Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Dictyostelium discoideum yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, SUNY Oswego, 2Department of Cell Biology, Johns Hopkins University School of Medicine

Summary

Burada akut mekanik stimülasyon hücresel yanıt değerlendirmek için yöntemleri açıklanmaktadır. Mikroskopi tabanlı tahlil fluorescently etiketli biyosensörler kesme akışı ile kısa stimülasyon takip yerelleştirilmesini inceleyin. Ayrıca akut mekanik stimülasyon karşılık olarak ilgi çeşitli proteinlerin aktivasyonu biyokimyasal olarak test ediyoruz.

Abstract

Kemotaksis, ya da bir chemoattractant kadar Degrade geçiş en iyi anlaşılmış, yönlendirilmiş geçiş modudur. Sosyal amip kullanarak çalışmalar ortaya Dictyostelium discoideum paralel yollar karmaşık sinyal iletim ağı chemoattractants cevaben güçlendirir ve önyargılı aktin polimerizasyon ve çıkıntı bir pseudopod yol açar degradenin yönünü. Buna ek olarak, diğer türleri, örneğin, yönlendirilmiş göç akışı veya elektrik alanları, yamultmak için maruz kalma nedeniyle sürüş moleküler mekanizmaları bilinmemektedir. Kemotaksis birçok düzenleyiciler, yerelleştirme ya da harekete geçirmek bir chemoattractant ile küresel stimülasyon sonrasında geçici değişiklikler gösterir yanı sıra, yerelleştirme önde gelen veya geçirme bir hücrenin ahşap kaplama kenarı sergilemek. Moleküler mekanizmalar yönlendirilmiş göç diğer türleri anlamak için hücresel yanıt-e doğru akış yamultmak için kısa (2-5 s) pozlama dayalı akut mekanik stimülasyon incelenmesi sağlayan bir yöntem geliştirdi. Bu uyarımı hücreleri tek hücre davranışı incelemek için biyosensörler fluorescently etiketli ifade görüntüleme sırasında bir kanal olarak teslim edilebilir. Ayrıca, hücre nüfus bir tabak, lysed ve immunoblotted ilgi proteinlerin etkin versiyonlar tanımak antikorları kullanarak teşvik. Her iki deneyleri birleştirerek, bir moleküller hücre altı Yerelleştirme ve/veya fosforilasyon değişikliklerden aktif geniş bir dizi inceleyebilirsiniz. Bu yöntemle akut mekanik stimülasyon kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları aktivasyonu tetikler belirledi. Başlatan olaylar kesme akış kaynaklı hareketliliği için gerekli anlamak için önemli hücresel yanıt akut mekanik uyarılması için incelemek için yeteneğidir. Bu yaklaşım da kemotaktik sinyal iletim ağ chemoattractant reseptör karıştırıcı etkisi olmadan çalışmak için bir aracı sağlar.

Introduction

Geçiş ökaryotik hücre ortamında gradyanlar çözünür veya yüzey bağlı chemoattractants, değişken sertliği yüzeylerde, elektrik alanları veya yamultma akışı dahil olmak üzere çeşitli kimyasal ve fiziksel ipuçları tarafından önyargılı. Moleküler mekanizmalar kemotaksisi sürüş bizim anlamada birçok gelişmeler rağmen daha az yönlendirilmiş göç ve nasıl bu farklı sinyaller Birleşik bir üretmek için hücresel düzeyde entegre edilmiştir diğer türleri hakkında bilinen göçmen yanıt.

Geçiş doğru bir chemoattractant artan bir konsantrasyon içerir üç davranış bileşenleri Yönetmen: hareketliliği, yönlü algılama ve polarite1. Motilite pseudopod çıkıntı tarafından elde hücrelerin rastgele hareket anlamına gelir. Yönlü bir hücre bir chemoattractant kaynağını tespit yeteneği algılama, hangi hatta oluşabilir hücrelerin immobilize. Polarite hücre içi bileşenler arasında önde gelen ve artan sebat hareketine yol açan bir hücrenin, ahşap kaplama kenarı daha istikrarlı asimetrik dağılımı gösterir.

Bir chemoattractant hücresel yanıt dört kavramsal olarak tanımlanmış düzenleyici ağları faaliyete bağlıdır: reseptör / G protein, sinyal iletimi, aktin sitoiskeleti ve polarite1. G protein birleştiğinde reseptör Chemoattractant bağlama heterotrimeric G protein α ve βγ yönlü sinyali güçlendirir aşağı akım sinyal iletim ağ üzerinden sinyal iletir. Birden çok sinyal iletim ağı içinde paralel olarak hareket ve önyargı aktin polimerizasyon ve bunun sonucunda pseudopod çıkıntı, degradenin yönünü aktin sitoiskeleti ağa beslenir. Ras GTPazlar, TorC2, fosfoinositid 3-kinaz (PI3K), fosfataz ve tensin homolog (PTEN) ve guanylyl cyclase kemotaksisi önemli düzenleyiciler arasında vardır. Geri bildirim mekanizmaları sinyal iletim ağı içinde ve arasında sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları daha fazla yanıt yükseltmek. Son olarak, kötü tanımlanmış polarite ağ giriş aktin sitoiskeleti alır ve daha fazla kalıcı degradenin yönünü geçişinde yaymak için sinyal iletim şebeke önyargıları.

Mekanik anlayışımızı kemotaksisi çoğunu fluorescently öğesini biyosensörler düzenleyici ağların çeşitli bileşenleri için gelişimi nedeniyle mümkün yapıldı. Birçok kemotaksisi düzenleyiciler asimetrik bir dağıtım düzenleyici molekül veya faaliyet var. Örneğin, tanımak biyosensörler harekete geçirmek yorum-in küçük GTPases Ras ve Rap1-Raf1 (RBD burada anılacaktır) Ras bağlayıcı etki ve RalGDS, sırasıyla-öncü bir chemotaxing hücre2,3yerelleştirilmesine. Benzer şekilde, PI3K ve onun ürün phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), pleckstrin homoloji (PH) etki alanı tarafından tanınan da göstermek yerelleştirme ön cep4,5. Buna ek olarak, bir 3-fosfataz PTEN hangi dönüştürür PIP3 geri phosphatidylinositol (4,5)-bisphosphate, hücre6ahşap kaplama kenarı yerelleştirir. Önemlisi, bu biyosensörler onların yerelleştirme yanıt küresel stimülasyon ile bir chemoattractant olarak değiştirin. Sitozolik ya da çıkıntılar resting hücredeki ipucu, kortikal Yerelleştirme ve bulunmadığına kenar işaretleri geri kalmış ise korteks için relocalize öncü işaretleri çıkıntılar resting hücrede ipuçları, sonra sitozolik haline uyarım. Biyoalgılayıcı dağıtım yanıt olarak bir chemoattractant ile küresel stimülasyon analizi katkı kez gözlemleri yıkmak hareketliliği ve polarite, en aza indirir. Bir chemoattractant ile bir hücre süspansiyon genel veya üniforma uyarılması da bir araç olarak protein harekete geçirmek, genellikle protein fosforilasyon7,8,9 tarafından algılanan nüfusu genelindeki değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan . Mikroskopi düzenleyici ağların çeşitli bileşenlerinin davranışı hakkında zamansal ve mekansal bilgi toplamak için kullanılan, ancak bu biyokimyasal tahlil öncelikle geçici bilgi, elde etmek için kullanılır.

Sinyal iletim ağ bir telaşlı sistem10,11özellikleri içerir. Supra-eşik kemotaktik uyaranlara yanıt "yaparak" ve ateşe dayanıklı dönemleri görüntülemek. Yanıt-e doğru da stochastically tetiklenir ve salınım davranış gösterebilir. Sinyal iletim olaylar dalgalar12,13,14,15yaymak bölgelere korteksin lokalizedir. Ön ya da geri, işaretçileri için işe veya aktif bölgelerinden yayılıyor dalgaların, ayırmak. Onlar karşılamak üzere active bölge izleyen ateşe dayanıklı bölge nedeniyle karşılıklı yönlendirilmiş dalgalar yok edin. Yayılıyor sinyal iletim dalgalar altında yatan hücre göç10arabuluculuk hücresel çıkıntılar.

Benzer düzenleyici mekanizmaları da nötrofil ve diğer memeli hücre türleri16 uygulanabilir olmasına karşın kemotaksisi olarak yukarıda belirtilen bilgilerin çoğunu sosyal amip Dictyostelium discoideum, iyice düşünülmüş--dan geldi . Dictyostelium tek hücreleri binlerce sonunda sporları içeren çok hücreli bir meyve vücut şekillendirme bir toplama merkezine doğru geçirirken, sırasında şiddetli açlık, güçlü kemotaktik tepki süresine sahip bir iyi kurulmuş model organizmadır. Bakteriyel gıda kaynakları bulmak için bu organizmanın tek hücre büyüme aşamasında kemotaksisi esastır. Önemlisi, geçiş tek Dictyostelium hücre memeli nötrofiller veya metastatik kanser hücrelerinin, Bütün bunlar çok hızlı protozlar türü göç geçmesi geçiş oldukça benzer. Aslında, düzenleyici ağların genel topoloji, hem çok bireysel sinyal iletim yollarının kemotaksisi dahil korunmuş Dictyostelium ve memeli lökosit17arasında. Ayrıca, fibroblastlar gibi diğer hücre reseptör tirozin kinaz (RTK) yerine GPCRs kullanın; Ancak, RTKs-ebilmek beslemek benzer ağlar.

Kemotaksis aksine, yönlendirilmiş göç çeşitli modları sürücü sinyal mekanizmaları konusunda eksiksiz bilgi bulunmuyor. Benzer şekilde chemoattractant Gradyanda geçiş hücreleri için çeşitli çalışmalarda harekete geçirmek ve/veya yerelleştirme tipik öncü işaretleri, aktin polimerizasyonu, PIP3 ve/veya hücre dışı sinyal düzenlenir kinaz (ERK) 1/2, dahil olmak üzere, bildirdin Açık geçiren hücre göç akışı veya elektrik alanları18,19,20,21değişimler yamultmak için yanıt olarak yönetti. Ancak, bu çalışmalarda uyarıcı sürekli maruz Ayrıca hücre göç, örneğin, bir uyarana tepki olarak özellikle öncü işaretleri yerelleştirilmesine, veya sadece öncü yerelleştirmek soru açık bırakarak sonuçlandı pseudopods ön geçirme hücre sayısının artmasına yüzünden.

Hücreleri cevaben kesme akışı hem düzeyinde nüfus ve tek tek hücreler22olarak teslim akut mekanik pertürbasyon gözlemlemek için bize izin deneyleri geliştirdik. Benzer bir chemoattractant, akut yaptığı ile küresel stimülasyonTion kesme akışı ile hareketliliği veya polarite mekanik bir uyarana karıştırıcı katkısı olmadan bir hücresel yanıt çalışma sağlar. Bu biyokimyasal ve mikroskobik deneyleri genetik veya farmakolojik tedirginlikler ile birleştirerek hakkında nasıl mekanik uyaranlara algılandığını öğrenmek için bize izin verir ve iletilen. Ayrıca, bu yaklaşım da yokluğunda böylece sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları reseptör/g izole eden bir chemoattractant, chemoattractant reseptör sistemi aşağı faydalanarak için yeni bir yöntem sağlar protein ağ.

Son zamanlarda biz açıklanan teknikleri kullanarak akut kesme stres kemotaktik sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar22birden çok bileşeni etkinleştirme için yol gösterdi. Akut mekanik uyarıcı değişen aralıklarla uygulayarak, biz aynı şekilde chemoattractants için mekanik bizi canlı tutan da altında yanıt yaparak davranışını da dahil olmak üzere bir telaşlı sisteminin özelliklerini sergileyen, gösterdi koşullar ve ateşe dayanıklı bir süre varlığı doyurarak. Son olarak, mekanik ve kimyasal uyarımı birleştirerek iki uyaranlara büyük olasılıkla birden çok uyaranlara karşı önyargı hücre göç entegrasyon için izin sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağlar, paylaşmak gösterdi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. hazırlık çözümler

  1. birini kullanarak hazırlamak HL-5 medya: 10 g/L dekstroz, 10 g/L proteose pepton, 5 g/L Maya ekstresi, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L KH 2 PO 4 ve aksi belirtilmediği sürece, 0,03 g/L streptomisin deiyonize su. Otoklav orta ve mağaza oda sıcaklığında.
    Not: farklı tedarikçiler elde proteose pepton ve Maya özü arasında yanı sıra bireysel toplu işlemleri arasındaki farklar nedeniyle ortam pH 6.4-6,7 tipik aralığına ayarlanması gereken.
  2. Birini kullanarak hazırlamak SM plakaları: 10 g/L dekstroz, 10 g/L pepton, 1 g/L Maya ekstresi, 2.31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 ve 20 g/M agar deiyonize su. Otoklav, serin ve 30 mL agar çözeltisi başına 10 cm Petri kabına dökün. Bir kez agar katılaşır, plakayı 4 ° c ilâ 1 ay için depolamak.
  3. Hazırlama 10 fosfat tampon (PB) kullanarak x 13,4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O ve deiyonize su 6.8 g/L KH 2 PO 4. Saat 4'te 10 x hisse senedi depolamak ° C. Dilute kullanılmak deiyonize su ile 1 x.
  4. Hazırlamak DB 1 X 2 mm MgSO 4 PB ve 0.2 mM CaCl 2 ilave tarafından arabellek.
  5. Hazırlama 100 mM kafein deiyonize su. Mağaza − 20 ° c
  6. Kamp sodyum tuzu monohidrat deiyonize su içinde eriterek tarafından hazırlamak 100 mM kamp hisse senedi çözüm. 1 mM deiyonize su stokta çalışma hazırlamak. Her iki hisse senedi Solutions'da saklamak − 20 ° C. hazırla son kamp çözüm, denemenin gün istenen konsantre DB.
    Not: Bir kaç kez dondurma çözdürülen hisse senedi çözümleri olabilir.
  7. Hazırlama 25 mM folik asit 1 x PB. Toz tamamen eriyene kadar 1 N NaOH birkaç damla ekleyin. Mağaza − 20 ° c
  8. 3 x örnek arabelleği aşağıdakileri kullanarak hazırlamak: 187,5 mM Tris-HCl pH 6.8, % 6 (w/v) Sodyum Lauryl Sülfat (SDS), % 30 gliserol, 126 mM dithiothreitol ve %0.03 (w/v) bromophenol mavi. Aliquot ve dükkanda − 20 ° C. Kullanın, bir 37 ° C su banyosunda çözülme ve 3 x 1 x örnek arabelleğe sulandrarak ve 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM sodyum pirofosfat ve 1 x ekleyerek fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile örnek arabellek hazırlamak için devam etmek için
    1. önceden tam EDTA ücretsiz proteaz inhibitörü deiyonize suyla kokteyl. İnhibitörleri hemen adımları 3.1.2-3.1.3 içinde açıklanan yordamı başlatmadan önce ekleyin.
  9. 5 mM DMSO çözümde Latrunculin A hazır olun. Aliquot ve dükkanda − 20 ° C.

2. Hazırlık D. discoideum hücre

Not: D. discoideum hücreleri HL-5 medya doku kültürü tabak ya da korumak veya bir süspansiyon kültürü daha önce 23 açıklandığı gibi. Gerektiğinde, dönüşüm fluorescently etiketli biyosensörler göre standart elektroporasyon protokoller 24 ile hücreleri. Çeşitli D. discoideum suşları yanı sıra plazmidleri biyosensörler veya ilgi diğer genlerin kodlama Dicty hisse senedi Merkezi'nden (dictybase.org) temin edilebilir.

  1. Büyüme ve bitkisel D. discoideum hücreler topluluğu
    1. bitkisel hücre, analiz için büyümek hücreleri genellikle içinde gözlenen macropinosomes, sayısını azaltmak için bakteri varlığında axenically yetiştirilen hücrelerin 25.
      1. Hazırla HL-5 orta Antibiyotikler olmadan istenen hacmi içine az sayıda hücre bir gliserol hisse senedi veya bir önceki kültür aşı tarafından Klebsiella aerogenes bir kültür. 16-18 h. için bir orbital Çalkalayıcı-200 devirde (0,42 x g) oda sıcaklığında (20-22 ° C) bakteri kültürü kuluçkaya
        Not: K. Burada kullanılan aerogenes yük olduğunu patojenik olmayan (bakınız Tablo reçetesi).
    2. D. discoideum üstel büyüme aşamasında doku kültürü plakaları veya süspansiyon kültür toplayıp üretici göre bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak ' s yönergeleri. 1 x 10 5 D. discoideum hücreleri ile 260 µL K. aerogenes süspansiyon bir SM plaka üzerinde yayılmış. Ertesi gün aşağı ters plaka açın. D. discoideum hücreleri başlayana kadar bakteriyel çim takas ama onlar toplayarak başlamadan önce oda sıcaklığında hücrelerin büyümesine (~ 36-48 h).
    3. Toplamak D. discoideum onları bir cam dağıtıcı ile kazıma tarafından 5 mL DB arabellek hücrelerde. Hücreleri 50 mL polipropilen boru aktarın. Başka bir 5 mL DB arabellek ile plaka ve havuzu orijinal süspansiyon ile yıkayın. 50 mL tüp ile DB tampon doldurun.
    4. 3-4 dakika süreyle santrifüj 360 x g, D. discoideum süspansiyon süpernatant Aspire edin ve Pelet 50 mL resuspend DB arabellek. Tekrar süpernatant olana çamaşır adımları (~ 3-4 yıkar) temizleyin. Son hücre Pelet DB arabelleği 5 ~ 10 6 hücre/mL x son yoğunluğunun resuspend.
  2. Toplama hazırlanması-yetkili D. discoideum hücre
    1. geliştirme D. discoideum standartlarına göre her 6 dk 1 h açlık açlık ve 50 nM kampıyla darbe 4 h ve ardından tarafından hücreleri protokolleri 23.
    2. Geliştirme hücre süspansiyon son hacim ölçmek.
    3. Dayalı geliştirme için kullanılan hücre başlangıç sayısını hesaplamak son süspansiyon hücre yoğunluğu.
      Not: kamp 100 µL cilt olarak her 6 dakikada teslim edilirse, kamp darbe her saat için 1 mL tarafından hücre hacmi artar. Böylece, 8 x 10 7 hücreleri 4 ml DB kullanarak standart koşullar için geliştirme 4 h sonra son hacim 7 mL ve son hücre yoğunluğu ~1.1 x 10 7 hücre/mL.

3. Biyokimyasal analiz, hücre veya yanıt olarak mekanik kimyasal uyarımı

    1. plaka 2 x 10 6 toplama yetkili Akut mekanik stimülasyon, hücreleri tarafından takip hücre lizis hücrelerden (Adım 2.2) 4 h sonra 35-mm yemekleri 2 mL DB ile geliştirme. Hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika eklemek izin verir. Hücreleri iki kez 1 mL DB ile yıkayın. DB hücrelerle 2.5 mM kafein plakaların herhangi bir rahatsızlık olmadan 30 dk için kuluçkaya.
      Not: hücreleri ile farmakolojik bir önleyici tedavi edilmesi gerekiyorsa, istenen inhibitör konsantrasyon veya uygun araç aynı hacmi kafein ile basalation sırasında ekleyebilirsiniz.
    2. Mekanik stimülasyon, uygulamak için bir orbital Çalkalayıcı plaka (teker teker) yerleştirin ve hemen 150 RPM (0,24 x g) 5 açın s.
      Not: Plaka da el ile hareket tarafından yaklaşık 5 için çapraz bir şekilde uyarılmış s.
    3. Aspire edin, belirtilen arabellek kez stimülasyon başladıktan sonra. Hemen 100 µL örnek arabellek fosfataz ve proteaz inhibitörleri ile ekleyerek hücreleri parçalayıcı.
    4. Plaka Buza koyun ve lysate 1.5 mL tüp içine toplamak. İçin ' zaman 0 ', sallayarak olmadan hücreleri parçalayıcı. Tüpler 95 ° C ısı blok için 10 dk sonra hemen lizis aktarın. İmmunoblotting ile devam etmek ya da lysates -20, saklamak ° C.
  2. Stimülasyon hücreleri bir Chemoattractant ile
    1. toplama yetkili hücreleri geliştirme sonra 4 h hızla onları 5 mM kafein 200 devirde (0,42 x g) huzurunda bir orbital Çalkalayıcı 30 dk için üzerinde sallayarak Basalate.
      1. Santrifüj hücre süspansiyon 360 x g 3-4 dakika süreyle süpernatant Aspire edin ve Pelet 10 mL resuspend buz gibi DB arabellek. Çamaşır adımı yineleyin.
    2. 4 x 10 7 hücre/mL (bkz. Adım 2.2) hücreleri geliştirmek için kullanılan bu ilk hücre sayının son yoğunluğunun buz gibi DB arabellekte son hücre Pelet resuspend. Hücre süspansiyon stimul önce buz üstünde tutmakation.
      1. Pipet 50 µL 10 µM kamp veya araç polistren bir fincan içine yerleştirilen bir orbital Çalkalayıcı.
    3. Hücreleri uyarmak için buz gibi hücre süspansiyon 450 µL aynı fincan içine ekleyin ve hemen shaker 200 rpm'de (0,42 x g) açın. Çeşitli zamanlarda stimülasyon başladıktan sonra at (örneğin 10, 30, 45, 60, 120 s), kısaca shaker durdurmak, hücre süspansiyon 50 µL aliquots almak ve 25 µL 3 X örnek arabellek içeren 1,5 mL tüpler ekleyerek hücreleri parçalayıcı.
      1. İçin ' zaman 0 ', unstimulated buz gibi hücre süspansiyon hücrelerden kullanın.
        Not: Hücre süspansiyon stimülasyon sırasında son sıcaklık ~ 9 ° C 26 yaşında. Bu koşullar altında en yüksek yanıt oda sıcaklığında (örneğin, yapışık hücreleri mikroskop üzerinde chemoattractant uyarılması veya mekanik yapışık hücreleri uyarılması) gerçekleştirilen uyarılması için gözlenen en yüksek biraz geç ortaya çıkar.
    4. Lizis hemen sonra 10 dakika için 95 ° C ısı bloğu tüpler aktarmak. İmmunoblotting ile devam etmek ya da lysates -20, saklamak ° C.
  3. Immunoblotting tarafından yanıt hücre analizi
    1. üzerinde 4-%15 Tris-HCl polyacrylamide jel lysates (Kimden adım 3.1.3 veya 3.2.4) çalıştırmak, polivinilidin florid membran, blok ve immunoblot fosfo-PKC ile transfer Ζ (fosfo-PKBR1 ve fosfo-PKBA algılamak için) Thr410. Sinyal ile gelişmiş Kemiluminesan substrat kullanarak Kemiluminesan tarafından takip horseradish peroksidaz Birleşik Anti-tavşan ikincil antikor, kuluçka saptamak.
    2. Leke sıyırma arabelleği ile birden fazla protein tespiti için şerit ve yeniden sonda ile birincil antikor karşı fosfo-p42/44 MAPK Thr302 / (fosfo-ERK2 algılamak için) 304. Eşit protein polivinilidin florid membran Coomassie parlak mavi ile boyama tarafından yükleme onaylamak.

4. Akut mekanik stimülasyon ve canlı görüntüleme, tek hücreler mikroskop

  1. bir akış aygıtı kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirilmesi
    1. toplamak ve bitkisel veya toplama yetkili seyreltik ~ 1 x 10 6 hücre/mL sırasıyla 2,1 ve 2,2, adımlarda açıklandığı gibi DB hücrelere. Bir kanal ile slayt ~ 600 µL yüklemek (Malzeme tablo Ayrıntılar için bakınız). Hücreleri 10 dk. yapmak için tüm alıcılar slaytta yer tamamen dolu emin eklemek izin verir. Gerekirse ilave arabelleği ile kontör.
      Not: çözümlemesi için kullanılan belirli slayt dar, 1 mm kanallarına yem, ama sonra geniş ve 3 mm bir kanal için birleştirin Üç giriş vardır. Kanal 0.4 mm yüksekliğidir. Hücreler kanal kaplama rağmen sadece geniş kısmını görüntüsü.
    2. 50 mL rezervuar sıvı biriminin açık değil vana aracılığıyla bağlı olduğu satırlardan birini geçmek (Malzemeler tablo Ayrıntılar için bakınız). İstimal bilgisayar yazılımı için pompa, vana kapalı olduğundan emin olun (Yani soldaki). Havzanın DB ile doldurun.
      1. 50 mbar basınç ayarlı ve açın. Doldurun ve açmak için kapak üzerinde tıklatarak satırı DB ile durulayın. 0 geri basınç açmak ve Vana ~ 30'dan sonra kapatın s.
    3. Herhangi bir hava kabarcıkları yakalama olmadan bir slaydın bir tarafta üç giriş hattı bağlayın. Diğer iki giriş takın. Slayt ikinci tarafında tek emişli için drenaj hattı bağlayın.
      Not: Bu kurulum giriş ve drenaj hatları için kullanılan boru bir iç 1.6 mm çapındadır.
    4. Mikroskop altında bir 20 X hava hedefi slayt yerleştirin. Kanal durulama için satırı açın ve'ı tıklatın için vana geçin " basınç ON ", yüksek basınçta (~ 50 mbar veya ~ 40 dyn/cm 2) sıvı drenaj itmek için başlangıç.
      1. Sıvı drenaj dışında olduğunda, dış basınç sıfıra azaltmak (i.e. yerçekimi akışı yalnızca, ~ 15 dyn/cm 2) ve ~ 30 s. şalter için kapak akışını durdurmak için ters pozisyon için durulama devam.
    5. Elde bir ters floresan mikroskop altında bir 40 X Petrol amaç üzerinde RFP ya da GFP aydınlatma 3 s aralıklarla görüntülerle. İstenilen basınçta, genellikle 15 ile 40 dyn/cm 2 arasındaki basınç ile kapak kapalı konumda açmak (0 - 50 mbar).
    6. 5 kare aldıktan sonra uyarıcı Vana geçiş yaparak teslim " açık " pozisyon. Vana için ters yönde geçiş yaparak sonra 2-5 s akışını devre dışı.
      Not: bazı zayıf biyosensörler (örneğin PTEN, CynA ve RalGDS) 40 X Petrol amacı ile donatılmış confocal mikroskop kullanarak görüntü hücrelere gerekebilir.
  2. Farmakolojik inhibitörlerinin yanıt-e doğru bir akış aygıtı kullanarak akut mekanik stimülasyon üzerinde etkileri test
    1. plaka slayt hücrelerde bir kanal ile 4.1.1. adımda açıklandığı gibi. İki satır ayarla: adım 4.1.2, olduğu gibi açık değil vana ile bir satır geçmek ve arka tarafında ikinci kapak yaptı. Sol çizgi Klamp ve kapak koy " kapalı " (sol) konum. Uygun araç ve ikinci bir farmakolojik inhibitörü olan faiz (örneğin 5 µM Latrunculin A) içeren solüsyon ile içeren DB ile bir satır doldurun.
      Not: Fiziksel olarak sol çizgi çünkü kelepçe gereklidir " kapalı " sola göre konum açılır kapak bu hat için.
    2. Dolgu ve durulama sağ satır 50 mbar basınç tahrik ve kapak için anahtarlama tarafından " aç " (sağda) konum. ~ 30 dolgu s. ve sol satır klempi ~ 30 s. bağlamak için kaldırarak durulayın sonra kapak sola her iki hat iki slayt kanalı içeren bir tarafındaki giriş için geçiş, kalan giriş fişi ve tek emişli üzerinde ikinci yan. drenaj bağlanmak < / l Ben >
    3. arabellek içeren slaydı sağ çizgi yıkamak ve stimülasyon 4.1.3 ve 4.1.4 yukarıdaki adımlarda açıklandığı gibi aynı arabellekte gerçekleştirmek.
      Not: her ne kadar doğru çizgi bu kurulum birinci olarak seçildi, sırasını tersine.
    4. Stimülasyon, sağ çizgi sıfır basınçta (Yani yerçekimi akışı yalnızca, ~ 15 dyn/cm 2) açmak için kapak geçin. Kelepçe sol satırından kaldırmak ve Vana bu çizginin açmak için sola geçin. İlk satırı kelepçe.
    5. 3-5 mL arabelleği inhibitörü ile birlikte çalışan sonra Vana akışını durdurmak için sağa geçin ve hücreleri için gerekli süreyi inhibitörü ile kuluçkaya (örneğin 15 dk). Vana her ~ 10 dk ~ 15 için geçiş yaparak akışını açmak oksijen yetmezliği önlemek için s. Stimülasyon ikinci satır ile yineleyin.
  3. Bir micropipette kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için alternatif bir yöntem
    1. DB ile standart protokol 23 göre dolu micropipette ayarlayın. 1500 PSI tazminat bastır.
    2. Toplamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi bitkisel hücreleri oranında seyreltin. ~7.5 x 10 5 hücre/mL 1-şey odasında yer 25 µL damla izin en az 10 dk için uygun ve 3 mL DB ile kapak için.
    3. Odası 40 X Petrol amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu yerleştirin. Hücreleri bulun. İlk alt odasının dokunana kadar micropipette görüş alanı ortasında içine yavaşça indirin.
      Not: tazminat basınç 1500 PSI kuruldu beri hücreler sürekli olarak DB çok yavaş bir akışı için micropipette maruz kalacağı.
    4. 3 s aralıklarla RFP ya da GFP aydınlatmalı görüntüleri alma başlar. Geçerli ' temiz ' micropipette sıvı bolus serbest bırakmak için işlev. Imaging ben devamn akışı nedeniyle tazminat basınç yalnız varlığı.
  4. Toplu arabellek eklenmesini kullanarak akut mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için alternatif bir yöntem
    1. toplamak ve 2.1 adımda anlatıldığı gibi bitkisel hücreleri oranında seyreltin. 20 µL damla hücre ~ 1 x 10 6 hücre/mL DB bir 8-şey odası bir kuyudan ortasında yerleştirin. Hücreleri en az 10 dk. için bağlı kalmak izin
    2. RFP veya GFP özel aydınlatma üzerinde 3 s aralıklarla 40 X amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu ile görüntüleri alma başlar. Damla kenarına yakın bir alan üzerinde odaklanmak.
    3. Hızla iyi bir yana DB 430 µL ekleyin. Görüntüleme devam.
    4. Mekanik ve kimyasal uyaranlara arasındaki etkileşimi analiz için mekanik stimülasyon, izleyen 12 veya 45 s yavaşça ekleyin folik asit (son konsantrasyonu 20 nM) veya araç (DB) 50 µL mekanik bir yanıt inducing olmadan. Görüntüleme devam.
  5. Yanıt miktar
    1. 32-bit TIFF görüntü içinde görüntü analiz yazılımı açın (detaylar için bakınız Tablo reçetesi) 27.
    2. Altında ' analiz ' sekmesinde, gidin " ölçümleri ayarlamak ". Kutusunu işaretleyin ' demek gri değeri '. Diğer kutularını işaretlenmemiş emin olun. ' I tıklatın " Tamam ".
    3. Altında ' işlem ' sekmesinde,'ı tıklatın " arka plan çıkarmak ". Çalışırken topu RADIUS 50 piksel çözünürlükte tutmak ve yapmak değil kontrol seçenekleri menüde listelenen. Bir hücre kullanarak üzerinde yakınlaştırma ' Büyüteç ' aracı.
    4. Kullanma ' dikdörtgen ' araç, bir kutu (~2.5 x 2.5 µm 2) çekirdek veya plazma zarı üzerinde çizmek değil emin sitozol çizmek. Basın " Ctrl " + " M " tuşları veya gitmek ' analiz ' etiket ve tıkırtı üstünde " ölçü " kutusu gri ortalama değerini belirlemek için. Kutuyu emin ilerlemek için izleyen çerçeveler ve ölçü birimi tekrar, sitozol içinde kalır.
      Not: D. discoideum hücreleri çok hızlı bir şekilde taşımak beri kutuyu bir çerçeveden diğerine sitozol içinde tutmak için taşınabilirler.
    5. Sonuçta bu çerçevede analiz var, bir elektronik tabloya değerleri kopyalamak. Çeşitli biyosensörler ifade düzeyde hücre hücre varyasyon için hesap için ortalama gri değeri 0 zamanında gözlenen değerleri normalize. Devrik değerlerin sinyal birikimi korteks üzerinde yansıtmak üzere değerleri hesaplamak.

5. Sürekli mekanik stimülasyon ve canlı görüntüleme, tek hücreler mikroskop

  1. hücreleri içinde merdiven 4.1.1 - 4.1.3 akut mekanik stimülasyon analiz için yukarıda açıklandığı gibi tam olarak ayarla. Birimin her seferinde bir kaç dakika daha uzun süre yanıt analiz Eğer tepesinde olmak bu yüzden arabellek ile havzanın kapsayan tak açın.
    Not: havzanın deneme süresince açık kalır çünkü bu tahlil dış basınç yokluğunda yapılan ve üzerindeki yerçekimi akış tek başına dayanıyor. Yerçekimi tarafından akış oranını artırmak için drenaj bir tablo mikroskop altında yerleştirilebilir.
  2. Hücreleri üzerinde Biyoalgılayıcı yanıt çözümlenmesi için 3 s aralıklarla 40 X amacı ile donatılmış bir ters Floresans mikroskobu RFP veya GFP özel aydınlatmalı Imaging başlar. Alternatif olarak, görüntü analiz genel hücre göç için 10 s aralıklarla bir 20 X hedefi kullanarak faz kontrast.
  3. Sıfır-basınç ayarında birkaç kare sonra üzerindeki akış açın (Yani akış bir yerçekimi yalnız veya ~ 15 dyn/cm 2 nedeniyle) kapak açık konuma değiştirme'yi. Sıvı düzey 5-10 ml Reservoir düştüğünde, daha fazla arabellek ile kontör. Hava kabarcıkları hatlarında tuzağa değil bu yüzden dikkatle sıvı eklemek için emin olun.
    Not: Bu bir şok yanıt olarak hücreleri önlemek için aynı sıcaklık sıvı ekleyin önemlidir.
  4. Ölçmek hücre hızı ve çözümleme bilgisayar yazılımı kullanarak sebat (Ayrıntılar için Malzemeler tablo görmek) Üretici göre ' s yönergeleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Zamansal kemotaksisi düzenleyiciler cevaben akut mekanik stimülasyon

D. discoideum hücre mekanik stimülasyon yanıtı değerlendirmek için yapisan toplama yetkili hücreleri için kesme akımı nabız kısa maruz bırakıldı. Toplama yetkili D. discoideum hücreler hücreleri komşu tarafından hissedilen kampı salgılar. Hücre-hücre sinyallemesi katkı üstesinden gelmek için hücreleri gozlemler cyclase D. discoideum içinde engeller ve böylece kamp salgı28kafein ile tedavi edildi. Nitekim, hücreleri ile önceden tedavi kafein PKBR1 ve ERK2 çok düşük Bazal etkinlik vardı ve 5 s stimülasyon kesme akışı (şekil 1A) ile takip bu kinaz anahtar kalıntılarının fosforilasyon sağlam bir artış gösterdi. Yanıt geçici ve bitkin çevresinde 10-15 s PKBR1 için ve çevresinde 30 s ERK2 için benzer şekilde için daha önce yayınlanan bu proteinler chemoattractant7ile aktivasyonu için bulgular.

Tek başına (veya bir araçla) için düşük Bazal düzeyi, bu testin geliştirilmesi için ön çalışmalar dikkate alınarak yanıt verimliliğini değerlendirmek zordur stimülasyon kesme akışı ile karşılaştırıldığında yamultmak akışı varlığı bir chemoattractant kampı (şekil 1B). Bu analiz bir artış yanıt akışı yamultmak için sinyal iletim ağ yanıt doymuş olduğunu düşündüren cAMP ile belli etmedi. Her ne kadar bu tahlil PKBR1 fosforilasyon kampı artmamıştır, hücrelerin yanıt-e doğru chemoattractant toplama yetkili hücre süspansiyon, saklandığı bir standart stimülasyon protokolü kullanarak cAMP ile uyarılmış ve çeşitli lysed görülebilir stimülasyon takip zaman puan. Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi bu koşullar altında orada PKBR1 fosforilasyon yanıt chemoattractant ama değil araç olarak geçici bir artış olur. En yüksek yanıt 30'görülmektedir çünkü hücre Süspansiyon sırasında tahlil sıcaklığını ~ 9 ° C, s Bu tahlil karşılaştırıldığında ~ 22 ° c26açıklanan mekanik stimülasyon tahlil için.

Önde gelen ve kenar işaretleri akut mekanik uyarılması için ahşap kaplama kronolojik zamanmekansal yanıt

Yukarıdaki nüfus tahlil yalnızca kemotaksisi düzenleyiciler davranışı hakkında geçici bilgi sağladığı hücreleri de bir mikroskopla gözlenen süre için kısa bir mekanik uyarıcı maruz bırakıldı. Bu tahlil toplama yetkili veya bitkisel gerçekleştirilebilir D. discoideum hücreleri olan yerelleştirme hücrelerdeki bir chemoattractant ile uyarılan tanımlanmış çeşitli fluorescently etiketli biyosensörler ifade. Hangi PIP3 veya yeni polimerli aktin tarafından işe alınan, iki öncü işaretleri, PH etki Crac ve kireçΔcoil, her ikisi de çoğunlukla sitozolik yerelleştirme resting hücrelerinde daha önce raporlanmış (şekil 2Aolarak, tamamlayıcı film 1 gösterdi )4,29. Basally aktif olan hücrelerde, bu biyosensörler pseudopods ipuçları üzerinde görülebilir. Stimülasyon 2 için kesme akışı ile takip s, hızla bir zirve ~ 6-10 ile korteks relocalized biyosensörler s ve için sitozol ~ 30 tarafından döndürülen s. Buna ek olarak, bir ahşap kaplama kenarı marker PTEN korteksi uyarımı (şekil 2A) önce yerelleştirilmiş. Sonra kısa darbe kesme akışı ile sitozolik PTEN yoğunluğu, daha yavaş dynamics da olsa için öncü biyosensörler artmış. Biyoalgılayıcı yerelleştirme sitozol üzerinden bir değişiklik korteks ve tersi, açıkça bir değişiklik olarak yanıt basit miktar için izin sitozolik yoğunluğu görülmektedir.

Biyosensörler akut mekanik stimülasyon karşılık olarak gözlenen davranış lider ve kenar yerelleştirme dynamics stimülasyon tek tip chemoattractant ile karşılık olarak ahşap kaplama ile tutarlıdır. Bu davranış gösterilen üç biyosensörler benzersiz değildi. Yerelleştirme önceden yayınlanmış, benzer değişimler de öncü işaretleri RBD ve RalGDS tespit edildi gibi hangi tanımak Ras ve Rap1, sırasıyla, hem de başka bir ahşap kaplama kenarı işaret CynA22,30gelince aktif.

Benzer bir tahlil çeşitli inhibitörleri etkilerini değerlendirmek için bir basit değişiklik deneysel Kur üzerinden tek bir giriş satır için bir çift biri tarafından kullanılabilir. Bu yöntemi kullanarak, hücreler ilk denetim koşullara maruz ve sonra istediğiniz test aracısı içeren arabelleği değiştirdim. Örneğin, aktin depolymerizing uyuşturucu LatA ilavesi RBD yanıt bloke yanı sıraΔcoil, akut mekanik stimülasyon (şekil 2B) için kireç.

Küresel yanıt hücre geçiş kesme akışı ile uzun süreli stimülasyon altında önce gelir.

Burada açıklanan yaklaşım da D. discoideum geçiş kesme akışı etkilerini çalışmaya adapte olabilir. Aslında, akış 2 sonra Kapat değil Eğer s ancak kaldı üzerinde deneme süresi için bitkisel hücre gösterdi yönetmen geçiş akış (şekil 3tamamlayıcı film 2) karşı. Bu göçmen bir yanıt temin gerekli kesme akışı (örneğin, 2B şekilgörüldüğü gibi) bitkisel hücrelerde akut stimülasyon ile küresel bir yanıt elde etmek için genellikle kullanılan basınç daha düşük olması gerekmektedir. Bununla birlikte, bile daha düşük basınçta, hücreleri sağlam bir üniforma yanıt hücrenin bulunduğu herhangi bir değişiklik öncesinde kireçΔcoil yerelleştirme, bir değişiklik göre ölçülen görüntülenir. Böylece, bu deneyler açıkça 1) küresel yanıt hücre harekette bağlı değildir ve 2) küresel yanıt yönlendirilmiş geçiş öncesinde gösterdi.

Akut mekanik stimülasyon yanıt test alternatif yaklaşımlar

Bir akış yoluyla odası kullanımı akut mekanik stimülasyon yanıtı incelenmesi için net avantajları olmasına rağmen biz de tek tek hücreler tepki için akut mekanik stimülasyon testi için iki ek deneyleri geçerliliği. Şekil 4' te gösterildiği gibi bir micropipette (şekil 4A) tarafından teslim veya toplu kullanarak el ile tampon bolus eklenmesi tarafından hücreleri uyardığında hızla ve geçici sitozol korteks için yeniden lokalizeΔcoil kireç Arabellek ek bir pipet (şekil 4B) ile. Bu açık bir dezavantaj bu deneyleri her iki hücreye teslim kesme Kuvvetleri tam miktarı bilinmiyor ve kolayca değişmeyen olduğunu belirtmek gerekir. Ancak, nerede mekanik ve kimyasal uyaranlara arasında geçiş isteniyorsa durumlar için toplu arabellek ek akışı aygıtın uyarılması için sağlam bir alternatif sunuyor.

Figure 1

Şekil 1: temsilcisi akut mekanik veya kimyasal uyarmaya yanıt D. discoideum hücre biyokimyasal değerlendirilmesi için sonuç. Toplama yetkili hücreleri mekanik veya kimyasal uyaranlara maruz kaldılar, belirtilen süre noktalarda lysed ve tanımak antikorları kullanarak immunoblotted fosforile PKBR1 veya ERK2. (A)yapışık hücreleri uyarılmış bir orbital Çalkalayıcı 5 üzerinde s. Membran Coomassie parlak mavi (eşit protein yükleme göstermek için CBB ile) lekeli. (B) yapışık hücreleri yaklaşık 5 s aşağıdaki için çapraz bir şekilde plaka manuel hareketi tarafından teşvik nedeniyle ek 1 µM kamp veya arabellek (araç) veya herhangi bir kimyasal stimülasyon (-) olmadan kimyasal uyarımı. İki immunoblots 0 zamanında gördün PKBR1 Bazal aktivasyonu varyasyon kapsamını gösterir. Zaman zaman, PKBA harekete geçirmek de bu tekniği ile alt panelinde gösterildiği gibi tespit edilemedi. (C) süspansiyon hücreleri 1 µM kamp veya arabellek (araç) ile teşvik. Bu rakam bir parçası (A) Artemenko ve arkdeğiştirildi. (2016) 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: temsilcisi sonuçları akut mekanik stimülasyon ve mikroskop üzerinde tek hücre canlı görüntüleme için. (A)toplama-yetkili D. discoideum hücreleri ifade RFP öğesini kireçΔcoilveya GFP öğesini PH-Crac veya PTEN uyarılmış tek yönlü laminar akış 15 dyn/cm2 ile 2 s. imge were-5 her 3 toplanan için s . Biyosensörler translocation mekanik stimülasyon karşılık olarak gösterilen temsilcisi hücreleri gösterilir. Korteks, her Biyoalgılayıcı birikimi olarak zaman 0 için normalleştirilmiş ortalama sitoplazmik yoğunluğunun tersini sayısal. 18 (kireçΔcoil), 20 (PH-Crac) veya 6 (PTEN) hücrelerin ortalama yanıt gösterilir. Değerleri RFP öğesini kireçΔcoilifade SE. (B) bitkisel bir hücre ± anlamına - RFP ve GFP öğesini RBD tedavi araç veya 5 mikron ile en az 15 dakika ve o zaman tek yönlü laminar akış 41 dyn/cm2 2 ile uyarılan LatA s. görüntüleri toplanan her 3 RBD-GFP s. ve kireçΔcoil- RFP birikimi korteks, (Aolduğu gibi) sayılabilir. Ortalama ± SE değerlerdir. Analiz hücre sayısı her koşul gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: Temsilcisi akışı ile uzun süreli uyarılması için D. discoideum hücreler yanıt için sonuç. (A)bitkisel hücrelerinΔcoil sürekli tek yönlü laminar akış 15 dyn/cm2 sinin ve her 3 s. parça 11 hücre görüntüsü RFP öğesini kireç ifade (B) gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu rakam Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: temsilcisi sonuçları için alternatif yaklaşımlar tepki için akut mekanik stimülasyon testi. (A)bitkisel D. discoideum hücreleri ifade RFP öğesini kireçΔcoil basally tahlil arabellek yavaş bir hızda serbest micropipette (*) maruz. Akış hızı kısa bir artış 0 zamanında bir bolus tahlil arabelleği hızlı teslimat tarafından sağlanır. Görüntüleri toplanan mikroskobu odası küçük bir düşüş olarak kaplama RFP öğesini kireçΔcoil ifade her 3 s. (B) bitkisel D. discoideum hücreleri mekanik olarak arabelleğe büyük miktarda eklenmesi tarafından teşvik odası. Görüntüleri toplanan her 3 ölçek s. bar = 10 µm. bölüm(a)bu rakamın modifiye edilmiştir Artemenko vd. (2016) 22. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 1: Akut mekanik stimülasyon kireçΔcoilhızlı ve geçici translocation tetikler bu biyosensörler ifade hücreleri - RFP veya toplama yetkili D. discoideum korteks için PH-Crac-GFP üzerinden sitozol. Tek yönlü laminar akış döndü için 5 s zaman 0 ve hücreleri 3 s aralıklarla görüntüsü. Kayıttan yürütme hızını 5 kare/sn olduğunu. Her hücre satırı için iki örnek gösterilir. Ölçek çubuğu 10 µm =. Bu film şekil 2A için karşılık gelen ve Artemenko ve ark. değiştirildi (2016) 22. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Tamamlayıcı film 2: Sürekli mekanik stimülasyon kireçΔcoilhızlı ve geçici translocation tetikler RFP - sitozol üzerinden geçiş hücre akışının yönü karşı önce korteks için. Bitkisel hücrelerin kireçΔcoilifade - RFP 0 zamanında başlayan 15 dyn/cm2 sürekli shear strese maruz ve 3 s aralıklarla görüntüsü. Kayıttan yürütme hızıdır 10 kare/s. ölçek 10 µm çubuk =. Bu film şekil 3 ' e karşılık gelir ve Artemenko vd. daha önce yayımlanmış olan (2016) 22. Bu dosyayı indirmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yöntem tanımlamak burada nüfus ve tek hücre davranış yanıt akışı yamultmak için değerlendirmek için kullanışlı bir yol sunar. Önceki çalışmalarda lider ve kenar işaretleri geçiş sırasında geri kalmış yerelleştirme analiz ederken, önemlisi, güncel yaklaşımlar ilk etkisi soruşturma akut kesme akışı uygulayarak sağlar. Bu yöntemi kullanarak aslında, ilk yanıt akışı yamultmak için hücre hücre geçiş gerektirmez, gösterdi. Bunun yerine, ilk kesme akışı uyarana hızlı ve geçici yanıt akışına benzer şekilde chemoattractant degradeyle görülen ilk küresel yanıt yamultmak için uzun süreli pozlama ile görülen yönlü geçiş önce gelir.

Her yöntemin farklı avantajları ve dezavantajları olsa bile biyokimyasal ve mikroskobik yaklaşımlar tamamlayıcı veri verim. Stimülasyon ardından hücre lizis ve immunoblotting PKBs, KrsB ve ERK, örneğin, hücre tüm bir popülasyon analiz eder ve böylece tek hücre davranış inceliyor bir tahlil aksine hücre hücre varyasyon ortalama. Ancak, nüfus tabanlı deneyleri maskesi ince değişiklikleri tek tek hücreler analiz ederek kolayca görülebilir hücre davranış eğilimindedir. Ayrıca, burada açıklanan biyokimyasal tahlil sadece daha sonra ele alınacak nedenlerle toplama yetkili hücreleri ile etkili olur. Buna ek olarak, RBD, RalGDS, PH-Crac, kireçΔcoilve PTEN, relocalization mikroskobu tabanlı tahlil Örneğin, korteks ve sitozol arasında bitkisel ve toplama yetkili hücreler için etkili ve böylece gözlemler için izin verir Bu kutuplaşma değişen derecelerde sahip hücrelerin genel olarak geçerlidir. İki yaklaşım tamamlayıcı kılan farklı kümeleri kullanılabilir satır aralığı/ahşap kaplama kenar işaretleri, böylece kesme akışı tahlil ile test sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağları kapsamı genişleyen incelemek gerçektir.

Çok sağlam mikroskobu tabanlı deneyleri içinde yanıt, bitkisel hücre, hücre lizis ve immunoblotting ardından uyarılması için yanıt vermeyen bu yüzden belirsizdir. Bir ihtimal plaka döndürüldüğünde hücrelerine uygulanan kesme kuvvet miktarı akış odası hücrelerde yaşadığı kuvvet eşleşmiyor. Gelişmiş hücre, buna ek olarak, harekete geçirmek için daha düşük bir eşik var ve, böylece, her iki koşul altında yanıt. Bu olan faaliyet biyokimyasal tahlil tarafından ölçülen biyosensörler değil ifade edilir veya folik asit içeren bitkisel hücrelerin uyarılması PKBR1/PKBA ve ERK2 sağlam harekete geçirmek yol açar bu yana bitkisel hücrelerde etkinleştirilmemesini düşüktür (veri değil gösterilen). Ayrıca, bitkisel hücreleri PIP3 birikimi yansıtır, PH-Crac açık işe alım mikroskobu tabanlı assay olarak gösterir. PKBA işe de PIP3 üzerinde bağlı olduğundan, biyokimyasal tahlil koşullarda yukarıda da belirtildiği gibi en uygun olmadığınız sürece, PKBA akut mekanik uyarmaya cevap değil zor görünüyor. Bu araştırma bir alan kalır.

Kemotaksis düzenleyiciler biyokimyasal analizini kafein deneme boyunca varlığını gerekli. İlk kafein kampı salgılanması nedeniyle hücre-hücre sinyallemesi önlemek için eklendi. Ancak, görünüşe göre ACA boş hücreler hala kafein PKBR1 fosforilasyon yanıt için gerekli bu yana kafein akut mekanik uyarmaya gozlemler cyclase (ACA) inhibisyonu yanı sıra başka bir rolü vardır. Kafein daha önce TorC2 etkinliği26blok gösterilmiştir. TorC2 inhibisyonu hücrelerin Bazal bazı hareketliliği bloke ve böylece PKBR1 Bazal aktivasyonu ve diğer bileşenleri sinyal iletim ve aktin sitoiskeleti ağların indirdi mümkündür. Düşük Bazal etkinlik akışı yamultmak için yanıt gözlemlemek için şart. Aslında, ne zaman hücre geliştirme sırasında önceki zaman noktalarda toplanmıştır, artan Bazal etkinliği ve düşük kesme akış indüklenen tepki göstermek. İlginçtir, bu bitkisel hücrelerin orantılı olarak daha fazla PKBA etkinliği ve kıyasla daha az PKBR1 hücreleri31geliştirilen bilinmektedir. Bu eksikliği bir biyokimyasal tahlil bitkisel hücrelerinin daha fazla katkıda Bazal devlet bitkisel ve toplama yetkili hücrelerinde biraz farklı şekilde düzenlenmiştir mümkündür. Hücreleri gelişiminin sonraki noktalarda toplanmıştır, merakla, onlar da azaltılmış bir yanıt, polarite yerelleştirme üzerinde güçlü etkisi ve bu tahlil incelendiğinde çeşitli kemotaksisi düzenleyiciler aktivasyonu nedeniyle büyük olasılıkla vardı.

Stimülasyon hücrelerinin mikroskopisi odası hem güç hem de uyarıcı süresi maksimal yanıt22' ye katkıda saptandı. Eğer uzun bir süre için uygulanan diğer bir deyişle, maksimal yanıt bile bir düşük kesme güçle elde edilebilir (10 s 2 karşı s). Bu gözlem ilk geçiş akış kaynaklı yamultmak için yol açar bir sürekli ama zayıf, uyarıcı maruz kalır neden hücreleri bir ilk küresel yanıt var açıklar. Geçerli aparatı ile aralığın alt ucundaki araştırmak için yeterince düşük kesme akışı oluşturmak koyamadık.

Belki de akut mekanik stimülasyon kullanılarak yürütülen çalışmaların en önemli dolaylı mekanik ve kimyasal uyaranlara ortak sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağlar beslemek için görünür olduğunu. Biz iki uyaranlara için mekanik stimülasyon toplu arabellek eklenmesini kullanarak entegre olsa da, gelecek çalışmalar nerede chemoattractant hızla çok daha çok yönlü olacak akışı aracılığıyla kanal, teslim edilebilir bir sistem geliştirmek amacı olacak ve mekanik ve kimyasal uyaranlara entegrasyonunu değerlendirmek için güçlü bir şekilde. Chemoattractant akışı huzurunda teslim edilmek üzere olduğu için ne yazık ki, geçerli iki satırlık Kurulumu kullanarak chemoattractant ikinci bir makaslama akışını uyarıcı ile ilişkili ektir. Bir alternatif için kamp Westendorf ve arktarafından başarılı bir şekilde gösterildi lazer uyarılmış sürümünden bir chemoattractant Kafesli habercisi olabilir. 32. gelecekte, aynı zamanda entegrasyon diğer uyaranların incelemek, örneğin, akış ve değişken elektrik alanları kesme veya akış ve değişken yüzey sertliği yamultmak için ilginç olabilir. Mekanik stimülasyon, iki tür içerir ilk sinyalinin alınmasına aralarında farklı olabilir, ancak ikinci örnek ilginç çünkü. Yönlendirilmiş göç teşvik tüm uyaranlara aynı sinyal iletim ağ paylaşmak ve sadece nasıl uyarıcı algılanmaktadır içinde değişir teyit hücreleri karmaşık ortamlarda nasıl gezinebileceğiniz açıklar. Son olarak, biz zaten kesme akışı ile akut stimülasyon insan nötrofil benzeri hücreleri22yaymak için yol gösterdi. Yapılacak çalışmalar daha fazla Yerelleştirme ve sinyal iletimi ve aktin sitoiskeleti ağları ile memeli hücrelerinde mekanik uyaranlara çeşitli bileşenlerini aktivasyonu muayene edecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Ulusal Sağlık hibe R35 GM118177 PND Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

Hücresel biyoloji sayı: 129 sinyal iletimi mechanotransduction kesme stres Kemotaksis rheotaxis kesme geçiş akış kaynaklı yönlendirilmiş geçiş Biyoalgılayıcı yerelleştirme akut uyarı
<em>Dictyostelium discoideum</em> yanıt-e doğru akut mekanik stimülasyon değerlendirilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.… More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter