Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Vurdering af Dictyostelium discoideum svar på akutte mekaniske Stimulation

Published: November 9, 2017 doi: 10.3791/56411

Summary

Her beskriver vi metoder til vurdering af cellulære reaktion på akut mekanisk stimulation. I analysen mikroskopi-baserede undersøger vi lokalisering af fluorescently mærket biosensorer efter korte stimulation med shear flow. Vi tester også aktivering af forskellige proteiner af interesse som reaktion på akut mekanisk stimulation biokemisk.

Abstract

Chemotaxis, eller migration op et forløb af en chemoattractant, er den bedste forstået tilstand af styret migration. Undersøgelser ved hjælp af sociale amøbe Dictyostelium discoideum viste, at en kompleks signaltransduktion netværk af parallelle veje forstærker svar på chemoattractants, og fører til tendentiøse actin polymerisation og fremspring af en pseudopod i den retningen af et farveforløb. Molekylære mekanismer kører andre typer af styret migration, for eksempel på grund af eksponering for shear flow eller elektriske felter, er derimod ikke kendt. Mange regulatorer af chemotaxis udstille lokalisering på førende eller halter kanten af en overflytning celle, samt vise forbigående ændringer i lokalisering eller aktivering efter globale stimulation med en chemoattractant. For at forstå de molekylære mekanismer af andre typer af styret migration udviklede vi en metode, der giver mulighed for undersøgelse af cellulære reaktion på akut mekanisk stimulation baseret på kort (2-5 s) eksponering for shear flow. Denne stimulation kan leveres i en kanal mens imaging celler, der udtrykker fluorescently mærket biosensorer til at undersøge enkelte celle adfærd. Derudover kan celle befolkning stimuleres i en plade, mængden, og immunoblotted ved hjælp af antistoffer, der genkender aktive versioner af proteiner af interesse. Ved at kombinere begge assays, kan man undersøge en bred vifte af molekyler aktiveres ved ændringer i subcellulært lokalisering og/eller fosforylering. Benytter indeværende metode vi fast besluttet på at akutte mekaniske stimulation udløser aktivering af kemotaktisk signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk. Mulighed for at undersøge cellulære svar til akut mekanisk stimulation er vigtigt for at forstå de igangsættende begivenheder nødvendige for shear flow-induceret motilitet. Denne tilgang giver også et redskab til at studere kemotaktisk signaltransduktion netværk uden forstyrrende indflydelse af chemoattractant receptoren.

Introduction

Migration af eukaryote celler er forudindtaget af forskellige kemiske og fysiske signaler i miljøet, herunder forløb af opløselig eller substrat-bundne chemoattractants, variabel stivhed af substrater, elektriske felter eller shear flow. Selv om der er sket mange fremskridt i vores forståelse for de molekylære mekanismer kørsel chemotaxis, mindre vides om andre typer af styret migration og hvordan disse forskellige signaler er integreret på cellulært niveau at udarbejde en samlet vandrende svar.

Instrueret migration mod en stigende koncentration af en chemoattractant indebærer tre adfærdsmæssige komponenter: motilitet, retningsbestemt sensing og polaritet1. Motilitet refererer til tilfældige bevægelse af cellerne opnået ved pseudopod fremspring. Retningsbestemt sensing er en celle evne til at opdage kilden til en chemoattractant, hvilket kan forekomme selv i immobiliserede celler. Polaritet refererer til den mere stabile asymmetrisk distribution af intracellulære komponenter mellem førende og halter kanten af en celle, hvilket fører til øget persistens i bevægelse.

Cellulære reaktion på en chemoattractant afhænger af aktiviteten af fire begrebsmæssigt definerede regulerende net: receptor / G protein, signaltransduktion, actin cytoskelettet og polaritet1. Chemoattractant binding til G protein-koblet receptor sender signal via heterotrimeric G proteiner α og βγ til downstream signaltransduktion netværk, som forstærker directional signal. Flere veje inden for signaltransduktion net fungere parallelt og indgå i actin cytoskeleton netværk til bias actin polymerisering, og deraf følgende pseudopod fremspring, i retning af gradient. Blandt vigtige regulatorer af chemotaxis er Ras GTPase, TorC2, phosphoinositide 3-kinase (PI3K), fosfatase og tensin homolog (PT) og guanylyl cyclase. Feedback-mekanismer inden for signaltransduktion netværk og mellem signaltransduktion og aktin cytoskeleton netværk yderligere forstærke svaret. Endelig, dårligt defineret polaritet netværket modtager input fra actin cytoskeleton, og yderligere fordomme signaltransduktion netværk for at fremme vedvarende migration i retning af gradient.

Meget af vores mekanistiske forståelse af chemotaxis blev muliggjort på grund af udviklingen af fluorescently markeret biosensorer til forskellige komponenter af de regulerende net. Mange chemotaxis lovgivere har en asymmetrisk fordeling enten af lovgivningsmæssige molekylet selv eller dets aktivitet. For eksempel, biosensorer, som genkender aktiveret versioner af små GTPases Ras og Rap1-Ras-bindende domæner af Raf1 (refereret til som RBD her) og RalGDS, henholdsvis-lokalisere til forkanten af en chemotaxing celle2,3. På samme måde, PI3K og dets produkt phosphatidylinositol (3,4,5)-trisphosphate (PIP3), anerkendt af en pleckstrin Homologi (PH) domæne, også vise lokalisering på forsiden af en celle4,5. Derimod et 3-fosfatase PT, der omdanner PIP3 tilbage til phosphatidylinositol (4,5)-bisfosfat, lokaliserer på halter kanten af den celle6. Vigtigere, ændre disse biosensorer deres lokalisering som svar på globale stimulation med en chemoattractant. Førende mærker, som er cytosole eller på spidsen af fremspring i en resting celle, relocalize cortex, mens halter kant markører, som har kortikale lokalisering og er fraværende fra spidsen af fremspring i en resting celle blive cytosole efter stimulation. Analyse af biosensor distribution som svar på globale stimulation med en chemoattractant minimerer motilitet og polaritet, som ofte forvirre observationer bidrag. Globale eller ensartet stimulering af en cellesuspension med et chemoattractant bruges også som et redskab til at vurdere befolkning-wide ændringer i protein aktivering, ofte opdaget af protein fosforylering7,8,9 . Denne biokemiske assay er primært bruges til at få tidsmæssige oplysninger, hvorimod mikroskopi bruges til at indsamle både tidsmæssige og rumlige oplysninger om opførsel af forskellige komponenter af de regulerende net.

Signaltransduktion netværk inkorporerer elementer af en overgearet system10,11. Reaktioner på supra-tærskel kemotaktisk stimuli er "alt" og vise ildfaste perioder. Svar også udløses stochastically og kan vise oscillerende adfærd. Signaltransduktion begivenheder er lokaliseret til områder af cortex, som overføres som bølger12,13,14,15. Forside, tilbage, markører er rekrutteret til eller tage afstand fra de aktive zoner af formeringsmateriale bølger. På grund af ildfaste regionen trailing zonen aktive, tilintetgøre oppositely rettet bølger som de mødes. Formeringsmateriale signaltransduktion bølger ligge til grund for de cellulære fremspring, der mægle celle migration10.

Mange af de ovennævnte oplysninger på chemotaxis kom fra undersøgelser på den sociale amøbe Dictyostelium discoideum, selv om lignende reguleringsmekanismer finder også anvendelse på neutrofile og andre pattedyr celle typer16 . Dictyostelium er en veletableret model organisme, der har en robust kemotaktisk svar under sult, når tusindvis af enkelt celler vandrer mod en sammenlægning centrum, til sidst danner et flercellet frugtsætning krop der indeholder sporer. Chemotaxis er også afgørende i én celle vækst fase af denne organisme for at lokalisere bakteriel fødekilder. Vigtigere, er migration af enkelt Dictyostelium celler bemærkelsesværdigt ens til migration af pattedyr neutrofiler eller metastatisk kræftceller, som alle gennemgår meget hurtige amoeboid-type migration. Faktisk er begge samlede topologien for de regulerende net, samt mange af de enkelte signaltransduktionsveje involveret i chemotaxis bevaret mellem Dictyostelium og pattedyr leukocytter17. Derudover bruge andre celler, såsom fibroblaster, receptor tyrosin kinaser (RTK) i stedet for GPCRs; RTKs kan dog indgå i lignende netværk.

