similar a las células que migran en un gradiente chemoattractant varios estudios han reportado activación o localización de marcadores típicos de vanguardia, incluyendo la polimerización de la actina, PIP3 o quinasa regulada por señal extracelular (ERK) 1/2, en el frente de las células que experimentan dirigido migración en respuesta a esfuerzo cortante flujo o cambios en campos eléctricos18,19,20,21. Sin embargo, en estos estudios la exposición continua al estímulo también dio lugar a la migración de la célula, dejando abierta la pregunta si, por ejemplo, los marcadores de punta localización específicamente en respuesta a un estímulo, o si simplemente localiza en el borde de ataque debido a aumento del número de pseudópodos en la parte delantera de una migración de la célula.
Desarrollamos análisis que nos permiten observar la respuesta de las células a perturbación mecánica aguda entregado como esquileo del flujo tanto a nivel poblacional y como células individuales22. Similar a la estimulación global con quimioatractiva, estimulación agudación con esquileo del flujo permite el estudio de la respuesta celular a un estímulo mecánico sin la contribución de la confusión de la motilidad o polaridad. Combinando estos ensayos bioquímicos y microscópicos con perturbaciones genéticas o farmacológicas nos permite aprender sobre estímulos mecánicos cómo se perciben y se transmite. Por otra parte, este enfoque también proporciona un método novedoso para aprovechar el sistema aguas abajo del receptor chemoattractant en ausencia de un chemoattractant, aislando así las señal de transducción y de la actinia citoesqueleto redes de receptor/G red de la proteína.
Utilizando las técnicas descritas a continuación recientemente demostró que corte la tensión aguda conduce a la activación de múltiples componentes de la señal quimiotáctica transducción y actinia citoesqueleto redes22. Mediante la aplicación de la estimulación mecánica aguda a intervalos diferentes, demostramos que, semejantemente a atrayentes, respuesta a estímulos mecánicos también exhibe características de un sistema excitable, incluyendo el comportamiento escogiendo de la respuesta en condiciones de saturación y la presencia de un período refractario. Finalmente, mediante la combinación de estimulación mecánica y química mostramos que dos estímulos comparten señal transducción y actinia citoesqueleto redes, que probablemente permitan la integración de múltiples estímulos a la migración de células de sesgo.
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Protocol
1. preparación de soluciones
- HL-5 preparar medios utilizando lo siguiente: 10 g/L dextrosa, peptona Proteosa de 10 g/L, extracto de levadura 5 g/L, 0,965 g/L de Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0,485 g/L KH 2 PO 4 y salvo indicación en contrario, estreptomicina de 0,03 g/L en agua desionizada. Autoclave el medio y almacenar a temperatura ambiente.
Nota: Debido a las diferencias entre Proteosa peptona y levadura extracto adquiridos de diferentes proveedores, así como entre lotes individuales, pH de los medios de comunicación puede necesitar ajustarse a la gama típica de 6.4 a 6.7. - Placas SM preparar utilizando lo siguiente: 10 g/L dextrosa, peptona 10 g/L, 1 g/L levadura extracto, 2,31 g/L de KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 y agar 20 g/L en agua desionizada. Autoclave, enfriar y vierta 30 mL de la solución de agar por caja de Petri de 10 cm. Una vez que el agar se solidifica, almacenar las placas a 4 ° C durante 1 mes.
- Prepare 10 x Buffer de fosfato (PB) utilizando 13,4 g/L de Na 2 HPO 4 ·7H 2 O y 6,8 g/L KH 2 PO 4 en agua desionizada. Almacenar el stock de 10 x a 4 ° C. Diluya a 1 x con agua desionizada para uso.
- Preparar Buffer DB complementando 1 X PB con MgSO 4 de 2 mM y 0,2 mM CaCl 2.
- Preparar la cafeína 100 mM en agua desionizada. Almacenar en − 20 ° C.
- Preparar 100 mM campo solución disolviendo campo sodio monohidrato de sal en agua desionizada. Preparar un 1 mM trabajando valores en agua desionizada. Almacenar ambas soluciones en − 20 ° C. preparar campo solución final a la concentración deseada en DB en el día del experimento.
Nota: Soluciones de Stock puede congelar-descongelar varias veces. - Preparar ácido de fólico de 25 mM x 1 PB. Añadir unas gotas de 1 N NaOH hasta que el polvo se disuelva completamente. Almacenar en − 20 ° C.
- Prepara el tampón x 3 usando lo siguiente: 187,5 mM Tris-HCl de pH 6.8, 6% (w/v) sodio dodecil sulfato (SDS), 30% glicerol, 126 mM Ditiotreitol y 0.03% (p/v) azul de bromofenol. Alícuota y tienda en − 20 ° C.
- Antes de utilizar, descongele en un baño de agua de 37 ° C y proceder a preparar el tampón con inhibidores de la proteasa y fosfatasa diluir 3 x sample buffer 1 x, y agregando 50 mM NaF, pirofosfato de sodio 25 mM, 2 mM Na 3 VO 4 y 1 x completa libre de EDTA inhibidor de la proteasa en agua desionizada. Añadir los inhibidores inmediatamente antes de iniciar el procedimiento descrito en los pasos 3.1.2-3.1.3.
- Prepare 5 mM solución A Latrunculin en DMSO. Alícuota y tienda en − 20 ° C.
2. Preparación de células de D. discoideum
Nota: mantener D. discoideum las células HL-5 medios en placas de cultivo de tejidos o en una suspensión de cultivo como describió anteriormente 23. Cuando sea necesario, transformar las células con marcada con fluorescencia biosensores según protocolos de la electroporación estándar 24. Varias cepas de D. discoideum, como plásmidos codifican biosensores u otros genes de interés se pueden obtener desde el centro de la acción de Dicty (dictybase.org).
- Crecimiento y recolección de las células vegetativas de D. discoideum
- para el análisis de células vegetativas, crecen las células en presencia de bacterias para reducir el número de macropinosomes, que típicamente se observan en las células axenically cultivadas 25.
- Preparar un cultivo de Klebsiella aerogenes por inocular a una pequeña cantidad de células de un stock de glicerol o de una cultura anterior en el volumen deseado de medio de HL-5 sin antibióticos. Incubar el cultivo bacteriano en un agitador orbital a 200 rpm (0.42 x g) a temperatura ambiente (20-22 ° C) para 16-18 h.
Nota: La K. aerogenes variedad utilizada aquí es no patógenos (ver la Tabla de materiales).
- Preparar un cultivo de Klebsiella aerogenes por inocular a una pequeña cantidad de células de un stock de glicerol o de una cultura anterior en el volumen deseado de medio de HL-5 sin antibióticos. Incubar el cultivo bacteriano en un agitador orbital a 200 rpm (0.42 x g) a temperatura ambiente (20-22 ° C) para 16-18 h.
- D. discoideum en la fase de crecimiento exponencial de las placas de cultivo de tejidos o de una cultura de suspensión y contar las células usando un hemocitómetro según fabricante ' instrucciones. Extensión 1 x 10 5 D. discoideum las células con suspensión de K. aerogenes de 260 μL en una placa de SM. Gire la placa boca abajo al día siguiente. Cultivar células a temperatura ambiente hasta las células de D. discoideum empiezan a limpiar el césped bacteriano pero antes de que empiecen a agregar (~ 36-48 h).
- Recoger D. discoideum las células en 5 mL DB de tampón por raspado con un difusor de vidrio. Transferir las células a un tubo de polipropileno de 50 mL. Enjuagar el plato con otro buffer 5 mL DB y piscina con la suspensión original. Llenar el tubo de 50 mL con buffer DB.
- Centrífuga la suspensión de D. discoideum a x 360 g 3-4 min aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 mL Buffer DB. Repita los pasos de lavado hasta que el sobrenadante esté claro (~ 3 a 4 lavados). Resuspender el precipitado final de la célula en buffer DB a una densidad final de ~ 5 x 10 6 células/mL.
- para el análisis de células vegetativas, crecen las células en presencia de bacterias para reducir el número de macropinosomes, que típicamente se observan en las células axenically cultivadas 25.
- Preparación de agregación-competente D. discoideum las células
- desarrollo D. discoideum las células por inanición de 1 h seguida de 4 h de hambre y de pulsación con campamento nM 50 cada 6 min según norma protocolos de 23.
- Tras desarrollo, medir el volumen final de la suspensión celular.
- Basado en el número inicial de células utilizadas para el desarrollo, calcular la densidad celular de la suspensión final.
Nota: Si el campo se entrega en volúmenes de 100 μl a cada 6 minutos, volumen celular aumenta 1 mL por cada hora de campo pulsante. Así, para las condiciones estándar con 8 x 10 7 células en 4 mL de DB, después de 4 h de desarrollo el volumen final es de 7 mL y la densidad celular final es ~1.1 x 10 7 células/mL.
3. Análisis bioquímicos de la respuesta de la célula mecánica o estimulación química
- Aguda mecánica estimulación de células seguida de lisis celular
- placa 2 x 10-6 competente agregación de células (del paso 2.2) después de 4 h de desarrollo en platos de 35 mm con 2 mL de DB. Permitir a las células a conectar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células dos veces con 1 mL de DB. Incubar las células en DB con cafeína 2,5 mM por 30 min sin ninguna alteración de las placas.
Nota: Si las células necesitan ser tratados con un inhibidor farmacológico, agregar inhibidor de la concentración o el mismo volumen de vehículo apropiado durante basalation con cafeína. - Para aplicar el estímulo mecánico, coloque el plato (uno a la vez) en un agitador orbital y encender inmediatamente a 150 rpm (0.24 x g) durante 5 s.
Nota: La placa puede también ser manualmente estimulada por el movimiento de manera transversal durante aproximadamente 5 s. - Aspirado el buffer en el indicado tiempo después del inicio de la estimulación. Inmediatamente lyse las células mediante la adición de 100 μl de tampón de muestra con inhibidores de la proteasa y fosfatasa.
- Coloque la placa en el hielo y recoger el lisado en un tubo de 1,5 mL. Para ' momento 0 ', lyse las células sin agitación. Transferir los tubos a un bloque de calor de 95 ° C durante 10 minutos inmediatamente después de la lisis. Proceder con immunoblotting o almacenar lisados de-20 ° C.
- placa 2 x 10-6 competente agregación de células (del paso 2.2) después de 4 h de desarrollo en platos de 35 mm con 2 mL de DB. Permitir a las células a conectar durante 10 min a temperatura ambiente. Lavar las células dos veces con 1 mL de DB. Incubar las células en DB con cafeína 2,5 mM por 30 min sin ninguna alteración de las placas.
- Estimulación de las células con un Chemoattractant
- Basalate células agregación competentes después de 4 h de desarrollo por agitación rápidamente en presencia de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0.42 x g) en un agitador orbital para 30 minutos.
- Centrífuga la suspensión celular en x 360 g 3-4 min aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 10 mL Buffer DB helada. Repetir el lavado.
- Resuspender el precipitado final de la célula en helada buffer DB a una densidad final de 4 x 10 7 células/mL en función del número de celular inicial utilizado para el desarrollo de las células (véase el paso 2.2). Mantener la suspensión de células en el hielo antes de stimulación.
- Pipeta 50 μl de 10 μm campo o vehículo en un recipiente de poliestireno se colocan en un agitador orbital.
- Para estimular las células, añadir 450 μl de la suspensión helada en la misma copa e inmediatamente encienda el agitador a 200 rpm (0.42 x g). En varias ocasiones después del comienzo del estímulo (por ejemplo, 10, 30, 45, 60, 120 s) brevemente dejar la coctelera, sacar 50 alícuotas de μl de suspensión celular y lyse las células mediante la adición a tubos de 1,5 mL conteniendo 25 μl 3 X buffer de la muestra.
- Para ' momento 0 ', utiliza las células de la suspensión helada sin estimular.
Nota: La temperatura final de la suspensión de la célula durante la estimulación es ~ 9 ° C 26. En estas condiciones la respuesta máxima ocurre ligeramente más adelante que el pico observado para la estimulación realizada a temperatura ambiente (por ejemplo, chemoattractant estimulación de células adherentes en el microscopio, o estimulación mecánica de las células adherentes).
- Para ' momento 0 ', utiliza las células de la suspensión helada sin estimular.
- Transferir los tubos a un bloque de calor de 95 ° C durante 10 minutos inmediatamente después de la lisis. Proceder con immunoblotting o almacenar lisados de-20 ° C.
- Basalate células agregación competentes después de 4 h de desarrollo por agitación rápidamente en presencia de cafeína de 5 mM a 200 rpm (0.42 x g) en un agitador orbital para 30 minutos.
- Análisis de la respuesta celular por Immunoblotting
- Ejecutar lisados (de pasos 3.1.3 o 3.2.4) en un gel de poliacrilamida al 4-15% Tris-HCl, transferencia a una membrana de fluoruro de polivinilideno, bloque y immunoblot con phospho-PKC Ζ Thr410 (para detectar fosfo-PKBR1 y fosfo-PKBA). Detectar la señal por la incubación con rábano conjugado con peroxidasa anti-conejo anticuerpo secundario, seguido por quimioluminiscencia utilizando sustrato de quimioluminescencia realzada.
- Para la detección de múltiples proteínas, tira el blot con tampón de extracción y volver a la punta de prueba con un anticuerpo primario contra la fosfo-p42/44 MAPK Thr302/304 (para detectar el phospho-ERK2). Confirmar la proteína igual cargando por la coloración de la membrana de fluoruro de polivinilideno con azul brillante de Coomassie.
4. Aguda la estimulación mecánica y en vivo la proyección de imagen de las células en el microscopio
- evaluación de la respuesta a la estimulación mecánica aguda usando un dispositivo de flujo
- recoger y diluir vegetativo o agregación competente células de ~ 1 x 10 6 células/mL en DB como se describe en los pasos 2.1 y 2.2, respectivamente. Cargar ~ 600 μL en la diapositiva con un canal (vea la Tabla de los materiales para más detalles). Permiten que las células a conectar para mínimo 10 Asegúrese de que todas las entradas de la diapositiva están completamente llenos. Rellenar con buffer adicional si es necesario.
Nota: La diapositiva particular utilizada para el análisis tiene tres entradas, que alimentan los canales estrechos, 1 mm, pero luego fusionan a un canal ancho, 3 mm. La altura del canal es de 0,4 mm. Aunque las células son plateadas a lo largo del canal, sólo la parte ancha es imagen. - Pasar una de las líneas que está conectada a un depósito de 50 mL a través de la válvula derecha frontal de la unidad de neumático (véase la Tabla de materiales para más detalles). Usando el software para la bomba, asegúrese de que la válvula está cerrada (es decir, a la izquierda). Llene el depósito con DB.
- Ajuste la presión a 50 mbar y enciéndala. Llenar y lavar la línea con DB haciendo clic en la válvula para abrirla. Convertir la presión a 0 y cerrar la válvula después de ~ 30 s.
- Conecte la línea a una de las tres entradas en un lado de la diapositiva sin atrapar burbujas de aire. Conecte las entradas de otros dos. Conecte la línea del drenaje a la entrada solo en la segunda parte de la diapositiva.
Nota: La tubería que se utiliza para las líneas de entrada y desagüe en esta configuración tiene un diámetro interior de 1,6 mm. - Colocar el portaobjetos en el microscopio bajo objetivo de aire de 20 X. Para enjuagar el canal, cambiar la válvula para abrir la línea y haga clic en " en la presión ", partida en una presión más alta (~ 50 mbar o ~ 40 dyn/cm 2) para empujar el líquido por el desagüe.
- Una vez que el líquido sale por el drenaje, reducir la presión externa a cero (es decir. gravedad flujo, ~ 15 dyn/cm 2) y continúe enjuagando ~ 30 s. interruptor de la válvula a la posición opuesta para detener el flujo.
- Adquirir imágenes con iluminación RFP o GFP en un microscopio de fluorescencia invertido bajo un 40 X objetivo de aceite en intervalos s 3. Con la válvula en posición cerrada, encender la presión a la presión deseada, típicamente entre 15 y 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
- Después de adquirir 5 marcos, entregar el estímulo por la conmutación de la válvula de la " abrir " posición. Apaga el flujo s de 2-5 por la válvula de conmutación a la posición contraria.
Nota: Para algunos biosensores más débiles (por ejemplo, PTEN, CynA y RalGDS) puede ser necesario a las células de la imagen utilizando un microscopio confocal equipado con una de 40 X objetivo aceite.
- recoger y diluir vegetativo o agregación competente células de ~ 1 x 10 6 células/mL en DB como se describe en los pasos 2.1 y 2.2, respectivamente. Cargar ~ 600 μL en la diapositiva con un canal (vea la Tabla de los materiales para más detalles). Permiten que las células a conectar para mínimo 10 Asegúrese de que todas las entradas de la diapositiva están completamente llenos. Rellenar con buffer adicional si es necesario.
- Pruebas de efectos de los inhibidores farmacológicos en respuesta a la estimulación mecánica aguda usando un dispositivo de flujo de
- placa de células en el portaobjetos con un canal como se describe en el paso 4.1.1. Establecer dos líneas: pasar una línea a través de la válvula derecha frontal como en el paso 4.1.2, y el segundo por la parte posterior izquierda válvula. La línea izquierda de la abrazadera y la válvula en el " cerrado " posición (izquierda). Una línea de llenado con DB que contiene el vehículo apropiado y el segundo con la solución que contiene un inhibidor farmacológico de interés (por ejemplo 5 μm Latrunculin A).
Nota: Es necesario fijar físicamente la línea de izquierda porque el " cerrado " posición izquierda abre la válvula para la línea. - Llenado y enjuague el derecho línea activando la presión a 50 mbar y conmutación de la válvula de la " abrir " posición (derecha). Conectar la válvula a la izquierda después de ~ 30 s. llenado y enjuague la línea izquierda quitando la pinza de conexión s. ~ 30 líneas a dos de las entradas en un lado de la diapositiva con un canal, conecte la entrada restante y conecte el drenaje a la entrada solo en el segundo lado. < / l i >
- lavar el portaobjetos con el tampón en la línea correcta y realizar estimulación en el mismo buffer como se describe en los pasos 4.1.3 y 4.1.4 arriba.
Nota: Aunque la línea de la derecha fue elegida como el primero en esta configuración, el orden podría revertirse. - Tras estimulación, interruptor de la válvula para abrir la línea derecha a presión nula (es decir, flujo por gravedad solamente, ~ 15 dyn/cm 2). Retire la abrazadera de la línea izquierda y cambiar la válvula a la izquierda para abrir esa línea. La primera línea de la abrazadera.
- Después de 3 a 5 mL de tampón con inhibidor a través, interruptor de la válvula hacia la derecha para detener el flujo e incubar las células con el inhibidor de la longitud requerida de tiempo (por ejemplo 15 minutos). Encender el flujo por la conmutación de la válvula cada min ~ 10 ~ 15 s para evitar la privación de oxígeno. Repita la estimulación con la segunda línea.
- placa de células en el portaobjetos con un canal como se describe en el paso 4.1.1. Establecer dos líneas: pasar una línea a través de la válvula derecha frontal como en el paso 4.1.2, y el segundo por la parte posterior izquierda válvula. La línea izquierda de la abrazadera y la válvula en el " cerrado " posición (izquierda). Una línea de llenado con DB que contiene el vehículo apropiado y el segundo con la solución que contiene un inhibidor farmacológico de interés (por ejemplo 5 μm Latrunculin A).
- Método alternativo para evaluar la respuesta a la estimulación mecánica aguda utilizando una micropipeta
- configurar la micropipeta llenada de DB según protocolo estándar 23. Mantener la presión de compensación a 1.500 psi.
- Recoger y diluir las células vegetativas como se describe en el paso 2.1. Gotas de lugar 25 μl de ~7.5 x 10 5 células/mL en un compartimiento del pozo 1, permiten adherirse durante al menos 10 minutos y cubrir con 3 mL DB.
- Coloque la cámara en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con objetivo 40 X aceite. Localizar las células. Baje suavemente la micropipeta en el centro del campo de visión hasta que primero toque la parte inferior de la cámara de.
Nota: Puesto que la presión de la indemnización fue fijada en 1.500 Psi, las células estarán continuamente expuestas a un flujo muy lento de DB de la micropipeta. - Comenzar adquirir imágenes con iluminación RFP o GFP en intervalos s 3. Aplicar la ' limpiar ' función para liberar un bolo de líquido de la micropipeta. Continuar con la proyección de imagenn la presencia de flujo debido a la presión de compensación solo.
- Un método alternativo para evaluar la respuesta a la estimulación mecánica aguda mediante la adición de tampón a granel
- recoger y diluir las células vegetativas como se describe en el paso 2.1. Colocar gotas de 20 μl de células en ~ 1 x 10 6 células/mL en DB en medio de un pozo de una cámara de 8 pozos. Permitir que las células se adhieran durante al menos 10 min
- Comenzar adquirir imágenes con iluminación específica RFP o GFP en un microscopio de fluorescencia invertido equipado con objetivo 40 X en intervalos s 3. Centrarse en un área cerca del borde de la caída de.
- Rápidamente añadir 430 μl de DB a un lado del pozo. Continuar la proyección de imagen de.
- Para el análisis de la interacción entre estímulos mecánicos y químicos, 12 o 45 s después del estímulo mecánico, suavemente añadir 50 μl de ácido fólico (concentración final 20 nM) o vehículo (DB) sin la inducción de una respuesta mecánica. Continuar la proyección de imagen de.
- Cuantificación de la respuesta
- abrir la imagen TIFF de 32 bits en el Software de análisis de imagen (véase Tabla de materiales para más detalles) 27.
- En el ' analizar ' pestaña, ir a la " establecer medidas ". Marque la casilla para ' valor de gris medio '. Asegúrese de que no se comprueban los otros cuadros. Haga clic en " OK ".
- En el ' proceso ' ficha, haga clic en " restar fondo ". Mantener el radio de la bola rodante en 50 píxeles y hacer no Compruebe cualquiera de las opciones enumerada en el menú. Zoom a una celda usando la ' lupa ' herramienta.
- Con el ' rectángulo ' herramientas, dibujar un cuadro (~2.5 x 2,5 μm 2) en el citosol, asegurándose de no dibujarlo sobre el núcleo o la membrana plasmática. Prensa " Ctrl " + " M " las llaves o ir a la ' analizar ' ficha y haga clic en " medida " para determinar el valor medio de gris de la caja. Avance a Marcos posterior y mida otra vez, asegurándose de que la caja permanece en el citosol.
Nota: Puesto que D. discoideum las células se mueven muy rápidamente la caja se puede mover de un marco al siguiente en el citosol. - Después de todo de los marcos han sido analizados, copiar los valores en una hoja de cálculo. Para tener en cuenta variación de célula a célula en los niveles de expresión de diversos biosensores, normalizar los valores para el valor de gris medio observado a tiempo 0. Calcular la inversa de los valores que reflejan la acumulación de la señal en la corteza.
5. Continua estimulación mecánica y en vivo la proyección de imagen de las células en el microscopio
- configurar las células exactamente como se describe anteriormente para el análisis de la estimulación mecánica aguda en pasos 4.1.1 - 4.1.3. Abrir el tapón que cubre el depósito con el buffer por lo que el volumen puede ser coronado si respuesta es analizada por más de unos minutos a la vez.
Nota: Porque el depósito permanece abierto durante la duración del experimento, este ensayo se lleva a cabo en ausencia de presión externa y se basa en flujo por gravedad solamente. Para aumentar la velocidad de flujo por gravedad, el drenaje se puede colocar sobre una mesa debajo del microscopio. - Comienzan las células con iluminación específica RFP o GFP en un microscopio invertido de fluorescencia equipado con objetivo 40 X en 3 intervalos de s para el análisis de las respuestas de biosensor la proyección de imagen. Por otra parte, la imagen con contraste de fases con objetivo 20 X en 10 intervalos de s para el análisis de la migración de la célula general.
- Activar el flujo después de varios marcos en el ajuste de presión de cero (es decir, el flujo es debido a la gravedad sola o ~ 15 dyn/cm 2) por la válvula de conmutación a la posición abierta. Cuando el nivel del líquido baja a 5-10 mL en el tanque, se recarga con el almacenador intermediario más. No se olvide de añadir el líquido con cuidado para que las burbujas de aire no quede atrapadas en las líneas de.
Nota: Es importante agregar el líquido de la misma temperatura para evitar una respuesta de choque en las células. - Cuantificar células velocidad y persistencia usando software de análisis de la migración (véase la Tabla de materiales para más detalles) según el fabricante ' instrucciones s.
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Representative Results
Respuesta temporal de los reguladores de quimiotaxis a estimulación mecánica aguda
Para evaluar la respuesta de D. discoideum las células al estímulo mecánico, células adherentes de agregación competentes fueron expuestas a un breve pulso de esquileo del flujo. Agregación-competente D. discoideum células secretan cAMP, que puede ser detectado por vecinos células. Para superar la contribución de la señalización de la célula, las células fueron tratadas con cafeína, que inhibe cyclase del adenylyl en D. discoideum y así previene la secreción campamento28. De hecho, las células previamente trataron con cafeína tenía muy baja actividad basal de PKBR1 y ERK2 y mostró un robusto aumento en la fosforilación de los residuos claves de estas quinasas después del estímulo s 5 con flujo de cizalla (figura 1A). La respuesta fue transitoria y enarboló alrededor de 10-15 s para PKBR1 y alrededor de 30 s de ERK2, del mismo modo que anteriormente publicaron resultados para la activación de estas proteínas con un chemoattractant7.
Aunque es difícil evaluar la eficacia de la respuesta teniendo en cuenta el bajo nivel basal, estudios preliminares que condujeron al desarrollo de este ensayo, en comparación con estimulación con esquileo del flujo solo (o con un vehículo) a esfuerzo cortante flujo en presencia de un chemoattractant campo (figura 1B). Este análisis no mostraron un aumento en la respuesta al campo, lo que sugiere que la respuesta de la red de transducción de señal a flujo de cizalla está saturada. Aunque en este ensayo cAMP no aumentó la fosforilación de la PKBR1, respuesta de las células a chemoattractant puede observarse utilizando un protocolo de estimulación estándar donde se guardan las células competentes de agregación en suspensión, estimulados con el campo y lisis en distintos momentos después del estímulo. Como se muestra en la figura 1, en estas condiciones, hay un aumento transitorio en la fosforilación PKBR1 en respuesta a chemoattractant, pero no vehículo. La respuesta máxima se observa en el 30 s en este ensayo porque la temperatura de la suspensión de células durante el ensayo es ~ 9 ° C, en comparación con ~ 22 ° C para análisis de estímulo mecánico descrito26.
Respuesta espacio-temporal de los principales y marcadores de borde a la estimulación mecánica aguda del revestimiento
Puesto que el análisis de la población anterior sólo proporciona información temporal sobre el comportamiento de los reguladores de la quimiotaxis, las células también estaban expuestas a un breve estímulo mecánico mientras se observa con un microscopio. Este ensayo puede realizarse con agregación competente o vegetativo D. discoideum las células con diversos biosensores marcada con fluorescencia cuya localización fue definida en las células estimuladas con un chemoattractant. Dos marcadores de la vanguardia, dominio PH de Crac y calΔcoil, que son reclutados por PIP3 o actina polimerizada recientemente, mostraban principalmente citosólica localización en las células de reclinación como previamente divulgados (figura 2A, suplementario 1 película )4,29. En las células que eran base activas, estos biosensores se veía también en los extremos de los pseudópodos. Después del estímulo con el flujo de cizalla de 2 s, los biosensores agrupamiento rápidamente a la corteza con un pico en el ~ 6 a 10 s y regresó al citosol por ~ 30 s. En contraste, un marcador de borde de forjado PTEN localizado en la corteza antes de estimulación (figura 2A). Después de un breve pulso con flujo del esquileo, citosólica PTEN aumento de la intensidad, aunque con dinámicas más lento que para los biosensores de vanguardia. Un cambio en la localización de biosensor desde el citosol a la corteza y viceversa, se ve claramente como un cambio en la intensidad citosólica que permite para la simple cuantificación de la respuesta.
El comportamiento observado de los biosensores en respuesta a la estimulación mecánica aguda es constante con líderes y rezagadas dinámica de localización de borde en respuesta a la estimulación con uniforme chemoattractant. Este comportamiento no es exclusivo para los tres biosensores que se muestra. Como también se observaron cambios similares, previamente publicados en la localización para los marcadores de punta RBD y RalGDS, que reconocen activa Ras y Rap1, respectivamente, así como otro marcador de borde de forjado CynA22,30.
Un análisis similar puede utilizarse para evaluar los efectos de diferentes inhibidores por una simple modificación de la disposición experimental de una sola línea de entrada a una doble. Usando este método, las células pueden ser primero expuestas a condiciones de control y cambió entonces en el búfer que contiene al agente de prueba deseado. Por ejemplo, además de droga despolimerizantes de actina LatA bloquea la respuesta de RBD, así como cal deΔcoil, a la estimulación mecánica aguda (figura 2B).
Respuesta mundial precede a la migración de la célula bajo estimulación prolongada con esquileo del flujo
El enfoque descrito aquí también podría ser adaptado para estudiar efectos del esquileo del flujo sobre la migración de la D. discoideum . De hecho, si el flujo no se apaga después de 2 s pero quedó para la duración del experimento, las células vegetativas mostraron dirigido migración contra el flujo (figura 3suplemento 2 de la película). Cabe señalar que el flujo de corte necesario para provocar una respuesta migratoria fue inferior a la presión que se suele utilizar para lograr una respuesta con el estímulo agudo de células vegetativas (por ejemplo, como se ve en la figura 2B). Sin embargo, incluso a la presión más baja, las células muestran una robusta respuesta uniforme, según lo medido por un cambio en la localización deΔcoil de cal, que precedió a cualquier cambio en la posición de la célula sí mismo. Así, estos experimentos demostraron claramente que 1) la respuesta no depende del movimiento de la célula, y 2) la respuesta mundial precede a migración dirigida.
Alternativas de pruebas de respuesta a la estimulación mecánica aguda
Aunque el uso de una cámara de flujo tiene claras ventajas para el estudio de la respuesta al estímulo mecánico agudo, también validamos dos análisis adicionales para probar la respuesta de las células individuales a estimulación mecánica aguda. Como se muestra en la figura 4,Δcoil transitorio y rápidamente volver a localizada desde el citosol a la corteza cuando las células fueron estimuladas por la adición de bolo de búfer entregados ya sea por una micropipeta (Figura 4A) o manualmente con bulto de cal adición de tampón con una pipeta (Figura 4B). Cabe señalar que una desventaja clara de ambos de estos ensayos es que la cantidad exacta de fuerza a la célula es desconocida y no puede variarse fácilmente. Sin embargo, para situaciones donde se desea cambiar entre estímulos mecánicos y químicos, además de búfer a granel ofrece una sólida alternativa a la estimulación en el dispositivo de flujo.
Figura 1: resultados de representante para evaluación bioquímica de la respuesta de D. discoideum las células a la estimulación mecánica o química aguda. Células competentes de agregación fueron expuestas a estímulos mecánicos o químicos, lisis en los momentos indicados, y immunoblotted utilizando anticuerpos que reconocen phosphorylated PKBR1 o ERK2. (A) las células adherentes fueron estimuladas en un agitador orbital durante 5 s. La membrana fue teñida con Coomassie brillante azul (CBB) para mostrar proteína igual carga. (B) las células adherentes fueron estimuladas por el movimiento manual de la placa de manera transversal para aproximadamente 5 siguiente s estimulación química debido a la adición de campamento 1 μm o búfer (vehículo), o sin ningún estímulo químico (-). Los dos immunoblots muestran el grado de variación en la activación basal de PKBR1 visto a tiempo 0. En ocasiones, activación de PKBA también se podía detectar mediante esta técnica, como se muestra en la parte inferior. Suspensión (C) las células fueron estimuladas con campamento de 1 μm o búfer (vehículo). Parte (A) de esta figura ha sido modificado desde Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: resultados de representante para estimulación mecánica aguda y la proyección de imagen viva de las células en el microscopio. (A) la agregación-competente D. discoideum las células expresando su etiqueta RFP calΔcoilo GFP-con la etiqueta PH-Crac o PTEN fueron estimuladas con flujo unidireccional laminar 15 dyn/cm2 para 2 a 5 imágenes s. fueron recogidos cada 3 s . Se muestran células representativas que muestran la translocación de los biosensores en respuesta a la estimulación mecánica. Acumulación de cada biosensor en la corteza se cuantificó como la inversa de la intensidad media de citoplásmica normalizada para el tiempo 0. Se muestra la respuesta media de 18 (LimaΔcoil), 20 (PH-Crac) o 6 células (PTEN). Los valores son promedio ± SE. (B) células vegetativas expresando cal etiqueta RFPΔcoil- RFP y GFP-tagged RBD fueron tratados con vehículo o 5 μm LatA durante al menos 15 minutos y luego estimulados con cabina de flujo laminar unidireccional en 41 dyn/cm2 para 2 s. imágenes fueron recogidos cada 3 s. RBD-GFP y acumulación de RFP - calΔcoilen la corteza se cuantificó como en (A). Los valores son medias ± SE. El número de células analizadas se indica al lado de cada condición. Barra de escala = 10 μm. Esta figura ha sido modificada desde Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados de representante para la respuesta de D. discoideum las células a la estimulación prolongada con flujo. (A) células vegetativas expresando cal etiqueta RFPΔcoil fueron expuestos a flujo laminar unidireccional continuo en 15 dyn/cm2 y reflejada cada 3 pistas s. de 11 células se muestran en (B). Barra de escala = 10 μm. Esta figura ha sido modificada desde Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Representante resultados de enfoques alternativos a las pruebas de respuesta a la estimulación mecánica aguda. Vegetativo (A) D. discoideum las células expresando cal etiqueta RFPΔcoil fueron expuestos a una micropipeta (*) basally liberando tampón de ensayo a un ritmo lento. Un breve aumento en la velocidad de flujo fue alcanzado por una entrega rápida de un bolus de tampón de ensayo a tiempo 0. Imágenes fueron recogidas cada 3 s. (B) vegetativo D. discoideum las células expresaban cal etiqueta RFPΔcoil plateado como una gota pequeña en una cámara de microscopía fueron estimuladas mecánicamente por la adición de un gran volumen de buffer el cámara. Imágenes fueron recogidas cada 3 s. escala de la barra = 10 μm. parte (A) de esta figura ha sido modificado desde Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Película adicional 1: Estimulación mecánica aguda provoca desplazamiento rápido y transitorio de LimaΔcoil- RFP o PH-Crac-GFP desde el citosol a la corteza en agregación competente D. discoideum las células expresando estos biosensores. Flujo laminar unidireccional fue encendido de 5 s en el tiempo 0 y las células fueron reflejadas en intervalos s 3. La velocidad de reproducción es 5 fotogramas/s. Se muestran dos ejemplos para cada línea celular. Barra de escala = 10 μm. Esta película corresponde a la figura 2A y ha sido modificada desde Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para descargar este archivo.
Película adicional 2: Estímulo mecánico continuo provoca desplazamiento rápido y transitorio de LimaΔcoil- RFP desde el citosol a la corteza antes de la migración de las células contra la dirección del flujo. Las células vegetativas con calΔcoil- RFP fueron expuestos a la continua tensión de esquileo en 15 dyn/cm2 a partir de hora 0 y reflejada en intervalos s 3. Velocidad de reproducción es 10 fotogramas/s. escala de la barra = 10 μm. Esta película corresponde a la figura 3 y ha sido publicada previamente en Artemenko et al. (2016) 22. por favor haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
Los métodos descritos aquí ofrecen una manera conveniente de evaluar población y comportamiento individuales de la célula en respuesta a flujo del esquileo. Lo importante, mientras que estudios previos analizan localización de los principales y marcadores del borde del revestimiento durante la migración, el enfoque actual permite investigación de efectos inmediatos aplicando el flujo de corte agudo. Con este método hemos demostrado que, de hecho, la respuesta inicial de las células para flujo del esquileo no obliga a migración de la célula. En cambio, la respuesta rápida y transitoria para el estímulo del flujo de cortante inicial precede la migración direccional vista con exposición prolongada a flujo, igual que la respuesta inicial con un chemoattractant gradiente de cizalla.
Los enfoques bioquímicos y microscópicos producen datos complementarios aunque cada método tiene ventajas y desventajas. Estimulación seguida de lisis celular y el immunoblotting de PKBs, KrsB y ERK, por ejemplo, analiza una población de células y así un promedio de variación de célula a célula, a diferencia de un ensayo que analiza el comportamiento de células individuales. Sin embargo, los análisis poblacionales tienden a cambios sutiles de la máscara en el comportamiento celular que puede observarse fácilmente mediante el análisis de células individuales. Además, el análisis bioquímico descrito aquí sólo es eficaz con células competentes de agregación, por razones que se discutirán más adelante. En cambio, el análisis basado en la microscopia de la relocalización de RBD, RalGDS, PH-Crac, calΔcoily PTEN, por ejemplo, entre la corteza y el citosol es eficaz para las células vegetativas y agregación competentes y así permite observaciones son ampliamente aplicables a las células con diversos grados de polarización. Lo que hace que los dos enfoques complementarios es el hecho de que examinan diferentes conjuntos de marcadores disponibles de líder/revestimiento de borde, ampliando así la cobertura de las señal transduction de la actinia citoesqueleto redes y probado con el análisis del flujo del esquileo.
No queda claro por qué las células vegetativas, que responden muy robusta en ensayos microscopia, no responden a estimulación seguida immunoblotting y lisis celular. Una posibilidad es que la cantidad de fuerza aplicada a las células cuando se gira la placa no coincide con la fuerza que experimentan las células en una cámara de flujo. Desarrollados de las células, en cambio, podrían tienen un umbral más bajo para la activación y, así, responder bajo cualquier condición. Es improbable que los biosensores cuya actividad se mide por el ensayo bioquímico no se expresan o no se activan en células vegetativas, ya que la estimulación de células vegetativas con ácido fólico conduce a activación robusta de PKBR1/PKBA y ERK2 (datos no se muestra). Por otra parte, células vegetativas muestran claro reclutamiento de PH-Crac, que refleja la acumulación de PIP3, en el análisis de microscopía. Puesto que el reclutamiento de PKBA también depende de PIP3, parece poco probable que PKBA no respondería a la estimulación mecánica aguda, a menos que las condiciones en lo análisis bioquímico no son óptimas como se mencionó anteriormente. Esto sigue siendo un área de activa investigación.
El análisis bioquímico de los reguladores de quimiotaxis requieren la presencia de la cafeína durante todo el experimento. Originalmente fue añadida cafeína para prevenir la señalización de célula a célula debido a la secreción del campo. Sin embargo, parece que la cafeína tiene otra función además de la inhibición de la ciclasa del adenylyl (ACA) ya que las células null ACA todavía necesita cafeína para fosforilación de PKBR1 en respuesta a la estimulación mecánica aguda. La cafeína se ha demostrado previamente para bloquear TorC2 actividad26. Es posible que inhibición de TorC2 había bloqueado algunos motilidad basal de las células y así baja la activación basal de PKBR1 y otros componentes de redes de señal de transducción y actinia citoesqueleto. Baja actividad basal era imprescindible para la observación de la respuesta al flujo del esquileo. De hecho, cuando las células se colectaron en anteriores momentos durante el desarrollo, exhibieron mayor actividad basal y una respuesta del flujo de cortante reducido inducida. Curiosamente, se sabe que las células vegetativas tienen proporcionalmente más actividad PKBA y menos PKBR1 en comparación con el desarrollado de las células31. Es posible que el estado basal se regula algo diferentemente en células vegetativas y agregación competente, contribuyendo aún más a la falta de una respuesta de células vegetativas en el análisis bioquímico. Curiosamente, cuando las células se colectaron en puntos posteriores del desarrollo, también tuvo una disminución en la respuesta, probablemente debido a la fuerte influencia de la polaridad en la localización y la activación de varios reguladores de quimiotaxis examinados en este ensayo.
Estimulación de las células en una cámara de microscopia reveló que la fuerza y la duración de los estímulos contribuyen a la respuesta máxima22. En otras palabras, una respuesta máxima se puede lograr incluso con una fuerza de esquileo baja si se aplica durante un período prolongado de tiempo (10 s y 2 s). Esta observación explica por qué las células tienen una respuesta inicial cuando primero están expuestos a un estímulo continuo, pero débil, que conduce a la migración inducida por el flujo del esquileo. Con el aparato actual, hemos podido generar un flujo de cizalla lo suficientemente bajo como para investigar el extremo inferior de la gama.
Tal vez, la implicación más importante de los estudios realizados utilizando la estimulación mecánica aguda es que estímulos mecánicos y químicos aparecen en transducción de señales comunes y redes del citoesqueleto de actina. Aunque demostró que los dos estímulos se integran mediante adición de tampón a granel para la estimulación mecánica, estudios futuros tendrá como objetivo desarrollar un sistema donde chemoattractant puede ser entregado rápidamente en el canal de flujo, que sería mucho más versátil y la forma poderosa para evaluar la integración de los estímulos mecánicos y químicos. Por desgracia, chemoattractant adición utilizando la configuración actual de dos líneas se asocia con un segundo estímulo del flujo de corte porque la chemoattractant tiene que entregarse en presencia de flujo. Una alternativa puede ser láser estimula liberación de quimioatractiva de un precursor enjaulado como fue demostrado con éxito para el campamento por Westendorf et al. 32. en el futuro, también sería interesante examinar la integración de otros estímulos, por ejemplo, esfuerzo cortante flujo y campos eléctricos variables o sustrato variable rigidez y flujo del esquileo. El último ejemplo es interesante porque implica a dos tipos de estimulación mecánica, aunque la recepción de la señal inicial puede diferir entre ellos. Confirmando que todos los estímulos que inducen la migración dirigida comparten la misma red de transducción de señal y varían sólo en cómo se percibe el estímulo a explicar cómo las células pueden navegar en entornos complejos. Por último, ya hemos demostrado que la estimulación aguda con esquileo del flujo conduce a separarse de las células humanas del neutrófilo-como22. Labor futura examinará además localización y activación de los diversos componentes de las señal de transducción y de la actinia citoesqueleto redes con estímulos mecánicos en células de mamíferos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por los institutos nacionales de donación de salud GM118177 R35 para PND.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Dextrose | Fisher | D16-1 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Proteose peptone | Fisher | DF0120-17-6 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Yeast extract | Fisher | 50-550-445 | Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2) |
| Na2HPO4·7H2O | Fisher | S373-500 | Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3) |
| KH2PO4 | Fisher | P386-500 | Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3) |
| Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) | Fisher | ICN10040525 | Use to prepare HL-5 media (step 1.1) |
| Peptone (Bacto) | Fisher | DF0118-17-0 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| K2HPO4 | Fisher | P288-100 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| MgSO4 | Fisher | M65-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| CaCl2 | Fisher | C79-500 | Use to prepare DB Buffer (step 1.4) |
| Caffeine | Fisher | O1728-500 | Use to prepare caffeine (step 1.5) |
| cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) | Fisher | 11-680-1100MG | Use to prepare cAMP (step 1.6) |
| Folic acid | Sigma | F7876 | Use to prepare folic acid (step 1.7) |
| Tris base | Fisher | BP152-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher | BP166-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Glycerol | Fisher | G33-500 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Dithiothreitol (DTT) | Bio-Rad | 1610610 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| Bromophenol blue | Bio-Rad | 1610404 | Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8) |
| NaF | Fisher | S299-100 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Na3VO4 | Fisher | 50-994-911 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Sodium pyrophosphate decahydrate | Fisher | S390-500 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) | Sigma | 11873580001 | Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8) |
| Latrunculin A | Enzo Life Sciences | BML-T119-0100 | Use to prepare Latrunculin A (step 1.9) |
| 4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel | Bio-Rad | 3450029 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Polyvinylidene fluoride membrane | Bio-Rad | 1620177 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2060 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody | Cell Signaling | 4370 | Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) | GE Healthcare | NA934-100UL | Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3) |
| Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) | Bio-Rad | 1705060 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) | Pierce | PI46430 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| Coomassie Brilliant Blue | Fisher | PI20278 | Use for immunoblotting (step 3.3) |
| K. aerogenes strain (non-pathogenic) | Dicty Stock Center (dictybase.org) | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials and Equipment | |||
| Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) | New Brunswick Scientific | Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm. | |
| 10 cm Petri dish | Fisher | FB0875712 | Use to prepare SM plates (step 1.2) |
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-51B | Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2) |
| 35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) | Fisher | 08-772A | Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1) |
| Polystyrene cup (5 mL) | VWR | 13915-985 | Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2) |
| Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) | Ibidi | 10902 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) | Ibidi | 80316 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| 50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) | Ibidi | 10978 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5) |
| Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) | Ibidi | 10964 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842). |
| Line for the drain (1.6 mm ID tubing) | Ibidi | 10842 | Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). |
| Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) | Zeiss | Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5) | |
| UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) | Perkin-Elmer | DM 16000 | An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4) |
| FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan | Eppendorf | 5252000021D and 5192000027 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i). |
| Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) | Eppendorf | 930000035 | Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3) |
| Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) | Eppendorf | 5242956.003 | Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1) |
| 1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-472 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2) |
| 8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) | Fisher | 12-565-338 | Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1) |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| Image Analysis Software (Fiji) | NIH | https://fiji.sc/ | Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5) |
| Migration analysis software (Tracking Tool PRO) | Gradientech | http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ | Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4) |
References
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