I modsætning til chemotaxis mangler grundig forståelse af de signaling mekanismer, der drev forskellige andre tilstande af styret migration. Tilsvarende celler migrerer i et chemoattractant forløb flere undersøgelser har rapporteret aktivering og/eller lokalisering af typiske førende mærker, herunder actin polymerisering, PIP3 og/eller ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK) 1/2, på den forsiden af celler gennemgår instrueret migration som svar på shear strømmen eller ændringer i elektriske felter18,19,20,21. Men i disse studier kontinuerlig eksponering til stimulus også resulterede i celle migration, forlader spørgsmålet om eksempelvis forkant markører lokalisere specielt som svar på en stimulus, eller om de blot lokalisere på forkant på grund af øget antal pseudopods på forsiden af en overflytning celle.

Vi udviklede assays, der tillader os at observere svar af celler til akut mekanisk undertrykkelse af netbårne leveret som shear flow både på befolkningsniveau samt enkelte celler22. Svarende til globale stimulation med en chemoattractant, akut stimulation med shear flow giver mulighed for undersøgelse af en cellulære reaktion på en mekanisk stimulus uden forstyrrende bidrag fra motilitet eller polaritet. Kombinere disse biokemiske og mikroskopiske assays med genetiske eller farmakologiske perturbationer tillader os at lære om hvordan mekaniske stimuli opfattes og overføres. Desuden, denne tilgang giver også en roman metode til at tappe system nedstrøms for chemoattractant receptoren i mangel af en chemoattractant, derved isolere signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk fra receptor/G protein netværk.

Ved hjælp af de teknikker, der er beskrevet nedenfor vi for nylig viste, at akut shear stress fører til aktivering af flere komponenter af kemotaktisk signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk22. Ved at anvende de akutte mekaniske stimuli med varierende mellemrum, viste vi, at på samme måde til chemoattractants, svar på mekaniske stimuli også udstiller funktioner af en overgearet system, herunder svar under alt adfærd mætte betingelser og tilstedeværelsen af en refraktær periode. Endelig, ved at kombinere mekaniske og kemiske stimulation viste vi, at de to stimuli del signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk, som sandsynligvis giver mulighed for integration af flere stimuli til bias celle migration.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. forberedelse af løsninger

  1. forberede HL-5 medier ved hjælp af følgende: 10 g/L dextrose, 10 g/L proteose pepton, 5 g/L gær extract, 0.965 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O, 0.485 g/L KH 2 PO 4, og medmindre andet er angivet, 0,03 g/L streptomycin i ionbyttet vand. Autoklave medium og opbevares ved stuetemperatur.
    Bemærk: På grund af forskelle mellem proteose pepton og gær ekstrakt erhvervet fra forskellige leverandører samt mellem individuelle batcher, pH af medierne kan skal tilpasses til den typiske række 6.4 til 6.7.
  2. Forberede SM plader ved hjælp af følgende: 10 g/L dextrose, 10 g/L pepton, 1 g/L gær extract, 2,31 g/L KH 2 PO 4, 1 g/L K 2 HPO 4 og 20 g/L agar i ionbyttet vand. Autoklave, afkøles og hældes 30 mL af agar pr. 10 cm petriskål. Når agaren størkner, gemme plader ved 4 ° C i op til 1 måned.
  3. Forbered 10 x fosfat Buffer (PB) ved hjælp af 13.4 g/L Na 2 HPO 4 ·7H 2 O og 6,8 g/L KH 2 PO 4 i ionbyttet vand. Opbevar 10 x bestanden ved 4 ° C. Dilute til 1 x med deioniseret vand til brug.
  4. Forberede DB Buffer ved at supplere 1 X PB med 2 mM MgSO 4 og 0,2 mM CaCl 2.
  5. Forbered 100 mM koffein i ionbyttet vand. Gemme på − 20 ° C.
  6. Forberede 100 mM lejr stamopløsning ved at opløse lejr natrium salt monohydrat i ionbyttet vand. Forberede en 1 mM arbejder lager i ionbyttet vand. Gemme både stamopløsninger på − 20 ° C. Forbered endelige lejr løsning på den ønskede koncentration i DB på dagen af forsøget.
    Bemærk: Lager løsninger kan være fryse-optøet et par gange.
  7. Forbered 25 mM folinsyre i 1 x PB. Tilsæt et par dråber 1 N NaOH, indtil pulveret er helt opløst. Gemme på − 20 ° C.
  8. Forberede 3 x prøvebuffer ved hjælp af følgende: 187.5 mM Tris-HCl pH 6,8, 6% (w/v) natriumsulfat dodecylbenzensulfonsyremethylester (SDS), 30% glycerol, 126 mM dithiothreitol og 0,03% (w/v) bromophenol blå. Alikvot og butik på − 20 ° C.
    1. Forudgående at bruge, tø i et 37 ° C vandbad og gå videre til at forberede prøvebuffer med protease og fosfatase hæmmere af fortynding 3 x prøvebuffer til 1 x og tilføje 50 mM NaF, 2 mM Na 3 VO 4, 25 mM natrium pyrofosfat og 1 x komplet EDTA-fri protease hæmmer cocktail i ionbyttet vand. Tilføj hæmmere umiddelbart før du starter fremgangsmåden i trin 3.1.2-3.1.3.
  9. Forberede 5 mM Latrunculin A løsning i DMSO. Alikvot og butik på − 20 ° C.

2. Forberedelse af D. discoideum celler

Bemærk: fastholde D. discoideum celler i HL-5 medier enten i vævskultur plader eller i en suspension kultur som tidligere beskrevet 23. Når det er nødvendigt, omdanne celler med fluorescently mærket biosensorer ifølge standard elektroporation protokoller 24. Forskellige D. discoideum stammer, samt plasmider kodning biosensorer eller andre gener af interesse kan fås fra Dicty Stock Center (dictybase.org).

  1. Vækst og samling af celler, vegetativ D. discoideum
    1. For analyse af vegetative celler, dyrke celler under tilstedeværelse af bakterier til at reducere antallet af macropinosomes, som observeres typisk i axenically vokset celler 25.
      1. Forbered en kultur af Klebsiella aerogenes ved at vaccinere et lille antal celler fra en glycerol lager eller fra en tidligere kultur ind i den ønskede mængde af HL-5 medium uden antibiotika. Inkuber bakteriekulturen på en orbitalryster på 200 rpm (0,42 x g) ved stuetemperatur (20-22 ° C) til 16-18 h.
        Bemærk: K. aerogenes stamme bruges her er ikke-patogene (Se Tabel of Materials).
    2. Indsamle D. discoideum i den eksponentielle vækstfase, enten fra vævskultur plader eller en suspension kultur, og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer ifølge producenten ' s instruktioner. Sprede 1 x 10 5 D. discoideum celler med 260 µL K. aerogenes suspension på en SM plade. Drej plade på hovedet ned den næste dag. Vokser celler ved stuetemperatur indtil D. discoideum celler begynder at rydde den bakterielle græsplæne, men før de begynder at aggregere (~ 36-48 h).
    3. Indsamle D. discoideum celler i 5 mL DB buffer ved at skrabe dem med et glas sprederen. Overfør celler til en 50 mL polypropylen tube. Skyl pladen med en anden 5 mL DB buffer og pool med originale suspenderingen. Fyld glasset til 50 mL med DB buffer.
    4. Centrifugeres D. discoideum suspension på 360 x g i 3-4 min. Aspirér supernatanten og resuspenderes i 50 mL DB Buffer. Gentag trinene vask indtil supernatanten er klart (~ 3 til 4 vasker). Resuspenderes sidste celle i DB buffer til en afsluttende tæthed af ~ 5 x 10 6 celler/mL.
  2. Forberedelse af sammenlægning-kompetente D. discoideum celler
    1. udvikle D. discoideum celler ved 1 h sult efterfulgt af 4 h af sult og pulserende med 50 nM cAMP hver 6 min ifølge standard protokoller 23.
    2. Efter udviklingen, måle den endelige mængden af cellesuspension.
    3. Baseret på den første række celler, der bruges til udvikling, beregne celle tæthed af den endelige suspension.
      Bemærk: Hvis cAMP leveres i 100 µL mængder hver 6 min, cellevolumen stiger med 1 mL for for hver time i cAMP pulserende. Således, for de standard betingelser ved hjælp af 8 x 10 7 celler i 4 mL af DB, efter 4 h udvikling endelige rumfang er 7 mL og endelige celle tæthed er ~1.1 x 10 7 celler/mL.

3. Biokemiske analyser af celle respons til mekanisk eller kemisk Stimulation

  1. Akut mekanisk Stimulation af celler efterfulgt af celle Lysis
    1. plade 2 x 10 6 sammenlægning-kompetente celler (fra trin 2.2) efter 4 h i udvikling i 35-mm retter med 2 mL DB. Tillad cellerne til at vedhæfte i 10 min ved stuetemperatur. Vaske cellerne to gange med 1 mL DB. Inkuber celler i DB med 2,5 mM koffein i 30 min. uden forstyrrelser af pladerne.
      Bemærk: Hvis celler skal behandles med en farmakologisk inhibitor, tilføje ønskede koncentration af hæmmer eller den samme mængde af passende køretøj under basalation med koffein.
    2. At anvende mekaniske stimulation, placere pladen (en ad gangen) på en orbitalryster og straks slå det til ved 150 rpm (0,24 x g) for 5 s.
      Bemærk: Pladen kan også manuelt stimuleres af bevægelse på en cross-wise måde for ca 5 s.
    3. Aspirat buffer på de angivne tidspunkter efter begyndelsen af stimulation. Straks lyse celler ved at tilføje 100 µL prøvebuffer med protease og fosfatase hæmmere.
    4. Pladen anbringes på is, og indsamle de lysate ind i et 1,5-mL-rør. For ' tid 0 ', lyse celler uden rystelser. Overføre rør til en 95 ° C varme blok i 10 min. umiddelbart efter lysering. Fortsætte med immunoblotting eller gemme lysates på -20 ° C.
  2. Stimulation af celler med en Chemoattractant
    1. Basalate aggregation-kompetente celler efter 4 h udvikling af hurtigt ryste dem i 5 mM koffein på 200 rpm (0,42 x g) på en orbitalryster i 30 min.
      1. Centrifuge cellesuspension på 360 x g i 3-4 min. Aspirér supernatanten og resuspenderes i 10 mL iskold DB Buffer. Gentag trinnet vask.
    2. Resuspenderes sidste celle i iskold DB buffer til en afsluttende tæthed af 4 x 10 7 celler/mL baseret på den oprindelige celle nummer bruges til at udvikle de celler (Se trin 2.2). Holde cellesuspension på is før stimulation.
      1. Afpipetteres 50 µL af 10 µM cAMP eller køretøj i en polystyren kop placeret på en orbitalryster.
    3. For at stimulere cellerne, tilføje 450 µL af den iskolde cellesuspension ind i samme kop og straks aktivere shaker på 200 rpm (0,42 x g). På forskellige tidspunkter efter starten af stimulering (f.eks. 10, 30, 45, 60, 120 s), kort stop shaker, tag 50 µL delprøver af cellesuspension, og lyse celler ved at føje dem til 1,5 mL rør indeholdende 25 µL 3 X prøvebuffer.
      1. For ' tid 0 ', bruger celler fra den unstimulated iskolde cellesuspension.
        NOTE: Den endelige temperatur af cellesuspension under stimulation er ~ 9 ° C 26. Disse betingelser top respons sker lidt senere end peak observeret for stimulation udføres ved stuetemperatur (f.eks. chemoattractant stimulation af vedhængende celler i mikroskop eller mekaniske stimulation af vedhængende celler).
    4. Overføre rør til en 95 ° C varme blok i 10 min. umiddelbart efter lysering. Fortsætte med immunoblotting eller gemme lysates på -20 ° C.
  3. Analyse af celle respons af Immunoblotting
    1. køre lysates (fra trin 3.1.3 eller 3.2.4) på en 4-15% Tris-HCl polyacrylamid gel, overførsel til en polyvinylidene fluor membran, blok og immunblot med phospho-PKC Ζ Thr410 (til at opdage phospho-PKBR1 og phospho-PKBA). Registrere signalet ved inkubering med peberrod peroxidasekonjugerede anti-kanin sekundær antistof, efterfulgt af chemiluminescence ved hjælp af forbedrede kemiluminescens substrat.
    2. Til påvisning af flere proteiner, fratage skamplet med stripping buffer, og igen sonde med en primær antistof mod phospho-p42/44 MAPK Thr302/304 (at opdage phospho-ERK2). Bekræfte lig protein lastning ved farvning polyvinylidene fluor membran med Coomassie strålende blå.

4. Akut mekanisk Stimulation og Live Imaging af enkelt celler i mikroskop

  1. vurdering af reaktion på akut mekanisk stimulation ved hjælp af en flow enhed
    1. indsamle og fortyndes vegetativ eller sammenlægning-kompetente celler til ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB som beskrevet i trin 2.1 og 2.2, henholdsvis. Indlæse ~ 600 µL i dias med en kanal (Se Tabel af materiale for detaljer). Tillad celler til at knytte til 10 min. Sørg for at alle fjorde i diaset er helt fyldt. Top op med ekstra buffer evt.
      Bemærk: Særlig diaset bruges til analyse har tre indgange, som foder til smalle, 1-mm kanaler, men derefter flette til en bred, 3-mm kanal. Højden af kanalen er 0,4 mm. Selvom cellerne er belagt i hele kanalen, kun den store del er afbildet.
    2. Forbi en af de linjer, der er knyttet til en 50 mL reservoir gennem den forreste højre ventil af det fluidic enhed (Se Tabel af materialer for detaljer). Ved hjælp af software til pumpen, Sørg for ventilen er lukket (dvs. til venstre). Fyld beholderen med DB.
      1. Sæt presset på 50 mbar og tænde den. Fylde og skyl linjen med DB ved at klikke på ventilen for at åbne den. Drej presset tilbage til 0, og lukke ventilen efter ~ 30 s.
    3. Forbinde linjen til en af de tre fjorde på den ene side af diaset uden diffusering eventuelle luftbobler. Tilslut de anden to fjorde. Tilslut linjen fra afløbet til de enkelt indgang på den anden side af diaset.
      Bemærk: Slangen bruges til input og dræn linjerne i denne konfiguration har en indre diameter på 1,6 mm.
    4. Placere diasset på mikroskop under en 20 X luft mål. For at skylle kanalen, skifte ventil for at åbne linjen og klikke på " pres på ", begynder ved højere tryk (~ 50 mbar eller ~ 40 dyn/cm 2) at presse væsken ud i afløbet.
      1. Når væsken kommer ud af afløbet, reducere pres udefra til nul (dvs. tyngdekraften flow kun, ~ 15 dyn/cm 2), og Fortsæt skylning for ~ 30 s. Switch ventil til den modsatte holdning til at standse strømmen.
    5. Erhverve billeder med RFP eller normal god landbrugspraksis belysning på en inverteret fluorescens mikroskop under en 40 X olieobjektiv 3 s mellemrum. Med ventilen i lukket position, Tænd Tryk på det ønskede tryk, typisk mellem 15 og 40 dyn/cm 2 (0 - 50 mbar).
    6. Efter erhvervelse af 5 billeder, levere stimulien ved at skifte ventil til den " åbne " position. Slå strømmen fra efter 2-5 s ved at skifte ventilen til den modsatte retning.
      Bemærk: For visse svagere biosensorer (fx PT, CynA, og RalGDS) kan det være nødvendigt at billedet celler ved hjælp af en Konfokal mikroskop udstyret med en 40 X olieobjektiv.
  2. Testing virkninger af farmakologiske hæmmere på svar på akutte mekaniske stimulation ved hjælp af en flow enhed
    1. plade celler i diaset med en kanal, som beskrevet i trin 4.1.1. Oprettet to linjer: passere en linje gennem den forreste højre ventil som i trin 4.1.2, og andet gennem bagsiden forlod ventil. Klemme den venstre linje og sætte ventilen den " lukket " (venstre) position. Udfyld en linje med DB indeholdende den passende køretøj, og andet med den løsning, der indeholder en farmakologisk hæmmer af interesse (f.eks. 5 µM Latrunculin A).
      Bemærk: Det er nødvendigt at fysisk klemme den venstre linje, fordi den " lukket " venstre position åbner ventilen for den pågældende linje.
    2. Fyld og skyl ret linje ved at dreje presset ved 50 mbar og skifte ventil til den " åbne " (til højre) stilling. Skift ventilen til venstre efter ~ 30 s. fyld og skyl den venstre linje ved at fjerne klemmen for ~ 30 s. Connect begge linjer til to af fjorde på den ene side af dias med en kanal, stik den resterende indløb, og Tilslut afløbet til den fælles indgang på den anden side. < / l Jeg >
    3. vaske dias med bufferen i den rigtige linje og udføre stimulation i den samme buffer som beskrevet i trin 4.1.3 og 4.1.4 ovenfor.
      Bemærk: Selv om det rigtige linje blev valgt som den første i denne opsætning, ordren kunne vendes.
    4. Efter stimulation, skifte ventil for at åbne den rette linje på nul pres (dvs. tyngdekraften flow kun, ~ 15 dyn/cm 2). Fjerne klemmen fra den venstre linje og skifte ventilen til venstre for at åbne denne linje. Klemme den første linje.
    5. Efter at have kørt 3-5 mL buffer med hæmmer gennem, skifte ventilen til højre for at stoppe strømmen, og der inkuberes celler med hæmmer til den ønskede længde af tid (f.eks. 15 min). Tænd for strømmen ved at skifte ventil hver ~ 10 min for ~ 15 s for at forhindre ilt afsavn. Gentag stimulation med den anden linje.
  3. Alternativ metode til at vurdere reaktion på akut mekanisk stimulation ved hjælp af en mikropipette
    1. oprettet mikropipette fyldt med DB ifølge standard protokol 23. Holde erstatning pres på 1.500 psi.
    2. Indsamle og fortyndes vegetative celler som beskrevet i trin 2.1. Sted 25 µL dråber af ~7.5 x 10 5 celler/mL i en 1-godt kammer, gør det muligt at holde sig i mindst 10 min, og dække med 3 mL DB.
    3. Sted i salen på en inverteret fluorescens mikroskop udstyret med en 40 X olie mål. Lokalisere cellerne. Sænk forsigtigt mikropipette ind i midten af synsfeltet, indtil den først rører bunden af kammeret.
      Bemærk: Da kompensation pres blev sat på 1.500 Psi, cellerne vil blive konstant udsat for en meget langsom strøm af DB fra mikropipette.
    4. Begynde at erhverve billeder med RFP eller normal god landbrugspraksis belysning med 3 s intervaller. Gælder det ' rene ' funktion til at frigive en bolus af væske fra mikropipette. Fortsætte imaging jegn forekomst af flow på grund af kompensation pres alene.
  4. En alternativ metode til at vurdere reaktion på akut mekanisk stimulation ved hjælp af bulk buffer tilsætning
    1. indsamle og fortyndes vegetative celler som beskrevet i trin 2.1. Sted 20 µL dråber af celler på ~ 1 x 10 6 celler/mL i DB i midten af et godt fra en 8-godt kammer. Tillad celler til at overholde i mindst 10 min.
    2. Begynde at erhverve billeder med RFP - eller normal god landbrugspraksis-specifikke belysning på en inverteret fluorescens mikroskop udstyret med en 40 X mål 3 s mellemrum. Fokus på et område tæt på kanten af henlægge.
    3. Hurtigt tilføje 430 µL af DB til den ene side af brønden. Fortsætte imaging.
    4. For analyse af interaktionen mellem mekaniske og kemiske stimuli, 12 eller 45 s efter mekanisk stimulation, forsigtigt tilføje 50 µL af folinsyre (slutkoncentration 20 nM) eller køretøj (DB) uden at fremkalde en mekanisk reaktion. Fortsætte imaging.
  5. Kvantificering af svar
    1. åbne 32-bit TIFF-billede i billede analyse Software (Se Tabel af materialer for detaljer) 27.
    2. Under de ' analyser ' fane, gå til " sæt målinger ". Indskrive boksen nemlig ' betyde grå værdi '. Kontroller de andre bokse ikke er markeret. Klik på " OK ".
    3. Under den ' proces ' fanen, klik på " trække baggrund ". Holde det rullende kugle radius på 50 pixel, og lave ikke indskrive nogen af mulighederne, der er anført i menuen. Zoome ind på en celle ved hjælp af den ' Forstørrelsesglas ' værktøj.
    4. Ved hjælp af den ' rektangel ' tool, tegne en kasse (~2.5 x 2,5 µm 2) i cytosol, og sørg for ikke at trække det over kernen eller plasmamembran. Tryk på " Ctrl " + " M " nøgler eller gå til de ' analyser ' fanen og klik på " foranstaltning " til at bestemme den grå gennemsnitsværdien af boksen. Forskud til efterfølgende rammer og mål igen, og sørg for boksen forbliver i cytosol.
      Bemærk: Da D. discoideum celler flytte meget hurtigt boksen kan flyttes fra én ramme til næste til at holde det i cytosol.
    5. Jo af frames er blevet analyseret, kopiere værdierne i et regneark. For at tage hensyn til celle til celle variation i udtrykket niveauer af forskellige biosensorer, normalisere værdierne for grå gennemsnitsværdien overholdes på tidspunkt 0. Beregner reciprokke værdier afspejler ophobning af signalet på cortex.

5. Kontinuerlig mekaniske Stimulation og Live Imaging af enkelt celler i mikroskop

  1. Opsætning af cellerne præcis som beskrevet ovenfor for akut mekanisk stimulation analyse i trin 4.1.1 - 4.1.3. Åbne stikket der dækker reservoir med buffer så diskenheden kan forhøjes, hvis svar er analyseret i mere end et par minutter ad gangen.
    Bemærk: Da reservoiret forbliver åben for varigheden af forsøget, denne analyse udføres i mangel af pres udefra og afhængig af tyngdekraften flow alene. For at øge hastigheden af strømmen af tyngdekraften, afløbet kan placeres på et bord under mikroskopet.
  2. Begynder imaging celler med RFP - eller normal god landbrugspraksis-specifikke belysning på en inverteret fluorescens mikroskop udstyret med en 40 X mål med 3 s intervaller for analyse af biosensor svar. Alternativt billede med fasekontrast ved hjælp af en 20 X mål med 10 s intervaller for analyse af overordnede celle migration.
  3. Tænder for strømmen efter flere rammer på nul-tryk-indstilling (dvs. flow er på grund af tyngdekraften alene eller ~ 15 dyn/cm 2) ved at skifte ventilen til åben position. Når væske falder til 5-10 mL i reservoiret, top med flere buffer. Sørg for at tilføje væsken omhyggeligt så luftbobler ikke bliver fanget i linjerne.
    Bemærk: Det er vigtigt at tilføje væske af den samme temperatur til at undgå et chok reaktion i cellerne.
  4. Kvantificere celle hastighed og udholdenhed ved hjælp af software til datamigrering analyse (Se Tabel af materialer for detaljer) Ifølge producenten ' s instruktioner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Tidsmæssige svar af chemotaxis regulatorer til akut mekanisk stimulation

For at vurdere svar af D. discoideum celler til mekanisk stimulation, blev vedhængende sammenlægning-kompetente celler udsat for en kort puls af shear flow. Sammenlægning-kompetente D. discoideum celler udskiller cAMP, der kan sanses af tilstødende celler. For at overvinde bidrag af celle-celle signalering, blev celler behandlet med koffein, som hæmmer adenylyl cyclase i D. discoideum og dermed forhindrer lejr sekretion28. Faktisk celler forbehandlet med koffein var meget lav basal aktivitet af PKBR1 og ERK2, og viste en stærk stigning i fosforylering af de centrale rester af disse kinaser efter 5 s stimulation med shear flow (figur 1A). Svaret var forbigående og toppede omkring 10-15 s for PKBR1, og omkring 30 s til ERK2, ligeledes til tidligere offentliggjort resultaterne for aktivering af disse proteiner med en chemoattractant7.

Selvom det er vanskeligt at evaluere effektiviteten af svar i betragtning af det lave basale niveau, indledende undersøgelser, der førte til udviklingen af denne analyse, sammenlignet med stimulation med shear flow alene (eller med et køretøj) til shear flow i en Chemoattractant cAMP (figur 1B). Denne analyse viste en stigning i reaktion med lejren, hvilket tyder på, at svar af signaltransduktion netværk til shear flow er mættet. Selv om i dette assay cAMP ikke steg fosforylering af PKBR1, kan celler svar på chemoattractant observeres ved hjælp af en standard stimulation protokol hvor sammenlægning-kompetente celler holdes i suspension, stimuleret med lejren, og mængden på forskellige tid point efter stimulation. Som vist i figur 1 c, disse betingelser er der en forbigående stigning i PKBR1 fosforylering i svar til chemoattractant, men ikke køretøj. Top respons er observeret på 30 s i denne analyse, fordi temperaturen i cellesuspension under analysen er ~ 9 ° C, i forhold til ~ 22 ° C til mekanisk stimulation assay beskrevet ovenfor26.

Spatiotemporelle svar af fører og halter kant markører til akut mekanisk stimulation

Da befolkningen analysen ovenfor kun giver tidsmæssige oplysninger om opførsel af chemotaxis regulatorer, blev celler også udsat for en kort mekaniske stimuli samtidig overholdes med et mikroskop. Denne analyse kan udføres enten med sammenlægning-kompetente eller vegetativt D. discoideum celler, der udtrykker forskellige fluorescently mærket biosensorer hvis lokalisering var defineret i celler stimuleret med en chemoattractant. To førende markører, PH domæne af Crac og kalk-Δcoil, som er ansat af PIP3 eller nyligt polymeriserede actin, viste begge det meste cytosole lokalisering i resting celler som tidligere rapporteret (figur 2A, supplerende film 1 )4,29. I cellerne, der basalt aktive, kunne disse biosensorer også ses på spidsen af pseudopods. Efter stimulation med shear flow for 2 s, biosensorer hurtigt relocalized cortex med et højdepunkt på ~ 6 til 10 s, og vendte tilbage til cytosol af ~ 30 s. Derimod lokaliseret en tilbagestående kant markør Yvonne_h_p i cortex før stimulation (figur 2A). Efter en kort puls med shear flow øget cytosole Yvonne_h_p intensitet omend med langsommere dynamics end for forkant biosensorer. En ændring i biosensor lokalisering fra cytosol er til cortex, og vice versa, tydeligt ses som en ændring i det cytosole intensitet giver mulighed for enkel kvantificering af svaret.

Den observerede opførsel af biosensorer reaktion på akut mekanisk stimulation er i overensstemmelse med førende og halter kant lokalisering dynamics i respons på stimulation med ensartet chemoattractant. Problemet var ikke enestående for de tre biosensorer vist. Som tidligere udgivne, lignende ændringer i lokalisering blev også observeret til forkant markører RBD og RalGDS, aktiveret som anerkender Ras og Rap1, henholdsvis, såvel som for en anden halter kant markør CynA22,30.

En lignende analyse kan bruges til at vurdere virkningerne af forskellige inhibitorer ved en simpel ændring af eksperimentelle opsætningen fra en enkelt inputlinje til dobbelt. Brug denne metode, kan cellerne først udsat for kontrol betingelser, og derefter skiftede til den buffer, som indeholder den ønskede test agent. For eksempel, tilsætning af aktin-depolymerizing stof LatA blokeret svar af RBD samt kalkΔcoil, at akutte mekaniske stimulation (figur 2B).

Global reaktion forud celle migration under langvarig stimulation med shear flow

Metoden beskrevet her kunne også være tilpasset til at studere virkningerne af shear flow på D. discoideum migration. I virkeligheden, hvis strømmen ikke blev slukke efter 2 s men forblev på for varigheden af forsøget, vegetative celler viste instrueret migration mod strømmen (figur 3supplerende Movie 2). Det skal bemærkes, at snitte flow nødvendig for at fremkalde en vandrende reaktion var lavere end det pres, der var typisk bruges til at opnå en global reaktion med akut stimulation i vegetative celler (for eksempel, som det ses i figur 2B). Dog, selv ved lavere tryk, celler, vises en robust ensartet svar, som målt ved en ændring i LimEΔcoil lokalisering, der gik forud for eventuelle ændringer i placeringen af cellen, selv. Således, disse eksperimenter viste tydeligt at 1) den globale reaktion ikke afhænger af bevægelse af cellen, og 2) den globale reaktion forud styret migration.

Alternative tilgange til test svar på akutte mekaniske stimulation

Selv om brugen af en gennemstrømnings-kammer har klare fordele for studiet af reaktion på akut mekanisk stimulation, godkendt vi også to yderligere assays til at teste individuelle celler reaktion på akut mekanisk stimulation. Som vist i figur 4, kalkΔcoil hurtigt og forbigående re lokaliseret fra cytosol til cortex når celler blev stimuleret af bolus tilsætning af buffer leveres enten med en mikropipette (figur 4A) eller manuelt ved hjælp af bulk buffer ud med en pipette (figur 4B). Det skal bemærkes, at en klar ulempe for begge disse assays er at det nøjagtige beløb af shear kraft leveret til cellen er ukendt og ikke kan varieres let. Men til situationer hvor skifter mellem mekaniske og kemiske stimuli ønskes, bulk buffer tilsætning tilbyder et solidt alternativ til stimulation i flow-enhed.

Figure 1

Figur 1: repræsentant resultat for biokemisk vurdering af D. discoideum celler reaktion til akutte mekaniske eller kemiske stimulation. Sammenlægning-kompetente celler blev udsat for mekaniske eller kemiske stimuli, mængden på de angivne tidspunkter, og immunoblotted ved hjælp af antistoffer, der genkender fosforyleret PKBR1 eller ERK2. (A) tilhænger celler blev stimuleret på en orbitalryster for 5 s. Membranen var plettet med Coomassie strålende blå (CBB) til at vise lige protein lastning. (B) tilhænger celler blev stimuleret af manuel flytning af pladen på en cross-wise måde for ca 5 s følgende kemiske stimulation som følge af tilsætning af 1 µM cAMP eller buffer (køretøj), eller uden nogen kemiske stimulation (-). De to immunoblots viser omfanget af variation i basal aktivering af PKBR1 ses på tidspunkt 0. Lejlighedsvis, kunne PKBA aktivering også påvises ved denne teknik, som vist i det nederste panel. (C) Suspension celler blev stimuleret med 1 µM cAMP eller buffer (køretøj). Del (A) i denne figur er blevet ændret fra Artemenko mfl. (2016) 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: repræsentant resultater af akut mekanisk stimulation og levende billedbehandling af enkelt celler på mikroskopet. (A) sammenlægning-kompetente D. discoideum celler udtrykker RFP-tagged kalkΔcoil, eller normal god landbrugspraksis-tagged PH-Crac eller PT blev stimuleret med envejs laminar flow på 15 dyn/cm2 for 2 til 5 s. billeder blev indsamlet hver 3 s . Repræsentative celler viser translokation af biosensorer svar på mekaniske stimulation er vist. Ophobning af hver biosensor på cortex var kvantificeres som inverse af den gennemsnitlige cytoplasmatisk intensitet normaliseret til tidspunkt 0. Den gennemsnitlige svar på 18 (kalkΔcoil), 20 (PH-Crac) eller 6 (PT) celler er vist. Værdier er betyde ± SE. (B) Vegetative celler udtrykker RFP-tagged kalkΔcoil- RFP og normal god landbrugspraksis-tagged RBD blev behandlet med køretøjet eller 5 µM LatA for mindst 15 min og derefter stimuleret med envejs laminar flow på 41 dyn/cm2 for 2 s. billeder blev indsamlet hver 3 s. RBD-normal god landbrugspraksis og LimEΔcoil- RFP ophobning på cortex var kvantificeres som i (A). Værdier er gennemsnit ± SE. Antallet af celler analyseret er angivet ud for hver betingelse. Skalalinjen = 10 µm. Dette tal er blevet ændret fra Artemenko et al. (2016) 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Repræsentant resultater af svaret fra D. discoideum celler til langvarig stimulation med flow. (A) Vegetative celler udtrykker RFP-tagged kalkΔcoil blev udsat for kontinuerlig envejs laminar flow på 15 dyn/cm2 og afbildet hver 3 s. spor af 11 celler er vist i (B). Skalalinjen = 10 µm. Dette tal er blevet ændret fra Artemenko et al. (2016) 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: repræsentant resultat for alternative tilgange til test svar på akutte mekaniske stimulation. (A) vegetativ D. discoideum celler udtrykker RFP-tagged kalkΔcoil blev udsat for en mikropipette (*) basalt frigive analysebuffer ved en langsom sats. En kort stigning i strømningshastigheden var opnået ved hurtig levering af en bolus med analysebuffer på tidspunkt 0. Billeder blev indsamlet hver 3 s. (B) vegetativ D. discoideum celler udtrykker RFP-tagged kalkΔcoil forgyldt som en lille dråbe i en mikroskopi kammer var mekanisk stimuleret ved tilsætning af en stor mængde af buffer til den kammer. Billeder blev indsamlet hver 3 s. skala bar = 10 µm. del (A) i denne figur er blevet ændret fra Artemenko et al. (2016) 22. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Supplerende Movie 1: Akut mekanisk stimulation udløser hurtige og forbigående translokation af kalkΔcoil- RFP eller PH-Crac-NGL fra cytosol cortex i sammenlægning-kompetente D. discoideum celler udtrykker disse biosensorer. Envejs laminar flow blev tændt for 5 s på tidspunkt 0 og celler blev afbildet med 3 s intervaller. Afspilningshastigheden er 5 rammer/s. To eksempler for hver cellelinje er vist. Skalalinjen = 10 µm. Denne film svarer til figur 2A og er blevet ændret fra Artemenko et al. (2016) 22. venligst klik her for at downloade denne fil.

Supplerende Movie 2: Kontinuerlig mekaniske stimulation udløser hurtige og forbigående translokation af kalkΔcoil- RFP fra cytosol cortex før migration af celler mod retning af strømmen. Vegetative celler udtrykker kalkΔcoilblev - RFP udsat for kontinuerlig shear stress på 15 dyn/cm2 starter på tidspunkt 0 og afbildet på 3 s intervaller. Afspilningshastighed er 10 rammer/s. skalaen bar = 10 µm. Denne film svarer til figur 3 og tidligere har været offentliggjort i Artemenko et al. (2016) 22. venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De metoder, der beskrives her tilbyder en nem måde at vurdere både befolkningen og individuelle celle adfærd som svar for at vride flow. Vigtigere, mens tidligere undersøgelser analyseret lokalisering af førende og halter kant markører under overflytningen, tillader den nuværende tilgang undersøgelse af umiddelbare virkninger ved at anvende shear flow akut. Benytter indeværende metode viste vi, at i virkeligheden, den første reaktion af celler til shear flow ikke kræver celle migration. I stedet, den hurtige og forbigående reaktion på indledende shear flow stimulus forud retningsbestemt migration set med langvarig udsættelse for shear flow, ligeledes til den første globale reaktion, set med en chemoattractant forløb.

De biokemiske og mikroskopiske tilgange udbytte supplerende data, selv om hver metode har forskellige fordele og ulemper. Stimulation efterfulgt af celle lysis og immunoblotting af PKBs, KrsB og ERK, eksempelvis analyserer en hel population af celler og dermed gennemsnit celle til celle variation, i modsætning til en analyse, der undersøger individuelle celle adfærd. Dog befolkningen-baserede undersøgelser har tendens til at maske subtile ændringer i celle adfærd, som nemt kan observeres ved at analysere enkelte celler. Derudover er biokemiske analysen beskrevet her kun effektiv med sammenlægning-kompetente celler, af grunde, som vil blive drøftet senere. Derimod mikroskopi-baseret analysen af relocalization RBD, RalGDS, PH-Crac, LimEΔcoilog PT, eksempelvis mellem cortex og cytosol er effektiv til både vegetative og sammenlægning-kompetente celler, og dermed giver mulighed for observationer der er stort set gælder for celler med varierende grader af polarisering. Hvad gør de to tilgange supplerer hinanden er det faktum, at de undersøger forskellige sæt af tilgængelige førende/halter kant markører, dermed udvide dækningen af de signal transduktion og aktin cytoskeleton net testet med shear flow assay.

Det er fortsat uklart, hvorfor vegetative celler, som reagerer meget håndfast i mikroskopi-baserede assays, ikke reagerer på stimulation efterfulgt af celle lysis og immunoblotting. En mulighed er, at mængden af shear kraft anvendes til celler, når pladen er roteret ikke stemmer overens med den kraft, der opleves af celler i et flow kammer. Udviklede celler, derimod måske har en lavere tærskel for aktivering, og således reagere på enten betingelse. Det er usandsynligt, at de biosensorer, hvis aktivitet er målt af biokemiske analysen udtrykkes ikke eller er ikke aktiveret i vegetative celler, da stimulation af vegetative celler med folinsyre fører til robust aktivering af både PKBR1/PKBA og ERK2 (data ikke vist). Vegetative celler viser desuden, klart rekrutteringen af PH-Crac, som afspejler PIP3 ophobning, i mikroskopi-baseret analysen. Da PKBA ansættelse afhænger også af PIP3, synes det usandsynligt, at PKBA ikke ville reagere på akutte mekaniske stimulation, medmindre betingelserne i den biokemiske assay ikke er optimal som nævnt ovenfor. Dette er stadig et område med aktiv efterforskning.

De biokemiske analyser af chemotaxis regulatorer kræves tilstedeværelsen af koffein i hele eksperimentet. Oprindeligt blev koffein tilføjet for at forhindre celle til celle signalering som følge af udskillelsen af lejren. Det synes imidlertid at koffein har en anden rolle udover hæmning af adenylyl cyclase (ACA) da ACA-null celler stadig kræves koffein ved fosforylering af PKBR1 svar på akutte mekaniske stimulation. Koffein har tidligere vist sig at blokere TorC2 aktivitet26. Det er muligt, at hæmning af TorC2 blokeret nogle basale motilitet af celler, og dermed sænkes basal aktivering af PKBR1 og andre komponenter af signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk. Lav basal aktivitet var bydende nødvendigt for observere svar på shear flow. I virkeligheden, når cellerne blev indsamlet på tidligere tidspunkter under udviklingen, vises de øgede basal aktivitet og en reduceret shear-flow induceret svar. Interessant, er det kendt at vegetative celler har forholdsmæssigt mere PKBA aktivitet og mindre PKBR1 i forhold til udviklet celler31. Det er muligt at basal staten er reguleret lidt forskelligt i vegetativ og sammenlægning-kompetente celler, yderligere bidrager til manglen en reaktion af vegetative celler i den biokemiske assay. Mærkeligt nok, når cellerne blev indsamlet på senere tidspunkter i udviklingen, de også havde en reduceret svar, sandsynligvis på grund af den stærke indflydelse af polaritet på lokaliseringen og aktivering af forskellige chemotaxis tilsynsmyndighederne undersøgt i denne analyse.

Stimulation af celler i en mikroskopi kammer afslørede, at både styrke og varighed af stimulus bidrage til maksimal svar22. Med andre ord en maksimal svar kan opnås selv med en lav shear kraft, hvis det anvendes i en længere periode af tid (10 s versus 2 s). Denne observation forklarer, hvorfor celler har en indledende globale svar, når de udsættes først for en kontinuerlig, men svag, stimulus, der fører til shear flow-induceret migration. Med den nuværende apparater var vi ude af stand til at generere lav nok shear flow for at undersøge den nederste ende af intervallet.

De vigtigste konsekvenser af de foretagne undersøgelser ved hjælp af akut mekanisk stimulation er måske, at både mekaniske og kemiske stimuli synes at indgå i fælles signaltransduktion og aktin cytoskeleton netværk. Selv om vi viste, at de to stimuli integrere ved hjælp af bulk buffer ud for den mekaniske stimulation, fremtidige undersøgelser har til formål at udvikle et system, hvor chemoattractant kan leveres hurtigt i gennemstrømnings-kanal, som ville være en meget mere alsidig og effektiv måde at vurdere integrationen af mekaniske og kemiske stimuli. Desværre er chemoattractant tilsætning ved hjælp af den aktuelle opsætning af to linjer forbundet med en anden shear flow stimulus fordi chemoattractant skal leveres i overværelse af flow. Et levedygtigt alternativ kan være laser-stimuleret udgivelsen af en chemoattractant fra et bur forløber, som med succes blev vist for cAMP af Westendorf mfl. 32. i fremtiden, det ville også være interessant at undersøge integration af andre stimuli, f.eks shear flow og variable elektriske felter, eller snitte flow og variable substrat stivhed. Det sidstnævnte eksempel er interessant, fordi det drejer sig om to typer af mekaniske stimulation, selvom den oprindelige signalmodtagelse kan afvige indbyrdes. Bekræfter, at alle stimuli, der inducerer styret migration deler det samme signaltransduktion netværk og varierer kun i hvordan stimulus opfattes vil forklare, hvordan cellerne kan navigere i komplekse miljøer. Endelig, vi allerede vist, at akut stimulation med shear strømmen fører til spredning af neutrofile-lignende menneskeceller22. Fremtidige arbejde vil undersøge yderligere, lokalisering og aktivering af forskellige komponenter af signal transduktion og aktin cytoskeleton netværk med mekaniske stimuli i pattedyrsceller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af nationale kontorer i sundhed grant R35 GM118177 på PND.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Dextrose Fisher D16-1 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Proteose peptone Fisher DF0120-17-6 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Yeast extract Fisher 50-550-445 Use to prepare HL-5 media and SM plates (steps 1.1, 1.2)
Na2HPO4·7H2O Fisher S373-500 Use to prepare HL-5 media, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1, 1.3)
KH2PO4 Fisher P386-500 Use to prepare HL-5 media, SM plates, and 10X Phosphate Buffer (steps 1.1-1.3)
Streptomycin (dihydrostreptomycin sulfate) Fisher ICN10040525 Use to prepare HL-5 media (step 1.1)
Peptone (Bacto) Fisher DF0118-17-0 Use to prepare SM plates (step 1.2)
K2HPO4 Fisher P288-100 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Agar Fisher BP1423-500 Use to prepare SM plates (step 1.2)
MgSO4 Fisher M65-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
CaCl2 Fisher C79-500 Use to prepare DB Buffer (step 1.4)
Caffeine Fisher O1728-500 Use to prepare caffeine (step 1.5)
cAMP (EMD Millipore Calbiochem Adenosine 3 ft.,5 ft.-cyclic Monophosphate, Sodium Salt) Fisher 11-680-1100MG Use to prepare cAMP (step 1.6)
Folic acid Sigma F7876 Use to prepare folic acid (step 1.7)
Tris base Fisher BP152-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Sodium dodecyl sulfate (SDS) Fisher BP166-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Glycerol Fisher G33-500 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Dithiothreitol (DTT) Bio-Rad 1610610 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
Bromophenol blue Bio-Rad 1610404 Use to prepare 3X sample buffer (step 1.8)
NaF Fisher S299-100 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Na3VO4 Fisher 50-994-911 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Sodium pyrophosphate decahydrate Fisher S390-500 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail (Roche) Sigma 11873580001 Use to prepare sample buffer with protease and phosphatase inhibitors (step 1.8)
Latrunculin A Enzo Life Sciences BML-T119-0100 Use to prepare Latrunculin A (step 1.9)
4-15% Tris-HCl polyacrylamide gel Bio-Rad 3450029 Use for immunoblotting (step 3.3)
Polyvinylidene fluoride membrane Bio-Rad 1620177 Use for immunoblotting (step 3.3)
Phospho-PKC (pan) (zeta Thr410) (190D10) Rabbit antibody Cell Signaling 2060 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (D13.14.4E) XP antibody Cell Signaling 4370 Primary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Rabbit IgG HRP Linked Whole Ab (from Donkey) GE Healthcare NA934-100UL Secondary antibody for use in immunoblotting (step 3.3)
Enhanced chemiluminescence substrate (Clarity Western ECL Substrate) Bio-Rad 1705060 Use for immunoblotting (step 3.3)
Stripping buffer (Restore Plus Western blot stripping buffer) Pierce PI46430 Use for immunoblotting (step 3.3)
Coomassie Brilliant Blue Fisher PI20278 Use for immunoblotting (step 3.3)
K. aerogenes strain (non-pathogenic) Dicty Stock Center (dictybase.org)
Name Company Catalog Number Comments
Materials and Equipment
Orbital shaker (model G-33, or a comparable alternative) New Brunswick Scientific Use to grow K. aerogenes (step 2.1.1), and to basalate and stimulate D. discoideum cells (step 3). The radius of gyration for this shaker is 9.5 mm.
10 cm Petri dish Fisher FB0875712 Use to prepare SM plates (step 1.2)
Hemocytometer Fisher 02-671-51B Use to count D. discoideum cells (step 2.1.2)
35 mm dish (Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Dish) Fisher 08-772A Use to plate D. discoideumcells for mechanical stimulation followed by cell lysis (step 3.1.1)
Polystyrene cup (5 mL) VWR 13915-985 Use to stimulate D. discoideum cell suspension with a chemoattractant (step 3.2.2)
Fluidic unit with pump (ibidi Pump System) Ibidi 10902 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Slide with a channel (μ-Slide III 3in1 ibiTreat: #1.5 polymer coverslip, tissue culture treated, sterilized) Ibidi 80316 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a fluidic device (steps 4.1, 4.2, and 5)
50 mL reservoirs (Ibidi Reservoir Holder for Fluidic Unit) Ibidi 10978 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5)
Lines for the fluidic unit (Perfusion Set YELLOW-and-GREEN) Ibidi 10964 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5). Note: the two lines can also be cut from the 1.6 mm tubing (catalog number 10842).
Line for the drain (1.6 mm ID tubing) Ibidi 10842 Use to setup the fluidic device for delivering mechanical stimulation to D. discoideum cells in a channel (steps 4.1, 4.2, and 5).
Zeiss Observer.Z1 inverted microscope equipped with a 40X/1.3 oil objective and a 20X/0.3 air objective (or a comparable alternative) Zeiss Used to image D. discoideum cells with phase-contrast or fluorescence illumination (steps 4 and 5)
UltraView spinning disk confocal microscope equipped with a 40×/1.25–0.75 oil objective (or a comparable alternative) Perkin-Elmer DM 16000 An alternative used to image D. discoideum cells (step 4.1.4)
FemtoJet Microinjector (Eppendorf; model 5247, or a comparable alternative) with Eppendorf InjectMan Eppendorf 5252000021D and 5192000027 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3). Note: catalog number are for the newest version of the equipment (4i).
Micropipette (Femtotip; 1 μm outside diameter, 0.5 μm inside diameter ) Eppendorf 930000035 Use to deliver mechanical stimulation to D. discoideum cells by a micropipette (step 4.3)
Microloader tips (Eppendorf Femtotips Microloader Tips for Femtojet Microinjector) Eppendorf 5242956.003 Use to fill the micropipette (femtotip) with buffer (step 4.3.1)
1-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass) Fisher 12-565-472 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by a micropipette (step 4.3.2)
8-well chamber (Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass) Fisher 12-565-338 Use to plate D. discoideum cells for mechanical stimulation delivered by bulk buffer addition (step 4.4.1)
Name Company Catalog Number Comments
Software
Image Analysis Software (Fiji) NIH https://fiji.sc/ Use to quantify response to mechanical stimulation (step 4.5)
Migration analysis software (Tracking Tool PRO) Gradientech http://gradientech.se/tracking-tool-pro/ Use to quantify cell speed and persistence (step 5.4)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swaney, K. F., Huang, C. H., Devreotes, P. N. Eukaryotic chemotaxis: a network of signaling pathways controls motility, directional sensing, and polarity. Annu Rev Biophys. 39, 265-289 (2010).
  2. Sasaki, A. T., Chun, C., Takeda, K., Firtel, R. A. Localized Ras signaling at the leading edge regulates PI3K, cell polarity, and directional cell movement. J Cell Biol. 167 (3), 505-518 (2004).
  3. Jeon, T. J., Lee, D. -J., Merlot, S., Weeks, G., Firtel, R. A. Rap1 controls cell adhesion and cell motility through the regulation of myosin II. J Cell Biol. 176 (7), 1021-1033 (2007).
  4. Parent, C. A., Blacklock, B. J., Froehlich, W. M., Murphy, D. B., Devreotes, P. N. G Protein Signaling Events Are Activated at the Leading Edge of Chemotactic Cells. Cell. 95 (1), 81-91 (1998).
  5. Funamoto, S., Meili, R., Lee, S., Parry, L., Firtel, R. A. Spatial and Temporal Regulation of 3-Phosphoinositides by PI 3-Kinase and PTEN Mediates Chemotaxis. Cell. 109 (5), 611-623 (2002).
  6. Iijima, M., Devreotes, P. Tumor Suppressor PTEN Mediates Sensing of Chemoattractant Gradients. Cell. 109 (5), 599-610 (2002).
  7. Lim, C. J., Spiegelman, G. B., Weeks, G. RasC is required for optimal activation of adenylyl cyclase and Akt/PKB during aggregation. EMBO J. 20 (16), 4490-4499 (2001).
  8. Kamimura, Y., et al. PIP3-Independent Activation of TorC2 and PKB at the Cell's Leading Edge Mediates Chemotaxis. Curr Biol. 18 (14), 1034-1043 (2008).
  9. Kortholt, A., King, J. S., Keizer-Gunnink, I., Harwood, A. J., Van Haastert, P. J. M. Phospholipase C Regulation of Phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate-mediated Chemotaxis. Molecular Biology of the Cell. 18 (12), 4772-4779 (2007).
  10. Huang, C. H., Tang, M., Shi, C., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. An excitable signal integrator couples to an idling cytoskeletal oscillator to drive cell migration. Nat Cell Biol. 15 (11), 1307-1316 (2013).
  11. Nishikawa, M., Hörning, M., Ueda, M., Shibata, T. Excitable Signal Transduction Induces Both Spontaneous and Directional Cell Asymmetries in the Phosphatidylinositol Lipid Signaling System for Eukaryotic Chemotaxis. Biophys J. 106 (3), 723-734 (2014).
  12. Gerisch, G., et al. Mobile Actin Clusters and Traveling Waves in Cells Recovering from Actin Depolymerization. Biophys J. 87 (5), 3493-3503 (2004).
  13. Gerisch, G., Ecke, M., Wischnewski, D., Schroth-Diez, B. Different modes of state transitions determine pattern in the Phosphatidylinositide-Actin system. BMC Cell Biol. 12 (1), 42 (2011).
  14. Bretschneider, T., et al. The Three-Dimensional Dynamics of Actin Waves, a Model of Cytoskeletal Self-Organization. Biophys J. 96 (7), 2888-2900 (2009).
  15. Weiner, O. D., Marganski, W. A., Wu, L. F., Altschuler, S. J., Kirschner, M. W. An Actin-Based Wave Generator Organizes Cell Motility. PLOS Biol. 5 (9), e221 (2007).
  16. Devreotes, P., Horwitz, A. R. Signaling Networks that Regulate Cell Migration. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7 (8), (2015).
  17. Artemenko, Y., Lampert, T. J., Devreotes, P. N. Moving towards a paradigm: common mechanisms of chemotactic signaling in Dictyostelium and mammalian leukocytes. Cell Mol Life Sci. 71 (19), 3711-3747 (2014).
  18. Dalous, J., et al. Reversal of cell polarity and actin-myosin cytoskeleton reorganization under mechanical and chemical stimulation. Biophys J. 94 (3), 1063-1074 (2008).
  19. Sato, M. J., et al. Switching direction in electric-signal-induced cell migration by cyclic guanosine monophosphate and phosphatidylinositol signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (16), 6667-6672 (2009).
  20. Zhao, M., Pu, J., Forrester, J. V., McCaig, C. D. Membrane lipids, EGF receptors, and intracellular signals colocalize and are polarized in epithelial cells moving directionally in a physiological electric field. Faseb j. 16 (8), 857-859 (2002).
  21. Decave, E., et al. Shear flow-induced motility of Dictyostelium discoideum cells on solid substrate. J Cell Sci. 116 (Pt 21), 4331-4343 (2003).
  22. Artemenko, Y., Axiotakis, L., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Chemical and mechanical stimuli act on common signal transduction and cytoskeletal networks. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (47), E7500-E7509 (2016).
  23. Artemenko, Y., Swaney, K. F., Devreotes, P. N. Assessment of development and chemotaxis in Dictyostelium discoideum mutants. Methods Mol Biol. 769, 287-309 (2011).
  24. Gaudet, P., Pilcher, K. E., Fey, P., Chisholm, R. L. Transformation of Dictyostelium discoideum with plasmid DNA. Nat. Protocols. 2 (6), 1317-1324 (2007).
  25. Veltman, D. M., Lemieux, M. G., Knecht, D. A., Insall, R. H. PIP3-dependent macropinocytosis is incompatible with chemotaxis. J Cell Biol. 204 (4), 497-505 (2014).
  26. Cai, H., Huang, C. H., Devreotes, P. N., Iijima, M. Analysis of chemotaxis in Dictyostelium. Methods Mol Biol. 757, 451-468 (2012).
  27. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Meth. 9 (7), 676-682 (2012).
  28. Brenner, M., Thoms, S. D. Caffeine blocks activation of cyclic AMP synthesis in Dictyostelium discoideum. Dev Biol. 101 (1), 136-146 (1984).
  29. Bretschneider, T., et al. Dynamic Actin Patterns and Arp2/3 Assembly at the Substrate-Attached Surface of Motile Cells. Curr Biol. 14 (1), 1-10 (2004).
  30. Swaney, K. F., Borleis, J., Iglesias, P. A., Devreotes, P. N. Novel protein Callipygian defines the back of migrating cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (29), E3845-E3854 (2015).
  31. Meili, R., Ellsworth, C., Firtel, R. A. A novel Akt/PKB-related kinase is essential for morphogenesis in Dictyostelium. Curr Biol. 10 (12), 708-717 (2000).
  32. Westendorf, C., et al. Actin cytoskeleton of chemotactic amoebae operates close to the onset of oscillations. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3853-3858 (2013).

Tags

Cellebiologi sag 129 signaltransduktion mechanotransduction shear stress chemotaxis rheotaxis shear flow-induceret migration styret migration biosensor lokalisering akut stimulation
Vurdering af <em>Dictyostelium discoideum</em> svar på akutte mekaniske Stimulation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Artemenko, Y., Devreotes, P. N.More

Artemenko, Y., Devreotes, P. N. Assessment of Dictyostelium discoideum Response to Acute Mechanical Stimulation. J. Vis. Exp. (129), e56411, doi:10.3791/56411 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter